JPH08502411A

JPH08502411A - ヘムタンパク質の安定化

Info

Publication number: JPH08502411A
Application number: JP6510574A
Authority: JP
Inventors: アンドレホルム，カイ; クレブスランゲ，ニールス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 1996-03-19
Also published as: EP0669975A1; WO1994010298A1; DK131792D0

Abstract

(57)【要約】ヘムタンパク質が次式（Ｉ）：R-O-(CHR′-CH₂-O-)_n （式中、Ｒは水素又はＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルでありそしてｎは４−50000である）の安定剤によって水性溶液中で安定化される。

Description

【発明の詳細な説明】ヘムタンパク質の安定化技術分野本発明は、ヘムタンパク質特にオキシドリダクターゼ例えばペルオキシダーゼ又はカタラーゼに関する。背景技術種々のオキシドリダクターゼ、例えばペルオキシダーゼ又はカタラーゼは、ヘムタンパク質であることが知られている。それらは多くの起源から、例えば西洋わさびおよび微生物例えばコプリナス（Coprinus）EP 179,486フミコラ（Humico la）又はシュタリジウム（Scytalidium）（WO 92/17571）から得ることができる。ペルオキシダーゼはしみの漂白を改善するため（WO 89／09813）又は一の繊維から他の繊維に染料が移行するのを阻止するため過酸化水素前駆体と共に洗剤に添加できる。ペルオキシダーゼの他の公知の使用は、パルプおよび製紙産業においてであり（ヨーロッパ特許（EP）418,201、EP 429,422、EP 433,258）更にパーティクルボード（米国特許4,432,921）の製造においてである。カタラーゼは、例えば繊維の漂白後残留過酸化水素を除去するため使用してもよい。幾つかの場合において、変性および酵素活性の損失に対しヘムタンパク質の安定性を改善することが望ましく、そして本発明の目的は溶液中のヘムタンパク質を安定化する方法を提供することにある。発明の開示本発明者等は驚くべきことに次の内容を見出した。すなわち、一定のアルコキシル化非イオン化合物、例えばポリエチレングリコールおよびアルキルフェノールエトキシレートが溶液中のペルオキシダーゼの如きヘムタンパク質に対する強い安定化効果を有する。米国特許4,414,326およびヨーロッパ特許公開 0272578は、コレステロールの測定のため酵素試剤組成物における上記タイプのアルコキシル化化合物の使用を開示している。該化合物はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含んでいた。そのような文献は、コレステロールエステラーゼの活性化と安定化並びにコレステロールオキシダーゼの活性化（米国特許4,414,326、９欄26〜28行；ヨーロッパ特許公開272578、２欄1 8〜20行）を記載している。ペルオキシダーゼに対するアルコキシル化化合物の効果は、記載されていなかった。コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼの使用は、本発明においては予期されていなかった。従って、本発明は水性溶液中のヘムタンパク質を安定化する方法を提供するものであり、この方法は次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ₁−Ｃ₂₀アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルでありそしてｎは４−50000である）で表わされる安定剤を包含せしめることを特徴とする。本発明は又、前記安定剤を混入することを特徴とする、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素又はそれらの前駆体を添加することを含んでなるプロセスを提供する。最後に、本発明はまた、前記安定剤を混入したことを特徴とする、スラリー、無粉塵性粒質物又は安定化された液体の形態で該漂白組成物又は該プロセスにおいて使用するためのペルオキシダーゼ調製品を提供する。本発明の詳細な説明ヘムタンパク質本発明方法は、如何なるヘムタンパク質、例えばオキシドリダクターゼに適用できる。例としては、ペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）、例えばコプリナス（C oprinus）（特にＣ．シネレウス（cinereus）、ヨーロッパ特許179486参照）由来のペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ（リグニナーゼ）、例えばファネロケテクリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来、又はカタラーゼ、例えばフミコラ（Humicola）又はスチタリジウム（Scytalidium）由来が挙げられる。他の例としてはハロペルオキシダーゼ、すなわち基質内で炭素−ハロゲン結合を形成するためハロゲン化物イオンおよび過酸化水素を利用するペルオキシダーゼであり、例えばクロロペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.10）、ブロモペルオキシダーゼ又はヨードペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.8）である。ヘムタンパク質は、組換えDNA工学（WO 92／16634）により生産できる。他の例は、セロビオースオキシダーゼ又はシトクロムオキシダーゼである。ペルオキシダーゼの量は、典型的には１ｌの水性溶液当たり0.1−５PODUに相当する。PODU（ペルオキシダーゼ単位）は、以下に定義されるペルオキシダーゼの尺度である。ペルオキシダーゼの場合には、本発明は増加した安定性に加えて増加した活性を提供する。安定剤本発明において用いられる安定剤は次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ_1-20アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルであり、そしてｎは４−50000である）を有する。安定剤は、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール（すなわち、上記式中Ｒが水素である）であってよい。この場合、鎖長（ｎ）は好ましくは50−500、特に100−300である。択一的に、安定剤はアルコールエトキシレート又はアルキル−フェノールエトキシレート（プロポキシレート）であってよく、ここでＲはＣ₁₀−Ｃ₁₈線状又は枝分れ鎖アルキル又はアルキル−フェニル基である。鎖長（ｎ）は、好ましくは５−50、特に５−20である。適当な安定化のため、前記安定剤の量はヘムタンパク質に対する安定剤の重量比が１−50であるようなそのよう量である。安定剤の適当な量は、１ｌの水性溶液当たり0.1−５ｇ、１−30重量％の漂白剤組成物又は１−10重量％のペルオキシダーゼ調製品である。安定剤およびペルオキシダーゼの適当な割合はペルオキシダーゼ活性（単位は以下に定義）PODU当たり0.2−５mgの安定剤に相当する。安定剤は典型的にはpH４−10の範囲内の、より好ましくは６−８の範囲内のpH で用いられる。過酸化水素源本発明において、過酸化水素の源は過酸化水素それ自身、その前駆体又はその発生せしめることのできる酵素系てあってよい。過酸化水素の前駆物質は、無機もしくは有機過酸又はそれらの塩、例えばナトリゥムパーボレート又はナトリゥムパーカーボネートである。酵素系は、適当なオキシダーゼとその基質の組合せであってよく、例えばグルコースとグルコースオキシダーゼである。ペルオキシダーゼ又はカタラーゼを用いるプロセス本発明によれば、ペルオキシダーゼ又はハロペルオキシダーゼは、例えば製紙用パルプの漂白プロセスにおいて（スウェーデン88／0673、ヨーロッパ特許418, 201）、パルプ製造からの廃水処理において（米国特許4,623,465、特開平２−31 887）、繊維製品からのメカニカルパルプの製造において（ヨーロッパ特許429,4 22、ヨーロッパ特許433,258）およびリグニンの改質に対し、例えばパーティクルボードの製造において（米国特許4,432,921）、過酸化水素又はその前駆物質と共に使用できる。カタラーゼは、染色前にアルカリ水素過酸化物により漂白される布帛から過酸化水素を除去するために使用され得る（英国特許2,216,149、特開平２−104781）。ペルオキシダーゼ調製品本発明のペルオキシダーゼ調製品は、スラリー、粒質物又は安定化液体として貯蔵および船積みに適した形態で提供され得る。酵素粒質物は、公知方法により、例えば抽出又はカナダ特許974,907、米国特許4,106,991、米国特許4,435,307又は米国特許4,661,452に従いドラム造粒によって製造することができる。安定剤は、グラニュールのコア中で他の成分と、好ましくは１重量％超、より好ましくは２％超、特に５％超そして一般に40％未満で混合され得る。択一的に、安定剤は予備形成された酵素粒質物を塗布することにより、包含せしめられ得る。塗料中の安定剤の量は、塗布された粒子の少なくとも１重量％を構成すべきである。塗布は、公知の方法により、例えば英国特許1,362,365の１頁、82行〜２頁、34行、および英国特許出願34973／73 およびベルギー特許146,802に相当する英国特許出願10842／74に記載される如く適用できる。塗布物質は、エトキシル化化合物に加えて、他のろう質塗布物質および粒状物質、例えばケイ酸マグネシウム、アルミノ珪酸塩、CaSO₄，CaCO₃、ベントナイト、ゼオライト、又はTiO₂を含んでいてもよい。本発明に係る液体酵素調製品は、当業者に公知の安定剤を包含せしめることにより微生物感染に対し安定化され得る。例として、無機塩（NaClの如く）、糖（スクロースおよびグルコースの如く）、ポリオール（グリセロール、ポリプロピレングリコールおよびソルビトールの如く）およびアルコール（エタノールおよびイソプロパノールの如く）が挙げられる。これらは10％超、特に20％超の量で一般に有効である。他の例は、有機酸（例えば、安息香酸、プロピオン酸、乳酸およびギ酸）であり、これらは低pH（５未満）で0.01−２％の量で一般に有効である。安定剤の他の例は、酸化防止剤（例えば二酸化硫黄）、１，２−ベンズ −イソ−チアゾリン−３−オン（BIT）およびパラベン（parabens）である。液体酵素調製品中の分散剤の量は、好ましくは１−10重量％である。酵素スラリーは、国際公開（WO）91／09941に従って製造することができる。ペルオキシダーゼ活性（PODU）の測定ペルオキシダーゼ活性は、（べルクマイヤーH.U.,Methods of Enzymatic anal ysis，３版、III巻、P.286−293，1983改訂に記載される如く）過酸化水素による、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート（ ABTS）（商標）の酸化に基づく分析によって測定される。生成した帯緑−青色を 418nmで測光する。分析条件は、0.88mMの過酸化水素、1.67mMnのABTS、0.1Ｍのホスフェート緩衝液、pH7.0、30℃で３分間インキュベートする。１ペルオキシダーゼ単位（PODU）は、これらの条件で毎分１μmolの過酸化水素の変換を触媒する酵素の量である。カタラーゼ活性（CIU）の測定１カタラーゼ単位（CIU）は、pH 7.0、25℃で毎分１μmoleのH₂O₂を分解し、この間H₂O₂濃度は反応混合物１ml当たり10.3μmolesから9.2μmolesに減少する。過酸化水素の分解は、240nmで分光測定器を用いて追跡される。実施例例１ペルオキシダーゼの安定化 pH7.0の0.1Ｍホスフェート緩衝液中に0.14、0.28、1.4又は2.8PODU／mlのコプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼおよび１ｇ／ｌの安定剤を含有する複数の溶液を作成した。試験される安定剤は、ポリエチレングリコール（分子量6,00 0）およびオクチルフェノールポリエトキシレート（エトキシル化の平均度：10 ；トリトンX405）であった。溶液を22℃で３時間保持し次いでペルオキシダーゼ活性をインキュベーションの前と後で測定した。ブランク実験を安定剤なしで同様の方法で行った。表１に示される結果は、初期活性の３時間後の残留活性（％）として表わされる。結果は、安定剤なしの対照においては相当に急速なペルオキシダーゼの非活性化を示しそして１ｇ／ｌの各安定剤の添加により十分な安定化を示す。一方、0.2ｇ／ｌのオクチルフェノールエトキシレートを用いそれ以上は同様の条件で更に試験したが十分な安定化が得られた。例２ペルオキシダーゼの安定化例１におけると同じ緩衝液中に、西洋わさびペルオキシダーゼ又はコプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼをオクチルフェノールエトキシレートと共に又はそれなしで含有する複数の溶液を調製し、次いでペルオキシダーゼ活性をAB TS（商標）法により測定した。結果：結果は、両方のペルオキシダーゼの活性がオクチルフェノールエトキシレートの添加により約10％だけ増加していることを示している。例３ペルオキシダーゼの安定化 0.2mlの10.6mM H₂O₂を含有する２mlの２mM ABTS（商標）（pH7.0）中に溶解した0.2mlの約0.1PODU／mlのコプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼの複数の溶液を30℃でインキュベートした。幾らかのペルオキシダーゼサンプルをトリトン（Triton）X405（0.2ｇ／ｌ）を加え、一方他のもの（対照）は安定剤を含有していなかった。追加の実験において、50mMの硫酸アンモニウムをインキュベーション前にABTS試剤に加えた。結果を表２に示す。表２から以下の内容が明らかである；すなわち約11％の酵素の増加が、トリトンX405の添加により得られる。硫酸アンモニウムの存在は、約10％の記録された ODにおいて追加の増加をもたらす。例４安定剤の用量ペルオキシダーゼサンプル中のトリトンX405の濃度を例２に記載した条件下（但し、温度は０℃であった）、インキュベーション前に０ｇ／ｌから1.5ｇ／ｌに変化させた。酵素活性を0.15および3.5時間に測定した。結果を表３に示す。表３から次の内容が明らかである；すなわち、改善されたペルオキシダーゼ安定性は、（インキュベーション中約0.1ｇ／ｌのトリトンX405の濃度に対応する）１ｇ／ｌ又は1.5ｇ／ｌトリトンX405を0.2mlのペルオキシダーゼを加えることによって得られる。例５酵素用量サンプル中のコプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼの濃度を、0.3−0.6PO DU／mlから３−６PODU／mlに変えた。ペルオキシダーゼサンプル中のトリトンX4 05の濃度は1.5ｇ／ｌであった。ABTS（商標）を用いたインキュベーションは、例２に記載した如く行った、但し温度は22℃であった。表４から次の内容が明らかである；すなわちトリトンX405の存在は低および高ペルオキシダーゼ濃度の双方で、ペルオキシダーゼ活性を３まで安定化させる。例６カタラーゼの安定化カタラーゼ溶液を、15％プロピレングリコールを加え次いでpH7.0に調節することによりWO 92／17571に従って得られた培養ブロスの濾液から得た。安定剤を表５に示す如く加えた。各溶液を25又は37℃で２週間又は４週間貯蔵し、貯蔵前と貯蔵後にカタラーゼ活性を測定し、そして結果を初期活性の％単位で残留活性として示した。例１で用いた同じ安定剤を用いた。表５から明らかなように、４週間のインキュベーション後において非常にわずかなカタラーゼ活性の損失がみられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１月１０日【補正内容】請求の範囲１．水性溶液中のヘムタンパク質を安定化する方法であって、ここにおいてヘムタンパク質が微生物起源であり、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ₁−Ｃ₂₀アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルでありそしてｎは４−50000である）で表わされる安定剤を包含せしめることを特徴とする前記方法。２．オキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）、ヨードペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.8）又はクロロペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.1 0）又はカタラーゼを安定化する請求の範囲第１項記載の方法。３．前記安定剤の量が、PODU（ペルオキシダーゼ活性）当たり0.2−５mgに相当する、請求の範囲第１又は２項のいずれか１項に記載の方法。４．ヘムタンパク質に対する前記安定剤の重量比が、１〜50の範囲内にある、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５．ＲがＣ₁₀−Ｃ₁₈線状又は分枝鎖アルキル又はアルキルフェニル基でありそしてｎは５−50（好ましくは５−20）である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６．Ｒが水素でありそしてｎが50−500（好ましくは100−300）である、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。７．前記安定剤の量が、水性溶液11当たり0.1〜５ｇの範囲内にある、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。８．ペルオキシダーゼおよび過酸化水素又はその前駆物質を添加することを含んでなる方法であって、ここにおいてペルオキシダーゼは微生物起源であり、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ_1-20アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルであり、そしてｎは４−50000である）を有する安定剤を含有せしめることを特徴とする、前記方法。９．更に請求の範囲第３〜６項のいずれか１項の記載におけると同様の内容を特徴とするか、又は請求の範囲第７項記載におけると同様の内容を特徴とする水性溶液中におけることを特徴とする、請求の範囲第８項記載の方法。 10．製紙用パルプの漂白、パルプ生産からの廃水の処理のための、又はリグニン改質のための請求の範囲第12又は13項記載の方法。 11．スラリー、粒質物又は安定化液体の形態にあるペルオキシダーゼ調製品であって、ここにおいてペルオキシダーゼが微生物起源であり、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ_1-20アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルであり、そしてｎは４−50000である）を有する安定剤を含んでなる、前記ペルオキシダーゼ調製品。 12．更に請求の範囲第３〜６項のいずれか１項の記載における如く特徴とする、請求の範囲第11項記載のぺルオキシダーゼ調製品。 13．１〜10重量％の前記安定剤を含んでなる、請求の範囲第11又は12項記載のペルオキシダーゼ調製品。 14．塗料中に前記安定剤を含有する、請求の範囲第11〜13項のいずれか１項に記載の塗布された粒質物。

Claims

【特許請求の範囲】１．水性溶液中のヘムタンパク質を安定化する方法であって、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ₁−Ｃ₂₀アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルでありそしてｎは４−50000である）で表わされる安定剤を包含せしめることを特徴とする前記方法。２．オキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）、ヨードペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.8）又はクロロペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.10 ）又はカタラーゼを安定化する請求の範囲第１項記載の方法。３．前記安定剤の量が、PODU（ペルオキシダーゼ活性）当たり0.2−５mgに相当する、請求の範囲第１又は２項のいずれか１項に記載の方法。４．ヘムタンパク質に対する前記安定剤の重量比が、範囲１〜50内にある、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５．ＲがＣ₁₀−Ｃ₁₈線状又は枝分れ鎖アルキル又はアルキルフェニル基でありそしてｎは５−50（好ましくは５−20）である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６．Ｒが水素でありそしてｎが50−500（好ましくは100−300）である、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。７．前記安定剤の量が、水性溶液１ｌ当たり0.1〜５ｇの範囲内にある、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。８．ペルオキシダーゼおよび過酸化水素又はその前駆物質を添加することを含んでなる方法であって、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ_1-20アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルであり、そしてｎは４−50000である）を有する安定剤を含有せしめることを特徴とする、前記方法。９．更に請求の範囲第３〜６項のいずれか１項の記載におけると同様の内容を特徴とするか、又は請求の範囲第７項記載におけると同様の内容を特徴とする水性溶液中におけることを特徴とする、請求の範囲第８項記載の方法。 10．製紙用パルプの漂白、パルプ生産からの廃水の処理のための、又はリグニン改質のための請求の範囲第12又は13項記載の方法。 11．スラリー、粒質物又は安定化液体の形態にあるペルオキシダーゼ調製品であって、次式： R-O-(CHR′-CH₂-O-)_nH （Ｉ）（式中、Ｒは水素又はＣ_1-20アルキル、アリール又はアルキルアリールであり、Ｒ′は水素又はメチルであり、そしてｎは４−50000である）を有する安定剤を含んでなる、前記ペルオキシダーゼ調製品。 12．更に請求の範囲第３〜６項のいずれか１項の記載におけると同様に特徴とする、請求の範囲第11項記載のペルオキシダーゼ調製品。 13．１〜10重量％の前記安定剤を含んでなる、請求の範囲第11又は12項記載のペルオキシダーゼ調製品。 14．塗料中に前記安定剤を含有する、請求の範囲第11〜13項のいずれか１項に記載の塗布された粒質物。