CN115317410B - 一种舒缓保湿、增强细胞活力的发酵油及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于日化用品技术领域，公开了一种舒缓保湿、增强细胞活力的发酵油及制备方法和应用。本发明发酵油的制备方法包括步骤：S1、将神经酰胺、乳化剂和植物油脂混合，搅拌，得到油相；S2、将油相、发酵菌株、培养基和水混合，搅拌发酵，得到发酵油；乳化剂包括胆甾醇、植物甾醇类、油菜甾醇类、野大豆甾醇类中的一种或多种；植物油脂包括葡萄籽油、植物角鲨烷、白池花籽油、山茶籽油、油橄榄果油、沙棘果油、沙棘籽油、深海两节荠籽油、亚麻籽油、狭叶青蒿油、紫草油、鳄梨油、小麦胚芽油、琉璃苣籽油、牡丹籽油中的一种或多种。本发明制得的发酵油具有显著的舒缓、保湿、增强细胞活力多重功效。
Description
技术领域
本发明属于日化用品技术领域，特别涉及一种舒缓保湿、增强细胞活力的发酵油及制备方法和应用。
背景技术
皮脂膜是保护皮肤的重要屏障。正常情况下，皮肤每天都会分泌油脂，油脂可以帮助维持皮肤pH值低的状态，使肌肤水油实现动态平衡。但随着年龄增长、气温及环境变化，皮脂腺油脂分泌不足，皮脂膜就会受损，从而导致皮肤出现干燥、暗沉、脱皮、容易产生皱纹等问题。随着科学的不断发展，天然植物油溶活性成分被不断挖掘，这类天然油脂可以为人体带来构建组织的成分，帮助舒缓肌肤的同时启动屏障修护功能。目前很多植物油是针对抑菌功效，在化妆品领域的其他功效应用较少。微生物在生长过程中可以产生很多生物活性成分，如脂类、蛋白脂类等，这些物质是优良的护肤材料。植物油经过微生物发酵处理后，其产物具有更出色、更有效的皮肤保护作用，但是发酵过程中由于微生物的各种生理代谢都依赖于水的存在，水油难于混合，使微生物与植物油难以充分接触，导致微生物对植物油的生物转化效率非常低。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种舒缓保湿、增强细胞活力的发酵油及制备方法和应用，本发明通过将神经酰胺、乳化剂和植物油脂混合处理后，再进行发酵，使微生物能够与植物油脂充分接触发酵，制得的发酵油具有显著的舒缓、保湿、增强细胞活力多重功效。
本发明的第一方面提供一种发酵油的制备方法，包括以下步骤：
S1、将神经酰胺、乳化剂和植物油脂混合，搅拌，得到油相；
S2、将所述油相、发酵菌株、培养基和水混合，搅拌发酵，得到所述发酵油；
所述乳化剂包括胆甾醇、植物甾醇类、油菜甾醇类、野大豆甾醇类中的一种或多种；
所述植物油脂包括葡萄籽油、植物角鲨烷、白池花籽油、山茶籽油、油橄榄果油、沙棘果油、沙棘籽油、深海两节荠籽油、亚麻籽油、狭叶青蒿油、紫草油、鳄梨油、小麦胚芽油、琉璃苣籽油、牡丹籽油中的一种或多种。
优选地，所述植物油脂包括葡萄籽油、植物角鲨烷、山茶籽油、油橄榄果油、沙棘果油、鳄梨油中的一种或多种。
优选地，所述发酵菌株包括酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母中的一种或多种，所述发酵菌株的浓度为105-109CFU/mL。更为优选地，所述发酵菌株的浓度为105-107CFU/mL。
优选地，所述神经酰胺包括神经酰胺EOP、神经酰胺NS、神经酰胺NG、神经酰胺NP、神经酰胺AS、神经酰胺AP中的一种或多种。
优选地，所述神经酰胺、所述乳化剂和所述植物油脂的用量比为1g:(0.01-10g):(10-1000g)。更为优选地，所述神经酰胺、所述乳化剂和所述植物油脂的用量比为1g:(0.1-1g):(10-100g)。
优选地，步骤S1中，所述混合的温度为25-90℃，所述搅拌的速度为30-250rpm，时间为3-40min。更为优选地，所述混合的温度为50-90℃，所述搅拌的速度为100-250rpm，时间为20-40min。
优选地，所述油相、所述发酵菌株、所述培养基和所述水的用量比为1g:(0.01-10mL):(0.1-200g):(1-1000g)。更为优选地，所述油相、所述发酵菌株、所述培养基和所述水的用量比为1g:(0.1-1mL):(0.1-2g):(1-10g)。
优选地，所述培养基采用MRS肉汤培养基。
优选地，步骤S2中，所述搅拌发酵的搅拌速度为30-250rpm，发酵温度为25-45℃，发酵时间为12-120h。更为优选地，所述搅拌发酵的搅拌速度为150-250rpm，发酵温度为30-45℃，发酵时间为84-120h。
本发明的第二方面提供一种发酵油，其采用本发明所述的制备方法制备而成。
本发明的第三方面提供本发明所述的发酵油在制备化妆品中的应用。
基于上述应用，所述化妆品的剂型包括霜剂、乳液、水剂、凝胶、面膜或洗剂中的一种；所述发酵油在所述化妆品中的含量为0.01wt％-95wt％。优选地，所述发酵油在所述化妆品中的含量为0.5wt％-50wt％。更为优选地，所述发酵油在所述化妆品中的含量为0.5wt％-5wt％。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过植物油脂的定向制备和微生物油水密接发酵技术进行有机结合，即先采用神经酰胺、乳化剂和植物油脂混合得到油相后再进行发酵，使得油相和发酵液在发酵过程中乳化明显，微生物能够与植物油脂充分接触发酵，最终得到的发酵油能够提高HaCat和人皮肤成纤维细胞的活力，同时降低UV照射后HaCat细胞产生的炎症因子IL-1β和TNF-α的含量，提高兜甲蛋白和丝聚蛋白的含量，具有显著的舒缓、保湿、增强细胞活力多重功效。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
以下实施例所用原料的信息如下：
胆甾醇：商品名为CHOLSTEROL JSQI，日本精化株式会社；
油菜(BRASSICA CAMPESTRIS)甾醇类：商品名为Generol R，巴斯夫(中国)有限公司；
植物甾醇类：商品名为Technol SD，横関油脂工業株式会社；
野大豆(GLYCINE SOJA)甾醇类：商品名为Generol 122，巴斯夫(中国)有限公司；
植物角鲨烷：商品名为Plantasens Olive Squalane，科莱恩化工科技(上海)有限公司；
山茶(CAMELLIA JAPONICA)籽油：商品名为SenplantTM COL-S，广州潮徽生物科技有限公司；
沙棘(HIPPOPHAE RHAMNOIDES)果油：商品名为沙棘果油(SH-5109)，北京三友汇智生物技术有限公司；
鳄梨(PERSEA GRATISSIMA)油：商品名为鳄梨油，Northstar Lipids(UK)Ltd；
油橄榄(OLEA EUROPAEA)果油：商品名为ORGANIC EXTRA VIRGIN OLIVE OIL，SOPHIM S.A.S.；
葡萄(VITIS VINIFERA)籽油：商品名为Grapeseed Oil CB葡萄籽油，NorthstarLipids(UK)Ltd。
实施例1
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NP 2g、植物甾醇类2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例2
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NP 1g、植物甾醇类1g、葡萄籽油98g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例3
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺EOP 2g、植物甾醇类2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例4
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NP 2g、胆甾醇2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例5
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NP 2g、植物甾醇类2g、山茶籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例6
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NP 2g、植物甾醇类2g、葡萄籽油48g、山茶籽油48g混合，在50℃下搅拌25min，搅拌速度为120rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵72h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例7
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NS 2g、野大豆甾醇类2g、沙棘果油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例8
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NS 1g、野大豆甾醇类1g、沙棘果油98g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例9
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺AS 2g、野大豆甾醇类2g、沙棘果油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例10
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NS 2g、胆甾醇2g、沙棘果油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例11
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NS 2g、野大豆甾醇类2g、油橄榄果油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例12
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NS 2g、野大豆甾醇类2g、沙棘果油48g、油橄榄果油48g混合，在50℃下搅拌25min，搅拌速度为120rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵72h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例13
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NG 2g、油菜甾醇类2g、鳄梨油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例14
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NG 1g、油菜甾醇类1g、鳄梨油98g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例15
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺AP 2g、油菜甾醇类2g、鳄梨油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例16
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NG 2g、胆甾醇2g、鳄梨油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例17
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NG 2g、油菜甾醇类2g、植物角鲨烷96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
实施例18
一种发酵油的制备方法，包括如下步骤：
S1、将神经酰胺NG 2g、油菜甾醇类2g、鳄梨油48g、植物角鲨烷48g混合，在50℃下搅拌25min，搅拌速度为120rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4gMRS肉汤培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵72h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例1(与实施例1的区别在于未经过发酵)
将神经酰胺NP 2g、植物甾醇类2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，得到油脂混合物。
对比例2(与实施例7的区别在于未经过发酵)
将神经酰胺NS 2g、野大豆甾醇类2g、沙棘果油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，得到油脂混合物。
对比例3(与实施例13的区别在于未经过发酵)
将神经酰胺NG 2g、油菜甾醇类2g、鳄梨油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，得到油脂混合物。
对比例4(与实施例1的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将20g葡萄籽油、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例5(与实施例7的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将20g沙棘果油、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例6(与实施例13的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将20g鳄梨油、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例7(与实施例6的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将10g葡萄籽油、10g山茶籽油、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例8(与实施例12的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将10g沙棘果油、10g油橄榄果油、4mL毕赤酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例9(与实施例18的区别在于油脂未经过与神经酰胺、植物甾醇类混合)
将10g鳄梨油、10g植物角鲨烷、4mL乳酸克鲁维酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例10(与实施例1的区别在于采用氨基丁三醇替换神经酰胺NP)
S1、将氨基丁三醇，植物甾醇类2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
对比例11(与实施例1的区别在于采用PEG-10聚二甲基硅氧烷替换植物甾醇类)
S1、将神经酰胺NP 2g、PEG-10聚二甲基硅氧烷2g、葡萄籽油96g混合，在50℃下搅拌20min，搅拌速度为100rpm，即得油相；
S2、将20g油相、4mL酿酒酵母菌液(浓度为107CFU/mL)、4g培养基和180g水混合，在30℃下搅拌发酵84h，发酵过程中的搅拌速度为150rpm，发酵结束后将发酵液在转速为10000rpm条件下离心25min，取离心后的油状液体，得到发酵油。
试验例1：红细胞溶血性评价
红细胞溶血实验基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。
以实施例1-18和对比例1-11制备的样品进行红细胞溶血实验，本实验依照欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的RBC实验测试方法及分级标准。其中HD50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，DI为蛋白质变性指数，L/D为HD50与DI的比值。评价标准见表1；评价结果见表2。
表1
| L/D | 分级 |
| L/D>100 | 无刺激性 |
| 10<L/D≤100 | 微刺激性 |
| 1<L/D≤10 | 轻度刺激性 |
| 0.1<L/D≤1 | 中毒刺激性 |
| L/D≤0.1 | 重度刺激性 |
表2
由表2可知，对比例10-11制备的样品有轻度刺激性，实施例1-18及对比例1-9制备的样品均对红细胞没有刺激性。
试验例2：对UV照射后人永生化角质形成细胞(HaCat)细胞存活率的影响
将HaCat细胞接种至6孔板中，在37℃和5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白对照组、模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有对应浓度受试样品(1％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm2)40min。于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h后吸取培养基，用PBS清洗2-3次，采用MTT法测试细胞存活率，细胞相对存活率(％)＝样品组细胞存活率/模型组细胞存活率×100，测试结果如表3所示。
表3
表3结果表明，实施例1-18和对比例4-11制得的发酵油，与对比例1-3未经发酵的油脂混合物相比，HaCat细胞活力更好，对UV照射后的HaCat细胞具有更好的保护作用；与对比例4-11相比，实施例1-18制得的发酵油对UV照射后的HaCat细胞具有更好的保护作用，并且能够促进细胞的生长，提高HaCat细胞活力。
试验例3：对UV照射后HaCaT细胞IL-1β、TNF-α、兜甲蛋白和丝聚蛋白含量的影响
将HaCat细胞接种至6孔板中，在37℃和5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白对照组、模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有对应浓度受试物样品(1％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm2)40min。于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定IL-1β、TNF-α、兜甲蛋白和丝聚蛋白含量，测试结果如表4和表5所示。
表4
表5
表4结果表明，相比于对比例1-11，实施例1-18制得的发酵油可以降低UV照射后HaCat细胞产生的炎症因子IL-1β和TNF-α的含量，表现出抗炎的活性。表5结果表明，相比于对比例1-11，实施例1-18制得的发酵油提高的兜甲蛋白和丝聚蛋白的含量，表现出修护保湿的作用。
试验例4：对UV照射后人皮肤成纤维细胞(HDF)存活率的影响
将HDF细胞接种至6孔板中，在37℃和5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白对照组、模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有对应浓度受试样品(1％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm2)40min。于37℃和5％CO2的培养箱中继续培养24h后吸取培养基，用PBS清洗2-3次，采用MTT法测试细胞存活率，细胞相对存活率(％)＝样品组细胞存活率/模型组细胞存活率×100，测试结果如表6所示。
表6
表6结果表明，实施例1-18和对比例4-11制得的发酵油，与对比例1-3未经发酵的油脂混合物相比，HDF细胞活力更好，对UV照射后的HDF细胞具有更好的保护作用；与对比例4-11相比，实施例1-18制得的发酵油对UV照射后的HDF细胞具有更好的保护作用，并且能够促进细胞的生长，提高HDF细胞活力。
试验例5：人I型胶原蛋白和基质金属蛋白酶分析
HDF在6孔板中以每孔2×104个细胞的密度在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。HDF用样品(1％)处理24小时后，HDF用PBS清洗两次，在30J/cm2的UVB照射。然后，去除PBS，HDF用样品(1％)在37℃下，质量分数5％CO2培养24小时。培养结束后，根据ELISA试剂盒操作方法，测定人I型胶原蛋白(COL-I)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的含量。测试结果如表7所示。
表7
表7结果表明，相比于对比例1-11，实施例1-18制得的发酵油在更好降低MMP-1的含量的同时，还能提高COL-I的含量。由于MMP-1的提高和COL-I的降低会引起皮肤衰老、产生皱纹，而本发明实施例1-18制得的发酵油在降低MMP-1的含量的同时，还能提高COL-I的含量，表明实验例1-18中的发酵油有更强的抗衰老功效。
应用例1
一种乳液，包括本发明实施例1制备的发酵油。其具体配方如表8所示。其制备方法按照乳液的常规制备方法制备即可。
表8
应用例2
本应用例2的乳液与应用例1的区别仅在于将实施例1制备的发酵油替换成实施例7制备的发酵油，其他组分、添加量及制备方法同应用例1。
对比应用例1
本对比应用例1的乳液与应用例1的区别仅在于将实施例1制备的发酵油替换成对比例1制备的发酵油，其他组分、添加量及制备方法同应用例1。
对比应用例2
本对比应用例2的乳液与应用例1的区别仅在于将实施例1制备的发酵油替换成对比例2制备的发酵油，其他组分、添加量及制备方法同应用例1。
空白对照组1
空白对照组1的乳液与应用例1的区别仅在于将实施例1制备的发酵油替换成水，其他组分、添加量及制备方法同应用例1。
对上述应用例1-2、对比应用例1-2及空白对照组1的乳液进行舒缓保湿功效评价。
对象选取志愿者150名，年龄在20-45岁，男女各半。分为5组，分别使用应用例1-2、对比应用例1-2及空白对照组1的乳液。测试部位为面部，受试者每天早晚洁面后，取适量产品按压均匀涂抹于面部，按摩至其吸收。每天使用两次，早晚各一次。受试者在产品使用前(第0天)、使用产品后14天及28天进行随访。评估指标包括测试部位皮肤红斑和脱屑，每个指标根据其程度按0分(很好)至9分(很差)来进行评估。另外，通过比较产品使用前后皮肤含水量、皮肤TEWL和皮肤红区面积来评估产品的修护和舒缓功效。结果见表9所示。
表9
由表9可知，与对比应用例1-2及空白对照组1的乳液相比较，受试者认为使用应用例1和应用例2的乳液后，皮肤红斑、脱屑有所改善；结合受试者使用前后皮肤含水量、TEWL值和红区面积变化，表明本发明的发酵油具有显著的舒缓、修护和保湿功效。
分别将本发明其他的实施例2-6、实施例8-18制得的发酵油也用于乳液中，得到的乳液的舒缓、修护和保湿功效均与上述应用例1-2的乳液的功效相当。
应用例3
一种面霜，包括本发明实施例13制备的发酵油。其具体配方如表10所示。其制备方法按照面霜的常规制备方法制备即可。
表10
| 成分 | 质量分数(％) |
| 水 | 余量 |
| 丁二醇 | 6 |
| 实施例13制备的发酵油 | 5 |
| 甘油 | 4 |
| 聚二甲基硅氧烷 | 4 |
| 聚二甲基硅氧烷 | 2 |
| C14-22醇 | 1.8 |
| 丙烯酸(酯)类共聚物钠 | 1.2 |
| 二C12-13醇苹果酸酯 | 1 |
| 1,2-己二醇 | 0.8 |
| 聚甲基倍半硅氧烷 | 0.5 |
| 生育酚乙酸酯 | 0.5 |
| 对羟基苯乙酮 | 0.5 |
| 泛醇 | 0.3 |
| 丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物 | 0.2 |
| EDTA二钠 | 0.02 |
| 尿囊素 | 0.2 |
对比应用例3
本对比应用例3的面霜与应用例3的区别仅在于将实施例13制备的发酵油替换成对比例3制备的发酵油，其他组分、添加量及制备方法同应用例3。
空白对照组2
空白对照组2的面霜与应用例3的区别仅在于将实施例13制备的发酵油替换成水，其他组分、添加量及制备方法同应用例3。
对上述应用例3、对比应用例3及空白对照组2的面霜进行舒缓紧致功效评价。
对象选取志愿者90名，年龄在20-45岁，男女各半。分为3组，分别使用应用例3、对比应用例3及空白对照组2的面霜，每天早午晚各使用一次，每次各涂抹1g产品于脸部，并按摩2分钟。根据感官评价填写试用评价表。使用7天、14天、28天各统计一次。志愿者在使用过程中对样品进行舒缓和紧致效果评价，其中最高分为5表示效果显著，最低分为0表示没有效果。结果见表11所示。
表11
由表11可知，志愿者认为使用应用例3制备的面霜后，皮肤紧致度和舒缓方面得到显著改善，优于使用对比应用例3及空白对照组2的面霜。紧致度和发酵油促进胶原蛋白的产生和抑制基质金属蛋白酶的活性有相关性；舒缓效果与发酵油提高兜甲蛋白和丝聚蛋白的含量有相关性，表明本发明的发酵油用于化妆品中也能展现出良好的舒缓作用。
分别将本发明其他的实施例1-12、实施例14-18制得的发酵油也用于面霜中，得到的面霜的舒缓、紧致功效均与上述应用例3的面霜的功效相当。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种发酵油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将神经酰胺、乳化剂和植物油脂混合，搅拌，得到油相；
S2、将所述油相、发酵菌株、培养基和水混合，搅拌发酵，得到所述发酵油；
所述乳化剂包括胆甾醇、植物甾醇类、油菜甾醇类、野大豆甾醇类中的一种或多种；
所述植物油脂包括葡萄籽油、植物角鲨烷、山茶籽油、油橄榄果油、沙棘果油、鳄梨油中的一种或多种；
所述发酵菌株包括酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母中的一种或多种，所述发酵菌株的浓度为105-109CFU/mL；
所述神经酰胺、所述乳化剂和所述植物油脂的用量比为1g:1g:(10-100g)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述神经酰胺包括神经酰胺EOP、神经酰胺NS、神经酰胺NG、神经酰胺NP、神经酰胺AS、神经酰胺AP中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述混合的温度为25-90℃，所述搅拌的速度为30-250rpm，时间为3-40min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相、所述发酵菌株、所述培养基和所述水的用量比为1g:(0.01-10mL):(0.1-200g):(1-1000g)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述搅拌发酵的搅拌速度为30-250rpm，发酵温度为25-45℃，发酵时间为12-120h。
6.一种发酵油，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的制备方法制备而成。
7.权利要求6所述的发酵油在制备化妆品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述化妆品的剂型包括霜剂、乳液、水剂、凝胶、面膜或洗剂中的一种；所述发酵油在所述化妆品中的含量为0.01 wt%-95wt%。
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