SU499813A3 - Способ получени водонерастворимого ферментного препарата - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

1

Изобретение относитс  к области микробиологии , в частности к получению ферментных препаратов повышенной активности из ненициллинов.

Водонерастворимые ферментные препараты получают из фермента пенициллин-ацилазы; водонерастворимого абсорбирующего материала , предпочтительно из структурированного полиакрилата, содержащего свободные карбоксильные группы; водорастворимого диальдегида , например глутарового; алифатического диамина, предпочтительно а, ы-диаминоалкана с 2-10 углеродными атомами. Указанные ферментные препараты обл.адают повышенной активностью при получении 6-аминопенициллиновой кислоты.

Известен способ получени  водонерастворимого ферментного препарата путем смещени  в водном растворе водонерастворимого абсорбирующего материала с пенипиллин-ацилазой и диальдегидом, отделени  твердого осадка и его промывки. Однако в известном способе выделение фермента из реакционной смеси затруднено: Способ пе обеспечивает также высокого выхода 6-аминопенициллиновой к: слоты и имеет невысокую степень новторного использовани  ферментного препарата при последующих (периодических) реакци х получени  этой кислоты. Дл  повышени  стабильности и эффективности действи  препарата предлагаетс  абсорбирующий материал, пепипиллпн-ацилазу и диальдегид дополнительно смешивать с алифатическим диамином, предпочтительно а, мдиаминоалканом с 2-10 атомами углерода.

Абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой, а затем к смеси последовательно добавл ют диальдегид и диамин; абсорбирующий материал смешивают с ферментом ацилазой и диамином, а затем к смеси

добавл ют диальдегид; абсорбирующий материал смешивают с диамином и диальдегидом, а затем к смеси добавл ют пенициллин-ацилазу .

Каждое из веществ, диамин и диальдегид,

добавл ют в количестве 0,01-20 ммоль/г абсорбирующего материала в мол рном соотношении диамина и диальдегида от 1 : 0,1 до 1 : : 40, предпочтительно в интервале от 1:1 до 1 : 10. При этом диамип добавл ют в количестве 0,1-5,0, предпочтительпо 0,2-2 ммоль/г абсорбирующего материала. Диальдегид добавл ют в количестве ОД-10, предпочтительно 2,5-5,0 ммоль/г абсорбирующего материала . Способ осуществл ют следующим образом Фермент ацилазу получают предпочтительно от бактерий, нанример штаммов Эшерихиа коли, дл  использовани  при расщеплении бензилпенициллина до 6-аминопенициллиновой кислоты или, например, из грибков и акцитомицетов дл  расщеплени  феноксиметилпенициллина . Предпочтительным водорастворимым диальдегидом  вл ютс  глиоксаль или глутаровый альдегид. В качестве абсорбирующего материала используют порошкообразную целлюлозу и ее производные, ионообменные смолы, силикагель и другие полимерные материалы. Предпочтительно использовать структурированные полиакрилатные или полиметакрилатные смолы , например, в макросетчатой форме, то есть при высоком соотношении удельной поверхности к весу. В качестве водонерастворимого адсорбента примен ют тонкоизмельченный полимерный материал с достаточной поверхностью дл  получени  водонерастворимых ферментных препаратов высокой удельной активности, при этом поверхность возрастает по мере уменьшени  размеров частиц абсорбента. В случае структурированных поли-(мет)-акрилатов частицы смолы могут иметь средний размер 0,6 мм, а удельна  поверхность смолы достигает 450 . По мере уменьшени  размеров частиц повышаетс  эффективность реакции сочетани , а также удельна  активность целевого водонерастворимого ферментного препарата . Из алифатических аминов предпочтительно использовать а,(й-алифатический диамин с пр мой цепью из 2-10 углеродных атомов, например 1,3-диаминопропан или 1,6диаминогексан . Ферментный препарат получают в водном растворе при рН 5-9. Водонерастворимый абсорбент сначала контактирует с ацилазой в присутствии диамина, а затем - противоточно с диальдегидом и алифатическим диамином. В этом случае фермент абсорбируют в присутствии диамина в количестве 0,1-5, нредпочтительно 0,2-2 ммоль/г абсорбента, и диальдегида в количестве 0,25-10,0, предпочтительно 2,5-5,0 ммоль/г абсорбирующего материала. Дл  исключени  реакции избыточного альдегида по окончании реакции копул ции смолу с ферментом промывают раствором метабисульфита натри , алифатического диамина, мочевины или глицина. Стабильность фермента - смолы определ ют инкубацией водонерастворимых ферментных препаратов, увлажненных буферным раствором при рН 7,8 и 37°С. При отсутствии стабилизирующего действи  субстрата или продуктов быстро увеличиваетс  потер  активности фермента. Ферментные препараты более высокой стабильности получают путем предварительной обработки абсорбента смесью диамина и диальдегида с последующей абсорбцией фермента ацилазы. При этом диамин и диальдегид используют в количестве 0,, предпочтительно 0,1 -10 ммоль/г абсорбента, а мол рное соотношение диамина и альдегида должно быть от 1 : 0,1 до 1 : 40, предпочтительно от 1 : 1 до 1 : 10, при рН 4-9. При оптимальных услови х стабильность ферментного препарата достаточна дл  проведени  50 или более последовательных расщеплений пенициллина. Активность фермента после абсорбции на субстрате повышаетс , например, при использовании в качестве последнего структурированной поли-(мет)-акрилатной смолы, если фермент предварительно обрабатывают моноили диальдегидом, например формальдегидом или глутаровым альдегидом при концентрации 0,5-5% и рН 5-8 в течение 2-24 ч з случае формальдегида и при концентрации 0,01-0,5% и рН 5-8 в течение 2-24 ч в случае глутарового альдегида. Такую обработку провод т до или после выделени  фермента из его природного источника, например из целых клеток Е. коли. Чистота фермента (препарата) колеблетс  от 0,15 до 50 ммоль/ мин/мг протеина и обычно лежит в интервале 1,5-15 ммоль/мин/мг протеина . Эффективность реакции копул ции и удельна  активность водонерастворимого ферментного препарата повышаютс  при повышении степени чистоты используемого при реакции копул ции фермента. Температура реакций копул ции колеблетс  от 1 до , предпочтительно 15-25°С. Возможна также обработка бензилпенициллина или феноксиметилпенициллина водонерастворимьш ферментным препаратом в водной среде с рН 6,0-9,0, предпочтительно 7,0- 8,5, дл  получени  6-аминопенициллиновой кислоты. При этом рН влажной смеси поддерживают периодическим или непрерывным добавлением щелочи (так -как в процессе дезацилировани  от пенициллина отрываетс  бокова  цепь) в емкости с мешалкой или в реакторе типа колонки. Используема  смола амберлит ХАД-7 представл ет собой структурированный полиметакрилат в макрорешетчатой форме. Частично очищенный препарат фермента цилазы получают выделением фермента из леток ацилазы нродуцирующего штамма .КОЛИ № С1В8743 механическим путем в гоогенизаторе . Обломки клеток удал ют фильрацией после доведени  рН до 5,0. Фермент саждают общеприн тым способом, например ульфатом аммони , насыщением до 75% бором осадка, повторным растворением в вое , диализом раствора, используемого непоредственно дл  копул ции с водонераствориым абсорбентом, либо подвергают сублимаии (сушке вымораживанием), а затем расворению по мере необходимости.

Пример 1. Некоторое количество диамина раствор ют в 1500 мл 0,5 М цитратно-фосфатного буфера при рН 5,0. Далее довод т рН до 5,0, внос т заданное количество пенициллин-ацилазы и 100 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем приливают 100 мл 50%ного водного раствора глутарового альдегида и довод т рН до 5,0. После дополнительного перемешивани  в течение 18 ч твердое веш,ество отфильтровывают, промывают чодой.

Пример 2. Способ осуш,ествл ют, как в примере 1, использу  300 мл буферного раствора и 50 мл фермента амилазы в 250 мл воды при перемешивании фермента и смолы в течение 18 ч до добавлени  200 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида. Активность препарата 20,6 мкм/мин/г.

При использовании 103 г указанного веш,ества дл  дезацилировани  бензилпенициллина (как в примере 1) 91% пенициллина конверсируетс  в 6-аминопенициллиновую кислоту в течение 6 ч после 18 последовательных повторных использований вешества.

Пример 3. Заданное количество 1,3-диамииопропана раствор ют в 1500 мл 0,25 М фосфатного буфера при рН 7,0. При рН 7,0 внос т 25 мл раствора пенициллин ацилазы и 100 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 18 ч, добавл ют 200 мл 25%-пого раствора глутарового альдегида, довод т рН до 7,0 и перемешивают еше 18 ч. Затем фильтруют , промывают, как в примере 1, и получают препарат установленной активности.

При использовании указанного вещества дл  дезацилировани  1 л 6%-ного бензилпенициллин-кали  при рН 7,8 и 37°С получают конверсию после 5 ч при дес ти последовательных экспериментах.

Результаты дезацилированн  приведены в табл. 2.

Пример 4. В 300 мл 0,5 М фосфатного буфера при рН 7,0 ввод т 60 мл раствора пенициллин-ацилазы , затем 240 мл дистиллированной воды и 100 г амберлита ХАД-7. Фер5%-ным раствором метабисуль|)ита натри , 1 М раствором хлористого натри  и 0,5 М фосфатным буфером при рН 7,8. Далее определ ют активность препарата. Некоторое количество полученных препаратов используют дл  проведени  р да последовательных дезацилирований бензилпенициллина кали  - 6% в литровом реакторе с мешалкой при рН 7,8 и 37°С. Выход конверсии з каждом эксперименте определ ют через 5 ч. Результаты опытов приведены в табл. 1.

Таблица 1

Таблица 2

мент абсорбируют на см )ле в течение 18 ч при перемешивании.

Затем внос т И мл 1,3-диаминопропана и 200 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида так, чтобы поддерживать рН 8,0. Далее раствор довод т до рН 7,0, перемешивают еш,е 18 ч, фильтруют и твердое веш,ество промывают, как в примере 1.

Получают 107 г нерастворимого фермента с активностью, установленной на Ьензилпенициллин-калий и равной 11,92 мкм/мин/г.

Пример 5. В 500 мл раствора пенициллин-ацилазы , приготовленного на 0,2 М фосфатном буфере при рН 7,0, внос т 100 г амберлита ХАД-7. Смесь перемешивают в течение 16 ч. Твердое вепхество отфильтровывают, внос т в 500 мл 5%-ного раствора глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,0 и перемешивают еше 16 ч.

Твердое вешество снова отфильтровывают, внос т в 500 мл 0,2%-ного растзора 1,3-диаминопропана в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,0 и перемешивают еш,е 16 ч. ОтфильтроБывают твердое вещество, промывают 5%-ным водным раствором хлористого натри , 2,5%-ным раствором метабисульфита натри  и 0,2 М фосфатным буфером при рН 7,0. Активность препарата 30,8 rviKM/мин/г.

Пример 6. В 600 мл воды внос т 100 г амберлита ХАД-7 и 200 мл 25%-кого водного раствора глутарового альдегида, рН довод т до 7,0 и перемешивают в течение 2 ч. Далее приливают 2 мл 1,3-диаминопропана и перемешивают еще 18ч. Твердое вещество отфильтровывают , промывают водой и суспендируют в 575 мл 0,2 М фосфатного буфера при рН 7,0. Затем приливают 25 мл раствора пенидиллинацилазы и перемешивают еще 18 ч. Твердое отфильтрованное вещество промывают 1 М раствором хлористого натри  и 0,2 М фосфатным буфером при рН 7,8. Активность препарата 42 мкм/мин/г.

120 г препарата используют дл  дезацилировани  1 л 8%-ного раствора бензилпенициллин-кали  при рН 7,8 и 37°С; при этом за 5 ч при щести последовательных экспериментах конверсируетс  больще 80% субстрата.

Пример 7. К 1 мл диаминопропана и 4 мл 25%-ного (объем/объем) глутарового альдегида в 0,2 М при рН 4,5-8,5 добавл ют раствор фермента (77 мкм/мин/г) и 20 г структурированной полиметакрилатной смолы - амберлита ХАД-7.

Довод т объем до 100 мл, перемешивают его в течение 16 ч при комнатной температуре , отфильтровывают смолу и тщательно промывают фосфатным буфером при рН 7,8. Удельную активность смолы определ ют еразу же и после хранени  последней при 37°С в течение 1,4 и 5 дней.

Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Таблица 3

Пример 8. В 0,2 М фосфатный буферный раствор внос т 16 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и 1 мл диаминопропана при рН 5-9, довод т объем до 100 мл, внос т 25 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 16 ч при 25°С и промывают буферным раствором при рН 6,0.

Смолу перенос т в раствор фермента в 0,2 М фосфатном буферном растворе при рН 6,0, перемешивают в течение 16 ч при 25°С,

отфильтровывают и промывают 0,2 М буферным раствором при рН 7,8.

Удельную активность смолы определ ют после хранени  во влажном виде (рН буфера 7,8) при 37°С в течение 1,4 и 8 дней.

Результаты испытаний приведены в табл. 4.

Таблица 4

Пример 9. В 0,2 Af фосфатный раствор внос т некоторое количество 25%-ного водного раствора глутарового альдегида и диамипопропана; рН довод т до 6,0, а объем до 100 мл. Далее внос т 25 г амберлита ХАД-7 и перемешивают в течение 16 ч при 25°С. Смолу отфильтровывают, промывают 0,2 М буфером при рН 6,0, после чего смолу внос т в раствор амилазы в 0,2 М фосфатном буферном растворе при рН 6,0, перемешивают в течение 16 ч при 25°С, отфильтровывают, промывают 0,2 М буферным раствором при рН 7,8.

Смолу испытывают сразу же и через восемь дней после хранени  во влажном состо нии при 37°С.

Результаты испытаний приведены в табл. 5.

Таблица 5

Пример 10. В 200 мл 0,2 М фосфатного буфера при рН 6,0 внос т 48 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида и 3 мл 1,3-диаминопропана, довод т рН до 6,0, а объем до 300 мл фосфатным буфером. Внос т 100 г амберлита ХАД-7, перемешивают в течение 16 ч при рН 6,0 и 25°С. Смолу отфильтровывают и промывают буферным раствором .

Далее готов т ферментный раствор в буферном растворе при рН 6,0 и обрабатывают 1%-ным формальдегидом в течение 12 ч при 25°С. В раствор фермента внос т предварительно обработанную смолу, перемешивают в