JP5069133B2 - 新規の微生物酵素およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的、詳細、および利点は、以下の図、詳細な説明、および実施例から明確になるであろう。
チロシナーゼ陽性の微生物に対するプレートスクリーニング
チロシナーゼ活性のスクリーニングのための指示薬は、文献から選択した。L-チロシン、p-クレゾール、p-クマル酸、チラミン、3-ヒドロキシアントラニル酸、およびカテキンは、表1に示す濃度で用いた。トリコデルマ・リーゼイは、選択した指示薬(表1)(Difco)を含む麦芽エキス寒天培地において、37℃で48日間培養した。プレート上の可能な色の変化を視覚的に観察した。
トリコデルマ・リーゼイからのtyr1およびtyr2遺伝子の単離
新規のチロシナーゼ遺伝子は共に、ゲノムT.リーゼイDNAからPCRにより増幅した。tyr1に対して使用したプライマーは以下である:
GCT ACC GCG GAT GGG CTT CCT CGC TCG CCT CAC (配列番号5)および逆方向:
CTG AGG ATC CTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCT CCC ACA ACA CCA ATC TCA GCA T (配列番号6)。
GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTA TCA TGC TGT TGT CAG GTC CCT CTC G (配列番号7)および逆方向プライマー:
GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCA GAG GAG GGA TAT GGG GAA CGG CAA A (配列番号8)。
強力なプロモーター存在下における、トリコデルマ・リーゼイ中のtyr2遺伝子の過剰発現
tyr2遺伝子フラグメントを、LR組み換え反応により、pDONR221ベクターからT.リーゼイ発現ベクターpMS186に移した。このベクターは、cbh1(セロビオヒドロラーゼ1)プロモーターとターミネーターとの間に挿入されたGateway リーディングフレームカセットC (RfC)を含有する。このベクターは、T.リーゼイ形質転換体の選択に対するハイグロマイシン耐性カセットも有する。LR組み換え反応は、製造業者により指示されたGateway組み換えキット(インビトロゲン社製)を用いて行った。この組み換えにおいて、tyr2遺伝子フラグメントはcbh1プロモーターとターミネーターの間に挿入され、プラスミドpMS190を生じる(図2)。
液体培養液におけるTYR2の産生
陽性形質転換体は、4%ラクトース、2% 蒸留器の廃粒子(distiller's spent grain)、100 mM PIPPS、および2 mM CuSO4を補充したトリコデルマ最小培地(Penttila et al., 1987)中で、8日間フラスコ振とう培養した。チロシナーゼ活性は、基質として15mM L-ドパ(L-3, 4 ジヒドロキシフェニルアラニン), (シグマ社製)を用いた培養の上清サンプルから測定した。前記活性は、2mMの濃度のL-チロシン(シグマ社製)の場合についても測定した。両方の活性測定は、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中、25℃で行われ、475nmにおけるドパクロムの形成をモニタリングした。モル吸光係数ε 3400 M-1 cm-1 (Robb, 1984)を用いた。測定は、二光波分光光度計(Lambda 20, Perkin-Elmer, Uberlingen, Germany)を用いて行った。活性は、ナノカタールとして表した。3つの最も良い形質転換体は、40、35、および11nkat/mlのチロシナーゼ活性を生じた。
TYR2の精製
遠心分離して濃縮した培養液上清(実施例4で得られた)を、初めにアビセル(Avicel)微結晶セルロース(0.2 g/ml 培養液上清)で処理して結合させ、セルラーゼを除去した。サンプルを4℃で10分間、一定の撹拌条件下でインキュベートした。上清を遠心分離により回収した(10000rpm)。緩衝液を10 mM トリス-HCl 緩衝液, pH 7.3に変え、Sephadex G-25 Coarse カラム (2.6 x 27 cm; Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いた。続く精製ステップは、AKTA(登録商標)精製器(アマシャムバイオサイエンス, Uppsala, Sweden)を用いて行った。サンプルを、10 mM トリス-HCl緩衝液, pH 7.3で最初に予め平衡化したHiPrep(登録商標) 16/10 CM セファロースファストフローカラムに適用した。トリス-HCl緩衝液中における0〜180mM NaClの直線勾配(120ml)を用いてタンパク質を溶出した。チロシナーゼ陽性画分を集め、Vivaspin 20 (10000 MWCO, PES, Vivascience)を用いて8.2mlの濃度まで濃縮し、ゲルろ過カラム、150mM NaClを含有する20 mM トリス-HCl、pH 7.5を用いて平衡化したHiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR カラム(AKTA, ファルマシア)に適用した。活性画分を集め、濃縮した。
TYR2の生化学的な特徴づけ
タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて、Bio-Rad DC タンパク質分析キット(Bio-Rad, Richmond, USA)により測定した。いくつかのタンパク質濃度は、Hitachi U-2000分光光度計(Hitachi, Tokyo, Japan)を用いて、280nmでの吸収をモニタリングすることにより決定した。チロシナーゼ活性は、実施例4に記載したように測定した。
チロシナーゼの基質特異性
種々の選択された基質におけるチロシナーゼの基質特異性は、酸素消費量測定により調べた。基質の濃度は2.5mMとし、化合物は0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0に溶解した。反応は、1.8 mlの2.5 mM 基質溶液および24μgの精製したTYR2を用いて行った。参考文献のように、基質特異性分析は、商業的なアガリクス・ビスポラス(Agaricus bisporus)粗製チロシナーゼ(シグマ社製)についても行った。それぞれ、50μgの前記マッシュルームチロシナーゼが試験に用いられた。試験に使用されたモノ-、ジ-、およびトリ-フェノール化合物の構造を表3および4に示す。TYR2およびアガリクスチロシナーゼは、ペプチド鎖の異なる位置にチロシンを含有する選択されたモデルペプチドを用いて分析した(表5)。TYR2およびアガリクスチロシナーゼによるL-/DL-D-ドパおよび-チロシンの酸化も測定した(表6)。
TYR2により引き起こされる、単離されたニワトリ胸筋筋原繊維の塩溶解性タンパク質(SSP)の分子量における変化は、SDS-PAGEにより分析した。SPPは、Xiong and Brekke, 1989により単離した。酵素処理のために、SSPは、0.6M NaClを含有する50 mM Na-リン酸緩衝液, pH 7中に懸濁し、タンパク質濃度を3 mg/mlとした。タンパク質グラム当り120nkatまたは240nkatのTYR2を懸濁液に加えた。対照懸濁液は、酵素を添加せずに同様の方法で処理した。反応混合物を30℃でインキュベートした。サンプルを、2分、1時間、3時間、および24時間のタイムポイントで取った。SDS-PAGEサンプル緩衝液を加え、サンプルを沸騰水浴中で加熱した。各サンプルからの20μgのタンパク質を12%トリス-HClポリアクリルアミドゲル上に負荷した。SDS-PAGEは、Laemmli, 1970により行った。
3%の商業的なカゼイン塩を水中で混合し、0.4% GDL(グルコノ-δ-ラクトン)および20 nkat/g のTYR2のタンパク質を混合物に加えた。室温で22時間置き、その後、ゲルの硬さをテクスチャーアナライザーで測定した(図6)。チロシナーゼ処理はカゼイン塩ゲルの硬さを2倍にした。
小麦生地の大きな変形レオロジーにおけるTYR2の効果は、Kieffer 伸展性器具(Stable Micro Systems, Ltd. United Kingdom)を用いて検討した。生地の伸展性および伸展に対する耐性は、酵素用量および生地を休ませる時間の関数として測定した。
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Claims (39)
- チロシナーゼ活性を有するタンパク質またはその成熟形態からなるタンパク質であって、配列番号3もしくは配列番号4に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、トリコデルマ属から得られるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、そのN末端にシグナル配列を含んでなるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、前記タンパク質の成熟形態は、配列番号4のアミノ酸19〜410からなるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、配列番号5と配列番号6に示す配列または配列番号7と配列番号8に示す配列を有するプライマー対を用いて増幅することによりトリコデルマ属のDNAから得られるポリヌクレオチドにより、コードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質であって、トリコデルマ・リーゼイから得られるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、配列番号1または配列番号2に含まれる配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、配列番号3または配列番号4に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、配列番号3または配列番号4に示すアミノ酸配列のチロシナーゼ活性フラグメントを含んでなるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、配列番号1または配列番号2に示す配列を有する核酸とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質であって、約42.9kDaの分子量、約9のpI、約8〜8.5の至適pH、アルカリ性または中性pHにおける活性を有する天然タンパク質であるタンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2に含まれる配列を有するか、または配列番号1または配列番号2に示す配列を有する核酸とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド。
- 請求項12または13に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドがcbh1のような強力なプロモーターの存在下で導入される発現ベクター。
- 請求項14または15に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
- 請求項16に記載の宿主細胞であって、糸状菌または酵母種である宿主細胞。
- 請求項17に記載の宿主細胞であって、トリコデルマ属である宿主細胞。
- 請求項18に記載の宿主細胞であって、トリコデルマ・リーゼイである宿主細胞。
- 請求項1に記載のタンパク質を産生する方法であって、
a)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するステップと、
b)前記タンパク質の発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
c)産生したタンパク質を任意に回収および精製するステップとを含んでなる方法。 - 請求項20に記載の方法であって、
a)細胞外チロシナーゼをコードするDNA配列であって、配列番号5と配列番号6、または配列番号7と配列番号8に示す配列を有するプライマー対を用いた増幅によりトリコデルマ属DNAから得られるDNA配列を、宿主細胞に導入するステップと、
b)発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
c)分泌されたタンパク質を培地から回収し、それを任意に精製するステップとを含んでなる方法。 - 請求項20または21に記載の方法であって、導入されたDNAがトリコデルマ・リーゼイから得られる方法。
- 請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法であって、前記宿主細胞がトリコデルマ属である方法。
- 請求項23に記載の方法であって、前記宿主細胞がトリコデルマ・リーゼイである方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を産生する方法であって、請求項1に記載のタンパク質をコードする細胞外チロシナーゼ遺伝子の発現を増強する効果のあるプロモーターを宿主細胞に導入するステップと、前記プロモーターを前記遺伝子に動作可能に結合するステップと、前記タンパク質の発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、産生されたタンパク質を任意に回収および精製するステップとを含んでなる方法。
- 請求項20〜25のいずれか1項に記載の方法により得られるタンパク質。
- タンパク質含有物質を修飾するための、チロシナーゼ活性を有する請求項1に記載のタンパク質の使用。
- 請求項27に記載の使用であって、前記タンパク質が、チロシン含有タンパク質の架橋結合のために使われる使用。
- 請求項28に記載の使用であって、前記タンパク質が、肉、乳製品、野菜、および穀物のような食物タンパク質を架橋結合させるために使われる使用。
- 請求項27に記載の使用であって、前記タンパク質が、シルク、ウール、カシミア、アルパカ、またはヒトの髪のようなタンパク質繊維または繊維誘導ポリマーを架橋結合させるために使われる使用。
- 請求項1に記載のタンパク質の使用であって、チロシン含有ペプチドを修飾するための使用。
- 請求項1に記載のタンパク質の使用であって、チロシンからL-ドパに酸化するための使用。
- タンパク質含有物質を修飾するための方法であって、前記物質を、チロシナーゼ活性を有する請求項1に記載のタンパク質と接触させる方法。
- 請求項33に記載の方法であって、チロシン含有タンパク質を架橋結合させることを含んでなる方法。
- 請求項34に記載の方法であって、肉、乳製品、野菜、および穀物のような食物タンパク質を架橋結合させることを含んでなる方法。
- 請求項33に記載の方法であって、シルク、ウール、カシミア、アルパカ、またはヒトの髪のようなタンパク質繊維または繊維誘導性ポリマーを架橋結合させることを含んでなる方法。
- チロシン含有ペプチドを修飾する方法であって、前記ペプチドを、チロシナーゼ活性を有する請求項1に記載のタンパク質と接触させる方法。
- チロシンをL-ドパに酸化する方法であって、前記チロシンを、チロシナーゼ活性を有する請求項1に記載のタンパク質と接触させる方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を含んでなる酵素製剤。
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