Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu 6-aminopenicy,lamowego.Problemem nastreczajacym najwiecej klopotów w produkcji kwasu 6-aminopenicylanowego jest zastosowanie odpowiedniego preparatu enzymatycz¬ nego.Od roku 1961 stosowano acylaze lub deacylaze penicylinowa, jak to stwierdzono w opisie paten¬ towym RFN nr 1 111 778. Trudno jednak bylo sto¬ sowac enzymy wolne od komórek, poniewaz nie¬ latwo je wyodrebnic z mieszaniny reakcyjnej. Po¬ nadto taki rozpuszczalny w wodzie enzym poz-* bawiony komórek, trudno bylo uzyc ponownie. W celu pokonania tych trudnosci, zaproponowano w zgloszeniowym opisie patentowym RFN nr 1917 0,57 zwiazanie enzymu z podlozem polimerowym i tym samym zapobiezenie rozpuszczenia w wodzie. Nie¬ rozpuszczalne preparaty, opisane w zgloszeniowym opisie patentowym RFN nr 1917 0i57, posiadaja dwie niedogodnosci — po pierwsze — rozpadaja sie mechanicznie i po wtóre — maja mala stabil¬ nosc chemiczna na silne zasady, takie jak wodo¬ rotlenek sodu. W wyniku tego, w przypadku sto¬ sowania ich w produkcji kwasu 6-aminopenicyla¬ nowego, prowadzono neutralizacje slaba zasada, .ta¬ ka jak amoniak lub trójetyloamina, w celu zmniej¬ szenia do minimum rozpacTu preparatu. Podobnie,, poniewaz preparat posiada mala stabilnosc me¬ chaniczna, nie moze on byc czesto regenerowany w przypadku stosowania go w procesie ciaglym.Ponadto, taki preparat enzymatyczny jest zwiaza¬ ny kowalentnie z nierozpuszczalnym absorbentem, co w rezultacie powoduje utrate aktywnosci en¬ zymatycznej.Inny sposób otrzymania nierozpuszczalnej w wo¬ dzie acylazy penicylinowej wedlug brytyjskiego opisu patentowego nr 1357 317 polegal na absorp¬ cji acylazy na podlozu i usieciowaniu go za pomo¬ ca dwualdehydu, przy czym powstawaly ewentu¬ alnie wiazania pomiedzy podlozem polimerowym i enzymem. Zgodnie z brytyjskim opisem paten¬ towym nr 1 357 31!7, enzym jest przylaczony do nie¬ rozpuszczalnego materialu poprzez dwualdehyd.Takie preparaty maja polepszona stabilnosc me¬ chaniczna.Pomimo tych opracowan, prowadzacych do o- trzymania nierozpuszczalnego enzymu do stosowa¬ nia wielokrotnego, istnieje w dalszym ciagu potrze¬ ba zwiekszenia calkowitej wydajnosci procesu o- trzymywania kwasu 6-aminopenicylanowego, w któ¬ rym stosuje sie preparat enzymatyczny, jak rów¬ niez potrzeba zwiekszenia krotnosci uzycia prepa¬ ratu enzymatycznego przy periodycznej reakcji wytwarzania kwasu 6-amdnopenicylanowego. Pre¬ paraty stosowane w sposobie wedlug wynalazku musza miec duzo wieksza stabilnosc niz te, które wytwarza sie cytowanymi sposobami oraz wiek¬ sza odpornosc ma silne zasady, a wiec dzialanie np. wiodorotlenku sodu. Ponadto musza miec wy¬ soka aktywnosc enzymatyczna i musza byc latwe 95 0953 95 095 4 wyników, uzyskrwan; do wydzielenia z wodnego srodowiska reakcyjne¬ go. ' INieoczekiwanie stwierdzono, ze przez polaczenie acylazy (penicylinowej z nierozpuszczalnym w wodzie materialem, stosujac rozpuszczalny w wodzie dwual- dehyd i alifatyczna dwuamine, uzyskuje sie nie¬ rozpuszczalne w wodzie enzymy acylazy penicyli¬ nowej o wysokiej stabilnosci ;i w formie dogod¬ nej do przechowywania 'i transportu. Takie pre¬ paraty enzymowe mozna latwo odzyskac z wod¬ nego srodowiska reakcji, prowadzacej do otrzyma¬ nia kwasu 6-amLnopenicylanowego z wysoka wy¬ dajnoscia i o wysokiej czystosci, co jest bardzo istotne w produkcji kwasu 6-amiinopenicylanowe- go. _ Zastosowanie dwuaminy alifatycznej prowadzi do wyników od dotychczasowych tych bez jej uzycia przy otrzy¬ mywaniu preparatów enzymatycznych rozpuszcza 1- 9gwtoMte*w&iBieJ [W szczególnosci tak otrzymany l^ll^fflj^^^ jest trwalszy, co umozli¬ wia wielokrotne jego uzycie w kolejnych reakcjach przemiany penicyliny w kwas 6-aminopenicyla¬ nowy..Wedlug wynalazku, sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego poprzez zetkniecie nieroz¬ puszczalnego w wodzie preparatu: enzymatycznego, w którym acylaza penicylinowa jest zwiazana z nierozpuszczalnym w wodzie aibsorbentem, z ben- zylopenicylina lub fenoksypenicylina w srodowisku wodnym o pH w granicach 6,0^9,0', polega na tym, ze jako nierozpuszczalny w wodzie preparat enzymatyczny stosuje sie preparat, zawierajacy enzym acylazy penicylinowej, zwiazany z zywica polimetakrylanowa lub poliakrylowa poprzez glio- ksal lub aldehyd glutarowy oraz alifatyczna dwu¬ amine, zawierajaca 2—10 atomów wegla, przy czym • zywice stosuje sie w formie makrosiatkowej.Korzystne jest stosowanie acylazy,, otrzymanej z bakterii, takich jak szczep Escherichia coli, przy rozszczepianiu benzylopenicyliny do kwasu 6-ami¬ nopenicylanowego lub, na przyklad, z grzybów promienicy, przy rozszczepieniu fenoksymetylope- nicyliny.Powierzchnia absorpcyjna absorbenta enzymu wzrasta ze zmniejszeniem rozmiarów czastek ab¬ sorbenta. W przypadku usieciowanych zywic poli- metakrylanowych korzystnie jest, jesli sredni roz¬ miar ich czastek wynosi 0,6 mm, przy którym po¬ wierzchnia wynosi 45K) im2/g zywicy. Ze zmniejsze¬ niem rozmiarów czastek wzrasta wydajnosc reak¬ cji sprzegania oroz aktywnosc specyficzna rozdrob¬ nionego, nierozpuszczalnego w wodzie preparatu enzymatycznego.Jako dwuamine alifatyczna korzystnie stosuje sie prostolancuchowa c«TCO-dwuamine alifatyczna, zawierajaca 2-^ro atomów wegla, zwlaszcza 1,3- •dwuaminopropan lub 1,6-dwuaminoheksan.Kolejnosc" mieszania czterech skladników prepa¬ ratu enzymatycznego ma czesto wplyw na wlasci¬ wosci otrzymanego preparatu. Jeden z dobrych sposobów polega na zetknieciu nierozpuszczalnego w wodzie absorbenta najpierw z aeylaza, ewentu- . alnie w obecnosci dwuaminy, a nastepnie dodanie, wspól lub przeciwpradowo, dwualdehydu i dwua¬ miny alifatycznej, o ile nie byla dodana uprzed¬ nio. W tym sposobie korzysfnie jest absorbowac enzym w oObecnosci od i0,,l do 5,0* korzystnie od 02 do 2,0 milimoli dwuaminy na gram absorben- ta i w obecnosci od 0,25 do 10$, korzystnie od 2,5 do 5,0 milimoli dwualdehydu na gram absorben¬ ta.W celu zapobiezenia reakcji nadmiaru grup al- ' dehydowych po zakonczeniu reakcji sprzegania, ko- io rzystnie jest przemyc zywice z naniesionym enzy¬ mem roztworem pirosiarczynu sodowego, dwuami¬ ny alifatycznej, mocznika lub glicyny.Stosujac powyzej opisane warunki, otrzymuje sie nierozpuszczalne w wodzie preparaty enzymatycz- ne wystarczajaco trwale, aby stosowac je co naj¬ mniej 25-krotn'ie do rozszczepienia penicyliny w reaktorze periodycznym bez znacznego zmniejsze¬ nia wydajnosci reakcji.Stwierdzono, ze pH srodowiska, w którym prze- biega reakcja sprzegania ma wplyw na trwalosc nierozpuszczalnego w wodzJie preparatu enzyma¬ tycznego. Uzyteczny sposób szybkiego oznaczenia trwalosci zywicy z zaabsorbowanym enzymem po¬ lega na inkubowaniu nierozpuszczalnego w wodzie preparatu enzymatycznego, zwilzonego roztworem buforowym o pH =, 7,8, w temperaturze 37°C. W przypadku .braku stabilizujacego wplywu podloza lub produktów, spadek aktywnosci enzymu jest znacznie przyspieszony. -30 Inny sposób sprzegania, prowadzacy do otrzy¬ mania nierozpuszczalnego -w wodzie preparatu en¬ zymatycznego o wiekszej nawet .trwalosci, polega na wstepnym traktowaniu absorbenta mieszanina dwuaminy z dwualdehydem i nastepujacej po tym absorpcji acylazy. W tym przypadku waznymi pa¬ rametrami sa ilosci i stosunki molowe dwuaminy alifatycznej i dwualdehydu. Ilosc uzytej' dwuami¬ ny i dwualdehydu powinna zawierac sie w gra¬ nicach od •0,0(1 do. 20,'9, korzystnie od '0„il do 1*0,0 40 milimoli na gram aibsorben.ta, a stosunek molowy dwuaminy do dwualdehydu powinien -sie .zawierac w granicach od 1 : 0,1 do 1 : 40, korzystnie od 1 :1 do 1 : 10. Wstepne traktowanie zywicy korzystnie jest prowadzic przy pH = 4—9. Trwalosc preparatu en- 45 .zymatycznego, otrzymywanego w optymalnych wa¬ runkach jest wystarczajaca, do co najmniej 50- -krotonego uzycia go do rozszczepiania penicyliny.|Stwierdzeno ponadto, ze zachowanie aktywnosci enzymatycznej po absorpcji na podlozu, szczegól- 50 nie w przypadku stosowania usieciowanej zywi¬ cy poli/met/akrylenowej jako podloza czesto po- . prawia sie, jezeli enzym potraktuje sie wstepnie jedno lu'b dwualdehydem, takim jak formaldehyd lub aldehyd glutarowy, w stezeniu od !0,i5 do 5;Vo, 55 przy pH od 5 do 8, w ciagu '2 do 24 godzin, jeze¬ li stosuje sie formaldehyd, i w stezeniu od 0,0|l°/o do 0,5% przy pH od 5 do 8 w ciagu 2 do 24 go¬ dzin, jezeli stosuje sie aldehyd glutarowy. Enzym mozna traktowac aldehydem przed lub po wy- 60 odrebnieniu go z jego naturalnego zródla, tj. ca¬ lych komórek E. Coli.Wydajnosc reakcji sprzegania oraz aktywnosc specyficzna koncowego, nierozpuszczalnego w wo¬ dzie preparatu enzymatycznego zwieksza sie ze w wzrostem czystosci enzymu, uzytego do reakcji95 095 6 sprzegania. Czystosc enzymu moze zawierac sie w granicach od '0,15 do 50 ^moU/min/mg 'bialka, a korzystnie jest, jezeli zawiera sie ona w grani¬ cach 1,5—15 ^moli/min/mg .bialka.JezeM poczatkowo absorbent poddaje sie zetknie¬ ciu z enzymem lub enzymem z dwuamina lub dwuamina z dwualdehydem w roztworze wcdnym, do zapewnienia dobrej absorpcji czas kontaktowa¬ nia wynosic powinien 2—24 godzin. Jesli produkt poddaje sie zetknieciu najpierw z dwualdehydem, a nastepnie z dwuamina lub z dwualdehydem i dwuamina równoczesnie, lub z roztworem enzy¬ mu, wówczas do uzyskania dobrej absorpcji czas ten powinien wynosic równiez 2—24 godzin. Re¬ akcje sprzegania prowadzi sie w temperaturze 1— 37°C, korzystnie 15—25°C.Stosujac sposób wedlug wynalazku do wytwa¬ rzania kwasu 6-aminopenicylanowego, benzylopeni- cyline lub fenioiksymetylopenicyline traktuje sie. nierozpuszczalnym w wodzie preparatem enzyma¬ tycznym, otrzymanym w wyzej omówiony sposób, w srodowisku wodnym o pH = 6,0i—9,0, korzystnie 7,0—8,5.Podczas prowadzenia tej reakcji pH mieszaniny utrzymuje sie, dodajac porcjami lub w sposób cia¬ gly alkalia, w celu zobojetnienia uwalnianego w czasie reakcji deacylacji penicyliny kwasu z lan¬ cucha bocznego.Najdogodniej jest wytwarzac kwas 6-aminopeni- cylimowy periodycznie w zbiorniku z mieszadlem.Zastosowanie reaktora kolumnowego, zawieraja¬ cego preparat enzymatyczny, jest mozliwe, jezeli bedzie sie szybko cyrkulowac srodowisko reakcji w celu zmniejszenia spadku wartosci pH, które koryguje sie w reaktorze z mieszadlem, polaczo¬ nym szeregowo z reaktorem kolumnowym^ Preparaty enzymatyczne, zastosowane w sposo¬ bie wedlug wynalazku, sa korzystne nie tylko ze wzgledu na mozliwosc ich wielokrotnego uzycia, ale równiez ze wzgledu ma to, ze po serii reakcji rozszczepiania penicyliny mozna je odzyskac, pozo¬ stale bialko usunac przez traktowanie kwasem i swiezy enzym ponownie poddac reakcji sprzega¬ nia z zywica sposobem, opisanym powyzej. Zywi¬ ce z zaabsorbowanym enzymem mozna uzyc do na¬ stepnej serii reakcji rozszczepiania penicyliny.Ponizej podano przyklady, ilustrujace sposób we¬ dlug wynalazku. Przyklady I—XII ilustruja spo¬ sób wytwarzania preparatu enzymatycznego, pole- in 45 gajacy na zetknieciu enzymu z podlozem przed dodaniem dwualdehydu, a przyklady XIII, XIV i XVI—XXI ilustruja sposób wytwarzania prepara¬ tu enzymatycznego, polegajacy na wstepnym trak¬ towaniu podloza dwualdehydem i dwuamina przed dodaniem enzymu. W przykladzie XV opisano spo¬ sób, w którym wszystkie skladniki miesza sie w zasadzie równoczesnie.Podany w przykladach Amberlit XAD-7 jest pro¬ duktem handlowym usieoiowanego poHmetakryla¬ nu o budowie makrosiatkowej, a aktywnosc pre¬ paratów enzymatycznych podano w ^molach kwa¬ su — 6-ammopenieylainowego, 'otrzymanego przy pH = 7,8, w temperaturze 37°C na minute na gram preparatu.W przykladach stosowano czesciowo oczyszczo¬ ny preparat enzymatyczny acylazy, otrzymany na drodze mechanicznego wyodrebnienia enzymu z ko¬ mórek szczepu Escherichia coli NCIB 8743, produ¬ kujacego acylaze, w homogenizatorze. Komórki od¬ padkowe usuwano na drodze saczenia po ustale¬ niu pH = '5,0i. Enzym wytracano konwencjonalny¬ mi sposobami, jak na przyklad przy uzyciu siar¬ czanu amonowego, na przyklad do 715)°/o nasycenia, osad zbierano,, 'rozpuszczano ponownie w wodzie, otrzymany roztwór poddawano dializie i albo uzy¬ wano bezposrednio do reakcji sprzegania z nie¬ rozpuszczalnym w wodzie absorbenitem lub tez lio¬ filizowano i nastepnie, w razie potrzeby, rozpusz¬ czano. Enzym o wiekszej czystosci otrzymywano przez dalsze oczyszczanie roztworu enzymu, uzys¬ kanego w sposób opisany powyzej, stosujac kon¬ wencjonalne sposoby oczyszczania bialek, jak na przyklad chromatografie jonowymienna lub obrób¬ ke cieplna.Przyklad I—VII. Dwuarnine w ilosci, poda¬ nej w tablicy 1, rozpuszczano w l190i0 ml, 0,5 m buforu cytrynianowo-fosiforainowego przy pH = = 5,0. pH roztworu doprowadzono do 5 i dodano acylaze penicylinowa w ilosci podanej w tablicy 1.Nastepnie dodano l0|0 g Amberlitu XAD-7 i ca¬ losc mieszano powoli w ciagu 18 godzin w tem¬ peraturze pokojowej. Z kolei dodano 100 ml 50°/o wodnego roztworu aldehydu glutarowego, pH do¬ prowadzono do 5 i mieszano w ciagu nastepnych 18 godzin. Nastepnie czesci stale odsaczono, prze¬ myto woda, '5°/o roztworem pirosiarczynu sodowe¬ go, 1 m roztworem chlorku sodowego i %5 m toz- Przyklad i, II in !IV . V VI V^T Amina o wzorze H2N(CH2)2NH2 nj 0 3 2 4 8 ilosc 115 g 11 ml 2 ml 14 g 13 g /18,7 g 22,2 g T a b 1 j Ilosc acylazy g '5 g 100 ml 1010 ml H50 ml aoo mi 1100 ml ca 1 Aktywnosc . preparatu (^mole/min/g) 16 (24 ,17,2 40 (10 a2,» ilA2 iReakcja deacylacji ilosc 200 g 100 g 100 g — — — —¦ Liczba kolejnych reakcji — — — Stopien przemiany •90 90 85 — — — —¦7 95 095 8 tworem buforu fosforanowego o pK = 7,8. Aktyw¬ nosc preparatu podano w talblicy 1.'Niektóre preparaty w Ilosciach, podanych w ta¬ blicy 1, (otrzymane sposobem opisanym powyzej, uzyto do kolejnych reakcji deacylacji soli pota¬ sowej benzyloparucyliny (6%) w reaktorze o po¬ jemnosci 1 litra przy pH = 7,8 w temperaturze 37°C. W kazdym przykladzie wydajnosc przemia¬ ny okreslano po 5 godzinach.Przyklad VIII. Postepowano w sposób, opi¬ sany w przykladzie I, stosujac tylko 300 ml roz¬ tworu buforowego i 50 ml amidazy w 250 ml wo¬ dy i mieszajac razem enzym z zywica w ciagu 18 godzin przed dodaniem '200 ml 25% wodnego roz¬ tworu aldehydu glutanowego. Aktywnosc otrzyma¬ nego preparatu wynosila 2N)„6 ^moli/mdn/g.: Przy uzyciu 103 g tego preparatu do deacyla¬ cji benzylopenicyliny sposobem, opisanym w przy¬ kladzie I, 01% penicyliny uleglo przemianie do kwasu '6-aminopenicylanowego w ciagu 5' godzin po 18 kolejnych uzyciach preparatu- Przyklady IX i X. 1,3-dwuaminopropan w ilosci podanej w tablicy 2 rozpuszczono w 1500 ml 0,25 m roztworu buforu fosforanowego o pH = = 7, doprowadzono pH do 7 i dodano 25 ml roz¬ tworu acylazy penicylinowej oraz 10i0 g Amberli- tu XAD-7. Po lagodnym mieszaniu w ciagu 18 godzin dodano ^ 20)3 ml 25% roztworu aldehydu glutarowego, doprowadzono pH do 7 i mieszano w dalszym ciagu jeszcze 18 godzin. Nastepnie pro¬ dukt odsaczono i przemyto w sposcb, opisany w przykladzie I, otrzymujac preparat o aktywnosci, podanej w tablicy :2. Przy stosowaniu otrzymane¬ go preparatu descylacji 1 litra 6% soli potasowej benzylopenicyliny przy pH = 7,8 i w temperatu¬ rze 37°C. Stopien przemiany penicyliny po 5 go¬ dzinach i po 10-krotnym uzyciu preparatu wynosil 75% (przyklad IX) i 90|% (przyklad X). Tablica 2 Ptrzy- klad : IX iX Ilosc dwua-„ miny ml 2 Aktywnosc preparatu ^mole/min/ /g ) 17,4 17,2 Reakcja destylacji Ilosc g 110 (6 Stopien przemiany % 7*5 90 Przyklad XJ. Do 300 ml 0,5 m roztworu buforu fosforanowego o pH =, 7,0 dodawano ko¬ lejno 60 ml roztworu acylazy penicylinowej i 240 ml destylowanej wody z 100 g Amberlitu XAD-7.Calosc lagodnie mieszano w ciagu 18 godzin i do¬ dano 11 ml 1,3-dwuaminopropanu oraz 200 ml 2Wo roztworu wodnego aldehydu glutarowego w taki sposób, by pH nie wzroslo powyzej 8,0. W koncu doprowadzono pH roztworu do 7,0 i mieszano je¬ szcze 18 godzin. Preparat loddzielono i przemyto w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymano 107g nierozpuszczalnego enzymu o aktywnosci, o- znaczonej przy uzyciu soli potasowej benzylope¬ nicyliny, równej 11,92 g jumoli/min/g.Przyklad XII. do 500 ml roztworu acylazy penicylinowej w 0,2 m roztworze buforu fosfora¬ nowego o pH = 7,0 dodano 100 g Amberlitu XAD-7 i calosc mieszano w ciagu 16 godzin. Czesci stale odsaczono, dodano do 5CiJ ml 5% roztworu alde¬ hydu glutarowego w 0,1 m roztworze buforu fos¬ foranowego o pH = 7,0 i mieszano jeszcze 16 go¬ dzin. Ponownie odsaczono czesci stale, dodano do 500 ml 0,2% roztworu 1,3-dwuaminopropanu w io 0,1 m roztworze bufoiru fosforanowego o pH = 7,0 i mieszano 16 godzin. Po odsaczeniu czesci sta- ¦ lych i przemyciu 5% wodnym roztworem chlorku sodowego, 2,5% roztworem pirosiarczynu sodowe¬ go oraz 0j2 m roztworem buforu fosforanowego o u pH = 7 otrzymano preparat o aktywnosci 30,8 ^mioli/min/g.Przyklad XIII. Dio 6C0 ml wody destylowa¬ nej, do której dodano 200 ml 25% wodnego roz¬ tworu aldehydu glutarowego dodano jeszcze 100 g Amberlitu XA,D-7, doprowadzono pH do 7,0 i ca¬ losc mieszano w ciagu 2 godzin. Nastepnie doda¬ no 2 ml 1,3-dwuaminopropanu i lagodnie miesza¬ no w ciagu 18 godzin. Po odsaczeniu' czesci sta¬ lych i przemyciu woda mieszano je z 575 ml 0,2 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,0, do¬ dajac 2.5 ml roztworu acylazy penicylinowej i la¬ godnie mieszano w ciagu 18 godzin. Nastepnie cze¬ sci stale przemyto 1 m roztworem chlorku sodo¬ wego i 0,2 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 7,8 otrzymujac preparat o aktywnosci 42 ^moli/min/g. do deacylacji 1 litra 8% soli potasowej benzy¬ lopenicyliny przy pH = 7,8 i w temperaturze 37°C uzyto 120 g tak otrzymanego preparatu. Po 6 ko- lejnych uzyciach preparatu po '5 godzinach sto¬ pien przemiany wynosil powyzej 80%.Przyklad XIV. Do 5C0 ml 5% V/V wodnego roztworu aldehydu glutarowego o pH = 7,0 doda¬ no 100 g Amberlitu XAD-7 i lagodnie mieszano « w ciagu 2 godzin. Nastepnie dodano 1 ml dwua¬ minopropanu, doprowadzono pH do 7,0. kwasem chlorowodorowym i lagodnie mieszano w ciagu nastepnych 14 godzin. Zywice odsaczono, przemy¬ to woda, ponownie odsaczono, dodano do roz- 45 tworu acylazy penicylinowej w 0,2 m roztworze buforu fosforanowego o pH = 7,0 i lagodnie mie¬ szano w ciagu 16 godzin. Zywice z zaabsorbowa¬ nym enzymem odsaczono, przeniesiono do. 500 ml wody, zawierajacej 1 ml dwuaminopropamu przy 50 pH = 7,0 i lagodnie mieszano w ciagu 8 godzin.Zywice z zaabsorbowanym enzymem odsaczono po¬ nownie i przemyto kolejno 1 m roztworem NaCl, 2,5% W/V roztworem pirosiarczynu sodowego oraz, dwukrotnie, 0,2 m roztworem buforu fosforanowe- 55^ go o pH = 7,0. Otrzymano preparat o aktywnosci równej 35 ^moli/min/g. 1|30 g tak otrzymanego preparatu uzyto do dea¬ cylacji 1 litra 71% W/W soli 'potasowej benzopenj • cyliny przy pH = 7,8, w temperaturze 37°C. Po 60 5 godzinach i 25 kolejnych uzyciach preparatu sto¬ pien przemiany wynosil ponad 90%.Przyklad XV. Do 1 ml dwuaminopropanu i 4 ml 215% V/V aldehydu glutarowego w 0^2 m roz¬ tworze buforu fosforanowego przy wartosciach pH, w wskazanych w tablicy 3, dodano roztwór enzymu9 95 095 o aktywnosci 77 /^moli/min/g zywicy i 20 g usie- ciowanego polimetakrylanu — Amberlitu XAD-7.Nastepnie uzupelniono objetosc roztworu do 100 ml i mieszano w temperaturze pokojowej w cia¬ gu 16 god.zin. Zywice odsaczono i przemyto do¬ kladnie roztworem buforowym o pH = 7,8. Specy¬ ficzna aktywnosc zywicy oznaczono natychmiast po przygotowaniu o:raz po 1,4 i 5 dniu przecho¬ wywania wilgotnej zywicy w temperaturze 37°C.Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 3.Tablica 3 pH re¬ akcji sprze¬ gania 4,5 ,5 6,5 7,5 " 8,5 Specyficzna aktywnosc zywicy z enzymem ^mole/min/ 38 41,5 38 39 Skumulowana strata pro¬ centowa aktywnosci w czasie przechowywania w temperaturze 37°C po 1 diniu 122 191 12 11 7 po 4 dniach 40 33 . 31 36 23 po 5 dniach 40 33 31 26 ,23 Przyklad XVI. Do 0,2 m roztworu fosfora¬ nowego dodano 16 ml 251% roztworu aldehydu glu- tarowego, 1 ml dwuaminopropanu i doprowadzono pH do wartosci, podanych w tablicy 4. Nadepnie objetosc roztworu doprowadzono do 1010 ml, do¬ dano 25 g Amberlitu XAD-7 i calosc mieszano w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°C. Zywice z kolei odsaczono, przemyto roztworem buforowym o pH = 6,0, dodano do roztworu enzymu w 0,2 m roztworze buforu fosforanowego o pH = 6,0 i mie¬ szano w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°C.Ponownie zywice odsaczono i przemyto 0,2 m roz¬ tworem buforowym przed pobraniem próbki. Na¬ stepne próbki pobrano po przechowaniu w stanie wilgotnym, w, obecnosci roztworu buforowego o pH = 7,8 w temperaturze 37°C po 1,4 i 8 dniu* Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy 4.Tablica 4 pH wstepne¬ go traktowa¬ nia il,3-dwua- miniopropa¬ nem i alde¬ hydem glu- tarowym ,0 9,0 Aktyw¬ nosc XAD umole/ /min/g 37 12 Skumulowana strata procentowa aktywnos¬ ci po przechowywaniu w temperaturze 37°C po 1 dniu 1 0 po 4 dniach 7 1 14 po 8 dniach 7 Przyklad XVII. Do 0,i2 roztworu buforu fos¬ foranowego dodano 25°/o roztwór aldehydu gluta- rowego i dwuaminopropan w ilosciach, podanych w tablicy 5. Doprowadzono pH do 6,0i, a objetosc do 100 ml, dodano 25 g Amberlitu XAD-7 i mie¬ szano w temperaturze 25°C w ciagu 16 godzin. 45 50 55 Nastepnie zywice odsaczono, przemyto. 0,2 m roz¬ tworem buforowym o pH = 6,0^ dodano do roztwo¬ ru acylazy w 0,2 m roztworze buforu fosforano¬ wego o pH = 6,0 i mieszano w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°C. Zywice ponownie odsaczo¬ no i przemyto 0,2 m roztworem buforowym o pH = 7,8. Preparat badano przed przechowywa¬ niem i po osmiodniowym przechowaniu w tem¬ peraturze 37°C w stanie wilgotnym. Wyniki po¬ dano w tablicy 5.Tablica 5 1% v/v dwuamino¬ propanu l 4 8 1,0 . */o V/V aldehydu glutaro- wego 4 4 4 4 Aktyw¬ nosc/g [umole/ /min/G] 4)0 41 46 41! Aktywnosc po 8 dniach przecho¬ wywania 34 29, 29 26 Przyklad XVIII. Do 200 ml 0^2 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 6,0 dodano 48 ml % roztworu wodnego aldehydu glutarowego i 3 ml 1,3-dwuaminopnopanu, pH mieszaniny do¬ prowadzono do 6,0 a objetosc uzupelniono do 300 ml roztworem buforu fosforanowego. Nastepnie dodano ICO g Amberliitu XAD-7 i calosc mieszano w ciagu 16 godzin przy pH = 6,0 w temperatu¬ rze 25°C. Z kolei zywice odsaczono, przemyto roz¬ tworem buforowym. Roztwór enzymu przygotowa¬ no w taki sposób w roztworze buforowym o pH = = 6, aby otrzymac mieszaniny o aktywnosci, po¬ danej w tablicy 6. Roztwór traktowano l*/o roz¬ tworem formaldehydu w ciagu 12 godzin w tem¬ peraturze 25°C. Wstepnie obrobiona zywice doda¬ no do tego roztworu enzymu, mieszaino w ciagu 16 godzin przy pH = 6,0 i w temperaturze 250C,' zywice z zaabsorbowanym enzymem .odsaczono i przemyto roztworem buforowym. Uzyskane war¬ tosci specyficznej aktywnosci zywicy i wydajnos¬ ci reakcji sprzegania przy róznej aktywnosci enzy¬ mu wyjsciowego podano w tablicy 6.Tablica 6 Aktywnosc wyj¬ sciowego roztwo¬ ru enzymu jed¬ nostki enzymu/g zywicy 77' ^5 62 Aktywnosc specyficzna zywicy z za¬ absorbowa¬ nym enzy¬ mem' 32 135 28 Wydajnosc reakcji sprze- 'gamia 1% 41,5 00 45 | 65 Przyklad XIX. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie XVIII, stosujac en¬ zym o innej czystosci. We wszystkich przypadkach aktywnosc wyjsciowego roztworu enzymu wyno¬ sila 77 ^rnioli/rnin/g zywicy. Uzyskane aktywnos¬ ci specyficzne preparatów i wydajnosc reakcji sprzegania podano w tablicy 7<95 095 11 'Tablica 7 Aktywnosc spe¬ cyficzna enzy¬ mu uzytego do reakcji sprzega¬ nia (^mole/min/ /mg/bialka) 3,3 6,1 13,8 Aktywnosc specyficzna z zaabsorbo¬ wanym enzy¬ mem (^mole/min/g) 31 40 59 Wydajnosc reakcji sprze¬ gania % 40 52 77 Przyklad XX. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie XVIII, stosujac Am- berlit XAD-7 o mniejszych rozmiarach czastek, tj.Tablica 8 Aktywnosc wyj¬ sciowa (^mole/min/g zywicy) ,1,15 (1154 Aktywnosc specyficzna zywicy z za¬ absorbowa¬ nym enzy¬ mem . (/fmole/min/g) 99 J135 Wydajnosc reakcji sprzegania % 86 88 12 pomiedzy 200 a 4'C'O mesh (wobec ziarn 30 mesh w przykladzie XVIII) przy 2 stezeniach enzymu.Uzyskane wyniki podano w tablicy 8.Przyklad XXI. Postepowano w sposób opi¬ sany w przykladzie XVIII, stosujac 5 kg Amber- litu XAD-7 i proporcjonalnie wieksze ilosci in¬ nych skladników. Otrzymany preparat enzymaty¬ czny, o aktywnosci 31 ^moli/miin/g, uzyto do roz¬ szczepienia 40 litrów roztworu benzylopenicyliny o stezeniu 6,5% W/V. Srednia wydajnosc przemia¬ ny do kwasu 6-aminopenicylanowego po szescio¬ godzinnej reakcji i 50-krotnym uzyciu preparatu wynosila 95%. i PL