FI118567B - Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö - Google Patents

Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI118567B
FI118567B FI20055059A FI20055059A FI118567B FI 118567 B FI118567 B FI 118567B FI 20055059 A FI20055059 A FI 20055059A FI 20055059 A FI20055059 A FI 20055059A FI 118567 B FI118567 B FI 118567B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protein
seq
tyrosinase
tyrosine
ser
Prior art date
Application number
FI20055059A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20055059A (fi
FI20055059A0 (fi
Inventor
Raija Lantto
Johanna Buchert
Karin Autio
Markku Saloheimo
Kristiina Kruus
Emilia Selinheimo
Original Assignee
Valtion Teknillinen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Valtion Teknillinen filed Critical Valtion Teknillinen
Publication of FI20055059A0 publication Critical patent/FI20055059A0/fi
Priority to FI20055059A priority Critical patent/FI118567B/fi
Priority to AU2006212149A priority patent/AU2006212149B2/en
Priority to KR1020077020739A priority patent/KR20080030550A/ko
Priority to NZ560352A priority patent/NZ560352A/en
Priority to CA002597462A priority patent/CA2597462A1/en
Priority to CNA2006800080813A priority patent/CN101137749A/zh
Priority to JP2007554586A priority patent/JP5069133B2/ja
Priority to PCT/FI2006/050055 priority patent/WO2006084953A1/en
Priority to EP06708959.9A priority patent/EP1848798B1/en
Priority to US11/815,988 priority patent/US7910344B2/en
Publication of FI20055059A publication Critical patent/FI20055059A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118567B publication Critical patent/FI118567B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M15/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M15/01—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with natural macromolecular compounds or derivatives thereof
    • D06M15/15—Proteins or derivatives thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2101/00—Chemical constitution of the fibres, threads, yarns, fabrics or fibrous goods made from such materials, to be treated
    • D06M2101/02—Natural fibres, other than mineral fibres
    • D06M2101/10—Animal fibres
    • D06M2101/12—Keratin fibres or silk

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Treatments For Attaching Organic Compounds To Fibrous Goods (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)

Description

118567
Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee entsyymitekniikkaa ja tarkemmin sanottuna uusia sienientsyymiproteiineja ja niiden käyttötapoja. Se koskee lisäksi 5 kyseisiä entsyymejä koodaavia polynukleotideja, menetelmiä näiden valmistamiseksi ja kyseisten entsyymien valmistuksessa käyttökelpoisia ilmentämis-vektoreita ja isäntäsoluja.
Keksinnön tausta
Entsyymejä käytetään useissa erityyppisissä teollisuusprosesseissa 10 selluloosan ja paperin valmistuksen, tekstiilien valmistuksen ja elintarvikkeiden, rehujen ja virvoitusjuomien valmistuksen alalla. Entsyymejä käytetään myös kosmeettisten ja farmaseuttisten aineiden valmistuksen alalla ja pesuaineissa. Teollisuusentsyymit voivat olla peräisin eläimistä, kasveista tai mikrobeista ja solunulkoiset entsyymit ovat edullisia. Ne ovat tavallisesti kohtalaisen stabiileja 15 ja niitä voidaan tuottaa vaikeuksitta yhdistelmätekniikalla. Solunsisäisten entsyymien eristys ja puhdistus isäntäsoluista on kallista ja työlästä, minkä johdosta on edullista, että entsyymi on solunulkoinen, toisin sanoen solusta erittyvä proteiini. Halutaan lisäksi, että entsyymiä voidaan tuottaa suurina määrinä teollisessa mittakaavassa ja että organismi on turvallinen ja viljeltävissä vai-20 keuksitta ja taloudellisesti.
• · ·.
’·* ’ Proteiinit ovat uusiutuvien raaka-aineiden merkittäviä ainesosia ja • m : elintarvikkeet, tekstiilikuidut ja muut näitä vastaavat materiaalit sisältävätkin ·· merkittäviä määriä proteiinia. Näiden materiaalien sisältämien proteiinien ja j.:*: niiden teknisten ominaisuuksien modifiointiin voidaan käyttää entsyymejä. Pro- : 25 teiinimatriksia voidaan modifioida hydrolyyttisillä entsyymeillä (proteaaseilla), :***: jotka kykenevät pienentämään proteiinin molekyylipainoa. Proteiineja voidaan ··· myös modifioida entsyymeillä, jotka kykenevät muodostamaan kovalenttisia sil- :·. toja proteiinien sisältämien aminohappotähteiden välille (esimerkiksi käy trans- • ♦· glutaminaasi, joka tuottaa lysiini- ja glutamiinitähteiden välisiä isopeptidisiltoja), T 30 tai entsyymeillä, jotka kykenevät hapettamaan tiettyjä aminohappotähteitä.
♦ ··
Tiettyjen aminohappotähteiden hapettuminen voi myös puolestaan johtaa silto-*:**: jen muodostumiseen. Proteiinipitoisen materiaalin modifiointia silloittamalla käytetään usein esimerkiksi elintarvikkeiden prosessoinnissa. Elintarvikkeen • » ..... laadun kyseessä ollessa on rakenne erittäin oleellinen tekijä. Se ei liity ainoas- ♦ · ♦ ·· 2 118567 taan aistein saatavaan havaintoon vaan myös vedenpidätyskykyyn, geeliyty-mis-ja emulgoitumisominaisuuksiin ja stabiilisuuteen.
Entsyymiavusteista rakenteen muokkausta proteiineja silloittamalla voidaan käyttää useissa elintarvikesovellutuksissa, esimerkiksi lihan, kalan, 5 maitotuotteiden ja viljan prosessoinnissa. Transglutaminaasi on tunnettu entsyymi esimerkiksi lihan osien sitouttamiseen kylmässä uudelleenstruktruoitujen lihatuotteiden valmistamiseksi, rakenteen parantamiseen ja jauhettujen lihatuotteiden vedensidontakyvyn parantamiseen, kalaraaka-aineiden rakenteen parantamiseen, maitogeelin muodostamiseen jogurtin valmistuksessa, jolloin 10 vesi saadaan pysymään tavallista paremmin Ilman haitallista synereesi-ilmiötä, pastatuotteiden keiton jälkeen tapahtuvan rakenteen heikkenemisen ehkäisyyn, laatuluokaltaan matalista jauhoista leivotun leivän viipaletilavuuden parantamiseen. Vegetaristeille tarkoitettujen elintarvikkeiden entsymaattista silloitusta esimerkiksi transglutaminaasilla kuvataan julkaisussa WO 03/007 728.
15 Transglutaminaasin tiedetään katalysoivan proteiinien sisäistä tai vä listä silloittumista sen välityksellä, että tällöin muodostuu e(K-glutamyyli)lysiini-isopeptidisidoksia sellaisten proteiinien sisällä/välille, kuten myosiini, gelatiini, kollageeni, kaseiini, kaseinaatti, heraproteiini, soijaproteiini, gluteeni, kanan-munaproteiinit (Kuraishi et ai., 2001; Nielsen, 1995). Reaktiivisuus on kuitenkin 20 riippuvainen kohteena olevien aminohappojen, toisin sanoen lysiinin ja gluta-miinin, esiintymisestä proteiinisubstraatissa sekä kyseisen entsyymin mahdolli-suuksista päästä vaikuttamaan näihin. Siten kaikki substraatit eivät ole sopivia • · · transglutaminaasin substraatteja sen vuoksi, että entsyymi ei pääse vaikutta-maan riittävässä määrin proteiinin sisältämiin glutamiini- tai lysiinitähteisiin, tai /*;* 25 että näiden määrä on vähäinen.
• · · ;··* ·' Fenolioksidaasit, jotka käyttävät elektroniakseptorina happea, so- : veltuvat erityisen hyvin entsymaattisiin prosesseihin, koska näissä reaktioissa • · · ei tarvita kallista regenerointia vaativia erillisiä kofaktoreita, toisin sanoen NAD(P)H/NAD(P):tä. Näitä fenolioksidaaseja ovat esimerkiksi lakkaasi ja tyro-30 sinaasi. Nämä kumpikin ovat kupariproteiineja ja voivat hapettaa useita erilai-siä fenoliyhdisteitä. Lakkaasien ja tyrosinaasien substraattispesifisyys on osit- • tain päällekkäistä.
• · ***\ Tyrosinaasi katalysoi sekä monofenolien ja aromaattisten amiinien o-hydroksylaatiota että o-difenolien hapettumista o-kinoneiksi tai o-aminofeno- ·:··: 35 lien hapettumista o-kinoni-imiineiksi (Lerch, 1981). Tyrosinaasit voidaan erot- :***· taa perinteisesti lakkaaseista substraattispesifisyyden ja inhibiittoriherkkyyden «n 3 118567 perusteella. Erottelu perustuu nykyisin kuitenkin rakenteellisiin piirteisiin. Ty-rosinaasien ja lakkaasien välinen tärkein rakenteellinen ero on se, että tyrosi-naasi sisältää binukleaarisen kuparikohdan, jossa tällä entsyymillä on aktiivisessa keskuksessaan kaksi tyypin III kuparia, kun taas lakkaasilla on aktiivi-5 sessa keskuksessa yhteensä neljä kupariatomia (tyypin I ja II kuparit ja tyypin III kuparien muodostama pari).
Tyrosinaasi kykenee hapettamaan proteiinien tyrosiinitähteitä vastaaviksi kinoneiksi, jotka voivat reagoida edelleen esimerkiksi vapaiden sulf-hydryyli- ja/tai aminoryhmien kanssa, mikä johtaa tyrosiini-kysteiini- ja tyrosiini-10 lysiinisiltojen muodostumiseen (Ito et ai., 1984). Kinonien on myös ehdotettu muodostavan tyrosiini-tyrosiinisidoksia kytkeytymällä toisiinsa.
Menetelmiä proteiinien silloittamiseksi lakkaaseilla on kuvattu esimerkiksi julkaisussa US2002/9770. Sopiviksi substraatteiksi on lueteltu pavuista ja viljoista peräisin olevat kasviproteiinit sekä eläinproteiinit, joita ovat maito, 15 muna, liha, veri ja jänteet. Lakkaasit muodostavat kuitenkin proteiineihin ja myös muihin mahdollisiin substraatteihin (esimerkiksi fenolikomponentteihin) radikaaleja. Tätä prosessia on tästä syystä vaikeampaa ohjata kuin kinoneista lähtöisin olevia tyrosinaasin katalysoimia reaktioita, joissa ei muodostu radikaaleja. Lakkaasin katalysoimassa reaktiossa voivat myös jotkin stabiilit radi-20 kaalit säilyä matriksissa, mikä aiheuttaa matriksin depolymeroitumista ja tämän jälkeistä hajoamista ajan funktiona. Sienten lakkaaseja kuvataan julkaisussa US2002/19 038.
i t ·
Tyrosinaasin kyvystä silloittaa elintarvikkeiden proteiineja on laadittu :;i.: katsauksia (Matheis ja Whitaker, 1984; Matheis ja Whitaker, 1987). Näissä tut- • · /·;* 25 kimuksissa on käytetty Agaricuksen solunsisäistä tyrosinaasia. Proteiinien sil- • · · j*Y loittaminen tyrosinaasilla etenee sen välityksellä, että proteiiniin sitoutuneesta : tyrosiinista muodostuu o-kinoneja. Nämä o-kinonit joko kondensoituvat toisiin- • * sa tai reagoivat proteiineissa esiintyvien vapaiden amino- ja sulfhydryyliryhmi-en kanssa.
30 Tyrosinaaseja on ehdotettu käytettäväksi heraproteiinien silloittami- :***: sessa (Thalmann ja Loetzbeyr, 2002) ja taikinan fysikaalisten ominaisuuksien • « · modifioinnissa (Takasaki ja Kawakishi, 1997). Elintarvikeproteiinisovellutusten • * *·*·[ lisäksi tyrosinaaseja voidaan käyttää esimerkiksi kosmeettisten ja farmaseuttis- *# * ten tuotteiden valmistuksen alalla (DE 102 44 124). Julkaisussa WO 99/57 993 ·:··· 35 kuvataan silloitusentsyymien käyttöä märehtijöiden rehussa ja julkaisussa :**·; US2003/0 177 589 kuvataan menetelmää proteiinipitoisten kuitujen käsittele- • *t 4 118567 miseksi tyrosinaasientsyymillä, millä estetään esimerkiksi viilasta valmistettujen tekstiilien kutistuminen. Konjugaatteja, joita saadaan saattamalla polypep-tidi, kuten gelatiini, ja polysakkaridi, kuten kitosaani, kosketukseen tyrosinaasin kanssa, kuvataan julkaisussa WO 2004/029 096. Gelatiini-kitosaanikonjugaat-5 tia voidaan käyttää lääketieteellisissä sovellutuksissa. Tyrosinaasia on myös käytetty kollageenisyiden ainesosina olevien tropokollageenimakromolekyylien polymerointiin (Dabbous, 1966). Molekyylinsisäisten ja molekyylien välisten siltojen muodostuminen tyrosiinitähteiden välillä johti polymeroitumiseen.
Tyrosinaasit ovat luonnossa laajalle levinneitä. Ne liittyvät melanii-10 nin ja eumelaniinin synteesiin kasveissa, nisäkkäissä ja hyönteisissä. Entsy-maattiset ruskettumisreaktiot hedelmissä ja vihanneksissa ja nisäkkäillä pig-mentoituminen johtuvat tyrosinaasista. Sienissä tyrosinaasin tehtävä korreloi-tuu solujen erilaistumiseen, itiöiden muodostumiseen, virulenssiin ja patogeneesiin (Sanchez-Ferrer et ai., 1995).
15 Parhaiten tunnetut ja luonnehditut tyrosinaasit ovat peräisin nisäk käistä. Tarkimmin tutkitut sienten tyrosinaasit sekä rakenteelliselta että toiminnalliselta kannalta katsottuna ovat peräisin Agaricus bisporuksesta (Wichers et ai., 1996) ja Neurospora crassasta (Lerch, 1983). On myös raportoitu muutamia bakteerien tyrosinaaseja, joista perinpohjaisimmin luonnehdittuja ovat Strepto-20 myceksen tyrosinaasit (US 5 801 047 ja US 5 814 495). Lisäksi on kuvattu tyrosinaaseja, jotka ovat peräisin esimerkiksi Bacilluksesta ja Myrotheciumista (EP 919 628), Mucorista (JP61 115 488), Miriococcumista (JP60 062 980) • « ·
Aspergilluksesta, Chaetotomastiasta, Ascovaginosporasta (Abdel-Raheem ja *;i,: Shearer, 2002), Trameteksestä (Tomsovskyja Homolka, 2004).
• * /·;* 25 On kuvattu sienten solunsisäisiä tyrosinaaseja ja niiden otaksutaan ! olevan sytoplasmisia entsyymejä (Van Gelder et ai., 1997). Tähän mennessä : tutkituilla sienten tyrosinaasigeeneillä ei todellakaan ole ollut signaalisekvens- • · · siä, vaikka on olemassa raportteja, joissa tyrosinaasiaktiivisuutta väitetään havaitun joidenkin makean veden askomykeettien (Abdel-Raheem ja Shearer, 30 2002), Chaetomiumin (JP62205783) ja Trametes spp:n (Tomsovskyja Homol- :'*** ka, 2004) viljelmäsupernatantista. Raportoidut viljelmäsupematanttien ty- • · · rosinaasiaktiivisuudet voivat johtua solujen autolysoitumisesta.
***\ Score et ai., 1997, ovat tutkineet fenolioksidaasin ja peroksidaasin \ ‘ muodostumista kahden basidiomykeetin (Serpula lacrymansin ja Conidiophora ·:··: 35 puteanan) ja useiden deuteromykeettien (Trichoderma spp:n ja Scytalium :***: FY:n) lajienvälisten vuorovaikutusten aikana käyttämällä alustavaa ja yksinker- ·«· „ 118567 ΐ> täistä malja-analyysiä. Nämä tutkijat käyttivät lakkaasien ja tyrosinaasien spesifisinä substraatteina naftolia ja p-kresolia, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Lakkaasia havaittiin kyseessä olevissa vuorovaikutuksissa Serpula lacry-mansista ja kaikista kolmesta Trichoderma-isolaatiosta. Hölker et ai. 2002 ovat 5 jokin aika sitten eristäneet ja luonnehtineet lakkaasin Trichodermasta. Tutkitussa Trichoderma-\a)\ssa ehdotettiin alustavista maljatutkimuksista saatujen tulosten perusteella esiintyvän myös tyrosinaasiaktiivisuutta (Score, 1997). Tyro-sinaasia ei kuitenkaan eristetty tai puhdistettu, joten Trichodermasta peräisin olevia tyrosinaaseja ei ole tähän mennessä eristetty tai luonnehdittu tarkemmin. 10 Streptomyceksen on raportoitu sisältävän solunulkoista tyrosinaasia ja erittävän entsyymiä viljelmäsupematanttiin, mutta tyrosinaasientsyymissä itsessään ei ole erittymisen signaalisekvenssiä. Streptomyceksen tyrosinaasin erittyminen vaatii toista proteiinia (tästä käytetään nimitystä MelC1 S. antibioti-cuksessa), jolla on signaalisekvenssi (Leu et ai., 1992; Tsai ja Lee, 1998), mi-15 kä tekee Streptomyceksen tyrosinaasin teollisen valmistuksen luontaisesti erittyvän tyrosinaasin valmistusta hankalammaksi ja monimutkaisemmaksi.
Mikrobien tyrosinaaseja on tuotettu heterologisesti. Esimerkiksi Aga-ricus bisporuksesta peräisin olevaa kahta tyrosinaasigeeniä on ilmennetty pieninä määrinä E. colissa (Wichers et ai., 2003). Aspergillus oryzaesta peräisin 20 olevan me/O-tyrosinaasigeenin tuotetta on tuotettu heterologisesti Saccharo-myces cerevisiaessa (Fujita et ai., 1995). Lisäksi Streptomyces antibioticuk- ..... sesta peräisin olevaa tyrosinaasigeeniä on ilmennetty samanaikaisesti E. co- ♦ · » .*a.' Iissä ORF438-proteiinin kanssa, joka todennäköisesti osallistuu proteiinin erit- :;f,s tämiseen (Della-Cioppa et ai., 1990, US 5 801 047). Kirjallisuudessa raportoi- • » *'”* 25 tujen mikrobien tyrosinaasien ilmentymistasot ovat kuitenkin melko matalia, ei- ··:: kä niillä ole mahdollista saada aikaan korkeatiitteristä entsyymien muodostu- • · : mistä. Tyrosinaasin saatavuus on todellakin rajoittanut entsyymin tutkimista ··· erilaisiin sovellutuksiin. Käytännössä Sigma-yhtiöstä saatavilla oleva Agaricuk- sen tyrosinaasi on ollut ainoa kaupallisesti saatavilla oleva tyrosinaasi. Tämä 30 kaupallinen entsyymi on kuitenkin puhdistamaton entsyymi, jonka aktiivisuus .***. on melko alhainen, ja se on hyvin kallista.
···
Yllä olevan esitykseen perustuen tarvitaan yhä uusia tyrosinaaseja, • · *···.* joilla on haluttavia ominaisuuksia sekä aktiivisuuden että saatavuuden kysees- *:**: sä ollessa., Jotta entsyymin talteenotto olisi vaivatonta, niin sen olisi erityttävä ·:··· 35 solusta suurina määrinä, millä vältytään hajottamasta soluja eristysmenetel- .··*. mässä ja millä voidaan välttää solujätteestä johtuvat hankaluudet. Entsyymin
Ml 6 118567 on sovelluttava lisäksi valmistamiseen yhdistelmätekniikalia kaupallisesti hyväksyttävissä määrissä, taloudellisesti ja mahdollisimman vähäisin ympäristöjä terveysvaaroin. Elintarvikesovellutuksissa on erityisen tärkeää käyttää turvallisia organismeja. Esillä olevassa keksinnössä on reagoitu näihin vaatimuk-5 siin.
Vaikka solunsisäisiä proteiineja voitaisiin periaatteessa tuottaa myös yhdistelmäjärjestelmissä erittyvinä tuotteina kytkemällä ne signaalisekvenssiin, niin luontaisesti erittyvien proteiinien odotetaan olevan suotuisampia tuotettavaksi solunulkoisesti. Tämä johtuu siitä, että ne ovat sopeutuneet hyvin eritys-10 reaktiotien proteiinien laskostumis- ja kuljetusmekanismeihin.
Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön tekijät ovat tunnistaneet tietämänsä mukaan ensimmäiset sienten solunulkoiset tyrosinaasit.
Esillä olevan keksinnön yksi tavoite on saada aikaan mainittuja uusia 15 entsyymejä. Nämä entsyymit soveltuvat käytettäväksi proteiinien modifiointiin.
Toinen tavoite on saada aikaan menetelmiä proteiinien modifioimi-seksi sekä uusien entsyymien käyttötapoja.
Vielä yksi esillä olevan keksinnön tavoite on saada aikaan menetelmiä näiden uusien entsyymien valmistamiseksi sekä keinoja, jotka ovat käyt-20 tökelpoisia niiden valmistuksessa.
Esillä olevassa keksinnössä onkin saatu aikaan uusia tyrosinaaseja, /’,* jotka ovat saatavissa Tr/c/ioc/erma-sienistä. Entsyymit ovat solunulkoisia ja so- • # « "j/ veltuvat hyvin tuotettavaksi yhdistelmämenetelmin ja elintarvikkeiden proteiinien *··.·* silloittamissovellutuksiin. Trichoderman tiedetään olevan erinomainen proteii- • 9 : 25 nien tuottaja sekä homologisesti että heterologisesti. Vielä yksi etu on, että • · ·.· j Trichoderma on tunnettu organismi, jonka katsotaan yleisesti olevan turvallinen.
:**]: Keksintö kohdistuu tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan segmentin kä sittävään proteiiniin, jolloin mainittu proteiini on saatavissa Trichoderma spp:stä. Keksintö kohdistuu lisäksi tätä proteiinia koodaavaan eristettyyn polynukleoti-.··*. 30 diin ja tätä polynukleotidia sisältävään ilmentämisvektoriin sekä tätä ilmentä- ’·’ misvektoria sisältävään isäntäsoluun.
*···* Keksintö kohdistuu lisäksi vielä menetelmään proteiinin valmistami- **’" seksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa: a) siirretään isäntäsoluun poly- m nukleotidi, joka koodaa tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan segmentin käsittävää .···, 35 proteiinia, jossa mainittu proteiini on saatavissa Trichoderma spp:stä, b) kasva tetaan mainittua isäntäsolua mainitun proteiinin ilmentämiseen soveltuvissa 7 118567 olosuhteissa ja c) valinnaisesti otetaan mainittu tuotettu proteiini talteen ja puhdistetaan se.
Vaihtoehtoisesti menetelmä proteiinin valmistamiseksi käsittää vaiheet, joissa: siirretään isäntäsoluun promoottori, jonka vaikutuksesta solunul-5 koisen tyrosinaasin geenin ilmentyminen lisääntyy, liitetään promoottori toiminnallisella tavalla mainittuun geeniin, kasvatetaan mainittua isäntäsolua mainitun proteiinin ilmentämiseen soveltuvissa olosuhteissa ja valinnaisesti otetaan mainittu tuotettu proteiini talteen ja puhdistetaan se.
Keksintö sisältää myös proteiinin, joka on saatu millä tahansa yllä 10 olevista menetelmistä.
Keksintöön sisältyy lisäksi tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan proteiinin käyttö proteiinipitoisen materiaalin tai tyrosiinia sisältävien peptidien modifiointiin tai tyrosiinin hapettamiseen L-dopaksi. Keksinnössä on saatu aikaan menetelmiä proteiinipitoisen materiaalin tai tyrosiinia sisältävien peptidien mo-15 difioimiseksi menetellen siten, että nämä saatetaan kosketukseen tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan proteiinin kanssa, sekä menetelmä tyrosiinin hapettami-seksi L-dopaksi, jossa menetelmässä tyrosiini saatetaan kosketukseen tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan proteiinin kanssa.
Tämän keksinnön tavoitteita ovat myös kyseistä uutta proteiinia si-20 sältävä entsyymipreparaatti sekä tyrosinaasiaktiivisuutta omaavalla proteiinilla modifioitu proteiinipitoinen materiaali.
Tämän keksinnön tiettyjä nimenomaisia suoritusmuotoja esitetään ·*.·. alipatenttivaatimuksissa.
• « ·
Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, yksityiskohdat ja edut käyvät .··; 25 ilmi seuraavista piirroksista, yksityiskohtaisesta selityksestä ja esimerkeistä.
* t · • * · «M t
Lyhyt kuvaus piirroksista :..,J Kuvio 1 esittää T. reesein TYR1:n ja TYR2:n aminohapposekvens sien rinnastusta. Sekvenssit esitetään TYR2:n C-terminaaliseen katkaisukoh-taan asti. Signaalisekvenssit ovat ensimmäisellä rivillä. TYRI:n otaksuttava .··*. 30 propeptidin irtolohkaisukohta on esitetty nuolella. Aktiivisen keskuksen raken- teen muodostumiseen osallistuvat aminohappotähteet on varjostettu. Varjoste- • · '···] tut histidiinit ovat aktiiviseen keskukseen sisältyvän kahden Cu-atomin ligande- * ja. Tyrosinaasien aktiivisessa keskuksessa osallisena olevien kysteiinin ja his- *:*·· tidiinin välinen tioeetterisidos esitetään sekvenssin yläpuolella olevalla vaa- .**·. 35 kasuoralla viivalla.
8 118567
Kuvio 2 esittää T. reesei -kannan transformointiin käytetyn plasmidin pMS190 geenikarttaa. cbh1 prom, cbh1:n promoottori; Tcbhl, cbh1:n ter-minaattori; hph, hygromysiiniresistenssigeeni; trpC, trpC:n teminaattori, ColE1 ori, E. colin replikaation origo; bla, beeta-laktamaasigeeni.
5 Kuvio 3 esittää puhdistetun TYR2:n stabiilisuutta pH-alueella 2-8 1 h ja 1 - 3 päivän kuluttua.
Kuvio 4 esittää puhdistetun TYR2:n lämmönkestoa, joka on määritetty 30 °C:ssa, 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa.
Kuvio 5 esittää myofibrilliproteiinien geelinmuodostumistehokkuutta 10 TYR2:n vaikutuksesta 25 °C:ssa, 30 °C:ssa ja 40 °C:ssa.
Kuvio 6 esittää kaseinaattigeelien kovuutta TYR2-käsittelyä käytettäessä ja ilman tätä.
Kuvio 7 kuvaa TYR2:n vaikutusta vehnätaikinan maksimipituus-muuttujan Emax arvoon (mm) ja Rmax:n kohdalta määritetyn pituusmuuttujan Ex 15 arvoon (mm) lepoajan funktiona.
Kuvio 8 esittää TYR2:n vaikutusta vehnätaikinan voimamuuttujan arvoon (g) lepoajan funktiona.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Tyrosinaasi on yleisesti tunnettu kuparientsyymi. Se sisältää aktiivi-20 sessa keskuksessaan kaksi Tili-tyyppistä kuparia ja se hapettaa useita erilaisia ... fenoliyhdisteitä vastaaviksi kinoneiksi. Kinonit ovat erittäin reaktiivisia ja voivat • m · )·*/ reagoida edelleen ei-entsymaattisesti. Tyrosinaasin tyypillinen substraatti on •·ί ί tyrosiini, joka hydroksyloituu ensin dopaksi, joka tämän jälkeen hapettuu edel- ··· leen tämän entsyymin vaikutuksesta dopakinoniksi. Tyrosinaasilla on siten yh- • · * 25 dessä ja samassa proteiinissa kaksi entsyymiaktiivisuutta, toisin sanoen mono- fenolimono-oksygenaasiaktiivisuutta (EC 1.14.18.1) ja katekolioksidaasiaktiivi- :***: suutta (EC 1.10.3.1).
···
OH monofenolimono- 0H O
• I oksygenaasi I katekolioksidaasi li | - φ ^>·ψ
R EC 1.14.18.1 R EC 1.10.3.1 R
***" 30 • *a • · • « 9 118567
Tyrosinaasin substraattispesifisyys on kohtalaisen laaja ja entsyymi kykenee hapettamaan useita polyfenoleja ja aromaattisia amiineja. Jyrkkänä vastakohtana lakkaasin (EC 1.10.3.2) suhteen, tyrosinaasi ei kuitenkaan hapeta syringaldatsiinia.
5 Kyseessä olevat uudet proteiinit ovat solunulkoisia tyrosinaaseja, mikä tarkoittaa sitä, että niillä on N-terminaalisessa päässään erittymisen aikana irti lohkeava signaalisekvenssi. Proteiinin on myös mahdollista muokkautua lisää erittymisen aikana. Toisin sanoen proteiini muodostuu solun sisällä epäkypsänä proteiinina, joka ei välttämättä ole entsymaattisesti aktiivinen. Eritty-10 misen aikana proteiini muokkautuu pienemmäksi proteiiniksi, joka on entsymaattisesti aktiivinen. Proteiinin muokkautuneesta muodosta käytetään nimitystä "kypsä" proteiini. Esillä olevan keksinnön mukainen proteiini "käsittää ty-rosinaasiaktiivisuutta omaavan segmentin”. Tämä tarkoittaa sitä, että proteiini voi olla muokkautumattomassa muodossaan mutta se sisältää vähintään tyro-15 sinaasiaktiivisuuteen tarvittavan osan proteiinista. Se sisältää toisin sanoen kypsän proteiinin tai vähintään tämän entsymaattisesti aktiivisen fragmentin.
Tyrosinaasiaktiivisuus voidaan määrittää tällä alalla yleisesti tunnetuin menetelmin. Substraattina voidaan käyttää L-dopaa tai tyrosiinia, minkä jälkeen dopakromin muodostumista voidaan seurata spektrofotometrisesti, tai 20 vaihtoehtoisesti substraatin kulutusta voidaan seurata seuraamalla hapen kulutusta. Tyrosinaasiaktiivisuus voidaan myös visualisoida agarmaljoilla lisää-... mällä sopivaa substraattia, kuten tyrosiinia, minkä avulla tyrosinaasiaktiivisuus ;*Y johtaa tumman vyöhykkeen muodostumiseen pesäkkeen ympärille.
• i · *;♦/ "Signaalisekvenssi” tarkoittaa proteiinin N-terminaaliseen osaan si- *···** 25 toutunutta aminohapposekvenssiä, joka edistää proteiinin kypsän muodon erit- : tyrnistä solun ulkopuolelle. Proteiinin kypsässä muodossa ei ole signaalisek- ·.: · venssiä.
:***: Kyseessä olevat uudet tyrosinaasit ovat saatavissa Trichoderma spptstä ja niitä koodaa mainitusta organismista saatavissa oleva polynukleoti-30 di. "Saatavissa oleva” tarkoittaa tässä keksinnössä sitä, että proteiineja tai po-.···. lynukleotideja voidaan saada Trichoderma-lajista, mutta näihin sisältyvät myös proteiinit ja polynukleotidit, jotka vastaavat tuosta nimenomaisesta sienestä *···] peräisin olevia tai tästä luonnossa muodostuvia proteiineja ja polynukleotideja.
Vastaavia muotoja voitaisiin yrittää löytää erityisesti muista rihmasienistä. Tämän ·:··; 35 keksinnön yhden tietyn nimenomaisen suoritusmuodon mukaisesti näitä uusia .···. proteiineja koodaa Trichoderma reeseistä saatavissa oleva polynukleotidi.
n» 10 118567
Trichoderma reeseistä peräisin olevat kaksi tyrosinaasigeeniä, joille on annettu nimitykset tyri (kehikossa 19) (sekvenssi nro 1) ja tyr2 (kehikossa 11) (sekvenssi nro 2), koodaavat proteiineja, joiden aminohappokoot ovat 623 (TYRI) (sekvenssi nro 3) ja 571 (TYR2) (sekvenssi nro 4). tyri-geeni käsittää kolme 5 intronia nukleotidiasemissa, jotka ovat: I 290 - 355, Il 487 - 571, III 839 - 890. fyr2-geeni käsittää seitsemän intronia: 1159 - 397, Il 475 - 540, III 624 - 725, IV 774 - 832, V 1 199- 1 243, VI 1 429 - 1 506, VII 2 123 - 2 221. Sekä TYR1:lla että TYR2:lla on N-terminaalisessa päässä otaksuttava signaalisekvenssi, mikä viittaa siihen, että nämä entsyymit ovat solunulkoisia. TYR1:n ja TYR2:n lä-10 himpiä homologeja tietokannoissa ovat kaksi erilaista otaksuttavaa tyrosinaa-sia, jotka ovat peräisin Gibberella zeaesta (identtisyysaste 47 % ja 46 %, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna). Nämä proteiinit on tunnistettu G. zeaen perimän sekvensointiyrityksessä, mutta niillä ei ole osoitettu olevan tyrosinaa-siaktiivisuutta. T. reese/n kahdella tyrosinaasilla on 30-prosenttinen identtisyys-15 aste toistensa suhteen. TYR1:n ja TYR2:n aminohapposekvenssien rinnastus TYR2:n C-terminaaliseen irtilohkaisukohtaan asti esitetään kuviossa 1. Näillä proteiineilla on N-terminaalisessa päässään signaalisekvenssi, mikä tarkoittaa sitä, että ne ovat solunulkoisia, toisin sanoen ne erittyvät soluista. Signaalisek-venssin ennustusohjelmalla on saatu viitteitä siitä, että TYR1:n signaalisek-20 venssi olisi 20 aminohapon pituinen ja TYR2:n 18 aminohapon pituinen.
Ainakin TYR2 muokkautuu proteolyyttisesti edelleen C-terminaalises-ta päästään, minkä vaikutuksesta proteiinista lohkeaa irti noin 1/3. Myös TYR1:n voidaan odottaa muokkautuvan C-terminaalisesta päästään samalla tavoin. Tryp- • · · '•I ** siinipeptidien massaspektrometrisen analyysin ja syanogeenibromidilla käsitellyn 25 entsyymin hydrolyysituotteiden mukaisesti TYR2:n C-terminaalinen irtilohkaisu- • · | kohta on aminohappoasemassa 410 (sekvenssi nro 4) sekvenssin -GPNSG jäl- keen. Monilla sienten tyrosinaaseilla on raportoitu olevan C-temninaalista muok-kautumista. Kirjallisuuden mukaan sienten tyrosinaasit aktivoituvat in vivo -olosuhteissa rajoittuneella proteolyyttisellä irtolohkaisulla, jonka on ehdotettu au- :*. t 30 kaisevan substraatille tien katalyyttiseen keskukseen. (Decker ja Tuczek, 2000).
• _____ «·♦·. Lisäksi TYRI voi sisältää N-terminaalisessa päässään signaalisek- V venssin jälkeen propeptidin, joka propeptidi lohkeaa irti spesifisen kex2-tyyppi- sen peptidaasin vaikutuksesta erittymisen aikana. Mahdollinen irtilohkaisukoh-ta voisi olla aminohappojen 36 ja 37 välissä sekvenssin SITRRR jälkeen.
35 TYRI :llä ja TYR2:lla on aktiivisessa keskuksessaan kaksi Cu-atomia.
,···. Kumpikin Cu-atomi on kolmen histidiinitähteen koordinoima. Tioeetterisidok- ··· ' 11 118567 sen, joka on myös havaittu muissa sienten tyrosinaaseissa, voidaan havaita esiintyvän kysteiinin ja Cu:hun assosioituvan toisen histidiinitähteen välillä.
Kyseessä olevia uusia proteiineja koodaa polynukleotidi, joka on saatavissa Trichoderma spp:n DNA:sta monistamalla alukkeella, joka on valittu 5 ryhmästä, joka koostuu sekvensseistä, jotka on esitetty sekvenssinä nro 5, sekvenssinä nro 6, sekvenssinä nro 7 ja sekvenssinä nro 8. Nukleiinihappojen monistus on tällä alalla yleisesti tunnettua. Nukleiinihapposekvenssi monistetaan yleensä PCR.IIä käyttäen eteenpäin suuntautuvasta ja käänteisestä aluk-keesta muodostuvaa kahta aluketta, jotka hybridisoituvat monistettavana ole-10 van sekvenssin kummallekin puolelle. Monistettavalla polynukleotidilla voi olla sekvenssiin nro 1 tai sekvenssiin nro 2 sisältyvä sekvenssi. Kyseessä olevilla uusilla proteiineilla voi olla sekvenssiin nro 3 tai sekvenssiin nro 4 sisältyvä aminohapposekvenssi. "Sisältyvä” tarkoittaa sitä, että sekvenssissä on vähintään osa mainitusta sekvenssistä. Siten proteiinit voivat käsittää ainoastaan 15 sekvenssin nro 3 tai sekvenssin nro 4 tyrosinaasiaktiivisen fragmentin.
Yhden tai useamman aminohapon lisääminen, korvaaminen, poistaminen tai liittäminen yhteen tai useampaan kohtaan aminohapposekvensseissä, jotka on esitetty sekvenssinä nro 3 ja sekvenssinä nro 4, ei välttämättä vaikuta proteiinien erittymiseen, muokkautumiseen tai entsymaattisiin ominai-20 suuksiin. Tästä syystä tämän keksinnön mukaisilla proteiineilla voi identtisyys-aste sekvenssinä nro 3 tai sekvenssinä nro 4 esitettyjen aminohapposek-... venssien tai mainittujen sekvenssien tyrosinaasiaktiivisen fragmentin suhteen / .* olla vähintään 70-prosenttinen tai vähintään 80-prosenttinen ja erityisesti vä- « · · hintään 90-prosenttinen tai vähintään 95-prosenttinen.
*···’ 25 Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti proteiinia koo- : daa polynukleotidi, joka kykenee hybridisoitumaan nukleiinihappoon, jolla on • · ·.· * sekvenssinä nro 1 tai sekvenssinä nro 2 esitetty sekvenssi. Tähän sisältyvät sekvenssit, jotka hybridisoituvat ainoastaan osaan tunnistetuista sekvensseistä. Tähän sisältyvät luonnollisesti sekvenssit, jotka hybridisoituvat kumpaan 30 hyvänsä komplementaarisista juosteista. "Hybridisoituminen” tarkoittaa ilmiötä, .·*·. jossa erotetut nukleiinihappojuosteet liittyvät komplementaarisiin juosteisiin emästen pariutumisen perusteella. Hybridisaatio-olosuhteet ovat vaativuudel-!··\ taan tavallisesti keskitasoisia tai korkeita. Esimerkiksi vaativuudeltaan keskita- \ * soa oleva hybridisaatio voidaan suorittaa 50 °C:ssa hybridisaatioseoksessa, ·:·*: 35 jonka kokoonpano on 6 x SSC (0,09 M natriumsitraattiin, jonka pH on 7, :]*[· valmistettu 0,9 M NaCI), 0,5-prosenttinen natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 12 118567 5xDenhardtin liuos ja konsentraatioltaan on 100 pg/ml oleva sillin maidin DNA. Vaativuudeltaan korkea hybridisaatio voidaan suorittaa esimerkiksi samassa hybridisaatioseoksessa 68 °C:ssa.
Kyseistä uutta proteiinia koodaavalla polynukleotidilla voi olla sek-5 venssiin nro 1 tai sekvenssin nro 2 sisältyvä sekvenssi tai tämä voi kyetä hybri-disoitumaan sekvenssiin nro 1 tai sekvenssiin nro 2 sisältyvään sekvenssiin.
Koska kyseiset uudet entsyymit ovat solunulkoisia, ne ovat erityisen käyttökelpoisia tuotantoon suuressa mittakaavassa. Tyrosinaasi sopii tuotettavaksi yhdistelmätekniikalla. Tämä tarkoittaa sitä, että tyrosinaasigeenin sisältä-10 vä fragmentti eristetään monistamalla PCR-reaktiossa (Coen, 2001) tai jollakin muulla yhdistelmä-DNA-menetelmällä (Sambrook et ai., 1989), geeni liitetään ilmentämisvektoriin voimakkaan promoottorin ohjaamaksi, vektori siirretään sopiviin isäntäsoluihin ja isäntäsoluja viljellään tyrosinaasientsyymin muodostumisen aikaansaavissa olosuhteissa. Menetelmät proteiinien valmistamiseksi 15 yhdistelmätekniikalla erilaisissa isäntäjäijestelmissä ovat tällä alalla tunnettuja (Gellissen, 2005). Vaihtoehtoisesti isännän kromosomissa sijaitsevaan tyrosi-naasigeeniin kytketään ainoastaan toiminnallisesti voimakas promoottori, jonka avulla mainittua geeniä saadaan ilmennettyä normaalia voimakkaammin.
"Hmentämisvektori” tarkoittaa tässä keksinnössä DNA-konstruktiota, 20 joka käsittää kyseessä olevia uusia proteiineja koodaavan polynukleotidin. Jotta vektori kykenisi ohjaamaan proteiinin ilmentymistä, se sisältää toiminnalli- ,·», sesti kytketyt elementit, jotka ovat: transkription promoottori, mainittua proteii- • * · . nia koodaava segmentti ja transkription terminaattori. Vektori voi olla kromosomi/ miin integroitu vektori tai olla autonomisesti replikoituva vektori.
• · /··* 25 ’’Isäntäsolu” tarkoittaa mitä tahansa isäntää, joka sisältää ilmentä- • · · •·γ misvektorin ja joka kykenee ilmentämään vektorin koodaamaa proteiinia. Isän- : täsolu voi olla prokaryoottinen tai eukaryoottinen. Mahdollisia isäntiä ovat bak-
«I
teerit, hiivat ja sienet ja varsinkin rihmasienet. Yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti tyrosinaasia ilmennetään homologisesti, toisin sanoen Trichoder- j*\. 30 massa ja erityisesti 7. reeseissä. Muita mahdollisia isäntiä voivat olla Aspergil- ·***. lus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum, Pycnoporus cinnaba- *·· .:. rinus, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytlca, Saccharo- • · **··] myces cerevisiae, Escherichia coli ja Bacillus subtilis.
\ * Sopiva promoottori on promoottori, jolla on voimakas transkriptioak- ·:··· 35 tiivisuus ja jolla tyrosinaasia kyetään ilmentämään voimakkaasti. Sopiva vahva ···*. promoottori Trichodermassa suoritettavaan ilmentämiseen on cbh1, ja vaihto- #·· 13 118567 ehtoisia promoottoreita ovat esimerkiksi cbh2, egl1, xyn1, xyn2 ja tki1 sekä Aspergillus nidulansin gpdA\n promoottori.
Tämän keksinnön yhden tietyn nimenomaisen suoritusmuodon mukaisesti proteiinia tuotetaan siirtämällä isäntäsoluun solunulkoista tyrosinaasia 5 koodaava DNA-sekvenssi, joka DNA-sekvenssi on saatavissa Trichoderman DNA.sta monistamalla alukeparilla, jolla on sekvenssinä nro 5 ja sekvenssinä nro 6, tai sekvenssinä nro 7 ja sekvenssinä nro 8, esitetyt sekvenssit, kasvattamalla mainittua isäntäsolua ilmentämiseen soveltuvissa olosuhteissa ja ottamalla erittynyt proteiini kasvatusmediumista talteen ja valinnaisesti puhdista-10 maila se. Proteiini voidaan erottaa kasvatusmediumista ja jatkopuhdistaa luontaisesta ympäristöstään tällä alalla tunnetuin eristys- ja puhdistusmenetelmin, kuten kromatografia, saostus, sentrifugointi, suodatus, geeiielektroforeesi ja muut vastaavat menetelmät.
Tämän keksinnön mukainen entsyymipreparaatti on koostumus, joka 15 käsittää uutta tyrosinaasia puhdistamattomassa tai puhdistetussa muodossa. Se voi lisäksi sisältää muita komponentteja, muut proteiinit ja entsyymit mukaan luettuna. Se voi esimerkiksi olla isäntäsolun kasvatusmedium, johon proteiini on eritetty.
Trichoderman tyrosinaasit ovat käyttökelpoisia muodostettaessa ki-20 noneja minkä tahansa tyyppiseen fenoliryhmiä sisältävään matriksiin, joka on reaktiivinen niiden kanssa ja jossa muodostuu myöhemmin silloittumista, ja jol-laisia ovat esimerkiksi proteiinimatriksit.
Trichoderman tyrosinaaseja voidaan käyttää minkä tahansa prote-iinipitoisen materiaalin käsittelyyn ja erityisesti sellaisten proteiinien käsittelyyn, 25 joissa tyrosiinitähteiden kokonaispitoisuus on kohtalaisen korkea tai joissa on • · · :*V kohtalaisen paljon tyrosiinitähteitä, joihin entsyymi pääsee vaikuttamaan. Myös • · * tyrosiinia sisältäviä peptidejä voidaan modifioida. Entsyymejä voidaan käyttää erityyppisissä teollisuussovellutuksissa, kuten farmaseuttisten aineiden, kosmeettisten tuotteiden, selluloosan ja paperin, pesuaineiden ja tekstiilien valmis-·**.. 30 tuksen alalla ja rehujen ja elintarvikkeiden valmistuksessa, ϊ*": Trichoderman tyrosinaasit soveltuvat erityisesti proteiinipitoisten y..t elintarvikemateriaalien, erityisesti liha-, maitotuote-, kasvis- ja viljamateriaalien, • · |*\ käsittelyyn. Elintarvikkeen rakennetta ja Teologisia ominaisuuksia voidaan pa rantaa silloittamalla elintarvikkeiden proteiineja tyrosinaasilla.
*”*: 35 Esimerkiksi kala-, siipikarja- tai muiden lihatuotteiden käsittely ty- rosinaaseilla voi edesauttaa sellaisen tuotteen aikaansaamista, jolla on hyvä 14 118567 rakenne ja jossa on aikaisempaa pienempiä määriä muita rakennetta muodostavia aineita. Tyrosinaasia voidaan myös käyttää geeliyttämiseen, minkä avulla voidaan välttää gelatiinin käyttöä. Tyrosinaasia voidaan lisäksi käyttää syne-reesin, toisin sanoen vesifaasin erottumisen, ehkäisemiseen, joka synereesi 5 on ongelma useissa maitotuotteissa varsinkin silloin, kun niiden rasvapitoisuus on pieni. Esimerkiksi jogurttia valmistettaessa ja erityisesti vähäkalorista jogurttia valmistettaessa on kiinteällä ja nestemäisellä faasilla taipumusta erottua varastoinnin aikana. Tämä ei ole kuluttajien mielestä hyväksyttävä ja tämä voidaan estää käsittelemällä jogurtin raaka-aineita tyrosinaasilla. Tyrosinaaseja 10 voidaan myös käyttää leipomoprosesseissa esimerkiksi taikinan kovettami-seen, joka on erityisen haluttua pakastettujen taikinatuotteiden valmistuksessa.
Tyrosinaaseja voidaan lisäksi käyttää Parkinsonin taudin hoidossa käyttökelpoisen L-dopan valmistamiseen ja kosmeettisten tuotteiden valmistuksen alalla käytettäviin ainesosiin kuuluvien melaniinien valmistuksessa. Lisäksi 15 tyrosinaaseja voidaan käyttää proteiinipitoisten kuitujen tai proteiinipitoisista kuiduista johdettujen polymeerien, kuten silkin, villan, kasmirin, alpakan tai ihmisten hiusten, silloittamiseen.
Keksintöä kuvataan käyttämällä hyväksi seuraavia sitä rajoittamattomia esimerkkejä. On kuitenkin selvää, että yllä olevassa selityksessä ja esi-20 merkissä esitettyjen suoritusmuotojen tarkoituksena on olla ainoastaan kuvaavia ja että tämän keksinnön suojapiirin sisällä on mahdollista tehdä useita eri- laisia muutoksia ja modifikaatioita.
• · · * • · :·: : Esimerkki 1
Ml • · ]··;* Tyrosinaasipositiivisten mikro-organismien maijaseulonta • · · 25 Tyrosinaasiaktiivisuuden seulontaan tarkoitettujen indikaattoreiden • · » ·*··* ·* valinta tehtiin ammattikirjallisuuden perusteella. L-tyrosiinia, p-kresolia, p-ku- :...! mariinihappoa, tyramiinia, 3-hydroksiantraniilihappoa ja katekiiniä käytettiin taulukossa 1 esitetyissä konsentraatioissa. Trichoderma reeseitä kasvatettiin 48 päivän ajan 37 °C:ssa valittuja indikaattoreita sisältävällä Malt Extract -aga-:**Ί 30 rilla (Difco) (taulukko 1). Mahdolliset värinmuutokset maljoilla havaittiin silmin.
T. reeseillä esiintyi selviä positiivisia reaktioita L-tyrosiinilla, tyra-***. miinilla, 3-hydroksiantraniilihapolla ja katekiinilla. Tulokset osoittivat selvästi, että T.reesei oli tyrosinaasipositiivinen mikrobi.
m « · ·«« • m • · ··· 15 118567
Taulukko 1. Maljatutkimusseulonta tyrosinaasiaktiivisuuden toteamiseksi T. reeseistä
Indikaattori Konsentraatio Värinmuutos __mM__ L-tyrosiini__ 10 ++_ p-kresoli__0/j__-_ p-kumariinihappo__1,0__-_
Tyramiini__1^0__+_ 3-hydroksiantraniilihappo _1^0__+_
Katekiini__1^0__++
Esimerkki 2 tyri- ja fyr2-geenien eristys Trichoderma reeseistä 5 Kumpikin uusi tyrosinaasigeeni monistettiin PCR:llä T. reesein peri män DNA:sta. tyri:lle käytetyt alukkeet olivat eteenpäin suuntautuva aluke: GCT ACC GCG GAT GGG CTT CCT CGC TCG CCT CAC (sekvenssi nro 5) ja käänteinen aluke: CTG AGG ATC CTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCT CCC 10 ACA ACA CCA ATC TCA GCA T (sekvenssi nro 6).
fyr2-geeni monistettiin käyttäen eteenpäin suuntautuvaa aluketta: GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTA TCA TGC :T: TGT TGT CAG GTC CCT CTC G (sekvenssi nro 7) ja käänteistä aluketta:
GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC AGT GGT 15 GGT GGT GGT GGT GCA GAG GAG GGA TAT GGG GAA CGG CAA A
··· : (sekvenssi nro 8).
:*X PCR-reaktio suoritettiin käyttäen lämmönkestävää Dynazyme EXT- • .· · polymeraasia (Finnzymes, Suomi) valmistajan suosittelemassa reaktioseok-***** sessa. PCR-ohjelmassa käytettiin ensimmäistä kolmen minuutin pituista dena- 20 turointivaihetta 94 °C:ssa, minkä jälkeen suoritettiin 25 sykliä, joihin sisältyi i ** 30 sekuntia 94°C:ssa. 45 sekuntia 52 °C:ssa ja 2,5 minuuttia 72°C:ssa. Tä- män jälkeen suoritettiin lopullinen 5 minuutin pituinen pidennysvaihe 72 °C:ssa. :***· Saatiin odotettua kokoa olevat PCR-tuotteet, näille suoritettiin ajo agaroosigee- • f·
Iissä tällä alalla tunnetuin menetelmin ja tuotteet puhdistettiin geelistä käyttäen • # 25 Qiaquick Minelute -geelipuhdistusreagenssipakkausta. fyrf-geenifragmentti kloo- ]^* nättiin pCR2.1TOPO-vektoriin käyttäen TOPO-TA Cloning Kit -reagenssipak- kausta (Invitrogen). fyr2-geenifragmentti siirrettiin pDONR221-vektoriin (Invitro- 16 118567 gen) käyttäen BP-rekombinaatioreaktiota, joka suoritettiin Gateway Recombination -reagenssipakkauksella (Invitrogen). Geenit sekvensoitiin PCR-mutaa-tioiden poissulkemiseksi.
Esimerkki 3 5 fyr2-geenin ilmentäminen normaalia voimakkaammin Trichoderma Teeseissä voimakkaan promoottorin ohjaamana iyr2-geenifragmentti siirrettiin LR-rekombinaatioreaktiolla pDONR221-vektorista T. reesei -ilmentämisvektoriin pMS186. Tämä vektori sisältää Gateway-lukukehyskasetin C (RfC), joka on sijoitettu cbh1\w (sellobiohydrolaasM) pro-10 moottorin ja terminaattorin väliin. Tämä vektori sisältää myös hygromysiini-resistenssikasetin T. reesei -transformanttien valintaa varten. LR-rekombinaa-tioreaktio suoritettiin käyttämällä Gateway Recombination -reagenssipakkausta (Invitrogen) valmistajan ohjeita noudattaen. Tässä rekombinaatiossa tyr2-gee-nifragmentti liitettiin cbh 1-promoottorin ja terminaattorin väliin, mistä saatiin 15 plasmidi pMS190 (kuvio 2).
Plasmidi pMS190 transformoitiin T. reesei -kantaan VTT-D-00775 menetellen olennaisesti aiemmin kuvatulla tavalla (Penttilä et ai., 1987) ja transformantit valittiin hygromysiiniresistenssin perusteella maljoilla, jotka sisälsivät 125 pg/ml hygromysiini B:tä. Transformanteista valmistettiin hajotusviljel-20 mät valintamediumia sisältäville maljoille kolmen peräkkäisen kierroksen ver-ran ja niistä tutkittiin tyrosinaasiaktiivisuus maljamäärityksellä. Määritysmaljat * · · .\.t sisälsivät Tr/choderma-minimimediumia (Penttilä et ai., 1987), jossa hiilen läh-
teenä on 2 % laktoosia, puskurointiaineena 1 % K-ftalaattia (pH 5,5), 0,1 rnM
• · /*;* CuS04 ja indikaattorisubstraattina 1 % tyrosiiniä. Transformanteista valmistet- • · · I"/ 25 tiin myös hajotusviljelmät maljoille ja niitä kasvatettiin 7 päivää. Tyrosinaasiak- : tiivisuus havaittiin maljoilla tummanruskeana värinä, joka tuli näkyville hajotus- • ·· vetojen ympärille. Havaittiin useita selvän värjäytymisen osoittavia positiivisia transformantteja. Lähtökannalla ei esiintynyt värjäytymistä tässä määrityksessä.
·· • · • *· ]···. Esimerkki 4 e · ,·] 30 TYR2:n tuotanto nestemäisissä viljelmissä • * **\ Positiivisia transformantteja kasvatettiin ravistelupulloissa 8 päivän ajan Trichoderman minimimediumissa (Penttilä et ai., 1987), jota oli täydennet-*:**: ty 4-prosenttiseksi laktoosin, 2-prosenttiseksi mäskijätteen, 100-millimolaari- :***: seksi PIPPS:n ja 2-millimolaariseksi CuS04:n suhteen. Tyrosinaasiaktiivisuus • •e 17 118567 määritettiin viljelmien supernatanttinäytteistä käyttäen substraattina 15 mM L-dopaa (L-3,4-dihydroksifenyylialaniinia) (Sigma). Aktiivisuus määritettiin myös L-tyrosiiniä (Sigma) kohtaan konsentraatiossa 2 mM. Kumpikin aktiivisuusmää-ritys suoritettiin 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,0) 25 °C:ssa seuraten 5 dopakromin muodostumista 475 nm:n kohdalta. Molaarisen ekstinktiokertoi-men e arvona käytettiin arvoa 3 400 M'1 cm'1 (Robb, 1984). Määritykset suoritettiin käyttämällä kaksisädespektrofotometria (Lambda 20, Perkin-Elmer, Clberlingen, Saksa). Aktiivisuudet ilmoitettiin nanokataaleina. Kolme parasta transformanttia tuottivat 40, 35 ja 11 nkat/ml tyrosinaasiaktiivisuutta.
10 Transformanttia pMS190NTTD-00775/98, joka tuotti ravistelupul- loissa suurimman tyrosinaasipitoisuuden, kasvatettiin Braun Biostat C-DCU 3 -fermentorissa (B. Braun Biotech, Saksa) 20 litrassa mediumia, jonka kokoonpano oli (g Γ1): laktoosi 20, mäskijäte 10, KH2PO4 15 ja 2 mM CuS04 x 5 H2O ja jonka pH säädettiin arvoon 5,5 - 6 NH40H:lla ja H3PC>4:llä, ja kasvatusläm-15 pötila oli 28 °C. Liuenneen hapen pitoisuus pidettiin 30 %:n yläpuolella ravistelemalla nopeudella 450 kierrosta minuutissa, ilmastamalla 8 litralla min1 ja käyttämällä tulevan ilman rikastamista 0 - 30-prosenttiseksi 02:\\&· Vaahtoami-nen estettiin lisäämällä automaattisesti Struktol J633 -polyoleaattivaahdon-estoainetta (Schill & Seilacher, Saksa). Näytteitä otettiin päivittäin laktoosin ja 20 kokonaisproteiinikonsentraation ja tyrosinaasiaktiivisuuden määrittämiseksi. Fermentaation jälkeen solut poistettiin sentrifugoimalla ja viljelmäsupernatantti väkevöitiin 2,5-kertaisesti ultrasuodattamalla.
• · ·
Kuuden viljelypäivän jälkeen saavutettiin taso, joka oli noin ::j.: 300 nkat/ml. Puhdistetun TYR2:n ominaisaktiivisuutta käyttäen suoritetun las- • · /·;* 25 kutoimituksen mukaisesti vastasi korkein aktiivisuus fermentaatiossa noin 1 g/l ί·ί ϊ entsyymiä.
• · • · · ti» ··· ♦ .·**; Esimerkki 5 e·· TYR2:n puhdistus
Sentrifugoitua väkevöityä viljelmäsupernatanttia (tämä oli saatu esi- :"*· 30 merkissä 4) käsiteltiin ensin mikrokiteisellä Avicel-selluloosalla (0,2 g/ml viljel- ··« mäsupernatanttia) sellulaasien sitomiseksi ja poistamiseksi. Näytettä inkuboi- • · **··) tiin 4 °C:ssa 10 minuutin ajan sitä jatkuvasti sekoittaen. Supematantti koottiin
talteen sentrifugoimalla (10 000 kierrosta minuutissa). Puskuri vaihdettiin 10 mM
·:··: Tris-HCI-puskuriksi, jonka pH oli 7,3, käyttämällä Sephadex G-25 Coarse -ko- .··*. 35 lonnia (2,6 x 27 cm; Pharmacia Biotech, Uppsala, Ruotsi). Seuraavat puhdis- ··· 18 118567 tusvaiheet suoritettiin käyttämällä ÄKTA™-puhdistuslaitetta (Amersham Bio-sciences, Uppsala, Ruotsi). Näyte johdettiin HiPrepTV 16/10 CM Sepharose Fast Flow -kolonniin, joka oli ensin tasapainotettu etukäteen 10 mM Tris-HCI -puskurilla, jonka pH oli 7,3. Proteiinit eluoitiin Tris-HCI-puskuriin valmistetulla 5 lineaarisella 0-180 mM NaCI-gradientilla (120 ml). Tyrosinaasipositiiviset fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin Vivaspin 20 -väkevöintilaitteella (molekyylipainon katkaisuraja 10 000, PES, Vivascience) 8,2 ml:ksi ja johdettiin geelisuodatus-kolonniin, HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR -kolonniin (ÄKTA, Pharmasia), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCI:lla, joka sisälsi 150 mM NaCI:ää ja jon-10 ka pH oli 7,5. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin.
SDS-PAGE (12 % Tris-HCI Ready Gel, Bio-Rad) suoritettiin julkaisun Laemmli (1970) mukaisesti. Proteiinijuovat visualisoitiin värjäämällä Coo-massie Brilliant Blue -väriaineella (R350; Pharmacia) ja verrattiin molekyylipai-nomarkkereihin (esivärjätyt markkerit SDS-PAGE Standards Broad Range, 15 tuoteluettelon numero 161-0318, Bio-Rad).
TVR2 tuli näkyviin PAGE:ssa kaksoisjuovana. Analysoimalla tarkemmin geelisuodatuksella ja käänteisfaasikromatografialla havaittiin, että puhdistetussa preparaatissa esiintyy ainoastaan yksi proteiinilaji, mistä syystä geelissä esiintyvä kaksoisjuova on geeliartefakti. Oli mielenkiintoista panna 20 merkille, että arvioitu puhdistetun TYR2:n molekyylipaino oli geelin perusteella ainoastaan 45 kDa, joka on paljon pienempi kuin päätellystä aminohapposek-,..., venssistä laskettu arvo (60,4 kDa). Tulos osoitti, että TYR2 oli muokkautunut ,1C-terminaalisesta päästään.
• · · :2:: Puhdistustaulukko esitetään taulukossa 2. Geelisuodatus 1 ja 2 tau-
• i1 J
• m *···2 25 lukossa tarkoittaa tyrosinaasipositiivisten näytteiden erilaista yhdistämistä.
• · · * 1 2
• 1t I
: :2; Taulukko 2. TYR2:n puhdistus
••ft · I
:3: Puhdistusvaihe Aktiivi- Proteiini Tila- Ominais- Aktiivisuus- Puhdis- • •ft suus (mg/ml) vuus aktiivisuus saanto tumis- (nkat/ml) (ml) nkat/ml (%) kerroin ft - - - .-.-..II— .··1. Viljelmäsuodos 769,9 23,4 60 33 100 1,0 ft ft 1 ......... —-—........—““........ “ — ’·1 Avicel-käsittely 719,6 17,1 44 42 68,5 1,3 ··» —. ...A-......... — —M, ---- - *···1 Suolanpoisto 389,1 12,7 63 31 53,1 0,9 ft ---— ------ ---— 1 Kationinvaihtokromatografia 1 285 4,73 8,2 272 22,8 8,3 2 • ^ -1-1 ····· Geelisuodatus (1)__369__2,16 5,5__171__44__5,2 .2·. Geelisuodatus (2) 238 0,61 4,4 390 2,3 11,9 3 19 118567
Esimerkki 6 TYR2:n biokemiallinen luonnehtiminen
Proteiinikonsentraatio määritettiin Bio-Rad DC -proteiinimääritysrea-genssipakkauksella (Bio-Rad, Richmond, USA) käyttäen standardina naudan 5 seerumialbumiinia. Jotkin proteiinikonsentraatiomäärityksistä suoritettiin seuraamalla absorbanssia 280 nm:n kohdalta Hitachi U-2000 -spektrofotometrillä (Hitachi, Tokio, Japani). Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
TYR2 kykeni hapettamaan sekä L-tyrosiinia että L-dopaa. Aktiivi-10 suuslukemat osoittivat, että L-dopalla saatiin suunnilleen kuusi kertaa suurempia aktiivisuusarvoja kuin L-tyrosiinilla. Tämä tulos varmistettiin myös määrittämällä entsyymiaktiivisuus L-dopaa ja L-tyrosiinia kohtaan seuraamalla hapen kulutusta entsymaattisessa reaktiossa. Kirjallisuuden mukaan monet mikrobien tyrosinaasit vaativat aktiivisuuteensa SDS:ää. SDS:n (Sigma) vaikutus tyrosi-15 naasiaktiivisuuteen määritettiin käyttäen aktiivisuusmäärityksessä erilaisia SDS-konsentraatioita. SDS:n havaittiin yllättäen inhiboivan entsyymiaktiivisuutta: 0,5 mM SDS-konsentraatiossa entsyymillä oli jäljellä ainoastaan 50 % aktiivisuudestaan.
Viljelmäsupernatantista peräisin olevan entsyymin ja puhdistetun 20 entsyymin isoelektrinen piste (pl) määritettiin käyttämällä isoelektristä fokusointia pH-alueella 3,5 - 9,5 (Ampholine PAGplate 3.5-9.5 for IEF, Amersham :T: Bioscience) LKB 2117 Multiphor II Electrophoresis System (LKB Pharmacia, • Bromma, Ruotsi) -laitteessa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tyrosinaasiaktii-
··· I
.***. visuutta sisältävät juovat visualisoitiin värjäämällä geeli 0,1 M natriumfosfaatti- : .·. 25 puskuriin (pH 7,0) valmistetulla 15 mM L-dopalla ja proteiinit Coomassie Blue •*V -värjäyksellä. Puhdistetulla TYR2:lla esiintyi Coomassie Blue -väriaineella vär- • · · jättynä kaksi juovaa pH-arvon ~ 9 kohdalla. Natiiveissa olosuhteissa isoelektri-***** sessä fokusoinnissa ei viljelmäsuodoksesta peräisin olevalla eikä puhdistetulla tyrosinaasilla esiintynyt L-dopalla värjättynä selvästi erottuvaa juovaa, aktiivi- ·· : **· 30 suus havaittiin sen sijaan ruskeana vyöhykkeenä noin pH:n 9 kohdalla.
Tyrosinaasin pH-optimi tutkittiin käyttämällä hapenkulutusmäärityk- .···, siä. Määritykset suoritettiin yksikanavaisella happimittarilla (Precision sensing ,]**: GmbH, Saksa), joka sisälsi kuituoptiset minianturit, joiden määritysalue oli • · . 0-100 % happea. Substraattina käytettiin L-dopaa 15 mM konsentraatiossa ja *!‘*! 35 liuotettuna 0,1 M natrium fosfaattipuskuriin, jonka pH oli 7,0. Reaktiot suoritet- ϊ,.,ί tiin käyttäen 1,8 ml substraattiliuosta ja 4,3 pg puhdistettua T. reesein tyrosi- 20 118567 naasia. Käytettiin kolmea eri puskuria niiden puskurointikapasiteetin mukaisesti. Mcllvainen puskuria käytettiin pH-alueella 2 - 7, 50 mM Tris-HCI puskuria pH-alueella 7 - 9 ja 12,5 mM boraattipuskuria pH-alueella 8 - 9,5. TYR2:n pH-optimi on 8 - 8,5. Entsyymin aktiivisuus on kohtalaisen korkea melko laajalla 5 pH-alueella 5-9. Tris-HCI-puskuria käytettäessä havaittiin L-dopan auto-oksi-daatiota pH-alueella 8-9, kun taas boraatilla ei samanlaista ilmiötä havaittu. Tris-HCI-puskurissa suoritetuissa määrityksissä pH-arvoissa 8,8,5 ja 9,0 suoritettiin myös nollakoe lisäämättä entsyymiä, minkä tarkoituksena oli korjata auto-oksidaation vaikutus tuloksiin. Tyrosinaasin pH-optimi näytti olevan riippu-10 vainen puskurista.
Entsyymin stabiilisuus eri pH-arvoissa määritettiin Mcllvainen, 50 mM Na2HP04 - 25 mM sitruunahappo, puskurissa inkuboimalla entsyymiliuosta eri pH-arvoissa huoneenlämmössä. Jäljellä oleva tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin määrittämällä entsyymiliuosten aktiivisuus käyttäen substraattina L-dopaa. 15 Lämmönkesto määritettiin 30, 40 ja 50 °C:ssa. Entsyymiliuosta (320 nkat/ml) 20 mM Tris-HCI-puskurissa (pH 7,5) inkuboitiin eri lämpötiloissa ja jäljellä oleva entsyymiaktiivisuus määritettiin tiettyjen aikavälien jälkeen määrittämällä tyrosinaasiaktiivisuus käyttäen normaalia aktiivisuusmääritystä 15 mM L-dopalla. Entsyymillä oli hyvä stabiilisuus neutraalissa ja alkalisessa pHrssa. 20 Kun pH laski alle 7:n, entsyymi alkoi menettää aktiivisuuttaan.
Tyrosinaasin moolimassa määritettiin ja N-terminaalinen sekven- sointi suoritettiin MALDI-TOF-massaspektrometrialla Ultraflex™-lentoaikalait- /*.’ teessä (BrukerDaltonics, Saksa) aikaisemmin kuvatulla tavalla (Palonen et ai.
• · · *;·/ 2003). Tyrosinaasin moolimassa analysoituna MALDI-TOF:lla oli noin 42,9 kDa.
25 N-terminaalinen aminohappoanalyysi osoitti, että N-terminaalinen pää oli blok- • · : kautunut. Tämä tarkoittaa sitä, että kypsässä proteiinissa on ensimmäisenä m · · aminohappona glutamiini. Tämä tulos on yhteensopiva sekvenssiä koskevien määritystulosten suhteen.
Puhdistetun TYR2:n optinen absorptiospektri määritettiin Varian Cary :*·„ 30 100 Bio -UV- ja näkyvän alueen spektrofotometrillä. Puhdistetun tyrosinaasin • .···. ultravioletti- ja näkyvän alueen absorptiospektrissä on pääproteiinipiikki 280 nm kohdalla ja olkapää 330 nm:n kohdalla. Olkapää merkitsee T3-tyyppi-*···[ sen kupariparin esiintymistä hapetetussa muodossaan sillan muodostavan hydroksyylin kanssa.
• · *«· * · • · ··· 21 118567
Esimerkki 7
Tyrosinaasin substraattispesifisyys
Tyrosinaasin substraattispesifisyys useilla erilaisilla valituilla substraateilla tutkittiin käyttämällä hapenkulutusmäärityksiä. Substraattien konsentraa-5 tio oli 2,5 mM ja yhdisteet liuotettiin 0,1 M natriumfosfaattipuskuriin, jonka pH oli 7,0. Reaktiot suoritettiin käyttäen 1,8 ml 2,5-millimolaarisia substraattiliuok-sia ja käyttäen 24 pg puhdistettua TYR2:ta. Vertailua varten suoritettiin sub-straattispesifisyysmäärityksiä kaupalliselle Agaricus bisporuksen puhdistamat-tomalle tyrosinaasille (Sigma). Määrityksissä käytettiin kussakin määrityksessä 10 erikseen 50 pg mainittua sienten tyrosinaasia. Tässä tutkimuksessa käytettyjen mono-, di- ja trifenoliyhdisteiden rakenteet esitetään taulukoissa 3 ja 4. TYR2:n ja Agaricuksen tyrosinaasin aktiivisuus analysoitiin valituilla mallipepti-deillä, jotka sisälsivät tyrosiinin peptidiketjun eri asemissa (taulukko 5). Määritettiin myös L-/DL-D-Dopan ja -tyrosiinin hapettuminen TYR2-tyrosinaasilla ja 15 Agaricuksen tyrosinaasilla (taulukko 6).
··1 2 3 • « · • · « a 1 • · · • · · *·· · «i· • 1 • a ··· • · • 1 · • · » ··· f • · • t 1 • · · • 1« · • 99 • 9 • 9 ·1· • ® Λ ·« * · 2 • · 3 9 • 99 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 999 22 118567
Taulukko 3. T. reesein ja Agaricuksen tyrosinaasin aktiivisuus verrattuna L-tyro$iiniin (%) monofenoliyhdistettä käyttäen. Hapenkulutus perustuu 02:n kulutuskäyrän lineaariseen osaan.
Substraatti TYR2 Agaricus tyr Rakenne (monofenolit) Suhteellinen ha- Suhteellinen ha-_ penkulutus (%) penkulutus (%)__ L-tyrosiini 100 100 ho^^ch^c'-Loh
Fenoli 121 85 5" ό
SH
4-merkaptofenoli 0 0 ^ __OH____ p-kresoli 172 104 f o ____
OH
4-aminofenoli 8 9 Jk 0 ! g 3-hydroksiantraniili- 0 0 f-0” ...
happo UL
• · _ — ...........
e e e
Tyramiini 42 85 :··:! Φ
• · · T
• · · OH
·· · · • · ch2ch2oh i.: : p-tyrosoli 346 157 ^
OH
—— —
f*·., p-kumariinihappo 390 0 no-ζ V CH=CH-C-OH
··* • * ________ __ o-kumariinihappo 0 0 /~Vch=ch-c-oh *...*____λ> ΌΗ__ ....! o
* · Ferulihappo 0 0 H C-OH
* 'c=c' S Ö
Il HO OCHs ··· I_I_ i___|____ 23 1 1 8 5 6 7
Taulukko 4. T. reesein ja Agaricuksen tyrosinaasin aktiivisuus verrattuna L-dopaan (%) di- ja trifenoliyhdistettä käyttäen. Hapenkulutus perustuu 02:n kulutuskäyrän lineaariseen osaan
Substraatti TYR2 Agaricuksen Rakenne
Suhteellinen tyrosinaasi hapenkulutus (%) Suhteellinen hapenkulutus (%) _
Difenolit__ L-dopa 100 100 ho h
-C-OH
OH
(-)-epikatekiir»i 106 286 X. 0H
“ζΟ:?
OH
OH
(+)-katekiini- 220 282 hydraatti
Lvi OH • xHj0 OH
··· OH
: Pyrokatekoli 88 328 oh
I.:-· U
• · · ........J 1. I—.- I — 1 2 3 i I " - ----- • · *·1·’ Trifenolit • · _____
· ♦ I I I
Pyrogalloli 55 248 °H
LI
·· · • · • · • · φ ··· • · • · • · · • · • · • 1 ··· * · · 2 • · · • · • · 3 24 118567
Taulukko 5. T. reesein ja Agaricuksen tyrosinaasin aktiivisuus verrattuna L-tyrosiiniin (%) dipeptidejä käyttäen. Hapenkulutus perustuu 02:n kulu-tuskäyrän lineaariseen osaan.
__TYR2__Agaricuksen tyrosinaasi
Substraatti ** Suhteellinen Suhteellinen __hapenkulutus (%)__hapenkulutus (%) Y__100_ 100_
Dipeptidit___ YG__128__140_ GY 292 115 ** Y = tyrosiini ja G = glysiini 5 Taulukko 6. L-/DL-D-Dopan ja -tyrosiinin hapettuminen T. reesein ja Agaricuksen tyrosinaasilla
Substraatti TYR2 +/- (%) Agaricuksen
Suhteellinen tyrosinaasi hapenkulutus (%) Suhteellinen hapenkulutus (%) L-dopa 100__ 100 DL-dopa__46__2 118 D-dopa 18 1 106 • . ............. . ....— .....
: L-tyrosiini 100 100 DL-tyrosiini 40 3 102 • * - —- —1— --— ' !**_· D-tyrosiini 7 1 61 • · · • » · ·*« · ··* TYR2 kykeni hapettamaan monia substituoituja monofenoleja, jotka sisälsivät para-asemassa olevan OH-ryhmän. Mikä tahansa fenolisen hydrok-io syyliryhmän suhteen orto-asemassa oleva sivuketju aiheutti steeristä estoa, mikä johti substraatin hapettumisen alenemiseen tai häviämiseen. Amiiniryh-män esiintyminen ja asema substraatin rakenteessa näytti olevan välttämätön, ·; kun otetaan huomioon hapen kulutusnopeus TYR2:lla. Mitä lähempänä fenolin hydroksyyliryhmä aminoryhmään nähden oli, niin sitä hitaammin substraatti *:**: 15 hapettui. Sama aminoryhmän aseman vaikutus havaittiin myös peptidimääri- :]**: tyksissä. Oli mielenkiintoista panna merkille, että TYR2:n substraattispesifisyys 25 118567 poikkesi huomattavasti Agaricuksen tyrosinaasin substraattispesifisyydestä. TYR2 on stereospesifinen verrattuna Agaricuksen tyrosinaasiin.
Kuten taulukosta 5 voidaan havaita, kykenivät TYR2 ja Agaricuksen tyrosinaasi hapettamaan tutkittuja mallipeptidejä. TYR2:n hapetusnopeus oli 5 erittäin paljon riippuvainen peptidin pituudesta ja tyrosiinitähteen asemasta. Dipeptidit hapettuivat yksittäistä tyrosiinia helpommin, ja peptidi, jolla C-termi-naalisessa päässä oli tyrosiinitähde, oli parempi substraatti TYR2:lle kuin peptidi, jossa tyrosiini oli N-terminaalisessa päässä. Agaricuksen tyrosinaasi ei ollut herkkä tyrosiinitähteen asemalle.
10 Oli yllättävää panna merkille, että Trichoderman tyrosinaasi oli erit täin stereospesifinen L-tyrosiinilla ja L-dopalla (taulukko 6). L-enantiomeerit hapettuivat D-enatiomeerejä suuremmalla nopeudella. Agaricuksen tyrosinaasilla ei havaittu mitään eroa eri enantiomeerien hapettumisnopeuksien välillä. Espin et ai (1998) ovatkin osoittaneet, että Agaricuksen tyrosinaasilla esiintyy affini-15 teetin osalta spesifisyyttä eri enantiomeerejä kohtaan, mutta ei reaktionopeuden osalta. Reaktionopeuksien selvä ero on etu synteettisessä kemiassa.
TYR2:n silloituskyky malliproteiineilla analysoitiin myös seuraamalla molekyylipainon muutoksia SDS-PAGE:ssa. Tulokset osoittivat, että TYR2 kykeni silloittamaan α-kaseiinia ja kanan myofibrilliä, mutta ei naudan seerumial-20 bumiinia. Yksityiskohdat esitetään esimerkeissä 8 ja 9.
Esimerkki 8. Lihaproteiinien silloittuminen tyrosinaasin katalysoimana • · · TYR2:n aikaansaamia kanan rintalihaksen myofibrillien eristettyjen : suolaliukoisten proteiinien (SSP) molekyylipainomuutoksia analysoitiin SDS- «·· PAGE:lla. SPP eristettiin julkaisun Xiong ja Brekke, 1989, mukaisesti. Entsyy-
I 25 mikäsittelyä varten SPP suspendoitiin proteiinikonsentraatioon 3 mg/ml 50 mM
natriumfosfaattipuskuriin, jonka pH oli 7,0 ja joka sisälsi 0,6 M NaCI:a. Sus- pensioon lisättiin 120 nkat tai 240 nkat TYR2:ta proteiinigammaa kohti. Kont- rollisuspensiota käsiteltiin samalla tavoin mutta entsyymiä lisäämättä. Reaktio- seosta inkuboitiin 30 °C:ssa. Näytteitä otettiin ajankohdilla 2 min, 1 tunti, 3 tuntia ]···. 30 ja 24 tuntia. Näytteisiin lisättiin SDS-PAGE-näytepuskuria ja niitä kuumennet- • · tiin kiehuvassa vesihauteessa. 20 pg proteiinia kustakin näytteestä pipetoitiin 12-prosenttisille Tris-HCI-polyakryyliamidigeeleille. SDS-PAGE suoritettiin jul-kaisun Laemmli, 1970, mukaisesti.
TYR2:n katalysoimana tapahtuneet proteiinijuovien tärkeimmät muu-,···, 35 tokset tunnistettiin alustavasti vertaamalla niiden suhteellista liikkuvuutta ja vär- jäytymisvoimakkuutta näytteisiin, joita oli käsitelty samalla tavoin mutta ilman 26 118567 entsyymiä. Käytetyissä olosuhteissa ja käytetyillä annoksilla TYR2 tuotti seu-raavat havaittavissa olevat elektroforeettiset muutokset, jotka ovat huomattavimpia 24 tunnin entsyymikäsittelyn jälkeen: (1) ~ 200 kDa:n suuruisen myosii-nijuovan etenevä häviäminen kummallakin entsyymiannoksella 3 h käsittelyn 5 jälkeen, (2) ~ 36 kDa:n juovan etenevä häviäminen kummallakin entsyymiannoksella 3 h käsittelyn jälkeen ja (3) geeliin tunkeutumattomien suurimolekyyli-painoisten proteiinituotteiden (> 200 kDa) ilmaantuminen 24 h käsittelyn jälkeen.
TYR2:n kykyä muodostaa siltoja kanan myofibrillimatriksiin tutkittiin myös varastomoduulin (G’) kehittymisenä, joka kuvaa geelinmuodostamisky-10 kyä pienellä muodonmuutosvoimalla. Määritykset suoritettiin vakiolämpötilassa suoritettavan lämmityksen aikana käyttäen Bohlin Rheometer -laitetta. Kanan rintalihaksen myofibrillit eristettiin julkaisun Xiong ja Brekke (1989) mukaisesti jättäen EDTA ja NaN3 pois eristyspuskurista. Eristetyt myofibrillit suspendoitiin 50 mM Na-fosfaattipuskuriin, jonka pH oli 6 ja jota oli täydennetty 0,30 M 15 NaCI:lla, proteiinikonsentraatioon 40 mg/ml. Suspensiota käsiteltiin 240 nkatlla TYR2:ta proteiinigrammaa kohti 25 °C:ssa, 30 °C:ssa ja 40 °C:ssa kolmen tunnin ajan. Kontrollinäytteitä käsiteltiin samalla tavoin mutta ilman entsyymiä.
Tulokset osoittavat, että myofibrillinäytteiden käsittely TYR2:lla sai aikaan suuremman G’:n lisääntymisen kuin ainoastaan Na-fosfaattipuskurilla 20 käsitellyillä näytteillä. (Tätä on tarkasteltu kuviossa 5; ala- ja yläosassa olevien viivojen merkitys on: kontrolli 25 °C, kontrolli 30 °C, kontrolli 40 °C, TYR2 t...t 25 °C, TYR2 30 °C ja TYR2 40 °C). Käsittelylämpötilan kohottaminen voimisti geelin muodostumista. Siten TYR2 muodosti siltoja kanan myofibrilliproteiini- • · ♦ : matriksiin.
«·· • · • · ··· : 25 Esimerkki 9. Maitotuoteproteiinin geeliyttäminen 7yr2:lla j :*: 3 % kaupallista kaseinaattia yhdistettiin veteen ja seokseen lisättiin :***· 0,4 % GDL:ää (glukonodeltalaktonia) ja 20 nkat/g TYR2-proteiinia. Tämän an- ··· nettiin olla paikoillaan 22 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen geelin ko-vuus määritettiin Texture Analyzer -laitteella (kuvio 6). Tyrosinaasikäsittely kak- • · · 30 sinkertaisti kaseinaattigeelin kovuuden.
• · »·· ϊ*": Esimerkki 10. TYR2:n vaikutus vehnätaikinan ominaisuuksiin ··· ····: TYR2:n vaikutus vehnätaikinan suuren muodonmuutoksen reologiaan ' . tutkittiin käyttäen Kiefferin venytyslaitetta (Stable Micro Systems, Ltd., Yhdisty- nyt kuningaskunta). Taikinan venyvyys ja venytysvastus määritettiin entsyymi- • · *···* 35 annoksen ja taikinan lepoajan funktiona.
27 118567
Vehnäjauhoja sekoitettiin Farinograph-laitteella (Brabender, Saksa) käyttäen 12 grammaa jauhoja ja 72 ml nestefaasia (60 %). Tyrosinaasia (1 ja 10 nkat/jauhogramma) lisättiin veteen juuri ennen jauhojen sekoittamista. Se-koitusaika oli 4 min. Tämän jälkeen taikina asetettiin muottiin noin 10-12 tut-5 kittavan taikinakoepalan aikaansaamiseksi. Puristettua muottia pidettiin huoneenlämmössä 15- 45 min, minkä tarkoituksena oli antaa jännitysten laueta. Kieffer-kokeissa taikinakoepaloja venytettiin keskeltä siihen asti, kunnes koepalan kimmoisuusraja ylittyi ja tämä katkesi. Maksimaalinen venytysvastus (Rmax)i maksimaalinen venyvyys (Emax) ja venyvyys Ex Rmax:n kohdalla määri-10 tettiin rekisteröimällä suurin voima ja etäisyys maksimissaan ja venytysrajan kohdalla. Taikinan valmistus, entsyymikäsittelyt ja määritykset suoritettiin kaikki huoneenlämmössä, suunnilleen 22 0C:ssa. Kieffer-kokeista saadut tulokset esitetään kuvioissa 7 ja 8. Ne osoittavat, että TYR2 lisäsi taikinan maksimaalista venytysvastusta Rmax ja pienesi taikinan venyvyyttä Ex Rmax:n kohdalla, mikä 15 osoittaa, että taikina oli kovettunut. Entsyymiannoksen lisääminen voimisti taikinan kovettumista.
·1 2 3· • · · • · « • · · • · · • •e t ··· • · ··· • · • · · • · · • · • · · • · · ··· · ··♦ * 1 • · ··♦ • 1 • ·· ··♦ • · • · ·1· ··· • · • · ··· • « · 2 ··« • · • · 3 28 118567
Kiijallisuusviitteet
Abdel-Raheem, A. ja Shearer, C.A. 2002. Extracellular enzyme production by freshwater ascomycetes. Fungal Diversity 11,1-19.
Coen, D.M. 2001. The polymerase chain reaction. Teoksessa: 5 Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., More, D.D., Seidman, J.G., Smith, K. ja Struhl, K. (toim.) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons. Inc., Hoboken, USA.
Dabbous, M.K. 1966. Inter- and intramolecula cross-linking in tyrosinase-treated tropocollagen. J. Bio. Chem. 241, 5307 - 5312.
10 Decker, H. ja Tuczek, F. 2000. Tyrosinase / catecholoxidase activity of hemocyanins: structural basis and molecular mechanism, Trends Biochem. Sci. 25, 392 - 397.
Della-Cioppa, G., Garger, S.J., Sverlow, G.G., Turpen, T.H. ja Grill, L.K. 1990. Melanin production in Escherichia coli from a cloned tyrosinase 15 gene. Bio/Technology 8, 634 - 638.
Espin, J.C., Garcia-Ruiz, P.A., Tudela, J. ja Garcia-Canovas, F. 1998. Study of stereospecificity in mushroom tyrosinase, Biochem. J. 331, 547-551.
Fujita, Y., Uraga, Y. ja Ichisima, E. 1995. Molecular cloning and nu-20 cleotide sequence of the protyrosine gene, melO from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochimica Bbphysica Acta 1261,151 -154.
Gellissen, G. (toim.) 2005. Production of recombinant proteins. Novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH Verlag Gmbh & Co.
• · "I.* weinheim, Saksa.
• * /•f 25 Holker, U., Dohse, J. ja Hofer, M. 2002. Extracellular laccase in as- • · · ··*/ comycete Trichoderma atroviride and Trichoderma harzianum, Folia Microbiol.
:.: : 47, 423 - 427.
• ··
Ito, S., Kato, T., Shinpo, K. ja Fujita, K. 1984. Oxidation of tyrosine residues in proteins by tyrosinase, Biochem. J. 222,407 - 411.
30 Kuraishi, C., Yamazaki, K. ja Susa, Y. 2001. Transglutaminase: its utilization in the food industry. Food Rev. Int. 17, 221 - 246.
···
Laemmli, UK.1970. Cleavage of structural proteins during the as- ***\ sembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680 - 685.
Lerch, K. 1981. Copper monooxygenases: Tyrosinase and dopa- ·:··; 35 mine y-hydroxylase. Teoksessa H. Sigel (toim.), Metal ions biological systems ·*“· (sivut 143 -186). New York, Marcel Dekker.
··· 29 1 1 8567
Lerch, K. 1983. Neurospora tyrosinase: structural, spectroscopic and catalytic properties, Mol. Cell. Biochem. 52,125 -138.
Leu, W.M., Chen, L.Y. ja Lee, Y.H. 1992. Secretion of the Strepto-myces tyrosianse is mediated through its trans-activator protein, melC1. J.
5 Biol. Chem. 267, 20108 - 20113.
Matheis, G. ja Whitaker, J.R. 1984. Modification of a protein by polyphenol oxidase and peroxidase and their products, J. Food Biochem., 8, 137-162.
Matheis, G. ja Whitaker, J.R.,1987. A review: Enzymatic cross-10 linking of proteins applicable to foods. J. Food Biochem. 11, 309 - 327.
Nielsen P.M. 1995. Reactions and potential industrial applications of transglutaminase. Review of literature and patents. Food Biotechnology 9, 119-156.
Palonen, H., Saloheimo, M., Viikari, L. ja Kruus, K. 2003. Purifica-15 tion, characterization and sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp. Enzyme Microb. Technol. 31,403 - 410.
Penttilä, M., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E., Knowles, J.K.C. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61,155 -164.
20 Robb, D. A., Tyrosinase, teoksessa Copper Proteins and Copper
Enzymes vol. 2, toim. R. Lontie, CRC Press Inc Boca, Raton, Florida, 1984, 207 - 240.
• · ♦ /Y Sambrook, J., Fritsch, E.F. ja Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: « · · :;j/ A laboratory manual, 2. laitos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring 25 Harbor NY.
• · :.: : Sanchez-Ferrer, A., Rodriguez-Lopez, N., Garcia-Canovas, F., Garcia- • · ; Carmona F. 1995 Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism, Bio- chimica et Biophysica Acta 1247,1 -11.
Score, A.J., Palfreyman, J.W. ja White, N.A. 1997. Extracellular 30 phenoloxidase and peroxidase enzyme production during interspecidic fungal • .·*·. interactions. Int. Biodeterioration and Biodegradation 39, 225 - 233.
Y Takasaki, S. ja Kawakishi, S. 1997. Formation of protein-bound 3,4- *···[ dihydroxyphenylalanine and 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanlne as new cross-linkers in gluten. J. Agr. Food Chem. 45, 3472 - 3475.
....: 35 Thalmann, C.R. ja Lotzbeyer, T. 2002. Enzymatic cross-linking of .···. proteins with tyrosinase. Eur. Food Res. Technol. 214, 276 - 281.
·«· 30 118567
Tomsovsky, M. ja Homolka, L 2004. Tyrosinase activity discovered from Trametes spp., World J. Microbiol. Biotechnol. 20, 529 - 530.
Tsai, T.-Y. ja Lee, Y.-H. W., 1998. Roles of copper ligands in the activation and secretion of Streptomyces tyrosinase, J. Biol. Chem. 273, 19243 -5 19250.
Van Gelder, C.W.G., Flurkey, W.H. ja Wicjers, H.K. 1997. Sequence and structural features of plant and fungal tyrosinases. Phytochem. 45,15 - 21.
Wichers, H.J., Gerritsen, Y.A.M. ja Chapelon, C.G.J., 1996. Tyrosinase isoforms from the fruitbodies of Agaricus bisporus, Phytochemistry 43, 10 333 - 337.
Wichers, H. J., Recourt, K., Hendries, M., Ebbelaar, C.E.M., Bian-core, G., Hoeberichts, F.A., Mooibroek, H. ja Soler-Rivas, C. 2003. Cloning, expression and characterization of two tyrosinase cDNAs frm Agaricus bisporus, Appi. Microbiol. Biotechnol. 61, 336 - 341.
15 Xiong, Y. L. ja C. J. Brekke, 1989. Changes in protein solubility and gelation properties of chicken myofibrils during storage. J. Food Sci. 54:1141 -1146.
aaa • # » t * » • · • # · • » · aaa · ··» •' a • · aaa • · • a a a a a ·** * a a a a a a a a a a a a aaa a a a a aaa aa a a a aa a aaa a a a a aaa a aaa a a a a ’ aaa a a a a a a a aaa a a a a aaa i 118567
SEQUENCE LISTING <110> Valtion teknillinen tutkimuskeskus <120> Novel Microbial Enzymes and Their Uses <130> 2042734FI
<160> 8 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 2075
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei <220> <221> Intron <222> (290)..(355) <223> <220> <221> Intron <222> (487)..(571) <223> <220> <221> Intron <222> (839)..(890) <223> .···, <400> 1 *.* * atgggcttcc tcgctcgcct cacttgggtc ttccacttgg tccttctttt ggtggccgcc 60 • · • · · • · · ·*· * caggactatg actttggcgt cgacgtcatc tccatcactc gtcgacggga taccgacgca 120 • · • # , ! cccatcgtcg tcggccgcct gccatcggcc tccaacggga gcacacccct gagactcgag 180 ! · * • *® * • ,·, atccgcgacg tcaaggcaga caaatatcgg tgggacctgt acattctggc gctgagtatg 240 • · « • *® ♦ ·***· tttcagtccg tcaatcagga cgatcccctg tcgtattacc aagttgctgg taagtgagat 300 ·«· gtgtgaacac gactcggctt tggcctcagc agtctgatga gctttgtgag cctagggata 360 ·· • **· cacggtgtgc cctttgtgac atggaatggg gttggaccag cagcgggagc gagccagtca 420 ·*· • * *···* ggttactgtc cgcatagttc agttctgttt ccaacgtggc accgcccata tctagccttg 480 ·** ·„.* tacgaggtga gtcggtctgg gttccagaca gccggcgccg gcaacgcccg cacgcacgtt 540 ··*·· ttgtggacaa gaagatgact ttgctttcca gcaagagctg cacaagcttg ccggtgccat 600 * • · tgccgacatg ttcgccaatg ccactgaacg cttcctctac aggcaagctg cctcggattt 660 • * · • t • « 2 118567 tcgtataccg tactgggact gggcatcgcc cgcccctgaa ggcgagagcc attttcccga 720 cgtcttttgg aactcgacca tgatccaata cggtcccaat ggcgtccaag ttattcgtaa 780 cccgctgtac tcttactcgt tccatccgct tgatggagat gcgctcatct ggccaccggt 840 acgtataatg gagggcaaca tacacacaat cgcctgctga cagctcatag ttgcgaagct 900 ggaacgaaac aaaacgagct ccaaatacag aaatcagtca agccgagcca ccttccatga 960 atgaccaagt gagcgcggcc ttgctggcca gattgcccga gatacagcag cgattgtaca 1020 tactcttctc tagttatcac gagtttgact cgttcagcaa caagaactat gccttttcgc 1080 agaacctcag ccatctggac tctatcgagg ccgttcacga cattatccac atatatggcg 1140 gatctagggg ccatatgacc tatgttcctc tgtcgtcctt tgatccgctc ttcttccttc 1200 accacgccat gacggacagg ctgatatcga tgtggcagct tctcaatccc tcggcatgga 1260 tgactccaca gatctcagga gagacgacat acactgcgct aaagggaacc atgcaaaact 1320 ccagcactcc gcttacgcca ttcatgtcct cagcagacgg cactttctgg gactctgaca 1380 tgtccaggtc aacggaagtg tttggctacg catacggaga cacctcatat gtgcctggcg 1440 actctgagag cccacgcaac aagctgattc gcaagattaa cagatggctt ggcctgaaca 1500 gcccggccat ggttcgaatc aagagccaag cacagaaccg gcgacccagc ggcgtatgga 1560 agggcaacac aggcgtcaaa ggcgtccagc ccagcctcaa gatagacatg agcgatgtcg 1620 tggacgacca ttatacggag tggattgcaa atgtacacgt caaccacgga gctttggacg 1680 gatcattcag catttacttc ttcgccggca agccgccagc cgacgtcggc acttgggcgt 1740 »I* * t * *·* " ttgctccaaa tctcatggga tcggtcggca tcttcaccat gagcggcatg ggtggccatc 1800 * · ft ft ft • · · *** · actccaagat gtcgggaagc gtgccgttga ccatggctct gatgaggctg gctagcctag 1860 • · • · . *1 gagctgtcca aagtgtcgag ccaaactcgg tggtggcgtt tctgcaaagc agactacact 1920 • · • · · ··· · • ttcgcatcgc tagcattgat gacaaggaaa ttgacccaag tctcgttgcc gggctcttca 1980 • · · ··· ♦ ·***· tcgggatcag cagcaccagg gtaaggctgc ccaagagtga gcttgagttt ccagattggg 2040 *·· gtcagccgat gctgagattg gtgttgtggg agtag 2075 ft# ft ft ft ·· .···, <210> 2 *...* <211> 2404
.I. <212> DNA
·,„* <213> Trichoderma reesei • *ί**ί <220> . <221> Intron ***** <222> (159)..(397) ,·»·. <223> ft ft ft·· 3 118567 <220> <221> Intron <222> (475)..(540) <223> <220> <221> Intron <222> (624)..(725) <223> <220> <221> Intron <222> (774)..(832) <223> <220> <221> Intron <222> (1199)..(1243) <223> <220> <221> Intron <222> (1429)..(1506) <223> <220> <221> Intron <222> (2123)..(2221) <223> ··· • · · • · · : .1. <400> 2 * · t *",2 atgctgttgt cagcgtccct ctcggcgttg gccttggcca cagtttcact cgcacagggc 60 • · . "1 acgacacaca tccccgtcac cggtgttccc gtctctcctg gtgctgccgt gccgctgaga 120
» · I
··· · ; ,·. cagaacatca atgacctggc caagtccggg ccgcaatggt gagtgacgcc ctccttccac 180 • · · ··« · ;3· cacactttac ctcagtcaag agacaagagg gagacaagta caaagcggat gaaaagaggt 240 ·· ggacaagaga gagagagaga gaaagtgtgt gtgtgtatgt gagagcgaga gagagagaga 300 *· .
• · ; ·· gagacaagag ctattggatg gaccaggagc cagcatggag aacaggggga gacttgacga 360 #·· • · *···1 ttcgaggaga ggggggctca catgtgcgtg cgaataggga tctctacgtt caggccatgt 420 ··« • a acaacatgtc caagatggac tcccatgacc cgtacagctt cttccagatt gccggtaaat 480 a atacatctcg gcctcctgcg aggcgacgtg actctcggag cttttagtaa caccagctag 540 · gcatccacgg cgcaccgtac attgagtaca acaaggccgg agcaaagtcg ggcgatggct 600 2 ··· • · • 1 3 a·1 4 118567 ggctgggcta ctgccctcac ggtgtatgtg tttttgtcca tcgaggaggg cgcaagagtt 660 tcatggactt gaactcttcg cccttgttgt gagccggaaa tcatcgtctc tgacagtttc 720 attaggagga cctcttcatc agctggcacc gcccctatgt cctgctcttt gaggtatgat 780 ttgaccacgc tggactttga cctcatacaa acatcaactg acatcgttgc agcaagcctt 840 ggtctccgtc gccaagggca tcgccaactc gtatcccccg tctgtccgcg ccaagtacca 900 ggctgccgcc gccagcctgc gcgcccccta ctgggactgg gccgccgaca gctccgtgcc 960 cgccgtcacc gtcccccaga cgctcaagat caacgtcccc agcggcagca gcaccaagac 1020 cgtcgactac accaacccgc tcaagacgta ctacttcccg cgcatgtcct tgaccggctc 1080 gtacggcgag ttcaccggcg gaggcaacga ccacaccgtc cgctgcgccg cctccaagca 1140 gagctatccc gccaccgcca actccaacct ggctgcccgt ccttacaagt cctggatcgt 1200 acgtagtccc cctttccctt tggaagcttc cccttgagta aagctcgtca ctgacacaga 1260 gagcggcccg cagtacgatg tcctgaccaa ctctcaaaac tttgccgact tcgcctccac 1320 cagcggcccc ggcatcaacg ttgagcagat ccacaacgcc atccactggg acggtgcttg 1380 cggctcccag ttcctcgccc ccgactactc cggcttcgac cccctgttgt aagtcaatcg 1440 agacgtcaag agtcatcttg tcaacaaccg atggcaaacg cagtctgtac tgacgctgca 1500 aaatagcttc atgcaccacg cccaggtcga ccgcatgtgg gccttctggg aggccatcat 1560 gccctcgtcg cccctcttca cggcctcgta caagggccag tcgcgcttca actccaagtc 1620 gggcagcacc atcacccccg actcgcccct gcagcccttc taccaggcca acggcaagtt 1680 • · · *·* * ccacacgtcc aacacggtca agagcatcca gggcatgggc tactcgtacc agggcatcga 1740 * ·*· • · · ***.’ gtactggcaa aagtcccagg cccagatcaa gtcgagcgtc accaccatca tcaaccagct 1800 • * • · ··· • gtacgggccc aactcgggca agaagcgcaa cgccccgcgc gacttcttga gcgacattgt 1860 • · · ··· · I caccgacgtc gagaacctca tcaagacccg ttactttgcc aagatctcgg tcaacgtgac 1920 ·*· · I***· cgaggtgacg gtccgccccg ccgagatcaa cgtctacgtc ggcggccaga aggccggcag 1980 ··· cttgatcgtc atgaagctcc ccgccgaggg cacggtcaac ggcggcttca ccattgacaa 2040 ·· • · J *· ccccatgcaa agcatcctgc acggtggtct ccgcaacgcc gtccaggcct ttaccgagga 2100 ·»· * · ··· cattgaggtt gagattctct ctgtaagttt tcccccctct ctccactccc gaccactcac 2160 ··· • » *·.·* tgtcactatt tcgactagtc accgtcaaga tgtgtatttg tttgctgacc cccaagcgca 2220 gaaggacgga caagccatcc ccctcgagac ggtccccagc ctgtccatcg acctcgaggt 2280 * * cgccaacgtc accctgccct ccgccctcga ccagctgccc aagtacggcc agcgctccag 2340 ··· • · • · ··· 5 118567 gcaccgcgcc aaggccgccc agcgcggaca ccgctttgcc gttccccata tccctcctct 2400 gtaa 2404 <210> 3 <211> 623
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei <400> 3
Met Gly Phe Leu Ala Arg Leu Thr Trp Val Phe His Leu Val Leu Leu 15 10 15
Leu Val Ala Ala Gin Asp Tyr Asp Phe Gly Val Asp Val lie Ser lie 20 25 30
Thr Arg Arg Arg Asp Thr Asp Ala Pro lie Val Val Gly Arg Leu Pro 35 40 45
Ser Ala Ser Asn Gly Ser Thr Pro Leu Arg Leu Glu lie Arg Asp Val 50 55 60
Lys Ala Asp Lys Tyr Arg Trp Asp Leu Tyr lie Leu Ala Leu Ser Met 65 70 75 80
Phe Gin Ser Val Asn Gin Asp Asp Pro Leu Ser Tyr Tyr Gin Val Ala 85 90 95
Ml • · * *·* * Gly lie His Gly Val Pro Phe Val Thr Trp Asn Gly Val Gly Pro Ala j 100 105 110 ··· · ··· • · • · «**1 Ala Gly Ala Ser Gin Ser Gly Tyr Cys Pro His Ser Ser Val Leu Phe J.J { 115 120 125 • · • « f • · · ··· f ·***· Pro Thr Trp His Arg Pro Tyr Leu Ala Leu Tyr Glu Gin Glu Leu His "* 130 135 140 »· * *·· Lys Leu Ala Gly Ala lie Ala Asp Met Phe Ala Asn Ala Thr Glu Arg .**·. 145 150 155 160 • · »·· ·#·
Phe Leu Tyr Arg Gin Ala Ala Ser Asp Phe Arg lie Pro Tyr Trp Asp ...,ϊ 165 170 175 • » ♦ ***** Trp Ala Ser Pro Ala Pro Glu Gly Glu Ser His Phe Pro Asp Val Phe ,·*·, 180 185 190 • t ···
Trp Asn Ser Thr Met lie Gin Tyr Gly Pro Asn Gly Vai Gin Val lie 195 200 205 6 118567
Arg Asn Pro Leu Tyr Ser Tyr Ser Phe His Pro Leu Asp Gly Asp Ala 210 215 220
Leu lie Trp Pro Pro Leu Arg Ser Trp Asn Glu Thr Lys Arg Ala Pro 225 230 235 240
Asn Thr Glu lie Ser Gin Ala Glu Pro Pro Ser Met Asn Asp Gin Val 245 250 255
Ser Ala Ala Leu Leu Ala Arg Leu Pro Glu lie Gin Gin Arg Leu Tyr 260 265 270 lie Leu Phe Ser Ser Tyr His Glu Phe Asp Ser Phe Ser Asn Lys Asn 275 280 285
Tyr Ala Phe Ser Gin Asn Leu Ser His Leu Asp Ser lie Glu Ala Val 290 295 300
His Asp Ile He His He Tyr Gly Gly Ser Arg Gly His Met Thr Tyr 305 310 315 320
Val Pro Leu Ser Ser Phe Asp Pro Leu Phe Phe Leu His His Ala Met 325 330 335 *·· • · · *«1 1 Thr Asp Arg Leu He Ser Met Trp Gin Leu Leu Asn Pro Ser Ala Trp • 340 345 350 ··· 1 ··· • · • · .21 Met Thr Pro Gin He Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Thr Ala Leu Lys Gly ί.ί : 355 360 365 • · • « 1 • · 2 ··· · ·***· Thr Met Gin Asn Ser Ser Thr Pro Leu Thr Pro Phe Met Ser Ser Ala **· 370 375 380 ·» ; ·· Asp Gly Thr Phe Trp Asp Ser Asp Met Ser Arg Ser Thr Glu Val Phe .1··, 385 390 395 400 • · *·· ···
Gly Tyr Ala Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Val Pro Gly Asp Ser Glu Ser ...·: 405 410 415 • ♦ • * Pro Arg Asn Lys Leu He Arg Lys He Asn Arg Trp Leu Gly Leu Asn 420 425 430 · 2 ··· 118567
Ser Pro Ala Met Val Arg lie Lys Ser Gin Ala Gin Asn Arg Arg Pro 435 440 445
Ser Gly Val Trp Lys Gly Asn Thr Gly Val Lys Gly Val Gin Pro Ser 450 455 460
Leu Lys lie Asp Met Ser Asp Val Val Asp Asp His Tyr Thr Glu Trp 465 470 475 480 lie Ala Asn Val His Val Asn His Gly Ala Leu Asp Gly Ser Phe Ser 485 490 495 lie Tyr Phe Phe Ala Gly Lys Pro Pro Ala Asp Val Gly Thr Trp Ala 500 505 510
Phe Ala Pro Asn Leu Met Gly Ser Val Gly lie Phe Thr Met Ser Gly 515 520 525
Met Gly Gly His His Ser Lys Met Ser Gly Ser Val Pro Leu Thr Met 530 535 540
Ala Leu Met Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ala Val Gin Ser Val Glu Pro 545 . 550 555 560
Asn Ser Val Val Ala Phe Leu Gin Ser Arg Leu His Phe Arg lie Ala 565 570 575 ·«· • · · *·* * Ser lie Asp Asp Lys Glu lie Asp Pro Ser Leu Val Ala Gly Leu Phe I .*. 580 585 590 • * · ··· # ··· • · • · lie Gly lie Ser Ser Thr Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Glu Leu Glu ·.· j 595 600 605 • · • ♦ · • · · I·· · »***· Phe Pro Asp Trp Gly Gin Pro Met Leu Arg Leu Val Leu Trp Glu *'·* 610 615 620 • *·· <210> 4 .···. <211> 571
<212> PRT
.!« <213> Trichoderma reesei • · · ··· ....: <400> 4 . « * . Met Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 ·»· • · • 9 ···' 8 118567
Leu Ala Gin Gly Thr Thr His Ile Pro Vai Thr Gly Vai Pro Vai Ser 20 25 30
Pro Gly Ala Ala Vai Pro Leu Arg Gin Asn Ile Asn Asp Leu Ala Lys 35 40 45
Ser Gly Pro Gin Trp Asp Leu Tyr Vai Gin Ala Met Tyr Asn Met Ser 50 55 60
Lys Met Asp Ser His Asp Pro Tyr Ser Phe Phe Gin Ile Ala Gly Ile 65 70 75 80
His Gly Ala Pro Tyr Ile Glu Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Ser Gly 85 90 95
Asp Gly Trp Leu Gly Tyr Cys Pro His Gly Glu Asp Leu Phe Ile Ser 100 105 110
Trp His Arg Pro Tyr Vai Leu Leu Phe Glu Gin Ala Leu Vai Ser Vai 115 120 125
Ala Lys Gly Ile Ala Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Vai Arg Ala Lys Tyr 130 135 140
Gin Ala Ala Ala Ala Ser Leu Arg Ala Pro Tyr Trp Asp Trp Ala Ala 145 150 155 160 ·*"* *·* * Asp Ser Ser Vai Pro Ala Vai Thr Vai Pro Gin Thr Leu Lys Ile Asn Ϊ , 165 170 175 • · · ··· f ··· • · * · .** Vai Pro Ser Gly Ser Ser Thr Lys Thr Vai Asp Tyr Thr Asn Pro Leu ·.· · 180 185 190 : ♦ · · ··$ · ·***· Lys Thr Tyr Tyr Phe Pro Arg Met Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Gly Glu ***** 195 200 205 • f J *·· Phe Thr Gly Gly Gly Asn Asp His Thr Vai Arg Cys Ala Ala Ser Lys .**·. 210 215 220 * ♦ *·· »·· *„.« Gin Ser Tyr Pro Ala Thr Ala Asn Ser Asn Leu Ala Ala Arg Pro Tyr ....I 225 230 235 240 • ♦ ***** Lys Ser Trp Ile Leu Vai Thr Asp Thr Glu Ser Gly Pro Gin Tyr Asp .**·. 245 250 255 • » *«· , 118567
Vai Leu Thr Asn Ser Gin Äsn Phe Ala Asp Phe Ala Ser Thr Ser Gly 260 265 270
Pro Gly Ile Asn Vai Glu Gin Ile His Asn Ala Ile His Trp Asp Gly 275 280 285
Ala Cys Gly Ser Gin Phe Leu Ala Pro Asp Tyr Ser Gly Phe Asp Pro 290 295 300
Leu Phe Phe Met His His Ala Gin Vai Asp Arg Met Trp Ala Phe Trp 305 310 315 320
Glu Ala Ile Met Pro Ser Ser Pro Leu Phe Thr Ala Ser Tyr Lys Gly 325 330 335
Gin Ser Arg Phe Asn Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ile Thr Pro Asp Ser 340 345 350
Pro Leu Gin Pro Phe Tyr Gin Ala Asn Gly Lys Phe His Thr Ser Asn 355 360 365
Thr Vai Lys Ser Ile Gin Gly Met Gly Tyr Ser Tyr Gin Gly Ile Glu 370 375 380
Tyr Trp Gin Lys Ser Gin Ala Gin Ile Lys Ser Ser Vai Thr Thr Ile 385 390 395 400 M» • · · *·* * Ile Asn Gin Leu Tyr Gly Pro Asn Ser Gly Lys Lys Arg Asn Ala Pro I 405 410 415 • » * • M · *»· * t • t ,*" Arg Asp Phe Leu Ser Asp Ile Vai Thr Asp Vai Glu Asn Leu Ile Lys •.f · 420 425 430 * .\ « · · ··· · ·***· Thr Arg Tyr Phe Ala Lys Ile Ser Vai Asn Vai Thr Glu Vai Thr Vai **** 435 440 445 ·· ; *·· Arg Pro Ala Glu Ile Asn Vai Tyr Vai Gly Gly Gin Lys Ala Gly Ser ,···, 450 455 460 t · 'f·· *,,,· Leu Ile Vai Met Lys Leu Pro Ala Glu Gly Thr Vai Asn Gly Gly Phe 465 470 475 480 • · ***** Thr Ile Asp Asn Pro Met Gin Ser Ile Leu His Gly Gly Leu Arg Asn .·*·. 485 490 495 • · ···'
Ala Vai Gin Ala Phe Thr Glu Asp Ile Glu Vai Glu Ile Leu Ser Lys 500 505 510 118567 10
Asp Gly Gin Ala Ile Pro Leu Glu Thr Vai Pro Ser Leu Ser Ile Asp 515 520 525
Leu Glu Vai Ala Asn Vai Thr Leu Pro Ser Ala Leu Asp Gin Leu Pro 530 535 540
Lys Tyr Gly Gin Arg Ser Arg His Arg Ala Lys Ala Ala Gin Arg Gly 545 550 555 560
His Arg Phe Ala Vai Pro His Ile Pro Pro Leu 565 570 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <400> 5 gctaccgcgg atgggcttcc tcgotcgcct cac 33 <210> 6 <2U> 55 <212> DNA <213> Artificial <400> 6 ,*i*. ctgaggatcc tcagtggtgg tggtggtggt gctcccacaa caccaatctc agcat 55 • · * • · • · · “I · <210> 7 <2ii> 55
<212> DNA
·.; · <213> Artificial Ϊ *** i <4oo> 7 ϊ***· ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tcatgctgtt gtcaggtccc, tctcg 55 .. <210> 8 • *·· <211> 76
.·*·, <212> DNA
*·..* <213> Artificial ··· %..* <400> 8 ····· ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agtggtggtg gtggtggtgc agaggaggga 60 tatggggaac ggcaaa 76 • · ··· • · • * *··

Claims (35)

  1. 31 118567 Patentti vaati m u kset
  2. 1. Proteiini, joka käsittää tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan segmentin, jolloin mainittu proteiini on saatavissa Trichoderma spp:stä ja sillä on ami- 5 nohapposekvenssi, joka on vähintään 70-prosenttisesti identtinen sekvenssinä nro 3 tai sekvenssinä nro 4 esitetyn aminohapposekvenssin tai tämän tyrosi-naasiaktiivisen fragmentin suhteen.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, joka käsittää N-terminaalisessa päässään signaaiisekvenssin.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jossa proteiini on kyp sä proteiini, jossa esiintyy tyrosinaasiaktiivisuutta.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jossa proteiinia koo-daa polynukleotidi, joka on saatavissa Trichoderma spp:n DNA:sta monistamalla alukeparilla, jolla on sekvenssinä nro 5 ja sekvenssinä nro 6, tai sek- 15 venssinä nro 7 ja sekvenssinä nro 8, esitetyt sekvenssit.
  6. 5. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen proteiini, jossa proteiinia koodaa Trichoderma reeseistä saatava polynukleotidi.
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jossa proteiinia koodaa polynukleotidi, jolla on sekvenssiin nro 1 tai sekvenssiin nro 2 sisältyvä 20 sekvenssi.
  8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jolla on sekvenssiin nro 3 tai sekvenssiin nro 4 sisältyvä aminohapposekvenssi.
  9. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, joka käsittää sek- Ml I .·**. venssinä nro 3 tai sekvenssinä nro 4 esitetyn aminohapposekvenssin tyrosi- ·*.’·. 25 naasiaktiivisen fragmentin. • · · j*V 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jossa proteiinia koo- daa polynukleotidi, joka kykenee hybridisoitumaan vaativuudeltaan keskitasoi-*··** sissa tai korkeissa olosuhteissa nukleiinihappoon, jolla on sekvenssinä nro 1 tai sekvenssinä nro 2 esitetty sekvenssi. ί *** 30 10. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteiini, jossa proteiinin mo- • · · lekyylipaino on noin 42,9 kDa, pl noin 9, pH-optimi pH-arvojen noin 8 - 8,5 « ,··*. kohdalla ja joka proteiini on aktiivinen alkalisessa tai neutraalissa pH:ssa. .[il: 11. Eristetty polynukleotidi, joka koodaa minkä tahansa patentti- • * • t vaatimuksista 1-10 mukaista proteiinia. ’!**! 35 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen polynukleotidi, jolla on sek- «·· venssiin nro 1 tai sekvenssiin nro 2 sisältyvä sekvenssi tai joka kykenee hybri- 32 118567 disoitumaan vaativuudeltaan keskitasoisissa tai korkeissa olosuhteissa sekvenssiin nro 1 tai sekvenssiin nro 2 sisältyvään sekvenssiin.
  10. 13. Ilmentämisvektori, johon on sijoitettu patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen polynukleotidi.
  11. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilmentämisvektori, johon po lynukleotidi on sijoitettu voimakkaan promoottorin, kuten cbh1 :n, ohjaamaksi.
  12. 15. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukaisen ilmentämisvektorin.
  13. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen isäntäsolu, joka on rih-10 masieni-tai hiivalaji.
  14. 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen isäntäsolu, joka on Tricho-derma-laji, edullisesti Trichoderma reesei.
  15. 18. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin valmistamiseksi, joka menetelmä sisältää vaiheet, joissa: 15 ai) siirretään isäntäsoluun polynukleotidi, joka koodaa proteiinia, joka käsittää tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan segmentin, jossa mainittu proteiini on saatavissa Trichoderma spp:stä, tai 82. siirretään isäntäsoluun promoottori, jonka vaikutuksesta solun-ulkoisen tyrosinaasin geenin ilmentyminen tehostuu, ja kytketään promoottori 20 toiminnallisesti mainittuun geeniin ja b) kasvatetaan mainittua isäntäsolua mainitun proteiinin ilmentämi-seen soveltuvissa olosuhteissa, ja I · f ' J : ,·. c) valinnaisesti otetaan muodostunut mainittu proteiini talteen ja puhdistetaan se. * ·
  16. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, joka sisältää ;·γ sen, että f · · *;·/ a) siirretään isäntäsoluun solunulkoista tyrosinaasia koodaava DNA- *···: sekvenssi, joka DNA-sekvenssi on saatavissa Trichoderma spp:n DNA:sta monistamalla alukeparilla, jolla on sekvenssinä nro 5 ja sekvenssinä nro 6, tai • « • *·· 30 sekvenssinä nro 7 ja sekvenssinä nro 8, esitetyt sekvenssit, ί]Ϋ b) kasvatetaan mainittua isäntäsolua ilmentämiseen soveltuvissa .···. olosuhteissa, ja ♦ · c) otetaan erittynyt proteiini talteen kasvatusmediumista ja valinnaisesti puhdistetaan se. ""! 35 20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen menetelmä, jossa siir- (j retty DNA saadaan T. reeseistä. 33 118567
  17. 21. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 18-20 mukainen menetelmä, jossa isäntäsolu on Trichoderma spp., edullisesti T. reesei.
  18. 22. Proteiini, joka on saatavissa minkä tahansa patenttivaatimuksista 18-21 mukaisella menetelmällä.
  19. 23. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin, jolla on tyrosinaasi- aktiivisuutta, käyttö proteiinipitoisen materiaalin modifiointiin.
  20. 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen käyttö, jossa proteiinia käytetään tyrosiinipitoisten proteiinien silloittamiseen.
  21. 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen käyttö, jossa proteiinia käy- 10 tetään elintarvikkeiden proteiinien, kuten liha-, maitotuote-, kasvis- ja viljamate- riaalien silloittamiseen.
  22. 26. Patenttivaatimuksen 23 mukainen käyttö, jossa proteiinia käytetään proteiinipitoisten kuitujen tai proteiinipitoisista kuiduista peräisin olevien polymeerien, kuten silkin, villan, kasmirin, alpakan tai ihmisen hiuksien silloit- 15 tamiseen.
  23. 27. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin käyttö tyrosiinia sisältävien peptidien modifiointiin.
  24. 28. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin käyttö tyrosiinin ha-pettamlseen L-dopaksi.
  25. 29. Menetelmä proteiinipitoisen materiaalin modifioimiseksi, jolloin mainittu materiaali saatetaan kosketukseen tyrosinaasiaktiivisuutta omaavan :T: patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin kanssa. : :*: 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, joka käsittää ·"*; sen, että silloitetaan tyrosiinia sisältäviä proteiineja. ·«· : .·. 25 31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, joka käsittää sen, että silloitetaan elintarvikkeiden proteiineja, kuten liha-, maitotuote-, kas- • · · *".* vis- ja viljamateriaaleja. *"* 32. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, jossa silloite- taan proteiinipitoisia kuituja tai proteiinipitoisista kuidusta peräisin olevia poly- • · : " 30 meerejä, kuten silkkiä, villaa, kaämiria, alpakkaa tai ihmisen hiuksia. :···: 33. Menetelmä tyrosiinia sisältävän peptidin modifioimiseksi, jossa :***: mainittu peptidi saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen ty- ··· rosinaasiaktiivisuutta omaavan proteiinin kanssa. * . 34. Menetelmä tyrosiinin hapettamiseksi L-dopaksi, jossa tyrosiini [ ^ 35 saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen tyrosinaasiaktiivi- *···: suutta omaavan proteiinin kanssa. 34 118567
  26. 35. Entsyymipreparaatti, j°ka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaista proteiinia. • · · • · · » · f • « • 1 · • · · *·1 · • M * # • 1 • · • · « • 00 ··· · • 1 * · f • · · • · · « • · 1 • 1 • 0 ··» • 1 • · • %0 * 1 · • · * 1 *·· ··« * « • 0 M» « • · t ··· * 0 • · • 00 35 118567
FI20055059A 2005-02-10 2005-02-10 Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö FI118567B (fi)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055059A FI118567B (fi) 2005-02-10 2005-02-10 Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö
CA002597462A CA2597462A1 (en) 2005-02-10 2006-02-09 Novel microbial enzymes and their use
KR1020077020739A KR20080030550A (ko) 2005-02-10 2006-02-09 신규 미생물 효소 및 이의 용도
NZ560352A NZ560352A (en) 2005-02-10 2006-02-09 Novel microbial enzymes and their use
AU2006212149A AU2006212149B2 (en) 2005-02-10 2006-02-09 Novel microbial enzymes and their use
CNA2006800080813A CN101137749A (zh) 2005-02-10 2006-02-09 新的微生物酶及其应用
JP2007554586A JP5069133B2 (ja) 2005-02-10 2006-02-09 新規の微生物酵素およびその使用
PCT/FI2006/050055 WO2006084953A1 (en) 2005-02-10 2006-02-09 Novel microbial enzymes and their use
EP06708959.9A EP1848798B1 (en) 2005-02-10 2006-02-09 Novel microbial tyrosinases and their use
US11/815,988 US7910344B2 (en) 2005-02-10 2006-02-09 Proteins having tyrosinase activity

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055059 2005-02-10
FI20055059A FI118567B (fi) 2005-02-10 2005-02-10 Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20055059A0 FI20055059A0 (fi) 2005-02-10
FI20055059A FI20055059A (fi) 2006-08-11
FI118567B true FI118567B (fi) 2007-12-31

Family

ID=34224269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20055059A FI118567B (fi) 2005-02-10 2005-02-10 Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7910344B2 (fi)
EP (1) EP1848798B1 (fi)
JP (1) JP5069133B2 (fi)
KR (1) KR20080030550A (fi)
CN (1) CN101137749A (fi)
AU (1) AU2006212149B2 (fi)
CA (1) CA2597462A1 (fi)
FI (1) FI118567B (fi)
NZ (1) NZ560352A (fi)
WO (1) WO2006084953A1 (fi)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI20065387A0 (fi) * 2006-06-07 2006-06-07 Valtion Teknillinen Maitotuote ja menetelmä sen valmistamiseksi
JP4982858B2 (ja) * 2007-06-08 2012-07-25 国立大学法人京都工芸繊維大学 酸化染毛剤の製造方法
EP2192842A1 (en) * 2007-09-18 2010-06-09 Novozymes A/S Method for producing an acidified milk drink
EP2193195B1 (en) 2007-09-18 2014-12-17 Novozymes A/S Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same
US8563268B2 (en) 2009-03-17 2013-10-22 Novozymes A/S Polypeptide having tyrosinase activity
WO2011000121A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Empa Eidgenössische Materialprüfungs- Und Forschungsanstalt Polypeptides having tyrosinase activity and uses thereof
CN105821091A (zh) * 2016-05-04 2016-08-03 浙江绿创生物科技有限公司 一种制备左旋多巴的方法
WO2017210172A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 Colorado State University Research Foundation Meat and methods of preparing same having reduced sodium content
WO2018124623A1 (ko) * 2016-12-29 2018-07-05 충남대학교 산학협력단 신규 재조합 티로시나아제
CN106983906B (zh) * 2017-05-22 2020-02-07 南京财经大学 一种改性医用大豆蛋白骨粘合剂及其制备方法
CN110283797B (zh) * 2019-06-20 2021-08-27 天津科技大学 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340734A (en) * 1992-11-25 1994-08-23 Biosource Genetics Corporation Method for making stable, extracellular tyrosinase and synthesis of polyphenolic polymers therefrom
AUPO684997A0 (en) * 1997-05-19 1997-06-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polyphenol oxidase genes from banana, tobacco & pineapple
CA2269752C (en) * 1996-02-05 2009-09-22 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genomic ppo clones
JPH10174586A (ja) * 1996-12-17 1998-06-30 Iwate Pref Gov シイタケチロシナーゼ遺伝子
JP2001157586A (ja) * 1999-12-01 2001-06-12 Iwate Prefecture プロモーター遺伝子
EP1311719B1 (en) * 2000-08-15 2010-10-06 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus A method for treating proteinaceous fibres
US6657586B2 (en) * 2001-05-03 2003-12-02 Wherenet Corp System and method for locating an object using global positioning system receiver
AU2002331272A1 (en) * 2001-07-18 2003-03-03 Dsm Ip Assets B.V. Vegetarian protein foodstuff
JP4267318B2 (ja) * 2002-12-24 2009-05-27 独立行政法人産業技術総合研究所 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＤ

Also Published As

Publication number Publication date
CN101137749A (zh) 2008-03-05
JP2008530989A (ja) 2008-08-14
US7910344B2 (en) 2011-03-22
KR20080030550A (ko) 2008-04-04
EP1848798A1 (en) 2007-10-31
JP5069133B2 (ja) 2012-11-07
NZ560352A (en) 2010-06-25
US20090203882A1 (en) 2009-08-13
AU2006212149B2 (en) 2010-03-04
FI20055059A (fi) 2006-08-11
CA2597462A1 (en) 2006-08-17
WO2006084953A1 (en) 2006-08-17
EP1848798A4 (en) 2008-08-27
WO2006084953A9 (en) 2006-10-26
FI20055059A0 (fi) 2005-02-10
AU2006212149A1 (en) 2006-08-17
EP1848798B1 (en) 2013-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118567B (fi) Uusia mikrobientsyymejä ja niiden käyttö
Marques de Souza et al. Purification and characterization of the main laccase produced by the white‐rot fungus Pleurotus pulmonarius on wheat bran solid state medium
Eggert et al. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase
Selinheimo et al. Production and characterization of a secreted, C‐terminally processed tyrosinase from the filamentous fungus Trichoderma reesei
Wang et al. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01
Palonen et al. Purification, characterization and sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp.
Hölker et al. Extracellular laccases in ascomycetes Trichoderma atroviride and Trichoderma harzianum
Sethuraman et al. Production of ligninolytic enzymes and synthetic lignin mineralization by the bird's nest fungus Cyathus stercoreus
Shi et al. Biochemical and molecular characterization of a novel laccase from selective lignin-degrading white-rot fungus Echinodontium taxodii 2538
CA2409007C (en) Novel laccase enzyme and the gene encoding the enzyme
Lisova et al. Two laccase isoforms of the basidiomycete Cerrena unicolor VKMF‐3196. Induction, isolation and properties
AU2001282198B2 (en) A method for treating proteinaceous fibres
AU2001282198A1 (en) A method for treating proteinaceous fibres
EP2126060B1 (en) Novel lysyl oxidases
Selinheimo Tyrosinase and laccase as novel crosslinking tools for food biopolymers
Ilesanmi et al. Potentials of purified tyrosinase from yam (Dioscorea spp) as a biocatalyst in the synthesis of cross-linked protein networks
EP4361275A1 (en) Laccase
EP4361274A1 (en) Laccase
Glušac et al. Partial characterization of bean and maize root peroxidases and their ability to crosslink potato protein
Lee et al. Purification and properties of laccase of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus
FI113182B (fi) Proteiinia sisältävien kuitujen käsittelymenetelmä
step Total 4.3 Three-dimensional structure of a laccase from Thielavia arenaria and elucidation of the oxidation capacity of fungal laccases with different redox potential (Publication III)
Hüner Purification and characterization of laccase from Coriolopsis polyzona

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118567

Country of ref document: FI