JPS59196091A - 固定化蛋白複合体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質の固定イＦ：（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ　）に関する。特定の特徴として本発明は、酵
素の固定化′に関する。

本発明の背景 「蛋白質Ｊ　（ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）の語には、酵素、
補足因子（ｃｏｆａｃｔｏｒｓ　）、補足因子類似物、
変更遺伝子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ　）およびかような性質
の他の物質を含む多数の生理学的に活性な、ならびに化
学的に活性な物質が含まれる。

これらの物質の多くは、特に酵素は、立体特異性の還元
、酸化、異性化、特定の分解、錯体合成などのような多
くの異積の型の反応を促進させる能力がある。大部分の
通常の無機触媒と異なり、この蛋白質型物質は、一般に
比較的水溶性であり、また比較的不安定であり、しばし
ば水性溶液中の遊離成分として１回だけ使用される。か
ような物質の経済的な使用は、比較的高価な蛋白質成分
の回収、再循環および再生の方法が利用できるか否かに
かかつている。

従って、前記の蛋白買物質を固定化し、酵素または他の
蛋白質を多重または繰返し使用ができ、そして、反応溶
液からその活性な蛋白質を取除くことによって反応を迅
速に停止させるか、またはこの逆が′できることは有利
であろう。多くの場合、固定化形態に安定化されている
酵素は、はるかに長い活性寿命を有する。処理されるべ
き成分を含有する溶液は蛋白質によって汚染されないた
め、分離の必要性が減少する。特に分析用としての目的
には、これらの蛋白物質、特に酵素は長い半減期を有す
るので試薬調製を減少させる。

担体を利用しない架橋、担体内または担体の表面での架
橋、担体への共鳴原子価結合、担体上または担体内への
収着および封入または閉じ込め（ｅｎｔ；ｒａｐ　’）
　　のような多種類の固定化法が最近提案されている。

米国特許明細置薬３，９１２．５９３号には、一方法と
して、水性媒質中において窒素含有物質とスズ、鉄、バ
ナジウム、チタンまたはジルコニウムのような金属の含
水酸化物または含水水酸化物とを混合して、その窒素含
有物質の固体金属キレートを形成する方法および現場で
形成する方法が教示されている。しかし、発明者は、前
記特許に教示されている特定の含水物質は必ずしも満足
のものでないことを見出した。信頼性に対する改善が明
らかに必要であった。

発明者は、現場で製造したアルミニウム、ガリウムまた
はインジウムから選ばれた金属の含水酸化物または水酸
化物を使用して酵素のような活性蛋白質を前記の含水金
属酸化物または水酸化物中に効果的に配合（１ｎｃｏｒ
ｐｏｒａｔｅ　）させうることを発見した。

酵素のような活性蛋白質の配合は、アルミニウム、ガリ
ウムおよびインジウムの中から選ばれる、好ましくはア
ルミニウムの水浴性第１Ａ族金属塩、の水性溶液を蛋白
質の溶液または分散体に徐々に添加し、その間、分散体
のＰＨを狙白質と金属酸化物または水酸化物との共沈に
好適な水準および蛋白質の安定性に好適な水準に維持で
きるように同時にアルカリ性溶液を添加することによっ
て得られる。得られた含水デル／蛋白質を分離、乾燥し
、適箔な粒度に粉砕してもよい。

得られた生成物は、有用な、安定、かつ極めて活性であ
り、長い貯蔵寿命を有する。第１Ｂ族金属の亜鉛の酸化
物または水酸化物に比較すると、発明者の組成物および
方法が優秀性を示す。第■族金属の鉄の水酸化物との比
較でも、発明者の生成物および方法が優秀性を示す。

発明者が確認した限りにおいては、周期表の第１１１Ａ
族のアルミニウム、ガリウムまたはインジウムを使用し
てゲルと蛋白質との同時沈殿および乾燥によって、乾燥
粉末の金属酸化物／蛋白質の均一な複合体を以前に製造
した者はいない。この生成物は、活性で、水に不溶性で
あり、長い貯蔵寿命を有し、測定、調剤、使用が容易か
つ簡易に行える。製造および分離に比較的苛酷な、手荒
い処理が含まれているにも拘らず最終的の蛋白質の乾燥
複合体が高い活性を保留していることは実に驚ろくべき
ことである。

本発明の詳細な説明 本発明によれは、（ａ）、酵素のような所望の活性蛋白
質の溶液または分散体を水、好ましくは蒸留水または脱
イオン水で形成する。蛋白物質の特定の例には、アルコ
ール　オキシダーゼ、カタラーゼ、グルコース　オキシ
ダーゼ、グルコース　イソメラーゼ、ラクターゼ、イン
ベルターゼ、α−およびβ−アミラーゼ、ゾルラナーゼ
、ペニシリン　アシラーゼ、バクテリア　プロテアーゼ
　トリジシン、キモトリプシン、グルコアミラーゼ、デ
キストラナーゼ、グルコシダーゼおよびマキサターゼ（
Ｍａｘａｔａｓｅ　）　（商標）のような酵素；コンカ
ナバリンのようなレクチン；卵胞刺戟ホルモン放出因子
、黄体化ホルモン放出因子、向副腎皮質性ホルモンのよ
うなホルモン放出因子；卵胞刺戟ホルモンおよび黄体化
ホルモンのようなホルモン（蛋白質）；抗肺炎菌血清中
の抗体および種々のγ−グロブリンおよびペニシリン、
グラミシジンＤ、微生物シ　ラスメンシス（Ｓ　、　、
ｌａｔｈｕｍｅｎｓｉｓ　）の生成するラスマイシン、
ネオマイシン、ポリミキシン、ストレプトマイシン、ア
ミシリンおよびクロロアンフェニコールのような抗生物
質；二：’チン酸アミドアデニンヌクレオチド（ＮＤＡ
　）および還元ニコチン酸アミドアデニンヌクレオテッ
ド（ＮＡＤＨ）のような補酵素；パン酵母、大腸菌、吃
チア　パストリイス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
　）などのような全細胞（Ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　）−
が含まれる。

本発明による第１１１Ａ族金属のゲルは、周期表の第１
１１Ａ族のある種類の金属、特にアルミニウム、ガリウ
ムまたはインジウムの適当な水溶性金属塩から形成され
る。アルミニウム塩が入手し易すさおよび取扱が容易な
ため好ましい。

水中の蛋白物質の水性溶液または分散体のこの（ａ）に
、（ｂ）第１Ｂ族金属塩の活水溶性溶液および（Ｃ）。

第１Ａ族アルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウ
ム、好ましくは水酸化ナテリウムまたは水酸化アンモニ
ウムの希溶液を含有する強アルカリ性水性溶液を、攪拌
混合物（ａｂ−）のＰＨを第■Ａ族含水金属酸化物また
は水酸化物と蛋白質とを共沈させるのに有効な範囲内に
維持するのに十分な量で攪拌しながら同時に添加する。

発明者の方法では、第１１Ａ族含水金属酸化物または水
酸化物と蛋白質とが共沈した、比較的均一な複合体のサ
スペンションが生成される。この含水ｒル／蛋白質は遠
心分離、濾過などによって分離される。湿った物質を乾
燥させて、乾燥した概して顆粒状の複合体を形成する。

この乾燥複合体は、触媒用途などのような種々の目的に
都合良いような寸法にすることができる。

本発明の範囲内で使用することができる金属塩は、硝酸
塩、酢酸塩、塩化物、臭化物などのようなアルミニウム
、ガリウムまたはインジウムなどの水溶性塩であり、現
在のところアルミニウム塩が好ましい。最大の生゛物学
的活性を得るためには、窒素含有有機物質、アルカリ性
溶液および金属塩の混合は、二酸化炭素、炭酸塩、炭酸
水素塩、および金属イオンをキレート化しうるキレート
化イオン（例えばクエン酸塩）の実質的に不存在におい
て行うべきであり、窒素含有有機物質のキレ−ト化は、
含水金属酸化物または水酸化物の性質を不利に変性して
しまう。

第ＭＡ族金属塩の水性溶液は、その金属塩の約１〜１０
重量％までの濃度、好ましくは約６〜８重量係の範囲内
に調製すべきであるが、所望ならばその塩の濃度を飽和
濃度までも使用できると考えられる。

強アルカリ性の薬剤は、水性水酸化アンモニウムまたは
第１Ａ族アルカリ金属水酸化物であるが現在のところ好
ましいのは大規模使用に便利で経済のため水性水酸化ナ
トリウムである。このアルカリ性溶液は、単にうすい溶
液を多く使用するか強い浴液を少なく使用するだけで濃
度を変えることができるが、便宜上約ｏ、１〜１Ｎが好
適である、しかし、５０重量％までの水性水酸化ナトリ
ウム溶液が使用できる。

固定化蛋白質を製造する発明者の方法によれば、蛋白質
含有溶液は約５０〜５００［］酵素単位／ｄの広い範囲
、さらに通常には約２００〜４０００酵素単位／７１Ｉ
ｌを含有するように調製できる。

蛋白含有溶液または分散体（ａ）に実質的に同時に（ｂ
）、約１〜１０重量％の金属塩の希溶液および（Ｃ）。

アルカリ性浴液を添加する。金属塩溶液とＰＨ調整用薬
剤の同時添加によって、含水金属酸化物または水酸化物
としての金属と蛋白質との膠質状沈殿物が形成される。

得られるゲル状生成物を剪断したり、破壊しないで含水
金属酸化物と蛋白質との共沈および収着ができるよう水
性混合物の攪拌を十分に緩和にして前記の反応体を導入
することは言うまでもない。

その過剰な水性液体は、減圧ストリッピング、凍結乾燥
およびデカンテーション、濾過などに続く遠心分離によ
って除去する。

かように単離されたゲル状反応塊を好ましくは洗液に実
質的に電解質が無くなるまで蒸留水で洗浄する。

洗浄した含水ゲルマトリックスは、例えば減圧で周囲温
度において、または慣用の乾燥炉内で約４０°〜７０℃
の温度で好ましくは突気循環を行って乾保させる。

得られた生成物は乾燥ゲルマトリックス中に均一に分散
され、かつ保護されている乾燥固定化蛋白質である。こ
れは、所望によって、蛋白質を損傷したりまたは活性度
を著しく損わないように粉砕、篩分して均一な粒度にす
ることができる。

凝集または変性のような蛋白質に対する起りうる損傷の
影響を避けるために、水性金属塩溶液またはアルカリ性
溶液のいずれでも単独に添加したり他の溶液の前に添加
してはならないことに留意すべきである。

発明者の発明の特別の利点は、ｉｊＪ記の蛋白（例えば
酵素）製剤に各種の添加物を容易に混合できることであ
る。例えば、アジ化ナトリウムのような安定剤を永住蛋
白質溶液／分散体に混合させ、沈ＩＲ））＋ルの部分と
することができる。着色剤も同様に使用することができ
、これによってケゝルを色分けすることができる。特定
比率の酵素の混合物が使用でき、乾燥蛋白質ゲル内にお
いて安定した醇者の特定比が得られる。

章明者は、酵素特にアルコールオキシタ−セ酵素を使用
して本明細書で本発明の方法を以後説明する。しかし、
この酵素を使用するのは当業者に本発明をさらに理解し
て貰うためのものであって本発明を１酵素または特定の
酵素に限定するものではないことを理解されたい。かよ
うに、実施例における実験ではビチア　バス）　ＩＪス
の生成したアルコールオキシダーゼで論議する。これは
代表例として使用するがこの酵素は高活性であり、現在
のところ好ましいアルコールオキシダーゼである。

現在のところ好ましいアルコールオキシダーゼは、ピチ
ア（Ｐｉｃｈｉａ　）　　属の微生物および発生学的お
よび（または）分類学的に密接にピチアに関連する微生
物を含むメタノールを利用するビチアー型微生物から得
られる。かようなメタノールをオＵ用するピチア酵母の
特定の例には：ビチア　生ストリス　ピチア　ピヌス（
Ｐ、　’ｐｉｎｕｓ　）ビチアまれる。

アルコールオキシダーゼは、薬品および生物学的製剤商
社から開業的に入手できる。しかし、好ましい態様に′
おいては、アルコールオキシダーゼは、選定した微生物
による醗酵、これに続いてアルコールオキシダーゼの分
離によって得られる。

アルコールオキシダーゼ（アルコール：　酸ｘ酸化還元
酵素）は、ビチア　パストリスから透析沈殿法を使用し
て可溶性形態または結晶させて純尿を上げて単離できる
。かような酵母は、その全蛋白質の約２０％をアルコー
ルオキシダーゼとして含有する。醗酵槽から採取した細
胞のサスペンションをダイノミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ　
）ガラス−ビーズミルで均質化し、得られたアルコール
オキシダーゼを含有する上澄欧から遠心分離によって細
胞破片から分離することによって酵素を単離できる。

約２００〜３０．０酵素単位（ｅｕ　）　／ｒｎｌを含
有する上澄液をｐＨ６，５に調整し、１０答積の水に対
して透析することによりさらに処理する。粗酵素溶液の
モルイオン濃度が好適に減少したとき、アルコールオキ
シダーゼの沈殿が形成される。この沈殿は、前記の上澄
液中に存在した酵素単位の８０％以上を含有し、はぼ９
５ｑ６の純度のアルコールオキシダーゼである。

ピチア　パストリスからの比較的高い酵素活性を有する
前記の上澄液（２００〜３００　ｅｕ／ｍＡ、）は、ま
た大量のカタラーゼも含有する、この酵素は２モルの過
酸化水素を１モルの酸素ガスと２モルの水とに急速に不
均化させる。アルコールオキシダーゼは、ピチア　パス
トリスから種々の純度で得られる： （ａ）　　全単一細胞蛋白質サスペンション：アルコー
ルオキシダーゼおよびカタラーゼの両酵累が細胞膜を通
過する拡散によって長期間に亘って得られる。

（１））　　破壊された細胞のホモシュネート（ｈｏｍ
ｏｇｅｎａｔｅ　）　ニ ーｉｆｆの細胞質破片を伴ってアルコールオキ−シダー
ゼおよびカタラーゼが溶液として得られる。

（Ｃ）　　（ｂ）の遠心分離後の上澄液：細胞を含まな
い上澄液は、アルコールオキシダーゼおよびカタラーゼ
を含む比較的高い酵素活性（２００〜３００　ｅｕ　７
’ｖｉｌ　）を含有する。

（ｄ）　　（Ｃ）の透析による高純度のアルコールオキ
シダーゼ： 約９５％の純度の沈殿アルコールオキシダーゼは上記上
澄液の酵素活性の８０チ以上になる。

一般的に、アルコールオキシダーゼの調製の好ましい方
法においては、メタノールを利用する微生物を使用し、
炭素エネルギー基質としてメタノールの醗酵によってア
ルコールオキシダーゼ活性を有する細胞の水性サスペン
ションが調製される。

この細胞の水性サスペンションは、以後「アルコールオ
キシダーゼ製法■」またはｒ　ＡＯＰ　Ｉ　Ｊと呼ぶが
細胞膜を通しての酵素の拡散によって比較的長期間に亘
ってアルコールオキシダーゼ活性を現わす。

細胞の水性サスペンションは、均質化してアルコールオ
キシダーゼ活性を有するホモシュネートになる０以後こ
れを「アルコールオキシダーゼ製剤■」またはｌ’−ｈ
ｏｐ旧と呼ぶ。

かようなホモジエネ−１・から懸濁固体を遠心分離、濾
過などによって除去できる、そして、得られた細胞を含
複ない流体は、アルコ−にオキシダーゼ活性を有する粗
浴液として使用でき、以後これを「アルコールオキシダ
ーゼ製剤１」または１’−ＡＯＰＩＪ　　と呼ぶ。

結晶性の、電気泳動的に純粋なアルコールオキシダーゼ
は、限外濾過、または透析もしくは他の方法によってｌ
”ＡＯＰｉＪから調製できるが現在のところ透析が好ま
しく便利である。これを「アルコールオキシダーゼ製剤
■」または「ＡＯＰ　Ｗ　Ｊと呼ぶ。

Ｈ２Ｏ２−ａｌｌ生物が望ましくないと考えられる多く
の応用において、カタラーゼ酵素も存在することは望ま
しいことである。

アルコールオキシダーゼとカタラーゼの組合さった酵素
の触媒による正味の反応効果は、遊離酸素の効果的な一
掃および副生物のＨ２Ｏ２の水への転化である。

アルコールオキ７ダーゼ製剤１’−ＡＯＰＩ’Ｊ、「Ａ
ＯＰ…」およびｒ　ＡＯＰ　Ｉ　Ｊの各々は、実質的の
カタラーゼ活性を有するので、本発明による組合せのア
ルコールオキシダーゼとカタラーゼを使用するときは新
たにカタラーゼを添加する必要はない。

結晶性アルコールオキシダーゼ「ＡＯＰ　ｌ’％）　Ｊ
は、しかし、実質的にカタラーゼ活性がないので、Ｈ２
Ｏ２の存在が問題でない場合は好ましい製剤である。あ
るいはまた、カタラーゼまたはパーオキシダーゼのよう
な若干の他の適当な酵素も所望ならばｌ’−ＡＯＰ　Ｉ
ｖＪに添加できることはもちろんである。

実施例。

本発明をさらに理解する一助として実施例を示す。使用
する特定の櫨、条件などは代表例と見做すべきであシ、
実施例および特許請求の範囲を含む不明＃Ｉ脅中に開示
されている発明者の発明の合理的な範囲を限定するもの
ではない。

本発明の実施例において使用するためのアルコールオキ
７ダーゼの無細胞の上澄０．は、ビテア型酵母、さらに
詳しくはピチアパストリス種を使用し、炭素エネルギー
基質としてメタノールを１更用し、水性好気性醗酵乗件
丁で運転されている水性好気醗酵法ρ・らの醗酵槽流出
液から単離したものである。得られた酵母細胞を、遠心
分離によって水性嵌酵体から分離した。

本発明に１史用するためのアルコールオキシダーゼの無
細胞の上澄液を醗酵槽流出液から”単離した。

前記の流出液のＰＨを約７．５に調藍し、０”６ｔの容
器を用いダイノミル（開襟）モデルＫＤＬを使用し、５
〜６０℃、ベルト組合せす３、流量２０〜３０１ｎｌ　
／時間による連続運転で１００〜１２０ｇ生物体ｉＡ（
乾燥■量）／１のような高紬胞督朋において均質化した
。遠心分離によってホモジエネート固体を分離して、ア
ルコールオキ７ダーゼ、カタラーゼおよび他の０Ｔ浴注
蛋白質を含有する無細胞の上澄液を得た。この上げ液は
、２００〜３００ｅｕ／ｒｎｌの程度を含有した。この
場合の酵素単位（ｅｕ）トハ、１分間に１マイクロモル
のメチルアルコールを、１マイクロモルのホルムアルデ
ヒドに転化するのに必要な酵素の途である。

屯気泳動的に純粋な結晶性アルコールオキシダーゼは、
無細胞の上澄液の透析によって得た。可溶性アルコール
オキシダーゼを含有する徂浴７疼ヲ、アルコールオキシ
ダーゼは不透過１生であるが、水、緩衝剤および無機分
子は透過性である膜を介して佐仇媒質に対して透析した
。使用する膜の揮頑は！＋λ犬ではない。例えば市販と
して入手できる酢はセルロースチューブは、透析袋の形
成に使用でき、または中空繊維透析セルも使用できる。

アルコールオキシみ−ゼを含有する溶液は、例えば水ま
たは緩衝溶液のような透析媒質に対して透析でき、これ
によって膜の酵素側では０．０５〜０．０１Ｍの間の回
収範囲のイオン濃度を有する回収範囲の溶液が得られ、
これによって′亀気泳動的に均質な結晶性アルコールオ
キシダーゼを沈殿させることができる。

あるいはまた、全ｊｇｔｌｌ　＠を含有する醗酵槽流出
液を、発明者の方法で処理して、例えば水性アルコール
浴液から溶存酸素の除去の促進用として仔用な固定化全
＃ＢＩＭＪ　ｔｌｊ素含有系（Ｓｙｓｔｅｍ　）を得る
こともできる。、圃胞破片を含有するホモジエネートも
同様に不発明の方法によって処理して、例えば水−アル
コール混合物から溶存酸素の除去を促進するために何月
な付加的の固定化酵累含仔糸が得られる。

実施例■ 不笑験では、アルミニウムデルで固定化したアルコール
オキシダーゼ糸の、水性メタノール浴液から溶存酸素の
除去の促進用としての有効性を証明する。固定化アルコ
ールオキ７ダーゼ糸は、無、咄Ｊ」己の上澄液（前記に
定−跳した）を、水性水酸化す）　ＩＪウムを使用して
約６〜７の範囲内にＰＨを維持して硝酸アルミニウム６
孜と接触させて製造した。

「ｐＨ５Ｊ（ｌビチア」ホモジエネート上液液）の試料
４５０　ｍｌを、マグネチツクスターラーバー牙６よび
ＰＨメータを備えている１ｔリビーカーに入れた。前記
のｌ’−ＰＨ８Ｊ試料は、約６７１酵素単位（ｅｕ）　
／　Ｉｕｔ；　（全４５　［１Ｉｕｔ３の試料の活性度
１６７．０ＤＤｅｕ　）　（アゾ化ナトリウみなし）。

水゛圧硝歌アルミニウムＣ６６ｆｉ　Ａｔ（ＮＯｓ）ａ
’ｓ’Ｈ２０／　５５　［］＋ａＡＨ２０］（１フロミ
リモルＡ７＋３　）の試料を分液１斗に入し、アルコー
ルオキツタゝ−ゼ、カタラーゼおよび１ワシの水浴性蛋
白質を倉荷する攪拌している水性混合物にン゛薗下で小
加した。この絖加の間、混合物のｐＨを監視し、水性水
酸化ナトリウム浴液（４０９ＮａＯＨ／　１　ｔＨ２０
）のｌ丙下小加によって約６．６〜７．１のＰＨ範囲に
維持した。沈殿は硝ばアルミニウムの龜加のＩＮＦを〕
瓜して就いた、そして、最長ｐＨの航みは約６．９であ
った。

前記の沈ＮＧヲフリットガラスデフナー漏斗で吸引濾過
して睡別し、脱イオン水で繰返し洗浄して透明な黄色確
漱を得た。ノ虱乾した沈殿物は約４８Ｉであった。この
４８．９の試料を乳鉢中で乳棒で粉砕し、粉末固体を得
た。ナ１０メツシュスクリーンパス、−４２０メツシユ
スクリンにｍ　マったこの固体は約５１．８ｇであった
。

この粒度なそろえた固体試料２０．！ｌｋ青状フロー反
応器に詰め、分子状酸素を飽オロさせた（約８−６　ｐ
ｐｍ　０２　）水性の流れで、１ｌ−１：！＞ｚｔ％の
メタノールを含＠する流れ力・ら浴存敵素の除去を促進
する効果を確めた。営状反応器からの流出液は、浴存眩
素プローブアセンブリー（ｐｒｏｂｅ　ａｓｓｅｍｂｌ
ｙ）で連続的に浴存酸素を監視した。水を約４〜１０ｍ
Ｅ／分の範囲内の速度でボンダで流れ系統に通した。

前記の流出液中の浴存ポ素一度は、長時間に亘って低水
準に維持されたことは、この固定化アルコールオキ／ダ
ヨゼ糸の長Ｊ９１間竹効性乞明らかに証明したものであ
る。例えは約１０日間、浴存戚索水準ハ、８３．７３５
’　ｍ１３の流出液で約Ｏｊ、５　ｐｐｍ浴存（疲系に
維持された。

この方法を数日間中晰した。本発明の固定化１素バッキ
ングは、この方法の再開始後に２いても水−メタノール
流からの温存酸素の除去の促進に１′古注を維持した。

水流の再開始後の反応器流出ｉ夜の沼存酸素嬢度は、約
１０日間約０．５　ｐｐｍ阪素に維持され、追加の処理
量は約６６．６ＣＪＯｄであった。この実験によってこ
の方法は中ｍｌ心・ムエ寵で、丹１ｍｌ始も良好にでき
、しかも固建化岬系はその活性を維持していることを砒
明してい金。

′史施トｌ■ この比較実験では、６〜７のＰＩ−１帷囲において燕泊
り砲の上澄ｌ仮ＣｌＰＨ３Ｊ　）と水Ｖｉ硝酸鉄（ＩＩ
Ｉ）浴液とを１妾触させて固定化アルコールオキ／ダー
ゼ試料の・煤法を示゛１−６ ２５ｍ１のＰＨ８試１）　（Ｃ１，［ｌ　２　重量ｑ６
すＮａＮ　３防腐Ｈす、全油Ｐ＋ｉ５４６３　ｅｕ　）
＆、５ＩのＦｅ（ＮＯ３）３゜’ｙ’　Ｈ２Ｏ’１５０
　Ｎ　Ｈ２ＯにｍＭ（１２，４ミリモ／ｌ／　Ｆｅ”）
して製造した水性硝酸鉄ｄ液で処理した以外は、実施例
１に記載の方法と本質的に同じ固定化方法であった。含
水沈殿物を吸引濾過で分離し、２００ａ部の脱イオン水
で４回洗浄し、ｊ虱乾した。

その風乾生成物は、常法の染料−パーオキ７ダーゼ検定
試験、詳細には、０−シアニンジンで緩薗した采科とセ
イヨウワサビ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ　）のパーオ
キ／り−ゼで、遅いが陽性のアルコールオキシダーゼ活
性ビ示したが、もろ＜、調定に、または効率的に使用で
きなかった。

実施例■ この比較実験は、６．４〜６．６のＰＨ範囲内で無細胞
の上置液（［ｐａｓＪ　）と水性硫酸亜鉛とを混合して
製造した固定化アルコールオキ／ダーゼ試料の製法を示
す。

コノ置屋化方法は、４７　ｍｌ　（’、）　ＰＨ８試料
（０，０２恵壜％　（’）、　ＮａＮ３防腐剤、全活性
度１０．５９８　Ｅｔｕ　）を、ｉｏ、ｐのＺｎＳＯ４
・７　Ｈ２Ｏ’ｌ　１００’ｌｌｌ’Ｈ２０に俗解（３
４，８ミリモルＺｎ”２）　して調製した水性硫酸亜鉛
浴液で処理した以外は実施例Ｉに記載の方法と不質的に
同じであった。得られた含水沈殿物を吸引濾過で分離し
、２５０酩部の脱イオン水で５回洗浄し、風乾した。こ
れらの洗浄からの濾液は、７／レコールオキンタ゛−ゼ
Ｃ古性を示さなかった。

前記の風乾生成物は、染料−バーオキ／ダーゼ検定試験
（例えば、０−ジアニンジン緩衝の染料およびセイヨウ
ワサビのパーオキ／ダーゼ）でほんの僅力）のアルコー
ルオキシダーゼ活性を示したに過ぎなかった。このわず
かの程１斐の７占１生度を工、この固定化試料を前記の
検定溶故と約２時間接触させた後の色の変化でイ芙出さ
れた。この実λ倹では、含水亜鉛ケゞルが蛋白質の成層
にシエ不４当であることを示している。

実施例■ この実験は、比叔的少量の薬剤乞１史用した以外は、実
施例１に記載の方法と本質的に同じである。

６０　ｍｌのＰＨ８試Ｎ　（０，０２ｔｉ　４％のＮａ
Ｎ３防腐痢：全話＝ｇ約２０．υ（Ｊ　Ｑ　ｅｕ　）　
ｋ、１１．２５ｉのＡＡ（Ｎｏ３）３・９Ｈ２０を１０
０　ｒｎｌ３　Ｎ２０中に俗解さぜた（６０ミリモルＡ
ｔ＋３）水１！＋：Ｓ液６Ｑ　ｒｎｌで、６．５〜７．
１のｐＨ馳囲内で処理した。得られた沈殿物を吸引濾過
によって分１艷し、２５０ｍ１部の脱イオン水で５回洗
紗し、風乾した。最初の濾液は、染料−オキシダーゼ、
検定で０．５　ｅｕ　／　ｒｎｌの活性度を示したが、
洗液中にはアルコールオキシダーゼ活性は無かった。

この風乾生成物８Ｉを、＋１０メツシユパス、ナ２０メ
ツシュ゛醒の物質を選んで粒度をそろえた。

この粒度なそろえた試料５ｇ’ａｊ、管状フロー反応器
に詰めて、０．１重量係のメタノールを入れた水流から
の溶存酸素の除去促進の活性度を確めた。

フロー反応器による結果では、前記の固定化酵素糸は、
４日間に亘って良好な活性度を保有した。

実施例Ｖ この実験では、硝酸アルミニウムの水性溶液とインベル
ターゼの水性溶液とを５．２〜６．０の一範囲内で接触
させることによる固定化インベルターゼの製法を説明す
る。この方法は、実施例Ｉに記載のものと同じであった
。

Ｐｉ−１５，０の酢ばナトリウム緩衝液中のインベルタ
ーゼ浴液（１２’　５．”２　ｅｕ　／　ｍｌ！　）　
’ｉ、５．２〜６．０のＰ）Ｉ範囲内で７．２．９　（
７Ｊ　ＡＡ（Ｎｏ３）３・９　Ｎ２０を６０１ｄの水に
溶解させた溶液（１９，２ミ’）モルＡｔ＋３　）で処
理した。得られた沈殿物を吸引螺退して取出し、８．９
ｇの固定化インベルターゼをペーストとして回収した。

この生成物を検定して、その活性度は、５０ｎ夕の試料
が２重量％の蔗楯水性溶液の１−アリコート中で１．４
２ミリモルのグルコースを生成することを確認した。

このペーストラ真空デシケーター中で破切に冷凍で、次
いで室温で乾燥させた。乾徹した複合体は、該複合体５
０〜．２０ｍｇおよび７　ｍ９を用いて２％水性蔗楯浴
液について試験したところ、谷々２重量％水注蔗糖浴液
ｉ　ｒｎｌ当り１．２〜１．３ミ！Ｊモルのグルコース
を生成する非常に高い活性度を示した。

実施例Ｖ１ この実、１涙では、約６〜７のＰＨ範囲内において水性
、朋側サスペンションとイ澗酸アルミニウムの水性浴液
とを接触させて酵母ａｍ含有のアルコールオキシダーゼ
の固定化試料の製法を示す。

ビ°テアパストリス酵母細胞の５［］ａサスペンシジン
をｉｓ、ｐのＡ１（ＮＯ３）３・９　Ｎ２０を１２５酩
の水に溶解させて製造した溶液（４１：１９モルＡ１　
＋　３　）で処理した。得られたゲル／細胞の沈殿物を
吸引濾過によって分離し、２５０１ｄ部の脱イオン水で
２回洗浄し、風乾して９．９９９の生成物を得た。

この風乾デル／細胞生成物は、染料−／（−オキシダー
ゼ法による検定試験で遅い陽性を示した。この遅い反応
は、恐ら（アルコールがアルコールオキ７ダーゼと接触
するまでに細胞膜を拡散しなけれはならなかったためで
あろう。この裏剤中に活性をカタラーゼが存在すること
は、前記の風乾試料の少量部分を水性過酸化水素中に入
れることによって確認された。恐らく０２であるガスの
発生は、反応Ｈ２Ｏ２→２Ｈ２０＋０２のカタラーゼに
よる促進の証拠である。

実施例ν■ これらの実験は、この固定化酵素系の洗伊濾液中の残留
酵素活性度’（ｌ−破小にするために、接触さぜろべき
硝酸アルミニウムと「ｐＨ５Ｊ（ｒビチア、ホモジエネ
ート上澄液）との相対量を示す。結果？第■表に要約す
る： 苦　ＰＨ８は［ビチアホモジエネート上澄液であル」ニ
アルコールオキシダーゼ活性度は２５９．２６ｕ／ｄ’
：カタラーゼ活性度はろ１４２ｅｕ／ｉ／Ｉｌであった
。

ａ、谷実験ではＰＨ８試料２５ｍ１を使用した（全アル
コールオキ／ダーゼ活１生度は５，９８０　ｅｕ。

全カタラーゼ活性度は７８，５５０　ｅｕでアラた）。

ｂ、これらの１直は、固定化酵素製剤の洗浄層液中ノア
ルコールオキシダーゼの概略の活性度を示す。

Ｃ９これらのｌ１ｉｔは、固定化酵素製剤の洗浄濾液中
のカタラーゼの概略の活性度を示す。

第１表の結果を参照すると、最初の全酵素活性度（ｅ’
ｕ）’：添加Ａｔ＋　３ミリモルが約ｉ　ｏｏｏ　：　
ｉの範囲に入るにつれて固定化酵素糸の洗＃濾液中の酵
素活性度はゼロに近づ（。ｅｕ／ミリモルＡ１＋３の比
が約１５４４（実験８）よシ太ぎ（なると１ｄ−液酔累
活性展は鋭く上昇１−る、例えは０．３３４ｅｕ　／　
ｍｌ　濾液から９．０４　ｅｕ　／　＋ｌＬｅ濾Ｍに肩
加する。

有効°な°固定化試料が得られた実施例■の実験におい
て、ＰＨ８試料中のｅｕ　’　：ミリモルＡＡ＋　３の
比は９　５　０　　：　　１　　（１６７，０００ｅｕ
　÷　１７６　ミ　リ　モルＡ１＋’３　）の大きさで
あることは興味あることである。この比は、洗浄婦液中
の酵素活性度がゼロになった実荻９および１０に示され
た範囲内であった。

データを含む本開示は、発明者の発明の価直および可動
性を証明してい心。本発明の分野の実施例、細繊、背景
および化学ならびに適用可能な科学の一般的原理が基瞳
となっており、この基礎から条件範囲および使用できる
成分の生物両群を含む不発明の広い記述事項が開発され
、そして、不明細簀に蘇付の特許請求の範囲の基礎を形
成している。

代理人　残材　皓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　アルミニウム、ガリウムまたはインジウムの
   金属酸化物／水酸化物の乾燥ゲルマ）　ＩＪラックス中
   分散させた蛋白質を含むことを特徴とする乾燥固定化蛋
   白複合体。 （２）前記の金属がアルミニウムである特許請求の範囲
   第１項に記載の固定化蛋白複合体。 （３）前記の蛋白質が、酵素である特許請求の範囲第１
   項または第２項に記載の固定化蛋白複合体。 （４）前記の酵素が、アルコールオキシダーゼ、カタラ
   ーゼまたは両者である特許請求の範囲第６項に記載の固
   定化蛋白被合体。 （５）前記の蛋白質が、全細胞である特許請求の範囲第
   １項または第２項に記載の固定化蛋白複合体。 （６）前記の全細胞が、ビチア　パストリスである特許
   請求の範囲第５項に言１載の固定化蛋白複合体。 （力　（Ａ）、（ａｌ、　　蛋白質の水性溶液／分散体
   、（ｂ）、第１Ａ族金属がアルミニウム、ガリウムまた
   ヲマインジウムである該第１［Ａ族金属塩の水性溶液お
   よび（Ｃ）。 前記の蛋白質および前記の第１［、Ａ族金属を、含水）
   ）−＋ルサスペンションとして共沈殿させ、該ｒルサス
   ペンションに前Ｍｅの蛋白質の少なくとも実質的部分を
   含有させるのに有効な割合の強アルカリ性溶液を実質的
   に同時に混合し、 （Ｂ）　　前記の含水デル／蛋白質を分離し、そして、
   （Ｃ’）　　該含水デル／蛋白質を乾燥させ、それによ
   って乾燥固定化ゲル／蛋白複合体を形成し、所望ならば
   、 （Ｄ）　　該乾燥複合体を粉砕して乾燥粒子複合体にす
   る ことを特徴とする乾燥固定化ゲル／蛋白複合体の製造方
   法。。 （８）前記のブルカＩＪ　１１溶液が、第ｉＡ族アルカ
   １ノ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの水性溶液
   である特許請求の範囲第７項に記載の方法。 （９）前記の金属塩の水性溶液１〜１０重量％を使用す
   る特許請求の範囲第８項に記載の方法。 α０）前記の第１Ａ族アルカリ金属水酸化物または水酸
   化アンモニウムの０．１Ｎ〜１Ｎ溶液を使用する特許請
   求の範囲第８項に記載の方法。 αＩ）　５０〜５０００酵素単位／　ｍｌｉの水性蛋白
   質を使用する特許請求の範囲第８項に記載の方法。 ０り　前記の第１１［Ａ族金属塩が、アルミニウムの塩
   である特許請求の範囲第７〜１１項に記載の方法。 （１３）前記の蛋白質が、酵素である特許請求の範囲第
   ７〜１２項に記載の方法。 α力　前記の酵素が、ピチアパストリスによって生成さ
   れたアルコールオキシダーゼである特許請求の範囲第１
   ３項に記載の方法。 α５）前記の酵素が、カタラーセ゛′である特許請求の
   範囲第１６項に舶載の方法。 １６１　　前記の蛋白質の水性分散体が、全細胞の水性
   分散体である特許請求の範囲第７〜１２項の任意の１項
   に記載の方法。 （１７）　　前記の第１Ａ族金属塩が、前記のアルミニ
   ウム、ガリウムまたはインジウムの酢酸塩、硝酸塩、塩
   化物または臭化物である特許請求の範囲第７〜１６項の
   任意の１項に記載の方法。