3
СО
til ел
9)
сл Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано при получении глюкозы из целлюлозы, такзке дл получени целлюлозы, исЪользуемой в качестве сорбента или носител дл иммобилизации разных веществ. Известен способ гидролиза целлюлозы смешиванием ее с одной из концентрированных кислот, например сол иой , серной или фтористоводородной вьц ерживаиием смеси в определенных услови х с последующей нейтрализацие кислоты и очисткой образовавшейс глюкозы от солей 3. Основным недостатком этого способа , преп тствующим использованию его в промышленности, вл етс загр знение продуктов гидролиза целлюлозы сол ми, дл очистки крторых необхоДИМЫ специальные очистные соорз ени Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ декристаллизации целлюлозы. По этому способу целлюлозу размалывают до частиц размером 1 мм и менее, размол смешивают с 80-85%-ным раствором фосфорной кислоты в соотношении 1 вес,ч. целлюлозы на 3-10 об.ч. фосфорной кислоты, в которой содержитс псзерхностно-активное вещество в количестве от 0,01 до 0,5 ч. на 100 ч. кислоты, после реакции к смеси добавл ют тетрагидрофуран, см шанный с водой в соотношении 30-100 на 1 ч. воды, в количестве 10-50 ч. растворител на 1 ч, кислоты, осадо углевода отдел ют, а раствор, содер жащий смесь фосфорной кислоты, тетр гидрофурана и воды, подвергают рект фикации дл повторного использовани 23. Недостатками известного способа вл ютс необходимость работы с бол шим объемом органического растворител и создани технологии регенера ции реактивов во взры обезопасном исполнении, потери органического растворител , достигающие 5-15 объе мов на 1 вес. ч. целлюлозы, а также необходимость использовани фторугл родного поверхностно-активного вещества дл снижени расхода кислоты за счет смачивани , что загр зн ет продукт токсичными фтористыми соеди нени ми, и необходимость размола це люлозного сырь . Целью изобретени вл етс упрощение процесса гидролиза целлюлозы. Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу гидролиза целлюлозы, включающему кислотную обработку целлюлозы, вьщерживание смеси и отделение нерастворившейс целлюлозы с последующим ферментативным гидролизом, обработку целлюлозы провод т смесью концентрированных фосфорной и серной кислот при их соотношении (3,5-50):1, смесь вьщерживают 1,5-4,5 ч при 30-50С и дополнительно обрабатывают водой при 2-lO°C. Способ осуществл ют следующим образом . 1 вес.ч. (в граммах) целлюлозы смешивают с 5-9 объемами, преимущественно 5 (в миллилитрах), смеси концентрированной фосфорной кислоты (ГОСТ 6552-80/7168-80, массова дол кислоты не менее 85%) и концентрированно серной кислоты (ГОСТ 420Д-77, массова дол кИслоты лежит в пределах 93,6-95,6%), вз той в соотношении (3,5-50):1, преимущественно (10-50):. Перемешивание провод т при 30-50°С в течение 1,5-4,5 ч. Доба:вка серной кислоты к фосфорной вызьшает умеренную и контролируемую деполимеризацию целлюлозы и образование в качестве промежуточного продукта водонерастворимого углевода, который после обработки водой на холоду становитс сильно набухаемым и хорошо фильтруемым. Благодар добавлению серной кислоты к фосфорной повьштаетс смачиваемость целлюлозы кислотой, благодар чему достаточно брать кислоты не более 10 объемов на 1 вес.ч. целлюлозы. После перемешивани к реакционной смбси добавл ют холодную воду, предпочтительно со льдом (температура 2-10°С), тщательно размешивают, фильтруют, дл промывки повторно добавл ют воду с последующим фильтрованием. Полученный нерастворимый продукт после промежуточной стадии высушивани или без нее подвергают ферментативному гидролизу. Возможность применени предлагаемого способа основана на том, что, как обнаружилось в ходе исследований действи кислот на целлюлозу, при определенных услови х на промежуточной стадии кислотной обработки получаетс продукт, способный давать зернистую, легко фильтруемзпо массу. 3 состо щую из частично деподимеризованной целлюлозы. Эта масса состоит из набухшего в воде полисахарида, в котором отношение воды к углеводу близко к величине 10:1, в котором растворенные в воде вещества (кислота ) быстро смешиваютс с добавлен ной водой. Этот набухший материал;. образуетс уже при добавлении 1 объ ма воды (со льдом) к 1 объему реакционной смеси и путем фильтровани можно отдел ть кислоту, концентраци которой достигает 30%. Образование такой частично деполимеризованной целлюлозы возможно только в присутствии добавок другой кислоты, например серной. Благодар этой добавке смешивание целлюлозы с кислотой улучшаетс , после выдерживани первоначально твердой смеси при ЗО-ЗО С она разжижаетс , что об легчает ее перемешивание и создает более полный контакт кислоты с целл лозой. Без добавки серной кислоты целлюлоза постепенно набухает в 10 объемах концентрированной фосфор ной кислоты, при этом образуетс резиноподобна масса, котора практически не смешиваетс с водой и, следовательно, отделение углевода от кислоты становитс невозможным. Отделить углевод от кислоты из ее смеси с концентрированной фосфорной кислотой добавлением воды можно толь ко в тех случа х, когда смесь этой кислоты с целлюлозой готов т при избытке кислоты, в 4-10 раз превьш1ающем используемые в данном способе. Частично деполимеризованна целлюлоза , полученна предлагаемым способом , не подвергаетс обратному процессу рекристаллизации, так как она становитс легко гидролизуемой под действием ферментов. Даже после вьюушивани , когда ее набухаемость в воде снижаетс , она сохран ет способность гидролизоватьс фермента ми. Пример 1 (контрольньй)|. 10 г хлопкового линта смешивают со 100 мл концентрированной фосфорной кислоты (отношение целлюлозы к кислоте 1:10) через 3 ч смесь превращаетс в упругую резиноподобную массу, котора после смешивани с 1 л воды сохран ет форму плотных, трудно растираемых комков резиноподобной массы.Материал не пригоден дл дальнейшей обработки. 654 П р и м е р 2 (котрольный). 5 г хлопкового линта смешивают с 35 мл концентрированной фосфорной кислоты и 15 мл 70%-ной серной кислоты (отношение целлюлозы к смеси кислот 1:10), оставл ют на 4 ч 20 мин. После этого добавл ют 20 мл холодной воды и перемешивают. До конца все размешать нельз , осадок имеет форму нефильтруемых хлопьев. После нескольких промывок водой с декантированием остаток кислоты нейтрализуют аммиаком. Из-за медленной диффузии кислоты из частиц осадка полной ее нейтрализации добитьс не удалось. Материал не пригоден дл дальнейшей обработки. Пример 3. 50 г хлопкового линта смешивают при 30С с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты 1:5), перемешивают 1 ч при 40С и 2 ч при 50°С. Добавл ют 50 г льда и 250 мл воды (), фильтруют, обрабатывают повторно водой и фильтруют, промывку повтор ют еще 3 раза. Остаток (вес гел 430 г) обрабатывают при и рН 5,0 50 г целловириди- . на ГЗх (соотношение субстрата и фермента около 1:1). Через сутки вс масса становитс жидкой, но трудно отдел емой от нерастворившейс части . Измерение восстанавливающих сахаров после трех суток инкубировани в супернатанте показало концентрацию Сахаров 7,5% (в глюкозных эквивалентах ), степень конверсии 70%. Пример 4. 5 г хлопкового линта смешивают при с 35 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты 1:10), перемешивают, вьщерживают 2 ч 40 минут при 50°С, обрабатывают 50 мл холодной воды (10°С), фильтруют, промывку водой повтор ют еще 3 раза получают 50 г набухшей в воде, целлюлозы в виде рассьтчатой темно-серой массы. К ней добавл ют раствор 1 г целловиридина ГЗх (соотношение фермента и субстрата около 1:5) в 4,5 мл воды и инкубируют при рН 4,5 в течение двух при 40°С. Получают сироп с концентрацией 4,1%, степень конверсии 46%. Дополнительное вьщерживание осадка при 40°С в течение 6 дней дало сироп с концентрацией восстанавливающих Сахаров 8,2%. Пример 5. Юг линта смешивают с 50 мл концентрированной фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты около 1:5) ппи 15-17С. Перемешивают 1,5чпри40°С, добавл ют 50 г льда и столько же воды (), тщательно перемешивают, фильтруют на воронке Бюхнера с бумаж ным фильтром, промывку водой повтор ют , после нейтрализации набухшую целлюлозу высушивают на воздухе, по лучают 9,3 г препарата. 2 г этого препарата и 1 г целловиридина ГЗх (соотношение фермента и субстрата 1:2) смешивают с 5 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 5,Оуинкубируют при ЗОС в течение 2 сут, в супернатанте .получают концентрацию восстанавливаю щих Сахаров 8%. В примерах 3-5 полностью исключены предварительное размельчение целлюлозы , добавки поверхностно-активных веществ, а также использование органического растворител . Примерб. 50г линта смешивают при 25-30с с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты (со отношение целлюлозы и кислоты около 1:5), перемешивают 1,5 ч при 30°С и еще 3 ч при , после чего смешивают с 10 л воды, супернатант (око ло 9 л) декантируют, а остаток фильт руют, нейтрализуют, до рН 5-6, высушивают на воздухе при 60-80°С, получают 46 г темного порошка. Пример ы 6а, 6б, 6в. 2 г пр парата, полученного в примере 6, и целловиридин ГЗх (см.таблицу) смеши вают с 8 мл О,1 М ацетатного буфера рН 5,0, инкубируют при 50°С в течение 2 сут., измер ют концентрацию восстанавливающих Сахаров в суперна танте. Пример 6г. 2г препарата, . полученного в примере 6, смешивают с 8 мл раствора 0,1 г целловиридина ГЗх (активность 77 ед/г по бумаге) И 0,01 г пектофоетидина П10х (активHoCTb ПГА/В 28 ед/г, целлобиазна 143 ме/г), в О,1 М ацетатном буфере рН 5,0. Набухший объем превьш1ает 6 мл. Смесь инкубируют без перемешивани 1,2 и 5 сут при 50°С. Получают сиропы с концентрацией 2,2; 3 и 5,3%. В последнем случае измер ют также концентрацию гёксоз антроновым методом в супернатанте, она равна 5,3%. Следовательно, все гексозы в последнем случае вл ютс глюкозой. Таким образом, предлагаемый способ получени продуктов гидролиза целлюлозы позвол ет упростить технологию процесса, получать глюкозные сиропы и целлюлозу в виде хорошо фильтруемого и набухаемого материала , пригодного дл использовани в качестве сорбентов и носителей иммобилизованных веществ, а также исключить стадию размола целлюлозы, применение поверхностно-активных веществ и полностью исключить стадии обработки органическим растворителем и регенерации растворител .