FI113182B - Proteiinia sisältävien kuitujen käsittelymenetelmä - Google Patents

Description

113182

Proteiinia sisältävien kuitujen käsittelymenetelmä

Esillä olevan keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista menetelmää proteiinikuitujen entsymaattiseksi käsittelemiseksi ja patenttivaatimuksen 25 johdannon 5 mukaisia proteiinipitoisia kuituja. Edelleen keksintö koskee patenttivaatimuksen 27 johdannon mukaista entsyymiä ja patenttivaatimuksen 29 johdannon mukaista entsyymivalmistetta.

Villa on hyvin kompleksi ja ristisilloittunut proteiinipitoinen kuitu. Esimerkkeinä muista 10 proteiinikuiduista ovat ihmisen hius, alpakka, mohair, kasmir, angora, laama ja silkki. Villaproteiini on keratiinia. Puhdas villa koostuu 97%:sta proteiinia, 2%:sta lipidejä ja l%:sta muita yhdisteitä, kuten suoloja ja hiilihydraatteja. Suuri osa keratiinista muodostuu mikrokiteisistä a-helixrakenteista. Keratiinissa on merkittävä määrä joko proteiiniketjujen välisiä tai sisäisiä rikkisiltoja, mikä johtuu keratiinin sisältämästä korkeasta kysteiinimää-15 rästä. Rikkisiltojen katkeamista tai uudelleenjärjestäytymistä aikaansaadaan monissa villankäsittelyprosesseissa., kuten kutistumisenestossaja fikseerauksessa. Kovalenttisten ristisidosten lisäksi villassa on vety- ja ionisidoksia sekä hydrofobisia vuorovaikutuksia.

Kutistuminen on eläinperäisen keratiinikuidun tyypillinen ominaisuus (Makinson, 1979). 20 Kutistumista esiintyy villan prosessointivaiheissa, joita ovat alkaalipesu, karstaus, kehräys, : '.. kudonta, värjäys ja viimeistely. Makinsonin (1979) mukaan kutistuminen voidaan luoki- : t i: telia kolmella tavalla: 1) kuitujen vesipitoisuudesta riippuva venyminen (hygral expansion) **/,·' 2) prosessoinnin aikana syntyneiden vetysidosten uudelleenjärjestäytymisestä riippuva ':‘: kutistuminen (relaxation shrinkage), kun villakuidut kastellaan prosessoinnin jälkeen, 3) ... 25 vanuminen, jossa kuidun suomumaiset pintarakenteet liukuvat sisäkkäin tyveä kohti, ja I I < *... kuitu lyhenee. Kuitujen vesipitoisuudesta riippuva venyminen ja prosessoinnin aikana syntyneiden vetysidosten uudelleenjärjestäytymisestä riippuva kutistuminen ovat omi- »· » i · · 113182 2 käsittely-ja kloorinpoistovaiheita, joiden jälkeen tulee polymeerin lisäysvaihe. Suomujen kemiallinen tuhoutuminen kloorikäsittelyssä lisää varautuneiden ryhmien määrää kuidussa, myös rikkisillat hapettuvat kysteiinihapporyhmiksi (Makinson, 1979). Polymeerikäsitte-lyllä pyritään pehmentämään suomuja peittämällä ne polymeerikerroksella (Makinson,

5 1979). Em. prosessien lisäksi on kehitetty myös muita prosesseja, esimerkkinä SIMPL-X

(EP 618 986). Kaksi prosessia, esim. Synthraprett BAP (Bayer) ja DC 109 (Dow Coming/PPT) prosessit ovat erikoistuneet ainoastaan polymeerikäsittelyyn. Nykyisin käytettävillä kutistumisenestokäsittelyillä on useita haittavaikutuksia, esim. kloorikä-sittelyjen tuottamat ympäristölle haitalliset AOX-yhdisteet.

10

Entsymaattisen villan prosessoinnin tutkimus aloitettiin peptidisidoksia pilkkovilla prote-aaseilla. Proteaasien käytöstä villan prosessoinnissa on raportoitu laajalti kirjallisuudessa, mutta nämä käsittelyt aiheuttavat lujuuden heikkenemistä ja painohäviötä (Ellis, 1995).

15 Villakäsittelyn entsymaattisia menetelmiä on kuvattu esim. seuraavissa patenttijulkaisuissa: WO 96/19611 kuvaa proteaasien käyttöä villakuidun suomujen muokkauksessa, mikä johtaa huopautumisen vähenemiseen. WO 98/27264 kuvaa menetelmän, jossa kutistumista vähennetään käsittelemällä villaa oksidaasi- tai peroksidaasiliuoksella näille entsyymeille sopivissa olosuhteissa. US5,529,928 - patentissa kuvataan prosessi, jossa · _ 20 villalle saadaan pehmeä, villainen tuntu ja kutistumattomuutta käyttämällä kemiallista ; ‘; esikäsittelyä tai entsyymikäsittelyä (esim. peroksidaasia, katalaasia tai lipaasia) ja sen jälkeen proteaasi- ja lämpökäsittelyä. EP 358386 kuvaa villankäsittelymenetelmän, johon kuuluu proteolyyttisen käsittelyn lisäksi joko hapettava käsittely (kuten NaOCl) tai ! ’polymeerikäsittely tai nämä molemmat. EP 134267 kuvaa eläinperäisen kuidun 25 hapetuskäsittelyn ja sitä seuraavan proteaasikäsittelyn suolaliuoksessa. WO 99/60200 kuvaa villan, villakuidun tai eläinkuidun proteaasi- ja transglutaminaasikäsittelyn.

. ·. : Fenolioksidaaseihin kuuluvien lakkaasien käytöstä villan kutistumattomuuskäsittelyssä on raportoitu (WO 94/25574). Lakkaasikäsittelyt on tehty joko HBT- tai ABTS-mediaattorin 30 kanssa. Näin käsitellyn villaflanellin raportoitiin kutistuvan vähemmän. Lakkaasien aiheuttamia kemiallisia muutoksia ei oltu tutkittu. Menetelmä, jossa villaa sisältävän materiaalin kutistumista on vähennetty oksidaasilla tai peroksidaasilla, erityisesti Trametes spp:stä tai Pleurotus spp:stä peräisin olevalla lakkaasilla, on kuvattu patentissa WO 98/27264. Kuitenkin villakuitu voi hapettua liikaa ja vahingoittua, kun sitä käsitellään voimakkailla 113182 3 radikaalin muodostajilla, kuten HBT ja ABTS. Lisäksi esim. lakkaasi/HBT-reaktio väljää villaa, mikä ei ole suotavaa myöhemmissä väqaysvaiheissa.

Vaikka villateollisuudessa on saavutettu huomattavaa edistystä kemiallisilla käsittelyillä, 5 näiden menetelmien ympäristölle aiheuttamat vaikutukset ovat niiden haittapuoli. Toisaalta monet entsymaattiset menetelmät aiheuttavat villassa painohäviötä ja lujuuden heikkenemistä. Niinpä edelleen on tarvetta parannnetulle entsymaattiselle villan, villakuidun tai eläinperäisen kuidun käsittelymenetelmälle, joka lisää kutistumattomuutta ja parantaa muita ominaisuuksia mutta aiheuttaa tunnettuja entsymaattista menetelmiä vähemmän 10 kuituvaurioita.

Tässä patenttihakemuksessa kuvatun keksinnön tarkoitus on poistaa tunnetun tekniikan ongelmat ja taqota ratkaisut näiden villaan tai villaa sisältävien materiaalien käsittelymenetelmiin liittyviin ongelmiin. Keksinnössä on kuvattu erityisesti proteiinipitoisen kuidun 15 parannettu käsittelymenetelmä. Menetelmään kuuluu proteiinipitoisen kuidun käsittely vesiliuoksessa, jossa tyrosinaasientsyymi on olosuhteissa, joissa se reagoi em. materiaalin kanssa.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä ' _ _ _ 20 on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa proteiinia sisältävän kuidun, esim. keratiinikuidun, käsittelyssä. Se sopii villan, villakuidun tai eläinkuidun, esim. angoran, mohairin, kasmirin, alpakan, tai muiden kaupallisesti käyttökelpoisten eläinkuitutuot-25 teiden, jotka ovat peräisin esim. lampaasta, vuohesta, laamasta, kamelista, kanista jne., käsittelyyn. Myös silkkiä, hämähäkin silkkiä tai ihmisen hiusta voidaan käsitellä tässä keksinnössä kuvatulla menetelmällä. Kuidut voivat olla kuitumuodossa, lankana, kudot-: tuna kankaana, neuloksena tai vaatteena.

'1 30 Tyrosinaasientsyymi voi olla peräisin mistä tahansa kasvista, eläimestä tai mikro-orga nismista, joka pystyy sitä syntetisoimaan. Erityisesti se on peräisin maljoista, hedelmistä • · (sitrushedelmät kuten greippi, omena, päärynä, persikka, banaani), vihanneksista (peruna, kaali, herne, papu, kurkku, tomaatti, pinaatti, oliivi), viljasta (ohra, vehnä, ruis), teestä, kahvi-ja kaakaopavuista, eläimistä (hiiri, sammakko, katkarapu), syötävistä sienistä 113182 4 (Agaricus kuten A. bisporus, Pleurotus, Lentinus), homeista (Neurospora crassa, Aspergillus kuten A. oryzae), bakteereista (Pseodomonas kuten P. maltophilia, Xanthomonas kuten X. maltophilia, Streptomyces kuten S. glaucescens, S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, Vibrio kuten V. tyrosinaticus, Rosebacterium, Thermomicrobium kuten T. roseum, Marino-5 monas kuten M. mediterranea, Altemaria kuten A. tenuis, Alteromonas tai Rhizobium). Keksinnön edullisessa sovelluksessa entsyymi on peräisin perunasta tai bakteerista, joka kuuluu heimoon Pseudomonadaceae kuten Pseudomonas, tai bakteerista, joka on läheistä sukua Pseudomonakselle kuten Xanthomonas (aiemmin luokiteltu kuuluvaksi Pseudo-monas-sukuun) tai Stenotrophomonas (aiemmin luokiteltu kuuluvaksi Xanthomonas-10 sukuun). Erityisesti tyrosinaasi voi olla peräisin mikrobikannoista, jotka kuuluvat sukuun tai lajiin, jota edustaa tämän keksinnön yhteydessä DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-kokoelmaan 16.6.2000 numerolla DSM 13540 talletettu kanta.

15 Tyrosinaasi voi myös olla peräisin mikro-organismeista, joiden tiedetään tuottavan Iäkkäästä, esim. Trameteksesta. kuten I hirsuta tai T. versicolor, tai Myceliophtorasiu.

Tyrosinaasin käsittelyannos kg:lle villaa tai villaa sisältävää materiaalia on 1 nkat/g -5000 nkat/g proteiinipitoista kuitua tai 10 mg/kg - 50g/kg proteiinipitoista kuitua. Mieluummin 20 käsittelyannokset ovat 10 nkat/g - 500 nkat/g tai 100 mg/kg - 5 g/kg. Käsittelyaika voi olla ', t, ’ 5 minuutista 24 tuntiin, mieluummin 30 minuutista 2 tuntiin. Käsittely voidaan tehdä eri ;'; prosessivaiheissa. Se voidaan tehdä ennen kutistumattomuuskäsittelyä tai sen aikana ja/tai ennen värjäystä ja/tai muuta viimeistelyvaihetta tai niiden aikana.

* I

113182 5 teiinidisulfidi-isomeraasia tai näiden yhdistelmiä. Kemialliset käsittelyt voivat olla mitä tahansa tavanomaisia kutistumisenestokäsittelyitä. Näihin kuuluu esim. käsittely, jossa on klooripohjainen kutistumista estävä aine.

5 Tyrosinaasikäsittelyyn voidaan yhdistää kemiallisia lisäaineita kuten kostuttimia ja peh-mentimiä.

Mieluummin tässä keksinnössä kuvattu tyrosinaasikäsittely suoritetaan ennen prosessivaihetta tai sen aikana, sekoituksen kanssa tai ilman sitä.

10

Keksinnön kohteena ovat myös proteiiniperäiset kuidut, joita on käsitelty tässä keksinnössä kuvatulla menetelmällä, kuten on esitetty patenttivaatimuksessa 25. Kuidut voivat olla villaa, villa- tai muuta eläinkuitua kuten angoraa, mohairia, kasmiria, alpakkaa tai muuta kaupallisesti käyttökelpoista eläinkuitutuotetta, joka voi olla peräisin lampaasta, vuohesta, 15 laamasta, kamelista, kanista jne. Kuidut voivat olla kuitumuodossa, lankana, neuloksena, kudottuna kankaana tai vaatteena. Tämän keksinnön kohteena ovat myös silkki tai hämähäkin silkki.

Edelleen tämän keksinnön kohteena on uusi entsyymi, jolle on tunnusomaista se, mikä on 20 esitetty patenttivaatimuksen 27 tunnusmerkkiosassa ja entsyymivalmiste, jolle on tunnus-; ’ · omaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 29 tunnusmerkkiosassa. Entsyymi on ’...' eristettävissä mikro-organismikannasta, joka kuuluu sukuun tai lajiin, jota edustaa tämän ‘' keksinnön talletettu kanta DSM 13540. Entsyymin optimaalinen pH on 8.0 ja lämpötila- ' * optimi 40-50°C. SDS-PAGEn perusteella arvioitu molekyylipaino on 95 000 Da, ja iso- ’ > > * 25 elektrisellä fokusoinnilla arvioitu pl-arvo on noin 5. Entsyymi on erityisen sopiva proteiini- ' · · · * pitoisen materiaalin, erityisesti villan, käsittelyyn. Proteiinia ristisilloittamalla tyrosinaasi voi stabiloida villaproteiinin rakennetta ja tällä tavoin estää villakuidun suomujen tyvi-',,; suuntaista liukumista huopautumisolosuhteissa. Entsyymi kuluttaa happea, ts. se hapettaa ’; ‘ villaproteiinia, villan käsittelylle suotuisissa olo-suhteissa pH-alueella 5-7 ja lämpötila- '·’ ‘ 30 alueella 40-50°C. Entsyymin aiheuttama villakuidun tyrosiinitähteiden hapettuminen lisäsi ' ·; ·' hiilen hapetusastetta kuidun pinnalla.

t » · •.,. · Tyrosinaasikäsittelyllä voi olla useita hyödyllisiä seurauksia riippuen prosessista, jota kul loinkin käytetään. Käsittely voi johtaa ristisilloittumisen lisääntymiseen, jolloin lujuus li- 113182 6 sääntyy ja taipuisuusominaisuudet paranevat. Lisäksi vettyvyys voi muuttua kuidunpinnan hapettumisen seurauksena parantaen näin kankaan väijäystä ja painamista. Reaktiivisten kohtien muodostuminen kuidun pinnalle voi parantaa värjäytyvyyttä.

5 Villan kemiallisessa hapetuksessa rikkisillat hapettuvat. Seurauksena on kuiturakenteen heikkeneminen, ja kuidusta tulee alttiimpi mekaanisille ja kemiallisille vaurioille. Toisaalta villan rakenteessa olevien aminohappotähteiden hapettaminen tyrosinaasilla johtaa toisen tyyppisiin hapettumisiin, jotka eivät välttämättä vaikuta ristisiltoihin. Tästä seuraa, että kuidun lujuus voidaan säilyttää tehokkaammin.

10

Eräs hyöty edellä mainittujen lisäksi on uusi ympäristöystävällinen prosessi villalle ja muille proteiinipitoisille eläinkuiduille, kohdistuen erityisesti kutistumisen estämiseen. Prosessin tarjoama joustavuus ja alhaiset päästöt ovat seikkoja, joita maailman tekstiili-markkinat vaativat. Prosessi vaikuttaa myös villasta tai muista eläinkuidusta valmistettujen 15 vaatteiden pestävyyteen, parantaa niiden värjäytyvyyttä ja lisää niiden pehmeyttä.

Kuvio 1 esittää tyrosinaasin katalysoimaa reaktiota.

Kuvio 2 esittää tyrosinaasin aktiivisuutta, pH:ta ja elävien solujen määrää tyrosinaasia tuottavan bakteerin DSM 13540 kasvatuksen aikana, cfu = colony forming units 1. elävien bak-20 teerien lukumäärä.

Kuvio 3 esittää tässä keksinnössä eristetyn DSM 13540:n tuottaman ja osittain puhdistetun tyrosinaasiaktiivisuuden pH-ja lämpötilaoptimit.

> ' ‘ Kuvio 4 kuvaa eri tyrosinaasien reaktiivisuutta villakuituja kohtaan. Reaktiivisuus on mi- ... · tattu hapenkulutuksena.

v. · 25 Kuvio 5 esittää DSM 13540:n tuottaman tyrosinaasin reaktiivisuutta villakuituja kohtaan.

Reaktiivisuus on mitattu hapenkulutuksena.

Kuvio 6 esittää tyrosinaasilla käsiteltyjen näytteiden emäsliukoisuutta.

Termi ’proteiinipitoinen kuitu’ tarkoittaa mitä tahansa proteiinia sisältävää kuitua, johon 30 kuuluu keratiinikuiturakenne tai kuidut, jotka on kudottu tai prosessoitu vaatteiksi tai muut . · ·. proteiinipitoisia kuituja sisältävät tuotteet kuten matot, hatut jne. Termiin sisältyy villa, .;, villakuitu tai eläinkuitu tai jokin muu kaupallisesti käyttökelpoinen eläinkuitutuote, joka * * * !., voi olla lähtöisin lampaasta, vuohesta, laamasta, kamelista, kanista jne. Esimerkkejä ovat ' I' angora, mohair, kasmir, alpakka, merino ja Shetlannin villa. Termiin sisältyy myös silkki, * * · ' |' 35 hämähäkin silkki ja ihmisen hius. Kuidut voivat olla kuitumuodossa, lankana, kudottuna * * · · ’ kankaana, neuloksena tai vaatteena. Proteiinipitoinen materiaali, jota voidaan prosessoida esitetyn keksinnön mukaisesti, sisältää yhdistelmät, joissa villan tai muiden proteiinipitois- 113182 7 ten kuitujen lisäksi on selluloosakuituja (puuvilla, pellava, rami, juutti, sisal jne.), tekokuituja (polyamidi, polyesteri, polypropyleeni, akryyli, spandex, nailon) tai kemiallisesti muokattuja luonnonkuituja (viskoosi, rayon, asetaatti, Lyocell® ja Tencel® jne.). Nämä keksintöön kuuluvat kuituseokset sisältävät vähintään 20%, mieluummin vähintään 50%, 5 mieluiten vähintään 80% proteiinipitoista materiaalia.

Termi ’kutistuminen’ ilmaisee tässä yhteydessä proteiinipitoisen materiaalin kuten villan ominaisuutta kutistua, kun sitä käsitellään kutistumisolosuhteissa.

10 ’Kutistumisolosuhteet’ tarkoittaa tässä yhteydessä olosuhteita, joissa proteiinipitoisella materiaalilla kuten villalla on taipumus palautumattomasti kutistua vanumalla. Olosuhteet, joissa vanumista tapahtuu, on kuvattu (Makinson, 1979). Veden, erityisesti yhdessä mekaanisen liikkeen kanssa, tiedetään aiheuttavan kutistumista. Muut olosuhteet, joiden on raportoitu lisäävän kutistumista joko yksinään tai yhdessä, ovat 20-60°C:een tai tätä korkeampi 15 lämpötila, happamuus tai emäksisyys, detergentit (saippuat) emäksisissä tai neutraaleissa olosuhteissa, neutraalit suolat, voiteluaineet, alkoholi ja sekoitus.

’Vanumisen vähentyminen’ tarkoittaa tässä yhteydessä kutistumisen vähenemistä verrattuna kutistumiseen ilman keksinnössä kuvattua käsittelyä.

20 ; ‘; ’Tavanomaiset kutistumisenestoprosessit ja kemialliset aineet’ tarkoittavat niitä prosesseja ‘ ‘ ja kemikaaleja, jotka ovat teollisuudessa tällä hetkellä käytössä ja joilla estetään tai kon trolloidaan tai vähennetään vanumista. Tällaiset prosessit voivat olla panosluonteisia tai ’ ‘jatkuvia, ja niissä yleisesti on useita käsittelyvaiheita villan hapettamisesta polymeeripin-25 noitukseen. Kaikkein tavallisimmat hapettavat aineet ovat kloori ja klooraavat yhdisteet tai peroxygenyhdisteet kuten permonorikkihappo. Polymeereihin kuuluvat paljon käytetty Hercosett -polymeeri (polyaminoamidi) tai jokin monista erityisesti tähän tarkoitukseen kehitetyistä polymeereistä. Nykyisessä kaupallisessa sovelluksessa ainoat vaihtoehdot :' ‘ ‘ näille hapetus/polymeeri -prosesseille ovat pelkät polymeeriprosessit, joissa polymeeri 30 lisätään ja tartutetaan tekstiilin pintaan. Tällaisten prosessien soveltaminen on rajoitetumpaa, koska niitä voidaan käyttää ainoastaan valmiille tekstiileille.

Termi ’tuntu’ viittaa subjektiiviseen vaikutelmaan, joka saadaan, kun kangasta tunnustellaan ja arvioidaan sen karheutta, kovuutta, joustavuutta tai pehmeyttä.

8 11318?

Termi ’pehmeys’ viittaa tuntumaan tekstiilistä, joka on joustava, jonka pinta muokkautuu helposti ja joka tuntuu miellyttävältä.

5 Termi ’nyppyyntyminen’ tarkoittaa kulutuksesta johtuvia ja takertuvia pieniä kuitukertymiä, nyppyjä, kankaan pinnalla.

’Venyvyys’ viittaa yksisuuntaiseen mittakasvuun, mikä johtuu langan tai kankaan venymisestä. Venyvyys ilmoitetaan yleensä suhteellisena kasvuna verrattuna 10 lähtötilanteeseen.

Tyrosinaasientsyymit

Tyrosinaasit kuuluvat fenolioksidaaseihin, jotka käyttävät happea primaarisena ko-15 substraattinaan ja ovat siten entsymaattisiin prosesseihin erityisen sopivia, koska kalliita kofaktoreita kuten NAD(P)H/NAD(P) ei reaktioissa tarvita. Tyrosinaasi katalysoi monofenolien o-hydroksylaatiota ja syntyvien o-difenolien hapettumista o-kinoneiksi (EC

1.14.18.1.; monofenolimono-oksygenaasi, EC 1.10.3.1.; katekolioksidaasi (Lerch, 1981). Siten tyrosinaasilla on kaksi aktiivisuutta, jotka katalysoivat kahta erillistä reaktiota 20 (Mayer,1987). Villassa on merkittävä määrä tyrosiinitähteitä, joiden esiintymistiheys !'; riippuu proteiinin sijainnista kuidussa; kuidun pinnassa, ytimessä, resistenteissä mem- braaneissa tai solunsisäisessä sideaineissa. Villakuidun kokonaistyrosiinipitoisuus on 3-4 %, solunjen välisessä sideaineksessa sitä on yli 7%. Täten tyrosinaasit ovat hyödyllisiä i 1 villan tai muiden proteiinikuitujen muokkaamisessa.

25

Tyrosinaasit voidaan erottaa lakkaaseista, vaikka molemmat käyttävät molekulaarista happea hyvin samankaltaisten substraattien hapetuksessa. Tyrosinaasille on tyypillistä, ’. että se ei kykene katalysoimaan p-difenolien hapettumista (Mayer ja Harel, 1979). Toisaal- ; ”' ta osoitus lakkaasiaktiivisuudesta on kykenemättömyys hapettaa tyrosiinia, mutta kyky 30 hapettaa L-dihydroksifenyylialaniinia (L-DOPA) (Mayer, 1987).

; * Rhizobium melilotin (Mercado-Blanco et ai., 1993), Streptomycesin (Beman et ai., 1985; ' Huber et ai, 1985; Kawamoto et ai., 1993; Ikeda et ai., 1996) Aspergillus oryzaen. (Fujita et ai., 1995), Neurospora crassan (Kupper et ai., 1989), Rana nigromaculatan (Takase et 113182 9 ai., 1992), Mus musculuksen (Kwon et ai., 1991) ja Homo sapiensin (Kwon et ai., 1987; Giebel et ai., 1991) tyrosinaasien primaarirakenne on analysoitu, ja niiden välillä on huomattavaa samankaltaisuutta. Kaikkien mainittujen entsyymien katalyyttisellä alueella on yksi kaksiytiminen kuparikeskus, joka muistuttaa hemoglobiinin vastaavaa (Gaykema 5 et ai., 1991).

Tyrosinaasin kykyä ristisilloittaa elintarvikeproteiineja on tutkittu (Matheis ja Whitaker, 1987). Matheisin ja Whitakerin (1987) mukaan proteiinien ristisilloittaminen tyrosinaasin avulla tapahtuu reaktioketjun välityksellä, missä tyrosiini muuntuu o-kinoniksi. Syntyneet 10 o-kinonit liittyvät toisiinsa tai reagoivat proteiinin amino- ja sufhydryyliryhmien kanssa (Matheis ja Whitaker, 1984a). Tyrosinaasi pystyy myös katalysoimaan tyrosiininp-hydroksifenyyliryhmän hapettumisen, tämä johtaa proteiinin ristisilloittumiseen (Matheis ja Whitaker, 1984b; EP 947 142).

15 Pienimolekyylisen fenolisen yhdisteen kuten tyrosiinin tai tyrosiinia sisältävän peptidin tai jonkin ei-fenolisen välittäjäaineen lisääminen voi lisätä tyrosinaasin kykyä ristisilloittaa tai muokata proteiineja. Käytettäessä tyrosiinia välittäjänä entsymaattisesti muodostuneet o-kinonit voivat reagoida proteiineissa olevien amino-, sulfhydryyli-, tioeetteri-, fenoli-, indoli-ja imodatsoliryhmien kanssa (Matheis ja Whitaker, 1984b).

: ’’ 20 * * ; ·; Tyrosinaasia on käytetty kollageenikuidun makromolekyylin, tropokollageenin polyme- • · rointiin (Dabbous, 1966). Tyrosiinitähteiden väliset molekyylinsisäiset ja molekyylien ,,. väliset ristisidokset j ohtivat polymeroitumiseen. 1

Uusia tyrosinaaseja, jotka soveltuvat proteiinipitoisen materiaalin muokkaamiseen, voidaan etsiä prosessi-ja luonnon ympäristöistä eristetyistä mikrobeista mittaamalla tyrosi-naasiaktiivisuutta sopivalla proteiinisubstraatilla. Villan proteiineja muokkaavia mikrobi-tyrosinaaseja voidaan etsiä pesemättömästä villasta, villatehtailta ja niiden läheisyydestä.

» “ * 30 Mikrobien tyrosinaasiaktiivisuus seulotaan kasvattamalla mikrobeja sopivassa seulonta- alustassa, ja eristämällä niitä puhdasviljelmiksi. Mikrobit kasvatetaan sopivassa nestemäi- . . sessä alustassa, joka indusoi tyrosinaasiaktiivisuutta. Tyrosinaaseja voi eristää myös mar- < * · joista, hedelmistä (greippi, omena, päärynä, persikka, banaani), vihanneksista (peruna, kaali, herne, papu, kurkku, tomaatti, pinaatti, oliivi), viljoista (ohra, vehnä, ruis), teestä, 113182 10 kahvi-ja kaakaopavuista, eläimistä (hiiri, sammakko, katkarapu), syötävistä sienistä ((Agaricus kuten A. bisporus, Pleurotus, Lentinus), homeista (Neurospora erässä, Aspergillus kuten A. oryzae), bakteereista (Pseodomonas kuten P. maltophilia, Xanthomonas kuten X. maltophilia, Streptomyces kuten S. glaucescens, S. antibioticus, S. castaneo-5 globisporus, Vibrio kuten V. tyrosinaticus, Rosebacterium, Thermomicrobium kuten T. roseum, Marinomonas kuten M mediterranea, Alternaria kuten A. tenuis, Alteromonas tai Rhizobium). Tyrosinaasi voidaan eristää myös mikro-organismeista, joiden tiedetään tuottavan lakkaasia, esim. Trametes, kuten T. hirsuta ja T. versicolor tai Myceliophthora.

10 Tyrosinaasien, joilla on sopivat pH- ja lämpötilaominaisuudet, annetaan reagoida villan kanssa. Tyrosinaasit voidaan lisätä kasvatusalustasuodoksena, osittain tai täysin puhdistettuina proteiineina. Tyrosinaasia koodaava geeni voidaan kloonata mistä tahansa ym. organismista. Geeni voidaan siirtää sopivaan tuotto-organismiin. Sopivia ekspressio-ja tuottoisäntiä voivat olla homeet kuten Trichoderma ja Aspergillus, hiiva, bakteerit kuten 15 Bacillus ja E. coli. Tehokkaiden tyrosinaasien seulonta voidaan suorittaa mittaamalla hapenkulutusta entsyymireaktion aikana.

Kuitu-, lanka- tai kangaskäsittelyiden olosuhteet 20 Tyrosinaasin käsittelyannos kg:a kohti missä tahansa muodossa olevaa proteiinipitoista '; kuitua, erityisesti villaa tai villaa sisältävää materiaalia, on 1 nkat/g - 5000 nkat/g pro- * ♦ teiinikuitumateriaalia tai 10 mg/kg -50 g/kg proteiinikuitumateriaalia. Mieluummin ,.. käsittelyannokset ovat 10 nkat/g - 500nkat/g tai 100 mg/kg - 5 g/kg. Käsittelyaika voi olla I 5 minuutista 24 tuntiin, mieluummin 30 minuutista 2 tuntiin. Käsittely voidaan tehdä pH- 25 alueella 3-8, mieluummin pH-alueella 5-7. Prosessilämpötila voi olla 20-80°C, mieluummin 30-70°C, mieluiten 40-50°C. Käsittely voidaan tehdä prosessin eri vaiheissa. Käsittely voidaan tehdä ennen ja/tai jälkeen kutistumisenestokäsittelyn, väijäyksen tai jonkin muun viimeistelyvaiheen tai näiden prosessivaiheiden aikana. Käsittely voidaan tehdä yksinään ; “ ‘ ilman kemiallisia vaiheita.

; * 30

Entsymaattisen käsittelyn voi tehdä missä tahansa villakäsittelyprosessin vaiheessa - myös kemiallisten kutistumisenestokäsittelyiden kanssa - kuidusta neulokseen tai kudottuihin

* I

* tuotteisiin. Vastaavasti käsittely voidaan tehdä ennen tai jälkeen värjäyksen. Entsymaat- tinen käsittely voidaan liittää kemialliseen, kuten hapetusvaiheena joko ennen tai jälkeen 113182 11 kemiallisen vaiheen. Pelkistin kuten askorbiinihappo voidaan liittää entsymaattiseen käsittelyyn. Kemiallinen ja entsymaattinen käsittely on mahdollista tehdä samanaikaisesti edellyttäen, että kemiallisen käsittelyn olosuhteet sopivat entsymaattiselle käsittelylle. Käsittelyt voidaan tehdä eri tyyppisillä tekstiilikoneilla, kuten haspelilla tai rummussa 5 käsiteltäessä neulosta tai haspelilla, jetillä tai jiggerillä käsiteltäessä kudottua kangasta.

Seuraavat esimerkit on laadittu havainnollistamaan esitettyä keksintöä, eikä niiden voi tulkita rajoittavan sitä millään tavalla.

10 ESIMERKIT

Esimerkki 1.Villatehtaasta eristettyjen mikro-organismien seulonta

Prosessin eri vaiheista kerättiin lika-, villa- ja pölynäytteitä. Mikro-organismien eristämistä 15 varten 1 ml näytteiden vesiliuoksia laimennettiin 1:10 fysiologiseen suolaliuokseen (0.9% w/v NaCl-liuos). 10 ml:ssa suolaliuosta oli noin 1 g kiinteää näytettä. Laimennuksen jälkeen näytteitä sekoitettiin 2 tuntia 200 rpm:n pyörimisnopeudella. Sekoituksen jälkeen tehtiin laimennussaija (tavallisesti 10‘2 -10-4). Bakteerikannat eristettiin laimennuksista kasvattamalla näytteitä Plate Count Agar-maljoilla (PCA-maljat), joihin oli lisätty 0.01% 20 benomyyliä (Sigma) estämään homeiden kasvua. Homeet eristettiin käyttämällä mallas-‘; uuteagar -maljoja (MEA-maljat), joihin oli lisätty 0.01% kloramfenikolia ja klortetrasyk- liiniä (Sigma) estämään bakteerien kasvua. Kaikki mikro-organismit kasvatettiin 30°C:ssa. Ensimmäisen kasvatuksen j älkeen tehtiin puhdasvilj elmät kasvattamalla bakteereita lähtien I yhdestä pesäkkeestä PCA-maljoilla ja homeita lähtien yhdestä itiöstä MEA-maljoilla.

25

Erilaisia värireagensseja käytettiin merkkinä hapettavasta entsyymiaktiivisuudesta malja-viljelyssä (Taulukko 1). Tyrosiinia (Sigma) käytettiin tyrosinaasin spesifisenä indikaatto-, ·, rina. Lakkaasin spesifisenä indikaattorina käytettiin guaiakolia (Merck). Lisäksi Remazol , *· · Brilliant Blue R:ää (RBBR, Sigma) käytettiin merkkinä hapettavasta entsyymiaktiivi- ** 30 suudesta. Guaiakolia ja RBBR:ää käytettiin Paasivirran (2000) mukaan.

• » * • * • » · » » t - » » 113182 12

Taulukko 1. Seulonnassa käytetyt spesifiset indikaattorit, niiden värireaktiot ja pitoisuudet maljoilla.

Indikaattori Pitoisuus, % Värinmuutos hapettumisen aikana

Tyrosiini 1.0 väritön, valkoinen —> ruskea

Guaiakoli 0.01 väritön —> purppura RBBR 0.02 sininen —> väritön RBBR = Remazol Brilliant Blue R 5

Noin 30 hometta ia 95 bakteeria eristettiin puhdasviljelmiksi asti villatehtaalta kerätyistä näytteistä, ja niistä seulottiin tyrosinaasi-, lakkaasi- ja peroksidaasiaktiivisuus. Seulotuista mikro-organismeista yksikään ei ollut lakkaasi- tai peroksidaasipositiivinen, mutta 8 tyrosinaasipositivista bakteeria löydettiin (Taulukko 2).

10

Taulukko 2. Villatehtaalta eristettyjen tyrosinaasipositiivisten bakteerien alkuperä.

Bakteerin tunnus Alkuperä ;' · t BW30 prosessijäte ;' “ BW41 karstausjäte ; ‘BW61 paakkuuntunut kuitujäte i ' BW64 tehtaan seinä ;" 1 BW65 tehtaan seinä BW68 villajäte BW88 lattia BW90 karstausjäte · ’ 15 Bakteerikanta BW65, joka tässä keksinnössä eristettiin, talletettiin DSMZ-Deutsche * » 1

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHrhon 19.6.2000 numerolla DSM 13540.

* · » I » » * i J · 11318? 13

Esimerkki 2. Kantakokoelmasta valittujen organismien seulonta tyrosinaasin suhteen ja tyrosinaasin tuotto

Mikro-organismit valittiin VTT:n kantakokoelmasta ja kasvatettiin niille soveltuvilla 5 kasvatusalustoilla (Taulukko 3).

Taulukko 3. VTT Biotekniikan kantakokoelmasta valittujen mikro-organismien seulonta tyrosinaasi-, peroksidaasi-ja lakkaasiaktiivisuuden suhteen.

Mikro-organismi VTT ATCC Kasvatuslämpötila, °C Kasvatusalusta tunnus tunnus

Neurospora erässä D-75017 9278 25 PDA

N. erässä D-94432 - 25 PDA

N. erossa D-96561 - 25 PDA

Aspergillus terreus D-82209 - 25 PDA

A. nidulans D-88382 - 25 PDA

Phanerochaete D-85241 - 37 PDA

chrysosporium

P. chrysosporium D-85242 24725 37 PDA

• ’·· Streptomyces E-82160 3338 28 AIA

•... · phaeoehromogenes1

S. viridosporus E-85228 39115 28 AIA

' ‘ Trametes versicolor D-83211 12679 25 PDA

1 = tunnettu tyrosinaasin tuottaja, jota käytettiin positiivisena kontrollina, PDA = peruna • ·' 10 dekstroosiagar (Difco), AIA = aktinomykeettien eristysagar (Difco), ATCC = American

Type Culture Collection . . Streptomyces viridosporus -bakteerin todettiin tuottavan tyrosinaasiaktiivisuutta l%:lla !.. ’ tyrosiinilla PCA-maljalla (Taulukko 4). Muut mikro-organismit eivät antaneet positiivista ’ · 15 reaktioita kasvatusmaljoilla, joihin oli lisätty 1 %tyrosiini. Trametes versicolor ja Phane rochaete chrysosoporium olivat lakkaasi- ja peroksidaasipositiivisia (Taulukko 4). Lakkaasi- ja peroksidaasipositiiviset mikro-organismit eivät reagoineet kasvatusalustoilla, :. ’ · joissa oli 1% tyrosiinia.

113182 14

Taulukko 4. VTT Biotekniikan kantakokoelmasta valittujen mikro-organismien tyrosi-naasi-ja lakkaasiseulonnan tulokset.

VTT Mikro-organismi Indikaattorireaktio

tunnus tyrosiini guaiakoli RBBR

D-95439 Aspergillus nidulans - D-82209 Aspergillus terreus ...

D-75017 Neurospora erässä - D-96561 D-94432 ...

D-85241 Phanerochaete chrysosporium + + D-85242 + + E-82160 Streptomyces phaeoehromogenes + - - E-85228 Streptomyces viridosporus + D-83211 Trametes versicolor + + RBBR = Remazol Brilliant Blue R, + = hapettumien, - = ei reaktiota.

5

Esimerkki 3. Tyrosinaasin induktio ja tuotto ravistelupullokasvatuksissa

Esimerkeissä 1 -2 saadut bakteerikannat kasvatettiin ravistelupulloissa. Tyrosinaasin tuottoa 10 indusoitiin eri indusoreilla ts. tyrosiinilla ja villakuiduilla. Bakteerien, jotka on mainittu

Taulukossa 2, ymppialustassa oli 1 g/1 glukoosia (BDH Laboratory Supplies), 2.5g/l • *' hiivauutetta (Difco) ja 5 g/1 kaseiinia (BDH Laboraory Supplies). Streptomykeettien ymppialustassa oli 4 g/1 glukoosia, 4 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 mallasuutetta (BDH Laboraory Supplies). Ymppejä kasvatettiin 8 tuntia 30°C:ssa 200 rpm:n ravistelussa.

, . 15 Kasvatuksiin käytettiin 10% ymppi. Tunnistamattomien mikrobien kasvatusalustassa oli 10 ... g/1 glukoosia, 2.5 g/1 kaseiinia ja indusorit. Streptomykeettien kasvatusalustassa oli 4 g/1 • * glukoosia, 5g/l mallasuutetta, 4 g/1 hiivauutetta,2 g/1 CaCl2 ja indusorit. Kasvatukset tehtiin 30°C:ssa 200 rpm:n ravistelussa. Kolmea erilaista indusoivaa vaihtoehtoa käytettiin: 1. 0.2% tyrosiini 20 2.0.1 %tyrosiini + 0.1% raakavillakuituj a 3. 0.2% raakavillakuituj a 113182 15

Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin käyttämällä 2 mM DL-DOPA:a (Sigma) substraattina. Substraattiliuoksen pH säädettiin 7:ään 0.05 M natriumfosfaattipuskurilla. 40 μΐ näytettä sekoitettiin 960pl:aan 2 mM DL-DOPA-liuosta. Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin mittaamalla absorbanssin nousua 475 nm aallonpituudella 3 minuutin ajan 30°C:ssa 5 käyttäen Perkin Elmer Lambda 20-spektrofotometriä. Aktiivisuus laskettiin kaavasta (3): „ 106 xMbs„.nmxVlnl tyrosmaasi aktiivisuus (nkat/ml) =-—— (3)

Vn xtxexkxl missä, 10 AAbs475 nm on absorbanssin kasvu reaktioaj an kuluessa aallonpituudella 475 nm

Vtot on reaktiotilavuus (1 ml) ε on hapettuneen dopakromin molaarinen ekstinktiokerroin (3400 lmol^cm'1) t on reaktioaika (s)

Vn on näytteen tilavuus (40ml) 15 k on laimennuskerroin 1 on valon kyvetissä kulkema matka (1 cm) 1 yksikkö (kataali) tyrosinaasiaktiivisuutta määritellään entsyymimääräksi, joka katalysoi 1 ; moolin dopakromin muodostumisen sekunnissa 30°C:ssa pH:ssa 7.

20 1 ml:n näytteitä otettiin kasvatusten kuluessa. Proteaasiaktiivisuus ehkäistiin lisäämällä näytteisiin 0.1 ml liuosta, jossa oli 17 mg/ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF, Sigma). Näytteet sentrifugoitiin, ja tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin supematantista.

25 DL-DOPA-substraatilla mitattuna DSM 13540 pystyi tuottamaan tyrosinaasia. Kas-;t: vatettaessa alustassa, jossa oli 10 g/1 glukoosia, 2.5 g/1 kaseiinia ja 2 g/1 villaa ja tyrosiinia ' ’ indusoreina, DSM 13540:n tuottama tyrosinaasiaktiivisuus oli 0.4 nkat/ml (Taulukko 5).

_ ‘ Muut alunperin seulonta-alustoilla tyrosinaasipostiivisiksi todetut bakteerit eivät tuottaneet ,,,, · tyrosinaasia nesteviljelmässä. DSM 13540:n tyrosinaasin tuottoa edelleen optimoitiin käyt- I « ;, · 30 tämällä indusoreina villakuituja, tyrosiinia, metioniinia ja näiden yhdistelmiä. Korkein saa- * vutettu tyrosinaasiaktiivisuus oli noin 8 nkat/ml, joka saatiin alustalla V (20 g/1 glukoosia,

I I · I

2.5.g/l kaseiinia, 2 g/1 tyrosiinia ja 2 g/1 villaa (Taulukko 5).

113182 16

Taulukko 5. Korkeimmat tyrosinaasiaktiivisuudet eri nesteviljelmissä.

Alustan Alustan koostumus Korkein tyrosinaasi no glukoosi kaseiini tyrosiini villa metioniini CUSO4 aktiivisuus (g/1) (g/1) m m m (mg/l) nkat/ml I 10 2.5 4 0 0 0 0.3 III 10 2.5 2 2 0 0 0.4 V 20 2.5 2 2 0 0 7.6 VI 20 2.5 4 0 0 0 0.2 X 20 2.5 1 2 1 0 4.3

Tyrosinaasin tuottoa tutkittiin edelleen alustassa V, jossa oli 20 g/1 glukoosia, 2.5 g/1 5 kaseiinia, 2 g/1 tyrosiinia ja 2 g/1 villaa (Taulukko 5). Peroksidaasi-, lakkaasi-, neutraali proteaasi- ja tyrosinaasiaktiivisuudet mitattiin kasvatuksen aikana. Lisäksi määritettiin elävät solut ja pH. Tyrosinaasiaktiivisuus saavutti huippunsa, kun solut siirtyivät lag-vaiheeseen (Kuvio 2). Lakkaasi-ja peroksidaasiaktiivisuutta ei kasvatuksessa havaittu.

10 Esimerkki 4. Perunan tyrosinaasin eristäminen

Perunan tyrosinaasi eristettiin Asterix-lajikkeesta. Tuorepainoltaan 500 g (kuivapaino 95 g) ...; kuorittuja perunoita homogenisoitiin Waring Blendor -homogenisaattorilla 200 ml:ssa 0.1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4 x 15 sekuntia suurteholla. Suspensiota sekoitettiin vielä jäähauteessa 30 minuuttia ja suodatettiin viirakankaalla ja lasikuitusuodattimella • * 15 (Whatman GF/C). Suodoksen lopputilavuus oli 300 ml. Tyrosinaasiaktiivisuutta inhiboivat · fenolit poistettiin saostamalla proteiinit 70% :11a ammoniumsulfaatilla 1 tunti 4°C:ssa. Sak ka liuotettiin 250ml:aan 0.1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7. Puolipuhdasta perunatyro-sinaasia säilytettiin 4°C:ssa (Taulukko 6). 1

Taulukko 6. Puolipuhtaan perunatyrosinaasin valmistus.

‘ ‘ Vaihe Aktiivisuus Tilavuus Kokonaisakt. Akt. Proteiini Kok. proteiini nkat/ml ml nkat saanto, % mg/ml mg

Uute 2Ö 3ÖÖ 6ÖÖÖ 1ÖÖ

Puolipuhdas 16 250 4000 67 1.5 375 113182 17

Puolipuhtaassa perunatyrosinaasissa ei ollut proteolyyttistä epäpuhtautta.

Esimerkki 5. Uuden tyrosinaasin pH- ja lämpötilaoptimien määrittäminen 5 DSM 13540:n tuottama uusi tyrosinaasi puhdistettiin osittain kasvualustakonsentraatista ionivaihtokromatografialla. Kasvatussuodos konsentroitiin ultrasuodatuksella, ja kon-sentraatti adsorboitiin 25 mM fosfaattipuskurilla, pH 7, tasapainotettuun Q-Sepharose anionivaihtajaan. Entsyymi eluoitiin gradientilla, jonka aloituspuskurissa oli 0.3 M NaCl. Fraktioiden tyrosinaasi- ja proteaasiaktiivisuutta seurattiin. Ne fraktiot, joissa oli ainoas-10 taan tyrosinaasiaktiivisuutta, yhdistettiin ja käytettiin uuden tyrosinaasin karakterisointiin. Puhdistuksessa säilyi 58% kasvualustakonsentraatin aktiivisuudesta. pH-optimi määritettiin mittaamalla entsyymipreparaatin tyrosinaasiaktiivisuutta pH-alueella 6.5 - 9.0. 2mM DL-DOPA:a käytettiin substraattina, reaktioseosta inkuboitiin 10 minuuttia ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 475 nm. Uuden tyrosinaasin lämpötilaoptimi määritettiin alueel-15 la 20 - 90°C optimi-pH.ssa. pH-optimin todettiin olevan 8.0 ja lämpötilaoptimin 40-50°C (Kuvio 3).

Esimerkki 7. Uuden tyrosinaasin molekyylipainon ja isoelektrisen pisteen määrittäminen !. ] 20 _' Uuden tyrosinaasin biokemialliset ominaisuudet karakterisoitiin standarditekniikoilla.

':" Molekyylipaino määritettiin SDS-PAGE:lla ja pl-arvo isoelektrisellä fokusoinnilla.

' , Molekyylipaino oli noin 95 000 Da ja pl-arvo noin 5.

25 Esimerkki 8. Uuden tyrosinaasin substraattispesifisyyden määrittäminen

Uuden entsyymin substraattispesifisyys määritettiin käyttäen 2 mM tyrosiinia, katekolia ja ’ * ' DOPA:a substraatteina. Suhteelliset aktiivisuudet em. substraatteja kohtaan pH:ssa 8 ja ‘, 50°C:ssa olivat 10,40 ja 100, tässä järjestyksessä.

30 ’ Esimerkki 9. Uutta tyrosinaasia koodaavan geenin eristäminen * » » i » '; ” Puhdistetun tyrosinaasiproteiinin N-terminaalin ja sisäisten peptidien aminohapposek venssi määritetään. Peptidisekvenssien perusteella syntetisoidaan oligonukleotidikoettimia 113182 18 PCR-tekniikalla. Oligonukleotidikoettimia käytetään hyväksi tyrosinaasigeenin kloonauksessa DSM 13540:n genomista.

Esimerkki lO.Tyrosinaasien reaktiivisuus villaa kohtaan mitattuna 5 hapenkulutuksena

Eri tyrosinaasien, ts. Agaricus bisporuksm (Sigma), perunatyrosinaasin (Esimerkki 4) ja DSM13540:n tyrosinaasin (Esimerkki 3) kykyä hapettaa villakuituja tutkittiin mittaamalla hapenkulutusta Orion Research 97-08 happielektrodilla VTT Biotekniikan menetelmällä 10 5555-95 suljetuissa Erlenmeyer -pulloissa. Käytetyt tyrosinaasiannokset olivat 500 tai 1000 nkat/ g villakuituja. Pestyjä villakuituja käytettiin substraattina. Käsittelyt tehtiin 45°C:ssa 200 rpm:n sekoituksessa. Liemisuhde oli 1:100. Liuenneen hapen pitoisuutta mitattiin 45 minuuttia 15 sekunnin välein.

15 Sekä perunan että uusi mikrobin tyrosinaasi pystyivät hapettamaan villaa hapenkulutuksena mitattuna. Agaricus bisporus -tyrosinaasi (Sigma T-7755) ei pystynyt hapettamaan villakuitujen tyrosiinitähteitä (Kuvio 4). Tässä työssä eristetyn DSM 13540:n (Kuvio 5) tuottama tyrosinaasi kulutti selvästi enemmän happea villakuiduilla kuin perunan tyrosinaasi (Kuvio 4).

..!· 20

Esimerkki 11. Entsyymikäsittelyjen vaikutus villakuitujen ominaisuuksiin : Villakuituja (topsi) käsiteltiin uudella tyrosinaasilla (DSM 13540) ja perunan tyrosinaa- ,.: silla. Käsittelyt tehtiin Linitest Plus -laitteella (Atlas) 20 rpm ravistelussa. Liemisuhde oli 25 1:15. Entsyymiannokset ja käsittelyolosuhteet on esitetty Taulukossa 7. pH säädettiin 7:ään 0.1 M natriumfosfaattipuskurilla (pH7). Referenssikäsittelyt tehtiin samoin mutta ilman entsyymilisäystä. Proteaasit joko inhiboitiin tai käytettiin proteaasittomia preparaatteja.

; · Taulukko 7. Villakäsittelyjen olosuhteet. Käsittelyaika oli 2 tuntia.

Entsyymi Entsyymiannos /g villakuituja pH T (°C)

perunan tyrosinaasi 50 and 400 nkat 7 30 °C

·’ : uusi DSM13540 tyrosinaasi 150 and 1000 nkat 7 45 °C

30 113182 19

Entsyymireaktiot lopetettiin upottamalla kuidut 5 minuutiksi 75°C:eiseen veteen, jonka pH oli säädetty 3.0:aan 75%:lla etikkahapolla. Sen jälkeen kuidut huuhdeltiin vesijohtovedellä 5 minuuttia ja kuivattiin 50°C:ssa. Kuidut tasapainotettiin SFS 2600 standardin mukaisesti kosteuteen 65% ± 2% ja lämpötilaan 20°C ± 2°C.

5

Villakuitujen painohäviö määritettiin punnitsemalla kuidut ennen ja jälkeen entsymaattisen käsittelyn. Villakuitujen emäsliukoisuus määritettiin IWTO-4-60 (Saksa) standardin mukaisesti. Villakuitujen kuivapaino määritettiin punnitsemalla 105°C:ssa vakiopainoon kuivattu näyte. Villakuitujen yksinkertainen vettyvyystesti tehtiin mittaamalla kuidunpät-10 kien uppoamisaikaa deionisoidun veden pinnalta standardoiduissa olosuhteissa. Noin 10 mg tasapainotettuja kuituja leikattiin lyhyiksi pätkiksi, ja ne aseteltiin varovasti deioni-soidun veden (50 ml) pinnalle. Uppoamisaikaa seurattiin. Villakuitujen huopautumista mitattiin felt ball density -testillä (IWTO-20-69, Aachener Filztest, Saksa).

15 Entsyymikäsittelyiden vaikutus villakuitujen painohävioon

Entsyymikäsittelyiden havaittiin aiheuttavan vain vaatimatonta 1.7 - 3.0%:n painohäviötä. Referenssiin verrattuna entsyymikäsittelyt eivät aiheuttaneet painohäviötä (Taulukko 8).

:, _ t · 20 Taulukko 8. Villakuitujen painohäviöt ja tyrosinaasi- ja lakkaasikäsittelyjen käsittely- >',*/ suodosten proteaasiaktiivisuudet ’ ’ Käsittely Entsyymiannos Kuituanalyysi nkat/g villakuituja Kuitujen painohäviö (%) referenssi uudelle DSM13540 - 2.8 tyrosinaasille · uusi DSM13540 tyrosinaasi 150 1.7 uusi DSM13540 tyrosinaasi 1000 2.0 referenssi perunan tyrosinaasille - 2.5 : ”· perunan tyrosinaasi 50 2.5 ; T perunan tyrosinaasi 400 2.1 113182 20

Entsyymikäsittelyiden vaikutus villakuitujen emäsliukoisuuteen

Emäsliukoisuus määritettiin IWTO-4-60:n mukaan. Kuviossa 6 on esitetty keskiarvot 2-3 mittauksesta. Tulosten mukaan tyrosinaasi aiheutti ristisilloittumista (Kuvio 6). BWV1 on 5 referenssi, joka on käsitelty samoissa olosuhteissa mutta ilman entsyymiä. (BWV1= puskurikäsittely, BWV11= tyrosinaasikäsittely)

Entsyymikäsittelyiden vaikutus villakuitujen vettyvyyteen ja huopautumiseen 10 Entsymaattisesti käsiteltyjen villakuitujen vettyvyys määritettiin yksinkertaisella uppoa-mistestillä. Entsymaatisesti käsiteltyjen kuitujen lyhyempi uppoamisaika verrattuna referenssikuituihin tulkittiin osoitukseksi kuitujen hydrofobisuuden vähentymisestä. Hydrofobisuuden vähenemistä havaittiin perunan tyrosinaasilla käsitellyissä kuiduissa.

15 Entsyymikäsittelyiden vaikutus huopautumiseen

Villan huopautumisominaisuutta testattiin felt ball density -testillä (Aachen) (Taulukko 9). Tulosten mukaan huopautumistaipumus väheni (Taulukko 9). 1 2 3 4 5 6

Taulukko 9. Tyrosinaasilla käsiteltyjen näytteiden tiheys (felt density) 2 Käsittely Huopatiheys, g/cm 3

Referenssi 0.17 ', , · Uusi tyrosinaasi 0.14 *' · 4 ‘ Entsyymikäsittelyiden vaikutus villakuitujen kemialliseen koostumukseen ESCA:lla 5 , , analysoituna 6 I ‘ ESCA analyysin mukaan tyrosinaasilla käsitellyt villakuidut hapettuivat selvästi. Tämä todettiin hapen (O) määrän lisääntymisenä ja samanaikaisena hiilen (C) määrän vähenemisenä kuidun pinnalla. Seurauksena O/C-suhde kasvoi, mikä on merkki hapettumisesta ; \ (Taulukko 10).

i 30

Taulukko 10. Entsyymikäsiteltyjen näytteiden pinnan alkuainekoostumus atomi%:na.

113182 21 Käsittely Entsyymi C_O_N [s Ca |Na bwv 1 refuusityr 79.3 10.4 7.4 2.5 0.4 0 bwvll uusi tyr 150 78.1 11 8.1 2.8 0 0 bwv 12 uusi tyr 1000__78.2_11,6_L6_2/7_0_0 bwv 10 ref peruna tyr 80.2 10.4 6.3 2.4 0.7 0 bwv 13 Peruna tyr 50 78.5 11.7 7.4 2.4 0 0 bwv 14 Peruna tyr 400__76.1_13.7_84_L9_0 0

Referenssit 5 Beman, V., Filpula, D., Herber, W., Bibb, M. and Katz, E. The nucleotide sequence of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus and characterization of the gene product. Gene 37 (1985) 101-110.

Byrne, K. M., Machine-washable knitwear-Production routes, In: Chemistry of the textiles 10 industry, Ed. C. M. Carr, Chapman & Hall, London, UK, 1995, 187-209.

Dabbous, M. K., Inter- and Intramolecular Cross-Linking in Tyrosinase-treated Tropocollagen, J. Biol. Chem. 22 (1966) 5307-5312.

15 Ellis, J., Scouring, enzymes and softeners, In: Chemistry of the textiles industry, Ed. C. M. Carr, Chapman & Hall, London, UK, 1995,249-275.

Fujita, Y., Uraga, Y. and Ichisima, E. Molecular cloning and nucleotide sequence of the ; protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast 20 cells. Biochim. Biophys. Acta 1261 (1995) 151-154.

Gaykema, W.P.J., Hoi, W. G. J., Vereijken, J. M., Soeter, N. M., Bak, H. J. and Beintema, . . J.J. 3.2 A structure of the copper-containing, oxygen-carrying protein Panulius interruptus haemocyanin. Nature 309 (1984) 23-29.

25

Giebel, L., Strunk, K. M. and Spritz, R. A. Organization and nucleotide sequences of the . . human tyrosinase gene and a truncated tyrosinase-related segment. Genomics 9 (1991) 435-445.

113182 22

Huber, M., Hintermann, G. and Lerch, K. Primary structure of tyrosinase from Streptomyces glaucescens. Biochemistry 24 (1985) 6038-6044.

Ikeda, K., Masujima, T., Suzuki, K. and Sugiyama, M., Cloning and sequence analysis of 5 the highly expressed melanin-synthesizing gene operon from Streptomyces castaneoglobisporus, Appi. Microbiol. Biotechnol. 45 (1996) 80-85.

Kawamoto, S., Nakamura, M. and Yashima, S. Cloning, sequence and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces lavendulae MA406 A-l.J Ferment. Bioeng., 76 10 (1993) 345-355.

Kong, K.-H., Hong, M.-P., Choi, S.-S., Kim, Y.-T. and Cho, S.-H., Purification and characterisation of a highly stable tyrosinase from Thermomicrobium roseum, Biotechnol. Appi. Biochem.3l (2000) 113-118.

15

Kupper, U., Niedermann, D. M., Travaglini, G. and Lerch, K. Isolation and characterization of the tyrosinase gene from Neurospora erossa. J. Biol. Chem. 264 (1989) 17250-17258.

20 Kwon, B. S., Haq, A. K., Pomerantz, S. H. and Halaban, R. Isolation and sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse c-albino locus. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 (1987) 7473-7477.

Kwon, B. S., Wakulchik, M., Haq, A. K., Halaban, R. and Kestler, D. Sequence analysis of 25 mouse tyrosinase cDNA and the effect of melanotropin on its gene expression. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 153 (1988) 1301-1309.

. Lerch, K. Copper monooxygenases: tyrosinase and dopamine β-monooxygenase, In Metal ; Ions in Biological Systems, V ol. 13, Ed. H. Siegel, Marcel Dekker Inc., New York, USA, 30 1981,143-186.

: : Lewis, D. M., Ancillary processes in wool dyeing, In Wool Dyeing, Ed. D. M. Lewis, ·: Society of Dyers and Colorists, West Yorkshire, England, 1992,111-136.

113182 23

Makinson, K. R., Shrinkproofing of wool, Marcel Dekker Inc., New York, USA, 1979, 379.

Matheis, G. and Whitaker, J. R., Modification of Proteins by Polyphenol Oxidase and 5 Peroxidase and Their Products, J. Food Biochem. 8 (1984a) 137-162.

Matheis, G. and Whitaker, J. R., Peroxidase-Catalyzed Cross Linking of Proteins, J. Protein Chem. 3 (1984b) 35-48.

10 Matheis, G. and Whitaker, J. R., A review: Enzymatic Cross-linking of Proteins Appicable to Foods,/. Food Biochem. 11 (1987) 309-327.

Mayer, A. M. and Harel, E., Review: Polyphenol oxidases in plants, Phytochemistry 18 (1979) 193-215.

15

Mayer, A. M., Polyphenol oxidases in plants - recent progress, Phytochemistry 26 (1987) 11-20.

Mercado-Bianco, J., Garcia, F., Femandes-Lopez, M. and Olivares, J. Melanin production 20 by Rhizobium meliloti GR4 is linked to non symbiotic plasmid pRmeGR4b: cloning, sequencing, and expression of the tyrosinase gene mepA. J. Bacteriol, 175 (1993) 5403-5410.

. Muller, G., Ruppert, S., Schmid, E. and Schutz, G.Functional analysis of alternatively 25 spliced tyrosinase gene transcripts. EMBO J. 7 (1988) 2723-2730.

Paasivirta, L.-L., Screening of microbes producing phenoloxidases, Master’s Thesis, •,' Helsinki University of Technology, Department of Chemical Technology, Espoo, 2000, 87 _ p.

30 : Takase, M., Miura, I., Nakata, A., Takeuchi, T. and Nishioka, M. Cloning and sequencing .1: · of the cDNA encoding tyrosinase of the Japanese pond frog, Rana nigromaculata. Gene 121(1992)359-363.

Claims (31)

1. 24 113182
2. 1. Menetelmä proteiinikuidun entsymaattiseksi käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että menetelmän mukaan villa, villakuitu, eläimen karva, silkki tai hämähäkinsilkki saatetaan 5 kontaktiin tyrosinaasientsyymiä sisältävän vesiliuoksen kanssa entsyymin toiminnalle sopivissa olosuhteissa aiheuttaen proteiinikuitujen tyrosiinitähteiden hapettumista.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä , t u n n e 11 u siitä, että tyrosinaasi on peräisin maljoista, hedelmistä, edullisesti sitrushedelmistä, kuten greipistä, omenasta, 10 päärynästä, persikasta, banaanista tai vihanneksista, kuten perunasta, kaalista, herneestä, pavusta, kurkusta, tomaatista, pinaatista, oliivista, tai viljoista, kuten ohrasta, vehnästä, rukiista tai teestä, kahvista ja kaakaopavuista tai eläimistä, kuten hiirestä, sammakosta, katkaravuista tai syötävistä sienistä, kuten Agaricus, Agaricus bisporus, Pleurotus tai Lentinus. 15
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä »tunnettu siitä, että tyrosinaasi on peräisin sienistä, kuten Neurospora erässä, Aspergillus, Aspergillus oryzae, Trametes, Trametes hirsuta , Trametes versicolor tai Myceliophthora.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä »tunnettu siitä, että tyrosinaasi on peräisin bakteereista, kuten Pseudomonas, P. maltophilia,, Xanthomonas, X maltophilia ; ; tai Stenotrophomonas, S. maltophilia, Streptomyces, S. glaucescens, S. antibioticus, S. ' . castaneoglobisporus, Vibrio, V. tyrosinaticus, Rosebacterium, Thermomicrobium, T. ,,. roseum, Marinomonas, M. mediterranea, Altemaria, A. tenuis, Alteromonas tai Rhizobium. 25
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyrosinaasi on perunan tyrosinaasi tai peräisin bakteereista, jotka kuuluvat Pseudomonadaceae-heimoon, • . kuten Pseudomonas sp., Xanthomonas sp. tai Stenotrophomonas sp..
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyrosinaasi on ! ’ tuotettu rekombinantti-isännän avulla ekspressoimalla entsyymiä koodaava geeni ekspressio- tai tuotantoisännässä. 113182
8. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinipitoinen materiaali käsittää villan, villakuidut tai eläimen karvan, kuten angoran, mohairin, kashmirin, alpakan, merinovillan tai Shetlannin villan tai muita kaupallisesti käyttökelpoisia eläinkarvatuotteita, jotka ovat peräisin esimerkiksi lampaan, vuohen, 5 laaman, kamelin, jäniksen karvasta tai että proteiinipitoinen materiaali käsittää silkin tai hämähäkinsilkin.
9. 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuidut ovat kuitujen, topsin, langan, tai kudotun tai neulotun kankaan tai vaatteiden muodossa. 10
10. 9. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitelty materiaali käsittää sekoitemateriaaleja, jotka sisältävät vähintään 20 % proteiinikuituja.
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekoitemateriaalit 15 käsittävät selluloosakuituja, kuten puuvilla, pellava, ramie, juutti, sisal, rayon, asetaatti, viskoosi tai Lyocell® tai Tencel® tai synteettisiä kuituja kuten polyamidi, polyesteri, polypropeeni, akryyli, spandeksi tai nylon.
12. 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 20 tyrosinaasin määrä on 1 - 5000 nkat/g proteiinikuitumateriaalia tai 10 - 50 g/kg I · proteiinikuitumateraalia, edullisesti 10 - 500 nkat/g tai 100 mg/kg - 5 g/kg ! _ proteiinikuitumateraalia.
13. 12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että • . 25 käsittely suoritetaan pH-alueella 3-8, edullisesti pH-alueella 5-7. t i I 1 2 3 4 5 6 7 8 Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kä- 2 :' ‘ ’; sittely suoritetaan lämpötilassa 20 - 80 °C, edullisesti 30 - 70 °C, edullisimmin 40 - 50 °C. 3 4 f i i 5
14. 14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 6 » » 7 ,;, käsittely suoritetaan ennen ja/tai samaan aikaan kuin kutistumisen estokäsittely tai jossain 8 !.. muussa käsittelyvaiheessa. 113182
15. 15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely tehdään ennen, jälkeen ja/tai väijäyksen aikana tai jossain muussa käsittelyvaiheessa.
16. 16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely tehdään ennen ja/ tai viimeistyksen aikana tai jossain muussa käsittelyvaiheessa.
17. 17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyrosinaasia käytetään yhdessä mediaattorin kanssa. 10
18. 18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mediaattori on tyrosiini tai mikä tahansa tyrosiinia sisältävä peptidi tai polypeptidi.
19. 19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 mediaattori on fenolinen tai ei-fenolinen yhdiste.
20. 20. Jonkin patenttivaatimuksen 1-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyrosinaasikäsittely tehdään yhdessä pelkistävän tekijän, kuten askorbiinihapon kanssa.
21. 21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ’' proteiinipitoisille kuiduille tehdään ennen tai jälkeen tai tyrosinaasikäsittelyn aikana toinen entsymaattinen tai kemiallinen konventionaalinen kutistumisen estokäsittely.
22. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen entsyymi 25 on lipaasi, lipoxygenaasi, transglutaminaasi, lakkaasi, proteaasi, proteiinidisulfidi-isomeraasi tai mikä tahansa näiden yhdistelmä. *. 23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely käsittää sekoituksen. 1 30 Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely tehdään ilman sekoitusta. 113182
23. 25. Proteiinipitoiset kuidut, jotka on käsitelty jonkin patenttivaatimuksen 1 - 24 mukaisella menetelmällä.
24. 26. Patenttivaatimuksen 25 mukaiset kuidut, tunnettu siitä, että ne käsittävät kankaan, 5 vaatteet, kuidun tai eläimen karvan.
25. 27. Entsyymi, jolla on tyrosinaasiaktiivisuus, tunnettu siitä, että se on eristettävissä mikro-organismikannasta, joka kuuluu Stenotrophomonas - tai Pseudomonas-sukmin, jota edustaa kanta DSM 13540 ja että entsyymin pH-optimi on noin 8,0 ja lämpötilaoptimi 10 noin 40 - 50 °C ja että entsyymin molekyylipaino on noin 95 000 Da määritettynä SDS-PAGEilla ja pl-arvo noin 5 määritettynä isoelektrisellä fokusoinnilla.
26. 28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen entsyymi, tunnettu siitä, että entsyymi on tuotettu rekombinantti-isännän avulla ekspressoimalla entsyymiä koodaava geeni 15 ekspressio- tai tuotantoisännässä.
27. 29. Entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin edellisen patenttivaatimuksen 27 tai 28 mukaista entsyymiä.
28. 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se on tuotantoisännän kasvatusliuos tai että se on valmistettu tuotantoisännän kasvatusliuoksesta ; ’ tai soluhomogenaatista konsentroimalla tai puhdistamalla.
29. 31. Patenttivaatimuksen 29 tai 30 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se 25 sisältää valinnaisesti lisäaineita kuten säilöntäaineita, puskureita tai stabilointiaineita. 28 113182