CN100448988C - 具有酚氧化酶样活性的培养物 - Google Patents

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Abstract

提供有效、廉价、而且简便进行纤维或毛发的染色、纸浆和纤维的漂白、废液中的酚化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、木质的改善等的手段。属于Flammulina属菌类的培养物通过在pH大于7.0的条件下对该菌类进行培养可获得其培养物，而且还公开了具有酚氧化酶样活性的、来自该菌类的培养物、该培养物的制造方法、在该培养物存在下使染色对象物与染料接触的染色方法、以及含有该培养物的染色用组合物。

Description

具有酚氧化酶样活性的培养物
技术领域
本发明涉及到具有酚氧化酶样(フェノ-ルォキシダ-ゼ樣)活性的培养物及其制造方法，染色方法及染色组合物。更详细地讲，涉及到对纤维或毛发的染色、纸浆和纤维的漂白、废液中酚化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、木质的改善等有用的培养物，以及可以简便、廉价而且大量获得该培养物的制造方法，通过各种染料可进行染色的纤维或毛发等的染色方法以及对该染色有用的染色用组合物。
背景技术
对酚化合物、多酚化合物等各种底物表现出氧化作用的氧化酶主要分为过氧化物酶类和酚氧化酶类两类。
上述的过氧化物酶类催化各种底物的氧化，作为通用的底物，反应体系中需要有过氧化氢存在。而酚氧化酶类催化各种底物的氧化，作为通用的底物需要有分子状态的氧存在。因此，在已知的氧化酶类中，上述的酚氧化酶类由于在大气中氧的存在可以催化各种底物的氧化，所以适用于在氧存在下由作为中间体的基团的生成引起的发色、脱色、聚合、分解等多种化学反应。
上述酚氧化酶类具有依据作为反应中间体生成的基团种类的作用而具有多种催化能力。例如，据报道，作为介质使用吩噻嗪-10-丙酸时，可以有效通过作为酚氧化酶类的漆酶进行靛蓝的分解反应(平成13年度福井大学地域共同研究中心高度技术研修资料集、第55页)。
上述氧化酶很早就在各种植物、细菌类以及真菌类等中被发现。例如，在植物中，在漆树科(Anacardiaceae)的分泌性导管、桃类、栗类、罗汉松科(Podocarpaceae)科等中发现了上述氧化酶。在真菌类中，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)的曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、漆斑菌属(Myrothecium)、青霉属(Penicillium)、盘多毛菌属(Pestalotia)、丝核菌属(Rhizoctonia)等；属于担子菌亚门(Basidiomycotina)的灰侧耳菌属(Pleurotus)、香菇属(Lentinus)、多孔菌属(Polyporus)、栓菌属(Trametes)、革盖菌属(Coriolus)等；属于子囊菌亚门(Ascomycotina)的束丙霉属(Podospora)、链孢霉属(Neurospora)、Monocillium等中，发现了上述氧化酶。在细菌中，在芽孢杆菌(Bacillus)、Azospirillum、链霉菌(Streptomyces)、产气杆菌(Aerobacter)等中发现了上述氧化酶。另外在作为担子菌的食用菌中，例如群交裂褶菌(Schizophyllum Commune)、杂色革盖属(Coriolusversicolor)、Pycnoporus coccineus、Pleurotus octreatus、Fomitella fraxinea等发现了上述氧化酶。
然而，由于很多酚氧化酶的最适pH在酸性附近，所以存在着使用用途被限定的缺点。另外，在具有最适pH中性或碱性的酚氧化酶中，由于使用的底物不同，最适pH有很大变动，存在着在中性附近不能有效作用于各种底物的缺点。
另外，Flammulin velutipes通过在pH 6.0的培养基中进行培养，发现表现出漆酶活性(特开昭60-156386)。
然而，上述漆酶是在具有最适pH酸性侧的酶，存在着在中性或碱性区域的pH下活性低下的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供可以应用以各种化合物、特别是酚类化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物为底物的反应，在纤维或毛发的有效染色、纸浆和纤维的漂白、废液中的酚化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、木质的改善等方面应用性优越的来自属于Flammulina属的菌类的培养物。另外，本发明的目的在于提供可以简便、廉价而且大量获得上述培养物的制造方法。另外，本发明的目的在于提供可以通过各种染料、具体来说如酚类化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物、天然物(类黄酮等)、动植物的黑色色素构成物等高效、简便地进行染色的染色方法。另外，本发明的目的还在于提供可通过各种染料、具体来说如酚类化合物、氨基苯酚化合物以及二氨基苯酚化合物、天然物(类黄酮等)、动植物的黑色色素构成物等进行染色、处理简便的染色用组合物。
即本发明的要点如下：
[1]一种具有酚氧化酶样活性、来自属于Flammulina属的菌类培养物，所述的培养物具有选自下面①～⑤中的至少一种底物特异性的，这5个反应是：①催化
式(I)
Figure C0381566000071
所示的伊文思蓝(Evans’Blue)、式(II)
Figure C0381566000072
所示的Acid Blue 80、式(III)
Figure C0381566000081
所示的Remazol Brilliant Blue R以及式(IV)
Figure C0381566000082
所示的Acid Violet 17分别进行氧化脱色反应[脱色活性]、
②催化对木质素的氧化分解反应[氧化分解活性]、
③催化式(V)
Figure C0381566000083
所示的靛蓝胭脂红(ィンティゴカルミン)、以及式(VI)：
所示的Natural Orange 6的氧化聚合反应[氧化聚合活性]
④催化4-氨基安替比林与从酚类化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中选择出来的一种化合物的氧化偶联反应[氧化偶联活性]、
⑤催化对从酚类化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中选择出来的一种化合物的直接氧化反应[直接氧化活性]。
[2]上述[1]所述的培养物，其中属于Flammulina属的菌类是Flammulina velutipes。
[3]上述[2]所述的培养物，其中Flammulina velutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
[4]上述[1]～[3]中任意一项所述的培养物，该培养物可以通过在pH大于7.0的条件下对属于Fiammulina属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体得到。
[5]一种具有酚氧化酶样活性的来自Flammulins属的菌类的培养物，所述的培养物是通过在pH大于7.0的条件下对属于Flammulins属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体得到的。
[6]上述[1]～[5]中任意一项所述的来自属于Flammulina属的菌类的培养物的制造方法，其特征是对属于Flammulina属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体后得到培养物。
[7]上述[6]所述的制造方法，其中属于Flammulina属的菌类是Flammulina velutipes。
[8]上述[7]所述的制造方法，其中Flammulina velutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
[9]一种染色方法，其特征是在上述[1]～[5]中任意一项所述的培养物存在下，使染色对象物和染料接触。
[10]一种含有上述[1]～[5]中任意一项所述培养物的染色用组合物。
附图的简单说明
图1是表示研究本发明的培养物的最适温度的结果的图。图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形。图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。
图2是表示研究本发明的培养物的热稳定性的结果的图。图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形。图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。
图3是表示研究本发明的培养物的最适pH的结果的图。图3中的图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形，图C表示以p-苯二胺为底物的情况。
图4是表示研究本发明的培养物的pH稳定性的结果的图。图4中的图A以及B表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图C和D表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。另外，图A和C表示1小时后的pH稳定性，图B和D表示20小时后的pH稳定性。
图5是表示用本发明的培养物对牦牛毛线以及羊毛织物进行染色的结果的图。在图5中，图A表示使用牦牛毛线的结果，图B表示使用羊毛织物的结果。
图6是表示研究依赖培养pH条件的活性诱导的变化的结果图。
图7表示对本发明的培养物以及在pH6.0培养得到的培养物的酚氧化酶样活性的最适pH进行比较的结果图。图A和B表示在pH 6.0下培养得到的培养物的最适pH、图C和D是本发明培养物的最适pH。另外，图A和C表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图B和D表示以p-苯二胺作为底物的情形。
用于上述发明的最好方式
本发明的培养物由于具有酚氧化酶样活性，所以在氧存在下，可以通过催化进行由于作为反应中间体的基团类的生成引起的多种化学反应，另外，由于使用的底物不同所引起的最适pH变动小，在中性附近具有高的活性。因此，本发明的培养物可以发挥能够在应用于纤维或毛发的染色、纸浆和纤维的漂白、废液中的酚类化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、粘合剂的制造等时产生优越效果。另外，本发明培养物因为是来自作为食用的下述以Flammu lina velutipes为代表的Flammulina属的菌类，因此培养物能够容易地释放到菌丝体外，容易从培养生成物中获得，具有优异的效果。
作为上述属于Flammulina属的菌类，具体来说如Flammulinavelutipes，更具体讲如Flammulina velutipes IFO 30601。
在本说明书中，所谓酚氧化酶样活性指的是在氧存在下，对酚类化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物等进行催化氧化的活性。这样的酚氧化酶样活性可以用通过例如将酚、苯胺衍生物等作为氢供体，通过使氧分子还原的发色反应进行测定。作为上述氢供体，如酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物等。
本发明的培养物至少具有下面①～⑤中的一个底物特异性，这5个反应是：①催化
式(I)
Figure C0381566000111
所示的伊文思蓝(Evans’Blue)、式(II)
Figure C0381566000121
所示的Acid Blue 80、式(III)
Figure C0381566000122
所示的Remazol Brilliant Blue R以及式(IV)
Figure C0381566000131
所示的Acid Violet 17分别进行氧化脱色反应(脱色活性)、
②催化对木质素的氧化分解反应[氧化分解活性]、
③催化式(V)
Figure C0381566000132
所示的靛蓝胭脂红、以及式(VI)：
Figure C0381566000133
所示的Natural Orange 6的氧化聚合反应[氧化聚合活性]
④催化4-氨基安替比林与从酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中选择出来的一种化合物的氧化偶联反应[氧化偶联活性]、
⑤催化对从酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中选择出来的一种化合物的直接氧化反应[直接氧化活性]。
作为上述酚化合物、如酚、2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、氢醌、邻苯三酚、没食子酸、棓酸丙酯、1-萘酚、儿茶酸等。而作为上述的氨基苯酚化合物如o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚等。另外作为二氨基苯酚，如o-苯二胺、m-苯二胺、p-苯二胺等。作为上述的杂环化合物，如5-羟基吲哚、2，6-二氨基吡啶。
另外关于上述底物特异性，上述①的脱色活性、上述②的氧化分解活性以及上述③的氧化聚合活性可以通过下面步骤确定：
a)将含有底物(染料、木质素等)的105.3mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)950μl于25℃下预温育5分钟，获得底物溶液的步骤，
b)将上述步骤a)得到的底物溶液和含有本发明培养物的培养溶液50μl混合，于25℃下温育60分钟的步骤，以及
c)对于上述步骤b)得到的产物测定对应于底物的波长的吸光度的步骤。
其中，作为染料对于伊文思蓝(Evans’Blue)、Acid Blue 80、Remazol Brilliant Blue R以及Acid Violet 17，在上述步骤c)中通过分别测定600nm、600nm、600nm以及550nm的吸光度，可以评价对各个染料的脱色活性。另外，对于上述木质素，在上述步骤c)中通过测定450nm的吸光度，可以评价对各个染料的氧化分解活性。另外，作为上述染料，对于靛蓝胭脂红以及Natural Orange 6，在上述步骤c)中可以通过分别测定600nm以及450nm的吸光度，评价对各个染料的氧化聚合活性。
另外，上述④的氧化偶联活性是通过以下步骤确定的。
a)将含有0.4μmol的氢供体和4.0μmol的4-氨基安替比林的105.3mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)190μl于25℃下预温育1分钟，获得底物溶液的步骤，
b)将上述步骤a)得到的底物溶液和含有本发明的培养物的培养溶液10μl混合，于25℃下温育60分钟的步骤，以及
c)对于上述步骤b)得到的产物测定对应于氢供体的波长的吸光度的步骤，其中以酚化合物、二氨基苯酚化合物和杂环化合物作为底物时，测定490nm的吸光度变化，当以氨基苯酚作为底物时测定450nm的吸光度变化。
另外⑤的直接氧化活性是通过以下步骤确定的。
a)将含有0.1mmol的底物的0.89mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)180μl于25℃下预温育1分钟，获得底物溶液的步骤，
b)将上述步骤a)得到的底物溶液和含有本发明的培养物的培养溶液20μl混合，于25℃下温育60分钟的步骤，以及
c)对于上述步骤b)得到的产物，根据底物不同，测定490nm、450nm或405nm的波长的吸光度的步骤。
本发明的培养物在pH6.0～pH8.0范围表现出高的酚氧化酶样活性。本发明的培养物由于在上述pH范围对各种酚化合物都表现出高的酚氧化酶样活性，所以表现出不必进行特别的pH调整，就可以进行有效反应的优点。
本发明的培养物在20～60℃范围表现出高的酚氧化酶样活性。本发明的培养物由于在上述温度范围都表现出高的酚氧化酶样活性，所以表现出不必调节到特别的温度，就可以在日常的生活温度(室温、水温、体温、气温等)下表现出高的活性。因此可以简便地进行染色、废液处理、高分子合成等。
另外，本发明的培养物在pH 5.0～pH9.5，于30℃下温育1小时时，与温育前的活性进行比较，保持约75％以上的相对剩余活性，在pH4.0～pH 10.5，于30℃下温育1小时的情况下，与温育前的活性进行比较，保持约40％以上的相对剩余活性。另外本发明的酚氧化酶化合物的pH稳定性当在30℃下温育20小时的情况下，与温育前的活性进行比较，在pH 7.0～pH9.0，保持约75％以上的相对剩余活性。本发明的培养物由于在上述pH范围都表现出好的pH稳定性，所以表现出不必进行特别的pH调整，就可以使用基于水反应溶液的优点。
本发明的培养物在0～40℃，pH 6.0温育1小时的情况下，与温育前的活性进行比较，保持约75％以上的相对剩余活性。本发明的培养物由于在上述温度范围都表现出优越的热稳定性，所以不必调节到特别的温度条件，就可以发挥在日常温度使用和保存的优越效果。因此可以发挥廉价而且简便地进行染色、废液处理、高分子合成等的优越效果。
本发明的培养物的一大特征是，它是在pH大于7.0的条件下，对属于Flammulina属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体后得到培养物。
本发明的培养物是在pH大于7.0的条件下，对属于Flammulina属菌类进行培养所得的培养物，表现出在pH 6.0～8.0范围显示出高的酚氧化酶样活性的优越性质。
另外在本说明书中，所谓“pH大于7.0的条件”是pH大于7.0，且pH 13.0以下的条件，优选pH7.5～11.0，更优选pH 8.0～10.0的条件。
本发明的培养物可以是对属于Flamulina属菌类进行培养后得到的培养液，也可以是从该培养液中除去菌丝体后得到培养物。因此，对Flammulina属菌类在培养基中进行适当培养，可以由菌丝体外的培养生成物简便供给所述培养物。另外通过将除去的菌丝体在新的培养基中进行培养，可以得到本发明的培养物，由此可以使该菌丝体再循环。在本发明中也包括本发明的培养物的制造方法。
本发明的制造方法的一大特征是通过对Flammulina属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体后可得到培养物。
如果利用本发明的制造方法通过对Flammulina属菌类进行培养，可以发挥简便、而且大量获得具有酚氧化酶样活性的培养物的优越效果。另外通过将除去的菌丝体在新的培养基中进行培养，再循环，可以发挥廉价而且简便获得具有酚氧化酶样活性的培养物的优越效果。
在对Flammulina属菌类的培养中，可以使用液体培养基、或固体培养基中的任一种。
作为在本发明的制造方法中使用的培养基的碳源，例如只要是属于Flammulina属菌类可以同化的都可以，如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等糖类、麦糠、柑桔渣等，上述碳源可以单独、或将2种以上碳源组合后使用。另外，作为氮源，如豆腐渣、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母提取物、麦芽提取物、脱脂大豆粉、玉米浆、尿素等有机氮源；硝酸钾、硫酸铵等无机氮等，上述氮源可以单独，也可以2种以上组合使用。在本发明制造方法使用的培养基中，根据需要也可以添加磷酸盐、硫酸镁、碳酸镁、碳酸钠、钾、钙、铁、铜、锌、锰、
等无机盐类、维生素类等。培养基中的上述碳源、氮源等的浓度只要是适合使生产本发明培养物的担子菌、特别是属于Flammulina属菌类充分增殖，使酚氧化酶样活性表达的浓度就可以，具体来说，碳源为0.1～20重量％、优选1～10重量％，氮源为0.1～10重量％，优选1～5重量％。
上述培养基的pH只要是适合使属于Flammulina属菌类充分增殖，使酚氧化酶样活性、特别是与上述基质特异性相伴的酚氧化酶样活性以及与上述反应最适pH相称的酚氧化酶样活性表达的pH就可以，从使与上述性质(例如、底物特异性、反应最适pH)相称的酚氧化酶样活性充分表达的观点考虑，希望pH大于7.0的pH(初期pH)、优选pH 7.5～11.0，最优选是pH 8.0～10.0。因此，希望将培养基调整到这样的pH，灭菌后使用。
培养温度只要是丝状体增殖的温度就可以，实用上10～40℃为好，优选20～35℃。
另外，对属于Flammulina属菌类进行液体培养时，最好是通气培养或振荡培养。
培养时间随各种培养条件不同而不同，通气培养时，通常为2～10天。另外，上述培养时间也可以以培养液的活性值达到最大时作为指标进行设定。
本发明的培养物可以分泌生产到菌体外，蓄积在培养液中。因此，可以直接使用上述培养液，也可以在培养后，通过离心分离、滤纸或滤布等过滤除去菌体等不需要的物质，作为培养上清液获得。
另外，在本发明中，对于以上述培养液得到的培养物和以培养上清液得到的培养物，如果可以使酚氧化酶样活性进一步提高，或从配合在化妆品、非医药品等制品的观点考虑，也可以进行脱色、浓缩、冷冻干燥、透析、盐析等。
另外，通过将本发明的培养物与各种染料、色素等一起使用，可以进行角蛋白纤维的染色。因此，本发明提供染色方法。
本发明的染色方法其一大特征是在培养物存在下，使染色对象物和染料接触。按照本发明的染色方法，由于使用本发明的培养物，通过各种染料可以廉价而且简便地对染色对象物进行染色。另外，按照本发明的染色方法由于使用本发明的培养物，不需进行特别的温度条件、pH条件的调节，可以在外界环境条件下进行。
作为上述染色对象物，如棉、乙酰醋酸酯、亚麻、亚麻布、liocel、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、苎麻、laen、tencel、三乙酸酯、毛皮、兽皮、皮革、绢或毛制布、丝、纤维、衣料、木材、毛发、膜等。
作为上述染料，可以将例如二氢吲哚以及二氢吲哚化合物、吲哚化合物、按照非医药品原料规格记载的氧化染料等作为底物进行氧化，也可以使用偶联剂。
作为二氢吲哚以及二氢吲哚化合物，具体例子如二氢吲哚、5，6-二羟基二氢吲哚、N-甲基-5，6-二羟基二氢吲哚、N-乙基-5，6-二羟基二氢吲哚、N-丁基-5，6-二羟基二氢吲哚、4-羟基-5-甲氧基二氢吲哚、6-羟基-7-甲氧基二氢吲哚、6，7-二羟基二氢吲哚、4，5-二羟基二氢吲哚、4-甲氧基-6-羟基二氢吲哚、N-己基-5，6-二羟基二氢吲哚、2-甲基-5，6-二羟基二氢吲哚、3-甲基-5，6-二羟基二氢吲哚、4-羟基二氢吲哚、2，3-二甲基-5，6-二羟基二氢吲哚、2-甲基-5-乙基-6-羟基二氢吲哚、2-甲基-5-羟基-6-β-羟基乙基二氢吲哚、4-羟基丙基二氢吲哚、2-羟基-3-甲氧基二氢吲哚、6-羟基-5-甲氧基二氢吲哚、6-羟基二氢吲哚、5-羟基二氢吲哚、7-羟基二氢吲哚、7-氨基二氢吲哚、5-氨基二氢吲哚、4-氨基二氢吲哚、5，6-二羟基二氢吲哚羧酸、1-二甲基-5，6-二羟基二氢吲哚、以及他们的盐类等。
作为吲哚化合物，具体例子如4-羟基吲哚、5-羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸、5，6-三(t-丁氧基羰酰氧基)吲哚、5，6-二(t-丁氧基羰酰氧基)吲哚、5-t-丁氧基羰酰氧基-6-羟基吲哚、6-t-丁氧基羰酰氧基-5-羟基吲哚、5，6-二(乙氧基羰酰氧基)吲哚、5，6-二(t-乙基氨甲酰氧基)吲哚、1-三甲基乙酰基-5-(三甲基乙酰氧甲氧基)-6-三甲基乙酰氧吲哚、1-三甲基乙酰基-5-三甲基乙酰基氧甲氧基-6-羟基吲哚、5，6-(氧羰酰甲氧基)吲哚等。
作为按照非医药品原料规格记载的氧化染料，具体例子如5-氨基-o-甲酚、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚、2，6-二氨基吡啶、5-(2-羟基乙基氨基)-2-甲基苯酚、N，N-二(β-羟基)-p-苯二胺·硫酸盐、p-硝基-o-苯二胺、p-硝基-2’，4’-二氨基偶氮苯·硫酸钠、甲苯-2，5-二胺、5-氨基-o-甲酚·硫酸盐、p-氨基苯酚·硫酸盐、o-氯-p-苯二胺·硫酸盐、4，4’-二氨基二苯胺·硫酸盐、p-甲基氨基苯酚·硫酸盐、p-苯二胺·硫酸盐、m-苯二胺·硫酸盐、甲苯-2，5-二胺·硫酸盐、2，4-二氨基苯氧基乙醇·盐酸盐、甲苯2，5-二胺·盐酸盐、m-苯二胺·盐酸盐、2，4-二氨基苯酚·盐酸盐、3，3-亚氨基二苯酚、p-苯二胺·盐酸盐、N-苯基-p-苯二胺·盐酸盐、N-苯基-p-苯二胺·醋酸盐、1，5-二羟基萘、甲苯-3，4-二胺、p-甲基氨基苯酚、N，N’-二(4-氨基苯基)-2，5-二氨基-1，4-醌二亚胺、o-氨基苯酚·硫酸盐、2，4-二氨基苯酚·硫酸盐、m-氨基苯酚·硫酸盐等。
在本发明中也可以使用2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、1-氨基-4-甲基氨基蒽醌、硝基-p-苯二胺盐酸盐、1，4-二氨基蒽醌、硝基-p-苯二胺、苦氨酸、苦氨酸钠、2-氨基-5-硝基苯酚·硫酸盐、间苯二酚、硝基-p-苯二胺·硫酸盐、p-硝基-o--苯二胺·硫酸盐、p-硝基-m--苯二胺·硫酸盐等直接染料。
在培养物的存在下，染色对象物与染料的接触可以通过例如在使用时将染料和培养物混合后与染色对象物接触，或在使用时在大气中使在厌氧条件下保存的染料和培养物的混合物与染色对象物接触进行。
另外，根据本发明的培养物，提供染色用组合物。
本发明的染色组合物其一大特征在于含有本发明的培养物。因此，根据本发明的染色用组合物，于氧气存在下、在外界环境条件下对各种染料、特别是苯酚化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物中的任一个，对最适pH无需做大的变动，发挥在中性附近的pH可以进行高效染色的优越效果。
在本发明的组合物中，本发明的培养物的含量从实用的染色时间的观点考虑，例如对毛发染色用组合物100g，酚氧化酶样活性为0.05～100KU，更好为0.5～25KU。而上述酚氧化酶样活性是用3mM的p-苯二胺作为底物，在25℃条件下，于pH7.0在1分钟内使490nm的吸光度增加1的量定义为1单位(U：unit)的值。
对本发明的染色用组合物其染料或色素具体可以使用上述的二氢吲哚以及二氢吲哚化合物、吲哚化合物、按照非医药品原料规格记载的氧化染料等，也可以使用偶联剂。另外，也可以使用上述的直接染料。
在本发明的染色用组合物中，染料或色素的含量从实用的染色时间的观点考虑，染色用组合物中为0.0005～12重量％，优选0.005～6重量％。
另外，本发明的染色用组合物也可以通过用表现本发明培养物的生理活性的染色用酸、碱、他们的缓冲液等调整pH。具体例子如盐酸、硫酸等无机酸；膦酸、醋酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、磺酸等有机酸；氨；单异丙醇胺、单乙醇胺等胺类；碳酸铵等碳酸盐类；氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化物盐等。
在本发明的染色用组合物中在不损害酚氧化酶样活性的范围内，可以配合硫代乳酸、亚硫酸钠、N-乙酰-L-半胱氨酸等还原剂。另外，在不损害本发明效果的范围内，除了上述成分之外，也可以适当配合表面活性剂、油性成分、硅氧烷类、增粘剂、溶剂、水、螯合剂、香料等。
另外，在将本发明的染色用组合物作为毛发用的染色用组合物时，例如可以在厌氧条件下，作为含有染料和培养物的一个包装式染色用组合物，通过使用时涂布于毛发上，与空气接触，进行毛发染色。另外，作为在含有培养物的组合物和含有染料的组合物的多包装式染色用组合物，也可以在使用时，将两个组合物混合后涂布于毛发上进行毛发染色。另外，本发明的染色用组合物可以做成液剂、膏剂、凝胶剂等各种适于各种染色的剂型使用。
本发明的培养物由于具有酚氧化酶样活性，所以除了上述的纤维和毛发的染色之外，对于纸浆和纤维的漂白、废液中的酚化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、木质的改善等的利用也是有用的。
以下通过实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1 Flammulina velutipes(IFO 30601)的培养物的制备(1)培养物的制备1
在净化台内进行以下操作。
在含有固体培养用琼脂培养基[组成：2.4重量％土豆葡萄糖培养液[Difco公司生产]、2.0重量％琼脂、其余为水]10ml的灭菌培养皿中接种相当于1白金环量的Flammulina velutipes(IFO 30601)，于25℃下培养10天。然后，用灭菌的白金环将在琼脂培养基整体中成长的菌丝体切成每边5mm的四方小片。
将上述小片10片接种到液体培养用培养基1[组成：2.4重量％土豆葡萄糖培养液[Difco公司生产]、其余为水(pH 5.2)；于121下灭菌15分钟]，于25℃下反复振荡培养(反复150次/分)7天。
将得到的培养液全量都添加到2L的三角烧瓶中的500ml的上述液体培养用培养基中，于25℃下反复振荡培养(反复100次/分)3周。
然后，使成长的片状菌丝体静置沉淀，除去培养液，向剩下的菌丝体中添加液体培养用培养基2[组成：1.0重量％葡萄糖、0.1重量％酵母提取液、0.14重量％(NH4)2SO4、0.36重量％K2HPO4、0.02重量％MgSO4·7H2O、0.1％无机混合物(组成：1.0重量％CuSO4·5H2O、1.0重量％ZnCl2、0.7重量％FeCl3·6H2O、0.5重量％CoSO4·7H2O、0.5重量％MnCl2·4H2O)、pH 9.2；于121℃下灭菌15分钟]500ml，再于25℃下培养3天。
然后，使成长的片状菌丝体静置沉淀，通过倾析回收培养物。得到的培养物是淡黄色、或黄褐色的清澄或混浊的液体。
(2)培养物的制备2
将上述(1)得到的Flammulina velutipes IFO 30601的培养物进行减压过滤后得到滤液。
将上述滤液的pH用氢氧化钠调整到7.5。对于1L得到的混合物，添加5g的DEAE-cellulose[Sigma公司生产]载体，于4℃下振荡搅拌30分钟。然后，静置10分钟，除去上清。
向得到的DEAE-cellulose载体中添加含有该载体3倍容量的1M氯化钠的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.5)。对得到的混合物进行5分钟振荡搅拌，将吸附在DEAE-cellulose载体上的蛋白质洗脱下来。对得到的洗脱液进行减压过滤后回收，于4℃下对去离子水进行透析，将得到的的产物进行冷冻干燥，作为冷冻干燥产物得到培养物。
实施例2本发明的培养物的反应最适温度
使上述实施例1的(2)中得到的培养物(冷冻干燥产物)102mg(蛋白质质量：23mg、比活性15U/mg蛋白质)溶解(终浓度为0.02mg蛋白质/ml)，得到培养物。
就得到的培养物在各种温度条件(0、20、30、40、50、60、70以及80℃)下测定酚氧化酶样活性。具体来说，当以o-氨基苯酚作为底物时，在微量离心管[PorexBioProducts Inc.公司生产]中，将100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)0.89ml、50m的Mo-氨基苯酚的二甲基亚砜溶液0.1ml和培养物溶液0.01ml混合，对得到的混合物于各个反应温度下进行10分钟反应。然后，通过向反应液添加2M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)0.1ml，使反应停止。另外当以2，6-二甲氧基苯酚作为底物时，除了在上述的o-氨基苯酚作为底物时取代o-氨基苯酚，使用50mM2，6-二甲氧基苯酚水溶液外，其他都进行同样的操作。
然后，对于得到的各个反应产物通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定，当以o-氨基苯酚作为底物时，通过测定420nm的吸光度，评价活性，当以2，6-二甲氧基苯酚作为底物时，通过测定470nm的吸光度，评价活性。上述活性是以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1单位(U：unit)。结果如图1所示。在图1中，以最大活性作为100，活性用相对活性表示。其中图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。
就象图1所表示的那样，可知本发明的培养物的反应最适温度在20～60℃。
实施例3本发明的培养物的热稳定性
将与上述实施例2同样的培养物溶液在各种温度条件(0、20、30、40、50、60、70以及80℃)下，于0.18ml的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中温育60分钟，进行前处理。
当以o-氨基苯酚作为底物时，在微量离心管中，将得到的产物0.05ml、100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)0.85ml、50mMo-氨基苯酚的二甲基亚砜溶液0.1ml充分混合，通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定420nm下所得的混合物吸光度的变化，评价活性。另外当以2，6-二甲氧基苯酚作为底物时，在与上述以o-氨基苯酚作为底物的情况相比，除了用50mM2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM的o-氨基苯酚二甲亚砜溶液外，其他进行同样的操作，通过测定470nm吸光度的变化，评价活性。而上述活性是以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1单位(U：unit)。结果如图2所示。在图2中，以最大活性作为100，活性用相对剩余活性表示。其中图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。
就象图2所表示的那样，本发明的培养物，对于2，6-二甲氧基苯酚，一直到40℃仍表现出84％的相对剩余活性，在50℃，表现出45％的剩余活性，在60℃表现出22％的相对剩余活性。对于o-氨基苯酚，本发明的培养物一直到40℃还表现出91％的相对剩余活性，在50℃表现出62％的剩余活性，在60℃表现出40％的相对剩余活性。
实施例4本发明的培养物的最适pH
在本发明的培养物和各个底物反应时，作为缓冲液，根据pH使用0.2M甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH 11.5、pH 10.5、pH 9.5)、0.2MTris-HCl缓冲液(pH 10.0、pH 9.0、pH 8.0、pH 7.0)、0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)、0.2M醋酸钠缓冲液(pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5)以及0.2M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0、pH 2.0)。
当以o-氨基苯酚作为底物时，在微量离心管中，将与实施例2同样的培养物溶液0.02ml、上述各缓冲液0.88ml、50mM的o-氨基苯酚的二甲基亚砜溶液0.1ml充分混合，对于得到的混合物通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定420nm吸光度的变化，评价活性。另外当以2，6-二甲氧基苯酚作为底物时，与上述以o-氨基苯酚作为底物的情况相比，除了用50mM2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM o-氨基苯酚二甲亚砜溶液外，其他进行同样的操作，通过测定470nm的吸光度的变化，评价活性。
当以p-苯二胺作为底物时，在反应时，作为缓冲液，根据pH使用0.1MTris-HCl缓冲液(pH 9.0、pH 8.0、pH 7.5、pH 7.0)、0.1M磷酸钠缓冲液(pH 9.0、8.5、8.0、pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0)、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 8.0、pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0)。在微量离心管中，将上述培养物溶液5μl、上述各缓冲液0.895ml、100mM p-苯二胺水溶液充分混合，对于得到的混合物通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定490nm吸光度的变化，评价活性。
而上述活性是以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1单位(U：unit)。结果如图3所示。在图3中，以最大活性作为100，活性用相对活性表示。其中图A表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图B表示以o-氨基苯酚作为底物的情形，图C表示以p-苯二胺作为底物的情形。
就象图3所表示的那样，可知本发明的培养物，在以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形中，最适pH约6.0；在以o-氨基苯酚作为底物的情形中，最适pH约6.0；在以p-苯二胺作为底物的情形中，最适pH约6.5～8.0。
实施例5本发明的培养物的pH稳定性
将与上述实施例2同样的培养物溶液0.02m l与pH 2～11.5的各种缓冲液0.18ml混合后，通过于30℃下温育1小时或20小时，进行前处理。在进行前处理时，作为缓冲液，根据pH使用0.2M甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH 11.5、pH 10.5、pH 9.5)、0.2MTris-HCl缓冲液(pH 9.0、pH 8.0)、0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.0、pH 6.0)、0.2M醋酸钠缓冲液(pH 5.0、pH 4.0)以及0.2M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0、pH 2.0)。
然后在微量离心管中，将前处理后的培养物溶液0.02ml、上述缓冲液0.88ml、50mM o-氨基苯酚的二甲基亚砜溶液0.1ml充分混合，对于得到的混合物通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定420nm吸光度的变化，评价活性。另外当以2，6-二甲氧基苯酚作为底物时，与以上述o-氨基苯酚作为底物的实验相比，除了用50mM2，6-二甲氧基苯酚水溶液取代50mM o-氨基苯酚二甲亚砜溶液外，其他进行同样的操作，通过测定470nm的吸光度的变化，评价活性。而上述活性是以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1单位(U：unit)。结果如图4所示。在图4中，以最大活性作为100，用相对剩余活性表示。其中图A和B表示以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形，图C和D表示以o-氨基苯酚作为底物的情形。另外图A和C表示1小时后的pH稳定性，图B和D表示20小时后的pH稳定性。
就象图4所表示的那样，本发明的培养物在处理1小时的情况下在pH6.0～10.0稳定，保持75％的相对剩余活性。另外在处理20小时的情况下在pH7.0～9.0稳定，保持75％的相对剩余活性。
实施例6本发明的培养物的底物特异性
为了研究培养物的底物特异性，使用p-苯二胺、4-羟基吲哚、2-甲氧基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、p-氨基苯酚、o-氨基苯酚、ABTS、シリンガルダジン、L-酪氨酸作为底物，具体来说是在微量高心管中将上述培养物溶液0.05ml、0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)0.85ml、底物溶液(使用1mM浓度的L-酪氨酸、1.1mM浓度的シリンガルダジン，其他为50mM的浓度)0.1ml充分混合，对于得到的混合物通过分光光度计[Jasco公司生产，商品名：V-530]测定420nm吸光度的变化，评价活性。而上述活性是以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1单位(U：unit)。结果如表1所示。
表1
Figure C0381566000251
由表1的结果可知，本发明的培养物具有酚氧化酶样活性。
以下，就实施例1的(2)中得到的培养物的底物特异性通过测定含有各个底物的缓冲液的吸光度的变化研究由于培养物的作用发生的各种底物的化学变化。
作为底物，使用市售的色素(Evans’Blue、Acid Blue 80、RemazolBrilliant Blue R、靛兰胭脂红、Acid Violet 17、Natural Orange6)、以及木质素(商品名：Lignin Allkali、东京化成公司生产)。表2给出了对于各个底物的终浓度以及测定波长。
表2
Figure C0381566000261
具体来说，将含有调整到表2所示终浓度的底物的105.3mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)950μl于25℃下预温育5分钟，然后向得到的产物添加培养溶液50μl，使其在比色杯内反应，用分光光度计(岛津制作所生产、商品名：UV-2450)测定于各个底物的测定波长下的吸光度。为了进行比较，将上述的缓冲液换成105.3mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，也对来漆斑菌属菌类的胆红素氧化酶进行同样研究。
而活性的1个单位[U(unit)]定为在1分钟内使吸光度减少1的量。对于来自培养物的活性，表3给出了各个底物的比活性(U/mg蛋白质)。在表3中，没有符号标记的比活性表示分解活性或脱色活性，-(负号)表示的比活性表示聚合活性。
表3
Figure C0381566000271
就象表3所表示的那样，可知本发明的培养物催化在中性条件下偶氮系色素、蒽醌系色素以及Acid Violet 17的氧化脱色反应、木质素的氧化分解反应、靛兰胭脂红以及Natural Orange 6的氧化聚合反应。特别是能激烈催化Remazol Brilliant Blue R的氧化脱色反应以及木质素的氧化分解反应。另外，本发明的培养物与用于比较的来自Myrothecium属菌类的胆红素氧化酶对Remazol Brilliant BlueR、靛兰胭脂红以及Acid Violet 17的特异性有很大不同。
以下，就在上述实施例1的(2)得到的培养物的氧化偶联反应以本发明的培养物催化的由底物(氢供体)和4-氨基安替比林的氧化缩合引起的发色作为指标进行测定。
作为氢供体，使用酚化合物(酚、2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、澡苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、没食子酸、没食子酸丙酯、1-萘酚、儿茶酸)、氨基苯酚化合物(o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、p-氨基苯酚)、二氨基苯酚化合物(o-苯二胺、m-苯二胺、p-苯二胺)以及杂环化合物(5-羟基吲哚、2，6-二氨基吡啶)。
向含有4-氨基安替比林和任意氢供体的反应体系添加上述培养溶液后，对于酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物通过测定490nm的吸光度的变化，对于氨基苯酚通过测定450nm的吸光度的变化，测定本发明的培养物的活性。另外，对于难溶于水的底物，可以使用使该底物溶解于少量的二甲基亚砜，用去离子水稀释到目的浓度后的溶液。表4给出了各个底物的测定波长和终浓度。另外，表4中，DMSO是二甲基亚砜的略称。
表4
表中，「％」表示体积/体积％。
具体来说，在96孔的微滴定板[Corning公司生产，Costor(登录商标)3368]的孔内将含有0.4μmol的底物和4μmol 4-氨基安替比林的105.3mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)190μl于25℃下预温育5分钟。然后向得到的产物添加上述培养溶液10μl，温育1小时。对得到的产物测定490nm或450nm的吸光度的变化。关于氧化偶联反应的活性以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1个单位(U：unit)。
另外，为了进行比较，将上述的缓冲液换成105.3mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)也对来自漆斑菌属菌类的胆红素氧化酶进行同样研究。表5给出了对各个底物的比活性(U/mg蛋白质)。
表5
Figure C0381566000291
就象表5所表示的那样，本发明的培养物催化在中性条件下各种酚化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物和苯胺化合物的4-氨基安替比林的氧化偶联反应。对于酚化合物，本发明的培养物对没食子酸以及没食子酸丙酯以外的化合物表现出高活性。其中，对2-甲氧苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、1-萘酚、儿茶酸的活性特别高。对于氨基苯酚化合物，本发明的培养物对所有的化合物都表现出高活性。其中，对o-氨基苯酚以及p-氨基苯酚活性特别高。对于二氨基苯酚化合物，本发明的培养物对全部化合物都表现出高活性。对于杂环化合物，本发明的培养物对全部的化合物都表现出高活性。其中对2，6-二氨基吡啶活性特别高。
就象表5所表示的那样，可知本发明的培养物与来自漆斑菌属菌类的胆红素氧化酶底物特异性有很大不同，比活性也高。
另外，对于上述实施例中得到的培养物的直接氧化反应，通过以本发明的培养物直接作用于底物产生的、由于底物氧化聚合生成的发色作为指标进行测定。
作为底物，使用二氨基苯酚化合物(2-氯-1，4-苯二胺、p-苯二胺、2，5-二氨基甲苯、N-苯基-p-苯二胺、二苯乙烯-3，4-二胺、m-苯二胺)、氨基苯酚化合物(o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、p-甲基氨基苯酚)、以及酚化合物(2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、没食子酸、没食子酸丙酯、1-萘酚、1，5-二氢萘、2，3，4-三羟基苯酮、2，3，4，4-四羟基苯酮)。对于难溶于水的底物，可以使用使该底物溶解于少量的二甲基亚砜，用去离子水稀释到目的浓度后的溶液。表6给出了各个底物的测定波长和终浓度。另外，表6中，「％」表示体积/体积％。
表6
Figure C0381566000311
具体来说，在96孔的微滴定板[Corning公司生产，Costor(登录商标)3368]的孔内将含有0.1mmol的底物的0.89mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)180μl于25℃下预温育1分钟。然后向得到的产物添加上述培养溶液20μl。对得到的产物测定490nm、450nm或405nm的吸光度的变化。关于直接氧化反应的活性以在1分钟内使吸光度增加1的量作为1个单位(U：unit)。
另外，为了进行比较，对来自漆树的漆酶以及来自漆斑菌属菌类的胆红素氧化酶也同样研究在pH 7.0的底物特异性。
表7给出了将代表性的化学染料2-氯-1，4-苯二胺作为底物时的测定值定为100的有关各个底物的相对活性(％)。
表7
Figure C0381566000321
就象表7所表示的那样，本发明的培养物催化在中性条件(pH7.0)下各种二氨基苯酚化合物、氨基苯酚化合物和酚化合物直接氧化反应。至于二氨基苯酚化合物，对除了m-苯二胺以外的化合物都表现出了高活性。其中，对p-苯二胺以及N-苯基-p-苯二胺的活性特别高。至于氨基苯酚化合物，对除了m-氨基苯酚以外的化合物都表现出了高活性。其中，对o-氨基苯酚、p-氨基苯酚以及p-甲基氨基苯酚的活性特别高。至于酚化合物，对2，6-二甲氧基苯酚、间苯二酚、2，3，4-三羟基苯酮以及2，3，4，4-四羟基苯酮的活性特别高。其中，2，3，4-三羟基苯酮以及2，3，4，4-四羟基苯酮的活性更特别高。
另外，本发明的培养物与来自漆树的漆酶比较，对p-苯二胺、m-苯二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、以及2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、没食子酸、没食子酸丙酯、2，3，4-三羟基苯酮以及2，3，4，4-四羟基苯酮的活性更高，其中对m-苯二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、没食子酸的活性更高。
另外，本发明的培养物与来自漆斑菌属菌类的胆红素氧化酶比较，对p-苯二胺、2，5-二氨基甲苯、二苯乙烯-3，4-二胺、o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、p-氨基苯酚、p-甲基氨基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、没食子酸丙酯、1-萘酚、2，3，4-三羟基苯酮以及2，3，4，4-四羟基苯酮活性更高，其中对o-氨基苯酚、m-氨基苯酚、5-氨基-o-甲基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、对苯二酚、1-萘酚、2，3，4-三羟基苯酮以及2，3，4，4-四羟基苯酮活性更高。实施例7利用本发明的培养物进行染色
(1)本发明的培养物的染色性
利用上述实施例1得到的培养物进行染色试验。利用上述培养物通过氧化聚合，用染料(p-苯二胺以及o-氨基苯酚)对牦牛毛线和羊毛织物进行染色。即，将染料0.5g(使用两种染料时，合计1.0g)、作为增粘剂的羟乙基纤维素(HEC)0.75g、作为表面活性剂的聚氧乙烯(20)硬化蓖麻油(HC-20)1.0g、乳酸0.5g混合，用单乙醇胺将pH调整到7，用离子交换水将重量调到50g，得到基材。
将上述基材2g和上述培养物溶液(相当于3.5U的量)混合，将得到的混合物涂布在牦牛毛线1g和羊毛织物1块(2×3cm)。涂布后的牦牛毛线和羊毛织物于30℃下保持1小时。上述培养物溶液中的活性是以p-苯二胺作为底物，于pH 7.0、25℃的条件下的活性。
对被染色的牦牛毛线和羊毛织物，使用色差计(Minolta公司生产、商品名：Chromometer CM-3610d)，测定L值、a值、b值。然后根据上述的L值、a值、b值，利用式1：
Figure C0381566000341
算出ΔE值，通过这个ΔE值评价染色性。另外，上述ΔE值表示染色前的牦牛毛线和羊毛织物的色调和染色后的牦牛毛线和羊毛织物的色调色差。为了进行比较，对于来自漆树的漆酶也进行同样的染色试验。表8给出了对于各个底物的ΔE值。
表8
Figure C0381566000342
就象表8所表示的那样，利用本发明的培养物对于牦牛毛线和羊毛织物，无论哪一个染料的组合都证实明显的染色性。另外，本发明的培养物与用于比较的来自漆树的漆酶进行比较，虽然在p-苯二胺单独、o-氨基苯酚+p-苯二胺中染色性稍微差些，但在单独的o-氨基苯酚以及o-氨基苯酚+m-苯二胺中，却明显地表现出染色性方面的优越性。
(2)本发明的培养物的使用量的研究
改变在上述实施例1中得到的培养物的使用量，利用本发明的培养物进行染色试验。使用本发明的培养物氧化的染料(o-氨基苯酚)，通过氧化聚合对牦牛毛线和羊毛织物进行染色，用色差计测定L值、a值、b值。
具体来说，将作为染料(底物)的o-氨基苯酚0.5g、作为偶联剂的m-苯二胺0.5g、作为增粘剂的羟乙基纤维素(HEC)0.75g，作为表面活性剂的聚氧乙烯(20)蓖麻油(HC-20)1.0g和乳酸0.5g混合，用单乙醇胺将pH调整到7，用离子交换水将重量调到50g，得到基材。
对于牦牛毛线1g和羊毛织物1块(2×3cm)，将上述基材2g和作为蛋白质量的调整到0至0.8mg的培养物溶液混合，将得到的混合物涂布在牦牛毛线1g和羊毛织物1块(2×3cm)。涂布后的牦牛毛线和羊毛织物于30℃下保持1小时。
对被染色的牦牛毛线和羊毛织物，使用色差计(Minolta公司生产、商品名：Chromometer CM-3610d)，测定L值、a值、b值。然后根据上述的L值、a值、b值，算出ΔE值，通过这个ΔE值评价染色性。图5给出了因本发明的培养物的使用量不同，ΔE值的变化。图5的图A是使用牦牛毛线的结果，而图B表示使用羊毛织物时的结果。
就象图5所表示的那样，在牦牛毛线和羊毛织物中，通过使本发明的培养物的使用量增加，ΔE值增加，在牦牛毛线中的ΔE值使用相当于0.2mg蛋白质的量的本发明的培养物时达到一定值，在羊毛织物中1的ΔE值使用相当于0.5mg蛋白质的量的本发明的培养物时达到一定值。
实施例8酚氧化酶样活性的诱导条件的研究
(1)菌体的培养
将在上述实施例1(1)中得到的培养物(液体培养物)于弱酸性至弱碱性范围的5个培养pH(初期pH：pH 5.0、pH 6.0、pH7.0、pH 8.0、pH 9.0)条件的液体培养液培养基2(实施例1所述的培养基)中培养，研究氧化活性(酚氧化酶样活性诱导)的差异。
对上述液体培养物充分搅拌，将得到的培养物0.5ml添加到100ml的活性诱导培养基中，于28℃的恒温槽内振荡培养(振荡速度130次/分)10天。
每天，取1ml培养物，于4℃、12,000rpm下离心分离5分钟，将上清液通过用DISMIC-25cs(0.20μm)过滤，除去菌体。
将得到的样品保存在4℃下。
(2)通过培养pH条件不同引起活性诱导的变化的研究
通过测定上述(1)中得到的各个样品的酚氧化酶样活性，研究因培养pH条件不同引起活性诱导的变化。
酚氧化酶样活性的测定作为底物使用2，6-二甲氧基苯酚、在pH6.0的反应pH条件下，测定酚氧化酶样活性。
将50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)0.20ml、去离子蒸馏水0.65ml、50mM上述底物溶液0.10ml和培养物0.05ml添加到半微量比色杯中，搅拌，于室温下用商品名：UV-2400(岛津制作所生产)测定0～30秒的470nm的吸光度的变化。图6给出了因培养pH条件不同引起活性诱导的变化。
由上述结果可知，就象图6所表示的那样，使用的培养基的pH越高，在2，6-二甲氧基苯酚的反应最适pH，即pH6.0中的酶活性越高。特别是当使用的培养基的pH大于7.0(培养时在pH 7.3前后)时，在2，6-二甲氧基苯酚的反应最适pH的pH 6.0中的酶活性变高。
另外，当使用的培养基的pH为pH 5.0时，即使对菌体培养10天，也检测不到对2，6-二甲氧基苯酚的酶活性。
另外就象图6所表示的那样，当使用的培养基的pH为pH9.0时，培养到第10天的活性与使用的培养基的pH为pH6.0时，培养到第10天的活性比，可知活性大约高10倍(0.283/0.027)。
因此，可知培养物中的酚氧化酶样活性通过使用pH大于7.0的pH培养基，可以进一步被诱导。
试验例
(1)菌体的培养
用搅拌器将250g大豆破碎，将得到的破碎物加入到1L容量茄型烧瓶中，再添加750ml己烷。将得到的混合物用玻璃棒搅拌到己烷变为淡黄色后，通过油浴在85℃加热。加热开始后1小时停止加热，将得到的产物用ADVATEC公司生产的No.2滤纸过滤。
然后将得到的过滤物再进行抽滤过滤。于通风厨内放置24小时，使己烷蒸发，使得到的大豆粕干燥。
然后，制备培养基(组成：2.0重量％葡萄糖、1.0重量％蔗糖、2.0重量％大豆粕、0.5重量％玉米浆、0.1重量％K2HPO4、0.05重量％MgSO4·7H2O、10γ/ml，FeCl2·6H2O、pH 6.0)。这样的培养基就是特开昭60-156385号公报所述的培养基。
将上述实施例1(1)得到的培养物(液体培养物)0.2ml添加到加了上述培养基30ml的300ml容量的三角烧瓶中，于28℃的恒温槽内振荡培养(振荡速度130次/分)4天。然后，将得到的培养液添加到加了上述培养基300ml的2L容量的三角烧瓶中，于20～25℃的室温条件下，振荡培养(振荡速度130次/分)4天。
培养结束后，培养液用ADVATEC公司生产的No.2滤纸，抽滤过滤，除去菌体。然后，将得到的滤液于4℃、14,800rpm(30,000×g)下离心分离30分钟，将得到的上清液作为培养物。得到的培养物保存在4℃下。
(2)因反应pH条件不同引起的酶活性变化
在酚氧化酶样活性的测定中，作为底物分别使用2，6-二甲氧基苯酚以及p-苯二胺。另外在酚氧化酶样活性的测定中，在pH2.5～4.0范围使用甘氨酸盐酸缓冲液、在pH4.0～5.5范围使用醋酸钠缓冲液、在pH 5.5～7.5范围使用磷酸钠缓冲液、在pH 7.5～8.5范围使用Tris-HCl盐酸缓冲液、在pH 8.5～11.0范围使用甘氨酸氢氧化钠缓冲液。另外，使用p-苯二胺作为底物时，在酚氧化酶样活性的测定时，在pH 3.0～7.0也可以使用柠檬酸钠缓冲液进行测定。
将500mM上述缓冲液0.20ml、去离子蒸馏水0.65ml、50mM上述底物溶液0.10ml和培养物0.05ml添加到半微量比色杯中，搅拌，于室温下用商品名：UV-2400(岛津制作所生产)测定0～30秒的470nm的吸光度的变化。另外，对于上述实施例1中得到的本发明的培养物也同样测定酚氧化酶样活性。图7给出了这些测定结果。
结果表明，与实施例1得到的本发明的培养物(图7图C和图D)情形相比，上述(1)中得到的培养物(图7的图A和B)，无论使用哪一种底物在酸性一侧都有最适pH。
由此可知，本发明的培养物中的酚氧化酶样活性与通过在pH 6.0的条件下培养得到的培养物的类酚氧化酶活性明显不同。
处方例
以下给出本发明涉及到的染色用组合物的处方例。将以下的组合物运用于白发，可以将白发染成黑色。配合量为重量％。
处方例1(凝胶型)
p-苯二胺              1.5
间苯二酚              0.3
m-间氨基苯酚          0.1
实施例1(2)的培养物    0.1
抗坏血酸钠            1.0
羟乙基纤维素          1.0
柠檬酸                适量
单乙醇胺              调整到pH 7.0
精制水                余下部分
合计                  100.0
处方例2(膏型)
p-苯二胺              1.0
p-氨基苯酚            0.8
m 氨基苯酚            0.1
十六醇                6.0
实施例1(2)的培养物         0.05
聚氧乙烯(20)十六醚         4.0
硬脂酰基三甲基氯化铵       1.0
L-半胱氨酸盐酸盐           0.2
柠檬酸                     适量
单乙醇胺                   调整到pH 7.0
精制水                     余下部分
合计                       100.0
处方例3(膏型)
5，6-二羟基二氢吲哚        1.0
5，6-二羟基吲哚-2-羧酸     0.5
o-氨基苯酚                 0.5
乙醇                       5.0
十八醇                     1.5
实施例1(2)的培养物         0.2
聚氧乙烯(40)硬化蓖麻油     3.0
聚甘油脂肪酸酯             4.0
N-乙酰半胱氨酸             0.1
黄原酸胶                   0.5
ACCULIN(注册商标)22        0.1
羟乙基纤维素               0.1
单异丙醇胺                 适量
单乙醇胺                   适量
精制水                     余下部分
合计                       100.0
处方例4(气溶胶型)
甲苯-2，5-二胺             1.5
p-氨基苯酚                 0.2
间苯二酚                   0.1
m-氨基苯酚                 0.1
聚氧乙烯(15)十六醚    2.0
丙二醇                5.0
亚硫酸钠              0.3
单乙醇胺              适量
柠檬酸                适量
实施例1(2)的培养物    0.3
液化石油气            4.0
精制水                余下部分
合计                  100.0
产业上利用可能性
利用本发明的培养物可用于纤维毛发的染色、纸浆和纤维的漂白、废液中的酚化合物的去除、内分泌紊乱物质的分解、酚醛树脂的制造、人工漆涂料的制造、木质的改善等，并可廉价、而且简便地进行。利用本发明的培养物的制造方法可以简便、廉价、而且大量获得上述培养物。另外，利用本发明的染色方法以及染色用组合物，在外界环境条件下对各种染料、特别是苯酚化合物、氨基苯酚化合物、苯二胺化合物中的任一种最适pH无需做大的变动，在中性附近的pH可以高效地、廉价、而且简便地对染色对象物进行染色，在纤维和毛发的染色中也有用。

Claims (6)

1.一种具有酚氧化酶样活性、来自Flammulina属的菌类的培养物，所述培养物的最适温度为20-60℃，所述培养物的最适pH，在以2，6-二甲氧基苯酚作为底物的情形中为约6.0；在以o-氨基苯酚作为底物的情形中为约6.0；在以p-苯二胺作为底物的情形中为约6.5～8.0；
所述培养物是在10-40℃、pH8.0-10.0的条件下，对属于Flammulina属菌类进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体、并收集所得的培养物得到的，其中所述的Flammulina属的菌类是Flammulina velutipes并且所述的培养物具有下述①～⑤的底物特异性：
①催化：式(I)所示的伊文思蓝
Figure C038156600002C1
式(II)所示的Acid Blue 80
Figure C038156600002C2
式(III)所示的Remazol Brilliant Blue R，
Figure C038156600003C1
以及式(IV)所示的Acid Violet 17
Figure C038156600003C2
分别进行氧化脱色反应、
②催化对木质素的氧化分解反应
③催化式(V)
Figure C038156600003C3
所示的靛蓝胭脂红、以及式(VI)：
所示的Natural Orange 6的氧化聚合反应
④催化选自4-氨基安替比林与选自酚类化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中的一种化合物的氧化偶联反应
⑤催化对选自从酚类化合物、氨基苯酚化合物、二氨基苯酚化合物以及杂环化合物中的一种化合物的直接氧化反应。
2.权利要求1所述的培养物，其特征在于所述的Flammulinavelutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
3.权利要求1或2所述的具有酚氧化酶样活性的、来自属于Flammulina属的菌类的培养物的制造方法，其特征是对所述的Flammulina属菌类在10-40℃、pH8.0-10.0的条件下进行培养，从得到的培养液中除去菌丝体后得到培养物，其中所述的Flammulina属的菌类是Flammulina velutipes。
4.权利要求3所述的制造方法，其特征在于Flammulinavelutipes是Flammulina velutipes IFO 30601。
5.一种染色方法，其特征是在权利要求1或2所述的培养物存在下，使染色对象物和染料接触。
6.一种含有权利要求1或2所述的培养物的染色用组合物。
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