KR20080030550A - 신규 미생물 효소 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트리코더마 종(Trichoderma spp.)으로부터 수득할 수 있는 세포외 티로시나제 및 재조합 기술에 의한 이의 생산 방법 및 수단에 관한 것이다. 당해 효소는 식품 단백질의 가교결합에서 특히 유용하다.

트리코더마 종, 세포외 티로시나제, 식품 단백질, 가교결합

Description

신규 미생물 효소 및 이의 용도{Novel microbial enzymes and their use}

본 발명은 효소 기술 및 더 정확하게는 신규 진균 효소 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 당해 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 당해 효소의 생산 방법 및 당해 효소의 생산에서 유용한 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

효소는 펄프 및 제지 산업, 직물 산업 및 식품, 사료 및 음료 산업의 다양한 종류의 산업적 공정에서 이용된다. 효소는 또한 화장품 및 약제 산업 및 세제에 이용된다. 산업용 효소는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것일 수 있고, 세포외 효소가 바람직하다. 이들은 보통 더 안정하고 재조합 기술에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 숙주 세포로부터 세포내 효소의 분리와 정제는 비용이 많이 들며 힘이 들고, 따라서 만약 효소가 세포외 효소, 즉 세포로부터 분비되는 단백질이라면, 이것은 장점이 될 것이다. 추가로, 효소는 산업적인 규모로 대량 생산될 수 있고 유기체는 안전하고 배양하기에 쉽고 경제적인 것이 바람직하다.

단백질은 재생가능한 원료의 중요한 성분이므로 식품, 직물 섬유 등은 상당 한 양의 단백질을 함유한다. 효소는 이러한 물질들 중의 단백질 및 이의 기술적 특징의 변형을 위해 이용될 수 있다. 단백질 매트릭스는 단백질의 분자량을 감소시킬 수 있는 가수분해 효소(단백질 분해효소)에 의해 변형될 수 있다. 단백질은 또한 단백질 내의 아미노산 사이의 공유적 가교결합을 생성할 수 있는 효소(예로서, 리신 및 글루타민 잔기 사이에서 이소펩티드 결합을 생성하는 트랜스글루타미나제)에 의해, 또는 특정 아미노산 잔기를 산화시킬 수 있는 효소에 의해 변형될 수 있다. 특정 아미노산 잔기의 산화는 또한 가교결합을 형성할 수 있다. 가교결합에 의한 단백질성 물질의 변형은 예를 들어 식품 가공에서 주로 이용된다. 식품의 질을 고려했을 때, 텍스쳐는 매우 중요한 요소이다. 이것은 감각적 인지 뿐만 아니라 수분 보유 능력, 겔화, 유화 특성 및 안정성과도 관련있다.

단백질 가교결합을 통한 효소-보조된 구조 공학은 몇몇 식품 적용, 예를 들어, 육류, 생선, 유제품 및 곡류 가공에 이용될 수 있다. 트랜스글루타미나제는 예를 들어, 육류 부위의 냉동 결합과 함께 재구성된 육류 가공품을 위해, 다진 육류 제품의 텍스쳐의 개선 및 수분 보유 능력을 위해, 생선 원료의 구조의 개선, 요거트 제품에서 바람직하지 않은 시네레시스(syneresis) 효과 없이 보다 우수한 수분 보유 능력을 갖는 우유 겔의 형성, 조리 후 파스타 제품의 텍스쳐 악화의 예방, 저등급 밀가루로 구운 빵의 부피의 개선을 위한 잘 알려진 효소이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제를 이용한 야채 식료품의 효소적 가교결합은 제WO 03/007728호에서 개시되었다.

트랜스글루타미나제는 미오신, 젤라틴, 및 콜라겐, 카제인, 카제인염, 유장 단백질, 대두 단백질, 글루텐, 난(卵) 단백질과 같은 상이한 단백질 내/사이의 ε(γ-글루타밀) 리신 이소펩티드 결합의 형성을 통한 단백질 내의 또는 사이의 가교결합을 촉매하는 것으로 알려져 있다(Kuraishi et al., 2001; Nielsen, 1995). 그러나, 반응성은 단백질 기질내의 표적 아미노산, 즉 리신 및 글루타민의 이용성 및 접근성에 의존한다. 따라서, 단백질의 글루타민 또는 리신 잔기의 불충분한 접근성 또는 제한된 양 때문에 모든 단백질이 글루타미나제의 적합한 기질이 되는 것은 아니다.

전자 수용체로서 산소를 이용하는 페놀 옥시다제는 값비싼 재생산이 필요한 분리된 보조인자, 즉 NAD(P)H/NAD(P)가 반응에서 필요하지 않으므로 효소적 공정에 적합하다. 이러한 페놀 옥시다제는 예를 들어 라카아제 및 티로시나제를 포함한다. 이들은 모두 구리 단백질이고 다양한 페놀 화합물을 산화할 수 있다. 라카아제 및 티로시나제의 기질 특이성은 부분적으로 중복된다.

티로시나제는 모노페놀 및 방향족 아민의 ο-하이드록실화 및 ο-디페놀에서 ο-퀴논 또는 ο-아미노페놀에서 ο-퀴논이민으로의 산화를 모두 촉매한다(Lerch, 1981). 전통적으로 티로시나제는 기질 특이성 및 저해제에 대한 민감성을 기반으로 라카아제와 구분할 수 있다. 그러나, 최근에 그 차이는 구조적 특징에 기반한다. 구조적으로 티로시나제 및 라카아제 사이의 주요한 차이는, 티로시나제가 이의 활성 위치에 2개의 III형 구리를 함유한 이핵구리 부위를 가지는 반면, 라카아제는 활성 위치에 모두 4개의 구리 원자(I형 및 II형 구리 및 III형 구리 1쌍)를 가진다는 것이다.

티로시나제는 단백질의 티로신 잔기를 상응하는 퀴논으로 산화할 수 있는 능력이 있고, 이 퀴논은 예를 들어, 유리 설프히드릴 및/또는 아미노 그룹과 추가로 반응하여 티로신-시스테인 및 티로신-리신 가교결합을 형성할 수 있다(Ito et al., 1984). 또한, 퀴논은 함께 커플링함으로써 티로신-티로신 결합을 형성하는 것으로 제안되었다.

라카아제에 의한 단백질의 가교결합을 위한 방법은 예를 들어 제 US2002/9770호에서 기재되었다. 대두 및 곡류로부터 유래된 식물 단백질 및 우유, 계란, 육류, 혈액 및 건을 포함하는 동물 단백질이 적합한 기질로 기재되었다. 그러나, 라카아제는 단백질 및 또한 다른 가능한 기질(예, 페놀 화합물)에 대한 라디칼을 형성한다. 따라서 공정은 티로시나제에 의해 촉매되는 퀴논-유래된 비라디칼 반응을 보다 제어하기가 더 어렵다. 라카아제-촉매된 반응에서는, 또한 일부 안정한 라디칼이 매트릭스내에 보유되어 탈중합 및 시간의 함수로서 매트릭스의 후속적 파괴를 유발할 수 있다. 진균의 라카아제는 제US2002/19038호에서 기술되어 있다.

식품 단백질을 가교결합시키는 티로시나제의 능력은 검토된 바 있다(Matheis and Whitaker, 1984; Mtheis and Whitaker, 1987). 이러한 연구에서 세포내의 아가리쿠스(Agaricus) 티로시나제가 이용되었다. 티로시나제를 이용한 단백질의 가교결합은 단백질-결합된 티로신으로부터 o-퀴논의 형성을 통해 진행된다. 이러한 o-퀴논은 서로 축합되거나 단백질에 존재하는 유리 아미노 및 설프히드릴 그룹과 반응한다.

티로시나제는 유장 단백질의 가교결합(Thalmann and Loetzbeyr,2002) 및 도 우의 물리적 특성을 변형(Takasaki and kawakishi, 1997)시키는 용도로 제안되었다. 식품 단백질의 적용에 추가하여, 티로시나제는 예를 들어, 화장품 및 약제 분야에서 이용될 수 있다(DE 102 44 124). 제WO99/57993호에는 반추동물의 사료에서 가교결합 효소의 용도에 대해 기술되어 있으며, 제US2003/0177589호에는 티로시나제 효소로 단백질 섬유를 처리함으로써, 예를 들어 모직물의 수축을 방지하는 방법이 기술되어 있다. 티로시나제를 젤라틴과 같은 폴리펩티드 및 키토산과 같은 폴리사카라이드와 접촉시킴으로써 수득되는 접합체는 제WO2004/029096호에서 기술되었다. 젤라틴-키토산 접합체는 의학적 적용에서 이용될 수 있다. 티로시나제는 콜라겐 섬유의 구성성분(Dabbous, 1996)인 트로포콜라겐 고분자를 중합하는데 이용되었다. 티로신 잔기 사이의 분자 간 또는 분자 내 가교결합의 형성은 중합을 일으킨다.

티로시나제는 자연에 폭넓게 분포한다. 이들은 식물, 동물 및 곤충의 멜라닌 및 유멜라닌 합성과 관련있다. 과일과 야채에서 티로시나제는 효소적 갈변 반응 및 포유류에서의 색소 형성에 관여한다. 진균에서 티로시나제의 역할은 세포 분화, 포자 형성, 독성 및 발병과 상호 관련있다(Sanchez-Ferrer et al., 1995).

가장 잘 알려지고 특성규명된 티로시나제는 포유동물 기원의 티로시나제이다. 구조적 및 기능적 관점 두 가지 모두에서 가장 집중적으로 연구된 진균의 티로시나제는 아가리쿠스 비스로러스(Agaricus bisporus)[참조: Wichers et al., 1996) 및 뉴로스포라 크랏사(Neurospora crassa)의 것이다(Lerch, 1983). 또한 몇몇 세균 티로시나제가 보고되었고, 이 중 스트렙토마이세스(Streptomyces) 티로시 나제가 가장 철저히 특성규명되었다(미국 특허 제5,801,047호 및 미국 특허 제5,814,495호). 추가로, 트로시나아제는, 예를 들어, 바실러스(Bacillus) 및 미로세시움(Myrothcium)(EP 919 628), 뮤코르(Mucor)(JP 61115488), 미리오코쿰(Miriococcum)(JP 60062980), 아스퍼길러스(Aspergillus), 케토토마스티아(Chaetotomastia), 아스코바지노스포라(Ascovaginospora)(Abdel-Raheem and shearer, 2002), 트라메테스(Trametes)(Tomsovsky and Homolka, 2004)로부터 기술되었다.

진균의 세포내 티로시나제는 기술되었고, 이들은 세포질 효소인 것으로 추측된다(Van Gelder et al., 1997). 몇몇 담수 자낭균(ascomycetes)(Abdel-Raheem and Shearer, 2002), 케토미눔(Chaetomium)(제 JP 62205783 호), 및 트라메테스 종(Trametes spp.) (Tomsovsky and Homolka, 2004)의 배양 상청액에서 티로시나제 활성이 검출되었다고 주장하는 보고가 있지만, 실제로 지금까지 분석한 진균의 티로시나제 유전자는 시그날 서열을 가지지 않았다. 배양 상청액에서 보고된 티로시나제 활성은 세포의 자가분해가 원인이 될 수 있다.

두 종의 담자균(설퓰라 라크리맨스(Serpula lacrymans) 및 코니디오포라 푸티나(Conidiophora puteana)) 및 몇몇 불완전 균류(트리코더마 종(Trichoderma spp.) 및 스키탈리움 FY(Scytalium FY)) 사이의 상호 특이적 상호작용 동안의 페놀 옥시다제 및 퍼옥시다제 생산이 Score 등(1997)에 의해 예비적이고 간단한 플레이트 분석에 의해 연구되었다. 저자는 나프톨 및 p-크레졸을 각각 라카아제 (laccase) 및 티로시나제의 특이적 기질로서 이용하였다. 라카아제는 세퓰라 라크 리만 및 세가지 모두의 트리코더마 분리체가 참여하는 상호작용에서 탐지되었다. 실제로, Holker 등(2002)이 최근에 트리코더마로부터 라카아제를 분리하고 특성규명하였다. 예비적인 플레이트 검정으로터의 결과에 기초하여 또한 티로시나제의 활성이 시험된 트리코더마 종에서 제안되었다(Score, 1997). 그러나, 티로시나아제는 분리되거나 정제되지 않았다. 토양 세균 및 진균 분리체 사이의 휘발성 유기 화합물의 상호작용을 연구할 때, Mackie 등(1999)은 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)에서 라카아제 및 티로시나제의 활성을 보고하였다. 그러나, 지금까지 티로시나제는 트리코더마로부터 분리되지도 않았고 추가 특성규명되지도 않았다.

스트렙토마이세스는 세포외 티로시나제를 가지고 있고 세포 상청액으로 효소를 분비하는 것이 보고되었지만, 티로시나제 효소 자체는 분비를 위한 시그날 서열을 가지지 않는다. 스트렙토마이세스 티로시나제의 분비는 시그날 서열을 가진 두 번째 단백질(에스. 안티바이오티쿠스(S. antibioticus)에서 MelC1이라고 불리는)을 필요로 하고(Leu et al., 1992; Tsai 및 Lee, 1998), 이는 스트렙토마이세스 티로시나제의 산업적 생산을 자연적으로 분비된 티로시나제의 생산보다 더디고 복잡하게 한다.

미생물의 티로시나제는 이종적으로 생산되었다. 예를 들어, 아가리쿠스 비스포러스의 두 종류의 티로시나제 유전자는 이. 콜라이(E. coli)에서 적은 양으로 발현된다(Wichers et al., 2003). 아스퍼길러스 오리제(Aspergilus oryzae)의 티로시나제 유전자 melO는 사카로미세스 세레비시에에서 이종적으로 생산되었 다(Fujita et al., 1995). 추가로, 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스의 티로시나제 유전자는 이. 콜라이에서 아마도 단백질의 분비에 관여하는 것으로 보이는 ORF 438 단백질과 공동 발현되었다(Della-Cioppa et al., 1990, US 5801047). 그러나, 문헌에서 보고된 미생물의 티로시나제의 발현 수준은 상대적으로 낮았고, 높은 역가의 효소의 생산을 허용하지 않을 것이다. 실제로 티로시나제의 이용성은 상이한 적용에서 효소의 시험으로 제한하였다. 실제로 시그마사(Sigma)로부터의 아가리쿠스 티로시나제만이 시판하는 티로시나제이다. 그러나, 이 시판 효소는 상대적으로 낮은 활성을 가지는 조 효소이고, 매우 값비싸다.

상기 관점에서, 활성과 이용성이라는 두 가지의 바람직한 특성을 가진 신규 티로시나제가 여전히 요구된다. 용이한 회수를 위해, 효소는 세포 외부로 많은 양으로 분비되어야 하는데, 이에 의해, 분리 공정에서 세포 파괴의 필요성을 피할 수 있고 세포 잔해로부터 생기는 복잡한 문제를 피할 수 있다. 효소는 또한 재조합 기술에 의해 상업적으로 허용할 수 있는 양으로 경제적으로 또한 최소한의 환경적 및 건강상의 위험으로 제조하는데 적합해야 한다. 안전한 유기체의 이용은 식품 적용에서 특히 중요하다. 본 발명은 이러한 요구에 대해 부응한다.

또한, 세포내 단백질이 원칙적으로 이들을 시그날 서열과 커플링시킴으로써 재조합 시스템에서 분비형 단백질로서 생산되지만, 자연적으로 분비되는 단백질이 세포외 생산을 위해서 더욱더 선호될 것으로 예상된다. 이는 자연적으로 분비되는 단백질이 단백질의 폴딩 및 분비 경로의 운반 기구에 적합하기 때문이다.

발명의 요약

본 발명자들은 본 발명자들이 알고 있는 한에서는 최초로 세포외 진균 티로시나제를 동정하였다.

본 발명의 하나의 목적은 상기한 신규 효소를 제공하는 것이다. 당해 효소는 단백질 변형에서 사용하기에 적합하다.

또 다른 목적은 새로운 효소의 용도뿐 아니라 단백질 변형을 위한 방법을 제공하는 것이다.

게다가 본 발명의 다른 목적은 신규 효소의 생산방법 및 이의 생산에서 유용한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 현재 트리코더마 진균에서 발견된 신규 티로시나제를 제공한다. 상기 효소는 세포외 효소이며, 재조합 생산 및 식품 단백질 가교결합 적용에 적합하다. 트리코더마는 통상 동종적으로 및 이종적으로 탁월한 단백질 생산자로 알려져있다. 또 다른 장점은 트리코더마가 통상 안전한 것으로 익히 공지된 유기체라는 점이다.

본 발명은 서열번호 3 또는 4로 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 티로시나제 활성 단편에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 티로시나제 활성을 가진 절편을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 당해 단백질은 트리코더마 종으로부터 수득 될 수 있다. 본 발명은 추가로 당해 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 a) 당해 신규 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 단계, b) 상기 단백질의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 c) 임의로, 생산된 상기 단백질을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 신규 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

대안적으로, 단백질의 생산방법은, 세포외 티로시나제 유전자의 발현을 증강시키는데 효과적인 프로모터를 숙주 세포에 삽입하는 단계, 상기 프로모터를 상기 유전자에 작동가능하게 연결시키는 단계, 상기 단백질의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세폴르 배양하는 단계 및 임의로, 생산된 상기 단백질을 회수 및 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 상기의 임의의 방법에 의해 수득된 단백질을 함유한다.

나아가 본 발명은 단백질-함유 물질 또는 티로신-함유 펩티드를 변형하기 위한 또는 티로신을 L-도파(L-Dopa)로 산화하기 위한, 티로시나제 활성을 가진 단백질의 용도를 포함한다. 단백질-함유 물질 또는 티로신-함유 펩티드를, 티로시나제 활성을 가진 단백질과 이들을 접촉시킴으로써 변형시키는 방법 뿐만 아니라, 티로신을 티로시나제 활성을 가진 단백질과 접촉시켜 티로신을 L-도파로 산화시키는 방법을 제공한다.

신규 단백질을 포함하는 효소 제제 및 티로시나제 활성을 가진 단백질에 의해 변형된 단백질-함유 물질 또한 본 발명의 목적이다.

본 발명의 구체적 양태는 종속청구항에서 나타낸다.

본 발명의 다른 목적, 세부 항목 및 장점은 다음의 도면, 상세한 설명 및 실 시예에서 명백해질 것이다.

도 1은 티. 리세이(T. reesei) TYR1 및 TYR2 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다. TYR2의 C-말단 절단 위치까지 서열이 표시되었다. 시그날 서열은 첫번째 줄이다. TYR1의 추정상의 프로펩티드 절단 위치는 화살표로 나타내었다. 활성 부위 구조의 형성에 관여하는 아미노산 잔기는 음영으로 나타내었다. 음영으로 나타낸 히스티딘은 활성 위치내 두 개의 구리 원자의 리간드이다. 티로시나제의 활성 부위와 관계있는 시스테인과 히스티딘 사이의 티오에테르 결합은 서열 위에 수평선으로 나타내었다.

도 2는 티. 리세이 균주를 형질전환하기 위해 사용된 플라스미드 pMS190의 유전자 지도를 도시한 것이다. cbh1 prom, cbh1 프로모터; Tcbh1, cbh1 터미네이터; hph, 하이그로마이신 내성 유전자; trpC, trpC 터미네이터, ColE1 ori, 이. 콜라이의 복제 기원; bla, 베타-락타마제 유전자.

도 3은 1시간 및 1 내지 3일 후 2 내지 8의 pH 범위 내에서 정제된 TYR2 안정성을 도시한 것이다.

도 4는 30℃, 40℃ 및 50℃에서 측정된 정제된 TYR2의 열안정성을 도시한 것이다.

도 5는 25℃, 30℃ 및 40℃에서 TYR2에 의한 근원섬유 단백질의 겔 형성 효율을 도시한 것이다.

도 6은 TYR2 처리가 있을 때 및 없을 때 카제인염 겔의 경도를 도시한 것이다.

도 7은 정치 시간의 함수로서 밀 도우의 최대 거리 E_max(mm) 및 R_max 매개변수에서 거리 E_x(mm)에 대한 TYR2의 효과를 도시한 것이다.

도 8은 정치 시간의 함수로서 밀 도우의 힘(g)의 매개변수에 대한 TYR2의 효과를 도시한 것이다.

티로시나제는 일반적으로 공지된 구리-효소이다. 이것은 활성 부위에 2개의 TⅢ-형 구리를 함유하고 다양한 페놀 화합물을 상응하는 퀴논으로 산화한다. 퀴논은 반응성이 매우 높고 추가로 비효소적으로 반응할 수 있다. 티로시나제의 통상적인 기질은 티로신이고, 이는 처음에 도파(Dopa)로 하이드록실화된 후, 이 도파는 효소에 의해 도파퀴논으로 추가로 산화된다. 따라서, 티로시나제는 하나의 동일한 단백질 내에 두 가지 효소 활성, 즉 모노페놀 모노옥시가나제 활성(EC 1.14.18.1) 및 카테콜 옥시다제 활성(EC 1.10.3.1)을 가진다.

티로시나제의 기질 특이성은 상대적으로 광범위하고, 당해 효소는 많은 폴리페놀 및 방향족 아민을 산화시킬 수 있다. 그러나, 라카아제(EC 1.10.3.2)와는 반대로 티로시나제는 시린갈다진(synringaldazin)을 산화시키지 않는다.

신규 단백질은 세포외 티로시나제이고, 이는 이들 단백질이 분비되는 동안 절단되는 시그날 서열을 이들의 N-말단에 갖는다는 것을 의미한다. 분비 과정 동안 단백질의 추가적인 프로세싱도 또한 가능하다. 환언하면, 단백질은 세포내에서 반드시 효소적으로 활성이 아닌 미성숙한 단백질로서 생산된다. 분비되는 동안, 단백질은 효소적으로 활성인 더 작은 단백질로 프로세싱된다. 단백질의 프로세싱된 형태를 "성숙한" 단백질이라고 부른다. 본 발명의 단백질은 "티로시나제 활성을 가진 절편을 포함한다". 이는 당해 단백질이 프로세싱되지 않은 형태일 수 있지만, 티로시나제 활성을 위해 필요한 단백질의 적어도 일부분을 함유한다는 것을 의미한다. 즉, 이것은 성숙한 단백질 또는 적어도 효소적으로 활성인 이의 단편을 함유한다.

티로시나제의 활성은 통상적으로 당업계에 알려진 기술에 의해 측정할 수 있다. L-도파 또는 티로신이 기질로서 이용된 후, 도파크롬 형성을 분광 광도측정으로 모니터링할 수 있거나, 대안적으로 기질 소비를 산소 소비를 추적하여 모니터링할 수 있다. 티로시나제의 활성은 또한 티로신과 같은 적절한 기질을 첨가함으로써 아가 플레이트 상에서 가시화될 수 있고, 이에 따라 티로시나제의 활성이 콜로니 주변에 어두운 지역으로 나타난다.

"시그날 서열"은 단백질의 N-말단 부위에 결합한 아미노산의 서열을 의미하고, 이는 성숙한 형태의 단백질의 세포 외부로의 분비를 용이하게 한다. 단백질의 성숙한 형태는 시그날 서열이 없다.

신규 티로시나제는 트리코더마 종로부터 수득될 수 있고 상기 유기체로부터 수득할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 본원에서 사용된 "수득할 수 있는 형태"는, 당해 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 트리코더마 종으로부터 수득할 수 있음을 의미하지만, 이는 또한 특정 진균으로부터 기원하거나 진균으로부터 천연적으로-생산되는, 당해 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 유사한 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 등가물은 특히 다른 사상진균에서 발견될 수 있다. 본 발명의 특정 일 양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 신규 단백질은 트리코더마 리세이로부터 수득될 수 있다.

tyr1(골격 19)(서열번호 1) 및 tyr2(골격 11)(서열번호 2)로 명명된, 트리코더마 리세이로부터 유래된 두 가지 티로시나제 유전자는 623(TYR1)(서열번호 3) 및 571(TYR2)(서열번호 4)개의 아미노산을 암호화한다. tyr1 유전자는 다음 뉴클레오티드 위치에 3개의 인트론을 포함한다: Ⅰ 290-355, Ⅱ 487-571, Ⅲ 839-890. tyr2 유전자는 7개의 인트론을 포함한다: Ⅰ159-397, Ⅱ 475-540, Ⅲ 624-725, Ⅳ 774-832, Ⅴ 1199-1243, Ⅵ 1429-1506, Ⅶ 2123-2221. TYR1 및 TYR2는 모두 N-말단에 추정상의 시그날 서열을 가지며, 이는 이 효소들이 세포외 효소임을 나타낸다. 데이타베이스에서 TYR1 및 TYR2와 가장 상동인 유사체는 지베렐라 제애(Gibberella zeae)(각각, 47% 및 46%의 상동성)로부터의 두 가지 상이한 잠재적 티로시나제이다. 이들 단백질은 지. 제애의 게놈 서열 분석의 시도에서 동정되었지만, 이들이 티로시나제 활성을 갖는다는 것은 제시되지 않았다. 두 종의 티. 리세이 티로시나제는 서로 30%의 동일성을 가진다. TYR2의 C-말단 절단 위치까지의 TYR1 및 TYR2의 아미노산 서열의 정렬은 도 1에 나타냈다. 당해 단백질은 이의 N-말단에 시그날 서열을 가지며, 이는 이들이 세포외에 존재하는, 즉 세포의 외부로 분비됨을 의미한다. 시그날 서열 예측 프로그램은 TYR1의 시그날 서열이 20개 아미노산의 길이이고, TYR2의 시그날 서열은 18개 아미노산의 길이라는 것을 나타낸다.

적어도 TYR2는 이의 C-말단에서 단백질 가수분해에 의해 더욱 프로세싱될 수 있고, 이에 따라 단백질의 약 1/3이 절단되어진다. 또한, TYR1도 유사한 방법으로 C-말단으로부터 프로세싱될 것으로 예상할 수 있다. 트립신에 의해 생성된 펩티드 및 시아노겐 브로마이드 처리한 효소의 가수분해 산물의 질량 분광 광도법 분석에 따르면, TYR2의 C-말단 절단 위치는 서열 -GPNSG 뒤에 있는 아미노산 위치 410번(서열번호 4)에 있다. 다수의 진균 티로시나제는 C-말단 프로세싱을 갖는 것으로 보고되었다. 문헌에 따르면, 진균 티로시나제는 생체 내에서 촉매 부위로의 기질 접근을 개시하는 것으로 제시된 제한된 단백질분해성 절단에 의해 활성화된다(Decker 및 Tuczek, 2000).

추가로, TYR1은 이의 N-말단의 시그날 서열 다음에 프로펩티드를 포함하고, 이 프로펩티드는 분비되는 동안 특이적 kex2-형 펩티다아제에 의해 절단된다. 가능한 절단 부위는 SITRRR 서열 아미노산 36번과 37번 사이에 있다.

TYR1 및 TYR2는 이들의 활성 부위에 두 개의 구리-원자를 가진다. 각 구리 원자는 3개의 히스티딘 잔기에 의해 배위 결합된다. 다른 진균 티로시나제에서 또한 발견되는 티오에테르 결합은 시스테인 및 구리와 결합한 두 번째 히스티딘 잔기 사이에서 검출될 수 있다.

당해 신규 단백질은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로서 나타내는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프라이머를 이용한 증폭에 의해 트리코더마 종의 DNA로부터 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 핵산의 증폭은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 통상적으로 핵산 서열은 증폭할 서열의 각 측면에서 하이브리드화하는 정방향 및 역방향 프라이머의 프라이머 쌍을 이용하는 PCR에 의해 증폭된다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 포함된 서열을 가질 수 있다. 신규 단백질은 서열번호 3 및 서열번호 4에 포함된 아미노산 서열을 가진다. "에 포함된다"는 서열이 상기한 서열의 적어도 일부분을 갖는다는 것을 의미한다. 따라서, 당해 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 티로시나제 활성 단편만을 포함할 수 있다.

서열번호 3 및 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열내의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환, 결실 또는 삽입은 단백질의 분비, 프로세싱 또는 효소적 특성에 반드시 영향을 미치는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 티로시나제의 활성 단편에 대해 70% 이상 또는 80% 이상 및 특히 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 갖는다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2에서 나타낸 서열을 가진 핵산에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 이는 동정된 서열의 단지 일부분과 하이브리드화하는 서열을 포함한다. 당연히, 이것은 상보적인 가닥중 어느 하나와 하이브리드화하는 서열을 또한 포함한다. "하이브리드화"는 분리된 핵산 가닥이 염기 쌍형성에 의해 상보적 가닥과 결합하는 과정을 지칭한다. 하이브리드화 조건은 통상적으로 중간 또는 높은 엄중성이다. 예를 들어, 중간 수준의 엄중성 하이브리드화는 50℃에서 6x SSC(0.09M의 나트륨 시트레이트 중의 0.9M NaCl, pH 7), 0.5% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 5x 덴하트 용액 및 청어의 정자 DNA 100㎍/ml을 함유하는 하이브리드화 혼합물에서 수행될 수 있다. 높은 엄중성 하이브리드화는 예를 들어, 68℃에서 동일한 하이브리드화 혼합물에서 수행될 수 있다.

신규 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 포함된 서열을 갖거나, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 포함된 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열을 가진다.

신규 효소는 세포외 효소이기 때문에, 이들은 특히 대규모의 제조에 유용하다. 편의상, 티로시나제는 재조합 기술에 의해 제조된다. 이것은 PCR 반응에서 증폭에 의한 티로시나제 유전자를 포함하는 단편의 분리(Coen, 2001) 또는 다른 재조합 DNA 기술(Sambrook et al., 1989), 발현 벡터에서 강력한 프로모터 하에 유전자의 삽입, 적절한 숙주 세포로 벡터의 도입 및 티로시나제 효소의 생산을 자극하는 조건에서의 숙주 세포의 배양을 의미한다. 상이한 숙주 시스템에서 재조합 기술에 의한 단백질의 생산방법은 당업계에 알려져 있다(Gellissen, 2005). 대안으로, 단지 강력한 프로모터가 숙주의 염색체 상의 티로시나제 유전자에 작동가능하게 연결되어, 상기 유전자가 과발현된다.

본원에서 사용되는 "발현 벡터"는 신규 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 작제물을 지칭한다. 단백질의 발현을 지시할 수 있기 위해, 벡터는 작동가능하게 연결된 다음의 요소를 포함한다: 전사 프로모터, 상기 단백질을 암호화하는 절편 및 전사 터미네이터. 벡터는 염색체로 통합되는 것 또는 자율적으로 복제되는 것이 될 수 있다.

"숙주 세포"는 발현 벡터를 포함하고 이 벡터에 의해 암호화되는 단백질을 발현할 수 있는 임의의 숙주를 의미한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 가능한 숙주는 세균, 효모 및 진균, 사상진균이다. 바람직한 일 양태에 따르면 티로시나제는 예를 들어 트리코더마에서, 특히 티. 리세이에서 동종적으로 발현된다. 다른 가능한 숙주는 아스퍼길러스 니거(Aspergilus niger), 아스퍼길러스 오리재(Aspergilus oryzae), 푸사리움 그라미니룸(Fusarium graminearum), 피크노포러스 시나바리너스(Pycnoporus cinnabarinus), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 폴리몰파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)가 될 수 있다.

적합한 프로모터는 강력한 전사 활성을 가지고 티로시나제의 높은 수준의 발현이 가능한 것이다. 트리코더마에서의 강력한 발현을 위해 적합한 강력한 프로모터는 cbh1이고, 대안적인 프로모터는 예를 들어 cbh2, egl1, xyn1, xyn2 및 tki1 및 아스퍼길러스 니듈라스(Aspergilus nidulans) gpdA의 프로모터이다.

본 발명의 구체적 일 양태에 따르면, 단백질은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 나타낸 서열을 가진 프라이머 쌍을 이용한 증폭에 의해 트리코더마의 DNA로부터 수득될 수 있는, 세포외 티로시나제를 암호화하는 DNA 서열을 숙주 세포에 삽입하고, 발현에 적합한 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시키고, 성장 배지로부터 분비된 단백질을 회수하고, 임의로 이를 정제함으로써 제조될 수 있다. 단백질은 성장 배지로부터 분리될 수 있고, 크로마토그래피, 침전, 원심분리, 여과, 겔 전기영동 등과 같이 당업계에 알려진 분리 및 정제 기술에 의해 이의 천연 환경으로부터 추가로 정제될 수 있다.

본 발명의 효소 제제는 조악한 또는 정제된 형태의 신규 티로시나제를 포함하는 조성물이다. 추가로, 이것은 다른 단백질 및 효소를 포함하는 다른 성분을 함유할 수 있다. 이것은 예를 들어, 단백질이 분비되어진 숙주 세포의 성장 배지가 될 수 있다.

트리코더마 티로시나제는 퀴논과 반응성인 페놀 그룹을 포함하는 임의의 종류의 매트릭스에 대한 퀴논의 형성과 함께, 예를 들어 단백질 매트릭스에서의 후속적 가교결합 형성에서 유용하다.

트리코더마 티로시나제는 임의의 단백질 함유 물질, 티로신 잔기의 비교적 높은 전체 함량 또는 비교적 높은 함량을 갖는 단백질의 처리에 이용될 수 있다. 또한 티로신-함유 펩티드는 변형될 수 있다. 효소는 약제, 화장품, 펄프 및 종이, 세제 및 직물 산업 및 사료 및 식품 산업과 같은 상이한 종류의 산업적 용도로 적용될 수 있다.

트리코더마 티로시나제는 단백질-함유 식품, 특히, 육류, 유제품, 야채 및 곡류 물질의 처리에 특히 적합하다. 티로시나제를 이용하여 식품 단백질을 가교결함시킴으로써 식품의 텍스쳐 및 유동학적 특징이 개선될 수 있다.

예를 들어, 생선, 가금류 또는 다른 육류 제품의 티로시나제로의 처리는 다른 구조 형성 제제의 양을 감소시키면서 우수한 텍스쳐의 제품을 수득하는데 있어 증진될 수 있다. 티로시나제는 겔화에도 이용될 수 있으므로, 젤라틴의 이용을 피할 수 있다. 티로시나제는 또한, 특히 지방의 함량이 낮은 경우에 다수의 우유 제품에서 문제가 되는 시네레시스, 즉 수성 상의 분리를 방지하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어 요거트 및 특히 낮은 칼로리의 요거트를 제조할 때, 저장하는 동안 고체 및 액체 상이 분리되는 경향이 있다. 이는 소비자에 의해 비난을 받게 되고, 요거트의 원료를 티로시나제로 처리함으로써 방지될 수 있다. 티로시나제는 제빵과정, 예를 들어 냉동 도우 제품을 만드는데 특히 바람직한 도우의 경화를 위해 또한 적용될 수 있다.

티로시나제는 또한 파킨슨병의 치료 및 화장품 산업용 성분인 멜라닌의 제조에 유용한 L-도파의 제조를 위해 이용될 수 있다. 추가로, 티로시나제는 실크, 울, 캐시미어, 알파카 또는 사람의 모발과 같은 단백질성 섬유 또는 섬유-유도된 중합체의 가교결합에 이용될 수 있다.

본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 설명된다. 그러나, 상기 설명 및 예시에서 주어진 양태는 설명적인 목적만을 위한 것이며, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 범위에서 가능하다는 것이 이해되어야 한다.

실시예 1

티로시나제-양성 미생물의 플레이트 선별

티로시나제 활성 선별을 위한 지표는 문헌에 따라 선택되었다. L-티로신, p-크레졸, ρ-쿠마르산, 티라민, 3-하이드록시 안트라닐산 및 카테킨이 표 1에서 나타낸 농도로 이용되었다. 트리코더마 리세이는 선택된 지표(표 1)(Difco)를 포함하는 맥아 추출물(Malt Extract) 아가상에서 37℃에서 48일 동안 성장시켰다. 플레이트 상의 가능한 색상 변화가 가시적으로 관찰되었다.

티. 리세이는 L-티로신, 티라민, 3-하이드록시 안트라닐산 및 카테킨과 명확한 양성 반응을 나타냈다. 결과는 명백하게 티. 리세이가 티로시나제-양성 미생물이라는 것을 나타냈다.

티. 리세이로부터 티로시나제 활성의 플레이트 시험 선별
지표	농도(mM)	색상 변화
L-티로신	10	++
p-크레졸	0.1	=
p-쿠마르산	1.0	=
티라민	1.0	+
3-하이드록시 안트라닐산	1.0	+
카테킨	1.0	++

실시예 2

트리코더마 리세이로부터 tyr1 및 tyr2 유전자의 분리

새로운 티로시나제 유전자 두 종류 모두는 티. 리세이 게놈의 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. tyr1을 위해 이용된 프라이머는 다음과 같았다:

정방향 프라이머: GCT ACC GCG GAT GGG CTT CCT CGC TCG CCT CAC(서열번호 5) 및 역방향 프라이머: CTG AGG ATC CTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCT CCC ACA ACA CCA ATC TCA GCA T(서열번호 6).

tyr2 유전자는 다음의 프라이머로 증폭시켰다:

정방향 프라이머: GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTA TCA TGC TGT TGT CAG GTC CCT CTC G(서열번호 7) 및 역방향 프라이머: GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GCA GAG GAG GGA TAT GGG GAA CGG CAA A(서열번호 8).

PCR 반응은 제조업자가 추천하는 반응 혼합물에서 Dynazyme EXT 열안정성 폴리머라제(Finnzymes, 핀란드)로 수행되었다. PCR 프로그램은 94℃에서 3분의 초기 변성 단계 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 45초 및 72℃에서 2.5분의 25회 사이클이 뒤따랐다. 뒤이어 72℃에서 5분의 마지막 신장 단계가 있었다. 예상된 크기의 PCR 산물을 수득하고, 당업계에 공지된 방법으로 아가로즈 겔에 전개시키고, Qiaquick Minelute 겔 정제 키트를 이용하여 겔로부터 정제시켰다. tyr1 유전자 단편은 TOPO-TA 클로닝 키트(인비트로젠)를 이용하여 pCR2.1TOPO 벡터내로 클로닝하였다. tyr2 유전자 단편은 Gateway 재조합 키트(인비트로젠)로 수행된 BP 재조합 반응으로 pDONR221 벡터(인비트로젠)로 전이시켰다. 유전자들은 PCR 돌연변이를 배제하기 위해 서열 분석되었다.

실시예 3

강력한 프로모터하에 트리코더마 리세이에서의 tyr2 유전자의 과발현

tyr2 유전자 단편을 LR 재조합 반응에 의해 pDONR221 벡터로부터 티. 리세이 발현 벡터 pMS186으로 전이시켰다. 이 벡터는 cbh1(셀로바이오하이드롤라제 1) 프로모터 및 터미네이터 사이에 삽입된 Gateway 판독 프레임 카세트 C(RfC)를 함유한다. 이 벡터는 또한 티. 리세이 형질도입체의 선별을 위한 하이그로마이신 내성 카세트를 가진다. LR 재조합 반응은 제조업자의 지시대로 Gateway 재조합 키트(인비트로젠)로 수행하였다. 이 재조합에서, tyr2 유전자 단편을 cbh1 프로모터 및 터미네이터 사이에 삽입시켜 플라스미드 pMS190(도 2)을 생성시켰다.

플라스미드 pMS190는 본질적으로 기술된 바와 같이(Penttila et al., 1987) 티. 리세이 균주 VTT-D-00775에 형질전환되었고, 형질전환체는 125㎍/ml의 하이그로마이신 B를 함유하는 플레이트 상에서 하이그로마이신 내성으로 선별되었다. 형질전환체는 3번의 연속적인 라운드를 위한 선택 배지를 함유하는 플레이트에 스트리킹되었고 플레이트 검정으로 티로시나제 활성이 시험되었다. 검정 플레이트는 탄소 공급원으로서 2% 락토오즈, 완충제(pH5.5)로서 1% K-프탈레이트, 0.1mM CuSO₄ 및 지표 기질로서 1% 티로신을 함유한 트리코더마 최소 배지(Penttila et al., 1987)를 갖는다. 형질전환체를 플레이트상에 스트리킹하고, 7일 동안 성장시켰다. 티로시나제 활성은 스트리킹한 부분 주변에 나타나는 암갈색으로서 플레이트 상에서 관찰되었다. 명백한 염색을 나타내는 몇몇 양성 형질전환체를 발견할 수 있었다. 모 균주는 당해 검정에서 염색을 나타내지 않았다.

실시예 4

액체 배양물에서 TYR2의 제조

양성 형질전환체를 4% 락토오즈, 2%의 주정박(distiller's spent grain), 100mM PIPPS 및 2mM CuSO₄ 가 보충된 트리코더마 최소 배지에서 8일 동안 진탕 플라스크에서 성장시켰다(Penttila et al. 1987). 티로시나제 활성은 기질로서 15Mm L-도파(L-3,4 디하이드록시페닐알라닌)(Sigma)를 이용하여 배양의 상청액 샘플로부터 측정되었다. 활성은 또한 2mM의 농도로 L-티로신(시그마)에 대해 측정되었다. 두 가지 활성 검정은 25℃에서 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 475nm에서 도파크롬의 형성을 모니터링하면서 수행되었다. 몰흡광 계수 ε3400M^-1cm^-1(Robb, 1984)가 이용되었다. 측정은 2-광선 분광 광도계(Lamda 20, Perkin-Elmer, 독일 위버링겐)를 이용하여 수행되었다. 활성은 나노카탈(nanokatal)로서 나타냈다. 3종류의 뛰어난 형질전환체는 티로시나제 활성의 40, 35 및 11nkat/ml를 산출하였다.

진탕 플라스크에서 가장 높은 수준의 티로시나제를 생산하는 형질전환체 pMS190/VTTD-00775/98는 다음을 포함하는 20 리터의 배지에서 Braun Biostat C-DCU 3 발효기(B.Braun Biotech, 독일)에서 배양되었다: 락토오즈 20 gl^-1, 주정박 10 gl^-1, KH₂PO₄ 15 gl^-1 및 2mM CuSO₄ x 5H₂O. pH는 NH₄OH 및 H₃PO₄로 5.5 내지 6으로 조정하였으며, 배양 온도는 +28℃였다. 용존 산소 수준은 교반 450rmp, 통기 8 리터/분 및 0 내지 30% 산소-농축된 유입 공기를 사용하여 30% 이상으로 유지시켰다. 발포는 스트룩톨(Struktol) J633 폴리오리트 소포제(Schill & Seilacher, 독일)의 자동 추가에 의해 조절되었다. 샘플은 락토오즈 및 총 단백질 농도 및 티로시아나제 활성을 측정하기 위해 매일 채취되었다. 발효 후에 세포는 원심분리에 의해 제거되었고 배양 상청액은 한외여과로 2.5x 농축되었다.

배양 6일 후에 약 300nkat/ml의 수준에 도달했다. 정제된 TYR2의 특이적 활성으로 계산한 바에 따르면, 발효에서 가장 높은 활성은 효소의 약 1g/L에 상응한다.

실시예 5

TYR2의 정제

원심분리한 농축된 배양 상청액(실시예 4에서 수득한)을 먼저 아비셀(Avicel) 미정질 셀룰로즈(0.2g/ml 배양 상청액)로 처리하여 셀룰라아제와 결합시켜 이를 제거하였다. 샘플은 지속적인 교반 하에서 4℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 상청액은 원심분리(10,000rpm)에 의해 수집되었다. 완충액이 세파덱스 G-25 혼합 컬럼(2.6 x 27 cm; Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)과 함께 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.3)으로 교체되었다. 샘플은 먼저 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.3)으로 예비평형화시킨 Hiprep^TM 16/10CM 세파로즈 Fast Flow 컬럼에 가해졌다. 단백질은 Tris-HCl 완충액 중의 선형 0 내지 180mM NaCl 구배(120ml)를 이용하여 용출하였다. 티로시나제 양성 단편을 모으고, 비바스핀(Vivaspin) 20 (10,000MWCO, PES, Vivascience) 농축기로 8.2mL로 농축시켜, 겔 여과 컬럼, 150mM NaCl(pH 7.5)를 함유하는 20mM Tris-HCl로 평형화시킨 Hi-prep 26/60 세파크릴 S-100 HR 컬럼(AKTA, 파마시아)에 가했다. 활성 단편을 모으고 농축시켰다.

SDS-PAGE(12% Tris-HCl Ready Gel, Bio-Rad)가 Laemmli(1990)에 따라 수행되었다. 단백질 밴드는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brillant Blue)(R350; Pharmacia)로 염색함으로써 가시화되었고 분자량 마커(Pre-stained SDS-PAGE Standards Broad Range, 카탈로그 번호 161-0318, Bio-Rad)와 비교되었다.

TYR2는 PAGE상에서 이중 밴드로 나타났다. 겔 여과 및 역상 크로마토그래피로 추가로 분석하면, 정제된 제제에서 단지 하나의 단백질 종만을 관찰할 수 있으므로, 겔 상의 이중 밴드는 겔 인공산물이다. 흥미롭게도, 겔로부터의 대략적으로 계산한 정제된 TYR2의 분자량은 단지 45kDa이고, 이는 추론된 아미노산 서열로부터 계산된 값(60.4kDa)보다 훨씬 낮다. 상기 결과는 TYR2가 이의 C-말단에서 프로세싱된다는 것을 나타낸다.

정제 표를 표 2에 나타내었다. 표에서 겔 여과 1 및 2는 티로시나제-양성 샘플의 상이한 수집물을 지칭한다.

실시예 6

TYR2의 생화학적 특성

단백질 농도가 소 혈청 알부민을 기준으로하여 Bio-Rad DC 단백질 검정 키트(Bio-Rad, 리치몬드, USA)에 의해 측정되었다. 몇몇 단백질의 농도 측정은 Hitachi U-2000 분광 광도계 (Hitachi, 도쿄, 일본)으로 280nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 수행되었다. 티로시나제 활성은 실시예 4에서 기술한 것처럼 측정되었다.

TYR2는 L-티로신 및 L- 도파 둘 다를 산화시킬 수 있다. 활성 판독치는 L-도파가 L-티로신보다 대략 6배 높은 활성가를 제공한다는 것을 나타낸다. 당해 결과는 또한 효소 반응에서 산소 소비를 추적하여 L-도파 및 L-티로신에 대한 효소 활성을 측정함으로써 확인하였다. 문헌에 따르면, 많은 미생물의 티로시나제는 이들의 활성을 위해 SDS를 요구한다. 티로시나제 활성에 대한 SDS(Sigma)의 효과는 활성 검정에서 상이한 농도의 SDS를 이용하여 측정되었다. 놀랍게도, SDS가 효소 활성을 억제한다는 것이 밝혀졌다: 0.5mM SDS 농도에서 효소의 활성은 단지 50%만이 남았다.

배양 상청액 및 정제한 효소로부터의 효소의 등전점(pI)은 제조업자의 지시에 따라 LBK 2117 Multiphor Ⅱ 전기영동 시스템 (LBK Pharmacia, 브로마, 스웨덴) 상에서 3.5 내지 9.5의 pH 범위(IEF에 대한 암포린 PAGplate 3.5 내지 9.5, Amersham Bioscience) 내에서 등전 포커싱(isoelectric focusing)에 의해 측정되었다. 티로시나제를 함유하는 밴드는 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 중의 15mM L-도파로 겔을 염색함으로써 가시화되었고, 단백질은 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화되었다. 정제된 TYR2는 쿠마시 블루로 염색하면 약 pH 9에서 2개의 밴드를 나타냈다. 등전 포커싱에서 천연 조건의 배양 여과 및 정제된 티로시나제 모두는 L-도파로 염색하면, 선명한 밴드는 나타나지 않는 대신, 활성이 약 pH 9에서 갈색 영역으로서 관찰되었다.

티로시나제에 대해 최적인 pH가 산소 소비 측정에 의해 연구되었다. 측정은 측정 범위가 0 내지 100% 산소인 광섬유 산소 소형 센서를 함유하는 단일 채널 산소 계기(Precision sensing GmbH, 독일)로 시행되었다. 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 용해시킨, 15mM 농도의 L-도파가 기질로서 이용되었다. 반응은 1.8mL 기질 용액 및 4.3 ㎍의 정제된 티. 리세이 티로시나제로 실행되었다. 3 종류의 상이한 완충액이 완충능에 따라 이용되었다. 맥클배인(Macllvaine) 완충액은 2 내지 7의 pH 범위 내에서, Tris-HCl 완충액(50mM)은 7 내지 9의 pH 범위 내에서, 붕산염 완충액(12.5mM)은 8 내지 9.5의 pH 범위 내에서 이용되었다. TYR2의 최적 pH는 8 내지 8.5이다. 효소는 광범위한 pH 범위인 5 내지 9 내에서 상대적으로 높은 활성을 가진다. Tris-HCl 완충액을 이용했을 때, L-도파의 자가-산화가 pH 값 8 내지 9에서 관찰된 반면, 붕산염으로는 동일한 종류의 현상이 나타나지 않았다. pH 8, 8.5 및 9.0 Tris-HCl 완충액을 이용한 측정에서, 또한 효소 첨가 없는 공시험을 수행하여 결과에서의 자가-산화의 효과를 보정하였다. 티로시나제의 최적 pH는 완충액에 의존하는 것으로 보인다.

상이한 pH-값에서의 효소의 안정성은 맥클베인, 50mM Na₂HPO₄-25mM 시트르 산, 완충액에서 상이한 pH-값의 효소 용액을 실온에서 항온처리함으로써 측정되었다. 잔류 티로시나제 활성은 기질로서 L-도파를 이용하여 효소 용액의 활성을 측정함으로써 측정되었다.

온도 안정성은 30, 40 및 50℃에서 측정되었다. 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 중의 효소 용액 (320 nkat/ml)이 상이한 온도에서 항온처리되었고, 잔류 효소 활성은 특정 시간 기간 후에 15mM L-도파에 대한 표준 활성 검정으로 티로시나제 활성을 측정함으로써 측정되었다. 효소는 중성 및 알칼리 pH에서 우수한 안정성을 나타냈다. pH가 7 이하로 저하되면, 효소는 활성을 상실하기 시작했다.

티로시나제의 분자량 및 N-말단 서열 분석은 이전에 기술한 것처럼(Palonen et al., 2003) Ultraflex^TM 이동시간 측정 장치(time-of-flight instrument) (BrukerDlatonics, 독일) 상에서 MALDI-TOF 질량 분광계에 의해 측정되었다. MALDI-TOF에 의한 분석에 따르면 티로시나제의 분자량은 약 42.9kDa이다. N-말단 아미노산 분석은 N-말단이 차단되었다는 것을 나타낸다. 이는 성숙한 단백질에서 첫 번째 아미노산으로서 글루타민의 존재를 나타낸다. 결과는 서열 자료와 일치한다.

정제된 TYR2의 광학 흡수 스펙트럼은 Varian Cary 100 Bio UV-가시광선 분광광도계로 측정되었다. 정제한 티로시나제의 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼은 330nm에서 숄더(shoulder)를 가지며, 280nm에서 주요 단백질 피크를 가졌다. 숄더는 브릿지 하이드록실을 갖는 산화된 형태의 T3형 구리 쌍의 지표이다.

실시예 7

티로시나제의 기질 특이성

선택된 다양한 기질에 대한 티로시나제의 기질 특이성은 산소 소비 측정에 의해 연구되었다. 기질의 농도는 2.5mM이었고, 화합물은 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 용해시켰다. 반응은 2.5mM 기질 용액 1.8mL 및 정제된 TYR2 24㎍으로 수행되었다. 참조물로서, 기질 특이성 검정은 시판되는 아가리쿠스 비스포러스(Agaricus bisporus) 원료 티로시나제(Sigma)에 대해서도 측정되었다. 각각 50㎍의 상기한 버섯 티로시나제가 검정에서 이용되었다. 연구에서 사용된 모노-, 디- 및 트리-페놀 화합물의 구조를 표 3 및 표 4에 나타내었다. TYR2 및 아가리쿠스 티로시나제의 활성은 펩티드 쇄의 상이한 위치에 티로신을 함유하는 선택된 모델 펩티드에서 분석되었다(표 5). TYR2 및 아가리쿠스 티로시나제에 의한 L-/DL-D-도파 및 -티로신의 산화가 또한 측정되었다(표 6).

TYR2는 파라-위치에 OH-그룹을 가진 많은 치환된 모노페놀을 산화시킬 수 있다. 페놀의 하이드록실 그룹에 대해 오르토-위치의 임의의 측쇄는 입체 장애를 유발하여 기질의 산화를 저하시키거나 존재하지 않게 하였다. 기질 구조에서 아미노 그룹의 존재 및 위치는 TYR2에 의한 산소 소비 속도의 중요한 고려 대상이 되는 것으로 나타났다. 페놀의 하이드록실 그룹이 아미노 그룹에 더욱 가까워질수록, 기질의 산화는 더욱 느려진다. 아미노 그룹의 위치의 동일한 영향이 또한 펩티드 측정에서 나타났다. 흥미롭게도, TYR2의 기질 특이성은 실질적으로 아가리쿠스 티로시나제의 기질 특이성과 구별된다. TYR2는 아가리쿠스 티로시나제와 비교했을 때 입체특이적이다.

표 5에서 볼 수 있듯이, TYR2 및 아가리쿠스 티로시나제는 시험된 모델 펩티드를 산화시킬 수 있었다. TYR2의 산화 속도는 펩티드의 길이 및 티로신 잔기의 위치에 더욱더 의존적이었다. 디펩티드는 단일 티로신보다 더 쉽게 산화되고, C-말단에 티로신 잔기를 가진 펩티는 티로신이 N-말단에 있는 펩티드보다 TYR2에 대한 더욱 우수한 기질이었다. 아가리쿠스 티로시나제는 티로신 잔기의 위치에 민감하지 않았다.

놀랍게도, 트리코더마 티로시나제는 L-티로신 및 L-도파에 대해 높은 입체특이성을 나타낸다(표 6). L-에난티오머는 D-에난티오머보다 훨씬 높은 속도로 산화된다. 아가리쿠스 티로시나제의 경우 상이한 에난티오머 사이의 산화 속도에서의 차이는 관찰되지 않았다. 실제로, Espin 등(1998)은 아가리쿠스 티로시나제가 상이한 에난티오머에 대해 이의 친화성에서 입체특이성을 나타냈지만 반응 속도에서는 그렇지 않다는 것을 보여주었다. 반응 속도에서의 명백한 차이는 합성 화학에서 장점이 된다.

TYR2의 모델 단백질에서 가교결합 능력은 SDS-PAGE 상의 MW의 변화를 추적하여 분석되었다. 결과는 TYR2가 α-카제인 및 닭의 근섬유를 가교결합시킬 수 있지만, 소 혈청 알부민은 가교결합 시킬 수 없다는 것을 나타냈다. 세부 사항은 실시예 8 및 9에 나타냈다.

실시예 8

육류 단백질의 티로시나제-촉매된 가교결합

TYR2에 의한 닭 가슴근육 근섬유의 분리된 염 가용성 단백질(SSP)의 분자량의 변화는 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. SSP는 Xiong 및 Brekke(1989)에 따라 분리되었다. 효소 처리를 위해, SSP는 0.6M NaCl을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 3mg/ml의 단백질 농도까지 현탁시켰다. 단백질 g당 120nkat 또는 240nkat의 TYR2를 현탁액에 첨가했다. 대조 현탁액을 유사한 방법이지만 효소 첨가 없이 처리하였다. 반응 혼합물은 30℃에서 항온처리하였다. 샘플은 2분, 1시간, 3시간, 및 24시간의 시점에서 회수하였다. SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하고, 샘플을 비등수 욕조에서 가열하였다. 각 샘플로부터 20㎍의 단백질이 12% Tris-HCl 폴리아크릴 아미드 겔에 적재되었다. SDS-PAGE는 Laemmili (1970)에 따라 시행되었다.

TYR2에 의해 촉매된 단백질 밴드의 주요한 변화는, 유사하지만 효소 없이 처리된 것에 대해 상대적인 이동성 및 염색 강도를 비교함으로써 실험적으로 동정되었다. 사용된 조건 및 용량에서, TYR2는 24시간 효소 처리 후에 가장 두드러진 다음의 검출가능한 전기영동 변화를 나타냈다: (1) 3시간 처리 후 두 가지 효소 농도에서 모두 약 200kDa의 미오신 밴드의 점진적인 소실, (2) 3시간 처리 후 두 가지 효소 농도에서 모두 약 36kDa의 밴드의 점진적인 소실 및 (3) 24시간 처리 후 겔에 진입하지 못한 큰 분자량의 단백질 생성물(>200kDa)의 출현.

닭의 근섬유 매트릭스에서 가교결합을 형성하는 TYR2의 능력은 또한 낮은 변형에서의 겔 형성 능력을 측정하는 저장 탄성률(G')의 발달에 따라 조사되었다. 측정은 보린(Bohlin) 유량계를 이용하여 일정한 온도로 가열하는 동안 수행되었다. 닭 가슴 근섬유는 분리 완충액으로부터 EDTA 및 NaN₃를 누락시켜 Xiong 및 Brekke(1989)에 따라 분리되었다. 분리된 근섬유는 0.30M NaCl이 보충된 pH 6의 50mM 인산나트륨 완충액에 40mg/ml의 단백질 농도까지 현탁시켰다. 현탁액은 25℃, 30℃ 및 40℃에서 단백질 g당 240nkat의 TYR2로 3시간 동안 처리하였다. 대조 샘플은 유사한 방식이지만 효소 없이 처리하였다.

결과는 근섬유 샘플의 TYR2 처리가 인산나트륨 완충액으로만 처리한 것보다 G'를 더 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다(도 5 참조; 하단에서 최상단까지의 선은 다음을 나타낸다: 대조군 25℃, 대조군 30℃, 대조군 40℃, TYR2 25℃, TYR2 30℃ 및 TYR2 40℃). 처리 온도의 증가는 겔 형성을 강화시켰다. 따라서, TYR2에 의해 닭의 근섬유 단백질 매트릭스에 대한 가교결합이 형성되었다.

실시예 9

Tyr2에 의한 유단백질의 겔화

3%의 시판되는 카제인염을 물과 혼합하고 0.4% GDL(글루코노-델타-락톤) 및 20nkat의 TYR2/단백질 g이 혼합물에 추가되었다. 실온에서 22시간 동안 정치시킨 후, 겔의 경도가 텍스쳐 분석기에 의해 측정되었다(도 6). 티로시나제의 처리는 카제인염 겔의 경도를 배가시켰다.

실시예 10

밀 도우의 특성에 대한 TYR2의 효과

밀 도우의 거대 변형 유동학에 대한 TYR2의 효과는 Kieffer 연성(延性) 장치(Stable Micro System, Ltd. 영국)를 이용하여 조사되었다. 도우 연성 및 신장에 대한 저항성은 효소 용량 및 도우의 정치시간의 함수로서 측정하였다.

밀가루는 12g의 밀가루 및 7.2mL의 액체 상(60%)을 이용하여 파리노그래프(Brabender, 독일)와 혼합하였다. 티로시나제(1 및 10nkat/g 밀가루)는 밀가루와 혼합하기 직전에 물에 첨가되었다. 혼합 시간은 4분이었다. 연이어서, 도우는 약 10 내지 12개의 시험 끈(string)을 제조하기 위해 주형에 놓여졌다. 압축된 주형은 스트레스 완화를 위해 실온에서 15 내지 45 분 동안 유지하였다. Kieffer 시험에서, 도우 끈은 끈의 탄성 한계를 초과하여 파열될 때까지 중심에서 신장되었다. 최대 저항성 R_max, 최대 연성 E_max 및 R_max에서의 연성 E_x는 최대치 및 신장 한계에서의 최고치 힘 및 거리를 기록하여 측정되었다. 모든 도우 제조, 효소 처리 및 측정은 실온, 약 22℃에서 수행되었다.

Kieffer 실험으로부터의 결과는 도 7 및 8에 나타냈다. 결과는 TYR2가 도우의 최대 저항성 R_max를 증가시키고, 도우의 경화를 나타내는 R_max에서의 도우 연성 E_x를 감소시킨다는 것을 보여준다. 효소 농도의 증가는 도우의 경화를 강화시켰다.

참조문헌

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Thr Met Ile Gln Tyr Gly Pro Asn Gly Val Gln Val Ile 195 200 205 Arg Asn Pro Leu Tyr Ser Tyr Ser Phe His Pro Leu Asp Gly Asp Ala 210 215 220 Leu Ile Trp Pro Pro Leu Arg Ser Trp Asn Glu Thr Lys Arg Ala Pro 225 230 235 240 Asn Thr Glu Ile Ser Gln Ala Glu Pro Pro Ser Met Asn Asp Gln Val 245 250 255 Ser Ala Ala Leu Leu Ala Arg Leu Pro Glu Ile Gln Gln Arg Leu Tyr 260 265 270 Ile Leu Phe Ser Ser Tyr His Glu Phe Asp Ser Phe Ser Asn Lys Asn 275 280 285 Tyr Ala Phe Ser Gln Asn Leu Ser His Leu Asp Ser Ile Glu Ala Val 290 295 300 His Asp Ile Ile His Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gly His Met Thr Tyr 305 310 315 320 Val Pro Leu Ser Ser Phe Asp Pro Leu Phe Phe Leu His His Ala Met 325 330 335 Thr Asp Arg Leu Ile Ser Met Trp Gln Leu Leu Asn Pro Ser Ala Trp 340 345 350 Met Thr Pro Gln Ile Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Thr Ala Leu Lys Gly 355 360 365 Thr Met Gln Asn Ser Ser Thr Pro Leu Thr Pro Phe Met Ser Ser Ala 370 375 380 Asp Gly Thr Phe Trp Asp Ser Asp Met Ser Arg Ser Thr Glu Val Phe 385 390 395 400 Gly Tyr Ala Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Val Pro Gly Asp Ser Glu Ser 405 410 415 Pro Arg Asn Lys Leu Ile Arg Lys Ile Asn Arg Trp Leu Gly Leu Asn 420 425 430 Ser Pro Ala Met Val Arg Ile Lys Ser Gln Ala Gln Asn Arg Arg Pro 435 440 445 Ser Gly Val Trp Lys Gly Asn Thr Gly Val Lys Gly Val Gln Pro Ser 450 455 460 Leu Lys Ile Asp Met Ser Asp Val Val Asp Asp His Tyr Thr Glu Trp 465 470 475 480 Ile Ala Asn Val His Val Asn His Gly Ala Leu Asp Gly Ser Phe Ser 485 490 495 Ile Tyr Phe Phe Ala Gly Lys Pro Pro Ala Asp Val Gly Thr Trp Ala 500 505 510 Phe Ala Pro Asn Leu Met Gly Ser Val Gly Ile Phe Thr Met Ser Gly 515 520 525 Met Gly Gly His His Ser Lys Met Ser Gly Ser Val Pro Leu Thr Met 530 535 540 Ala Leu Met Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Val Glu Pro 545 550 555 560 Asn Ser Val Val Ala Phe Leu Gln Ser Arg Leu His Phe Arg Ile Ala 565 570 575 Ser Ile Asp Asp Lys Glu Ile Asp Pro Ser Leu Val Ala Gly Leu Phe 580 585 590 Ile Gly Ile Ser Ser Thr Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Glu Leu Glu 595 600 605 Phe Pro Asp Trp Gly Gln Pro Met Leu Arg Leu Val Leu Trp Glu 610 615 620 <210> 4 <211> 571 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 4 Met Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Thr Val Ser 1 5 10 15 Leu Ala Gln Gly Thr Thr His Ile Pro Val Thr Gly Val Pro Val Ser 20 25 30 Pro Gly Ala Ala Val Pro Leu Arg Gln Asn Ile Asn Asp Leu Ala Lys 35 40 45 Ser Gly Pro Gln Trp Asp Leu Tyr Val Gln Ala Met Tyr Asn Met Ser 50 55 60 Lys Met Asp Ser His Asp Pro Tyr Ser Phe Phe Gln Ile Ala Gly Ile 65 70 75 80 His Gly Ala Pro Tyr Ile Glu Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Ser Gly 85 90 95 Asp Gly Trp Leu Gly Tyr Cys Pro His Gly Glu Asp Leu Phe Ile Ser 100 105 110 Trp His Arg Pro Tyr Val Leu Leu Phe Glu Gln Ala Leu Val Ser Val 115 120 125 Ala Lys Gly Ile Ala Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Val Arg Ala Lys Tyr 130 135 140 Gln Ala Ala Ala Ala Ser Leu Arg Ala Pro Tyr Trp Asp Trp Ala Ala 145 150 155 160 Asp Ser Ser Val Pro Ala Val Thr Val Pro Gln Thr Leu Lys Ile Asn 165 170 175 Val Pro Ser Gly Ser Ser Thr Lys Thr Val Asp Tyr Thr Asn Pro Leu 180 185 190 Lys Thr Tyr Tyr Phe Pro Arg Met Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Gly Glu 195 200 205 Phe Thr Gly Gly Gly Asn Asp His Thr Val Arg Cys Ala Ala Ser Lys 210 215 220 Gln Ser Tyr Pro Ala Thr Ala Asn Ser Asn Leu Ala Ala Arg Pro Tyr 225 230 235 240 Lys Ser Trp Ile Leu Val Thr Asp Thr Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Asp 245 250 255 Val Leu Thr Asn Ser Gln Asn Phe Ala Asp Phe Ala Ser Thr Ser Gly 260 265 270 Pro Gly Ile Asn Val Glu Gln Ile His Asn Ala Ile His Trp Asp Gly 275 280 285 Ala Cys Gly Ser Gln Phe Leu Ala Pro Asp Tyr Ser Gly Phe Asp Pro 290 295 300 Leu Phe Phe Met His His Ala Gln Val Asp Arg Met Trp Ala Phe Trp 305 310 315 320 Glu Ala Ile Met Pro Ser Ser Pro Leu Phe Thr Ala Ser Tyr Lys Gly 325 330 335 Gln Ser Arg Phe Asn Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ile Thr Pro Asp Ser 340 345 350 Pro Leu Gln Pro Phe Tyr Gln Ala Asn Gly Lys Phe His Thr Ser Asn 355 360 365 Thr Val Lys Ser Ile Gln Gly Met Gly Tyr Ser Tyr Gln Gly Ile Glu 370 375 380 Tyr Trp Gln Lys Ser Gln Ala Gln Ile Lys Ser Ser Val Thr Thr Ile 385 390 395 400 Ile Asn Gln Leu Tyr Gly Pro Asn Ser Gly Lys Lys Arg Asn Ala Pro 405 410 415 Arg Asp Phe Leu Ser Asp Ile Val Thr Asp Val Glu Asn Leu Ile Lys 420 425 430 Thr Arg Tyr Phe Ala Lys Ile Ser Val Asn Val Thr Glu Val Thr Val 435 440 445 Arg Pro Ala Glu Ile Asn Val Tyr Val Gly Gly Gln Lys Ala Gly Ser 450 455 460 Leu Ile Val Met Lys Leu Pro Ala Glu Gly Thr Val Asn Gly Gly Phe 465 470 475 480 Thr Ile Asp Asn Pro Met Gln Ser Ile Leu His Gly Gly Leu Arg Asn 485 490 495 Ala Val Gln Ala Phe Thr Glu Asp Ile Glu Val Glu Ile Leu Ser Lys 500 505 510 Asp Gly Gln Ala Ile Pro Leu Glu Thr Val Pro Ser Leu Ser Ile Asp 515 520 525 Leu Glu Val Ala Asn Val Thr Leu Pro Ser Ala Leu Asp Gln Leu Pro 530 535 540 Lys Tyr Gly Gln Arg Ser Arg His Arg Ala Lys Ala Ala Gln Arg Gly 545 550 555 560 His Arg Phe Ala Val Pro His Ile Pro Pro Leu 565 570 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <400> 5 gctaccgcgg atgggcttcc tcgctcgcct cac 33 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <400> 6 ctgaggatcc tcagtggtgg tggtggtggt gctcccacaa caccaatctc agcat 55 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tcatgctgtt gtcaggtccc tctcg 55 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agtggtggtg gtggtggtgc agaggaggga 60 tatggggaac ggcaaa 76

Claims (38)

1. 서열번호 3 또는 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열 또는 이의 티로시나제 활성 단편에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 티로시나제 활성을 갖는 절편을 포함하는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 트리코더마 종(Trichoderma spp.)으로부터 수득할 수 있는 단백질.
3. 제1항에 있어서, N-말단에 시그날 서열을 포함하는 단백질.
4. 티로시나제 활성을 나타내는 성숙한 단백질인 단백질.
5. 제1항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로 나타낸 서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용한 증폭에 의해 트리코더마 종의 DNA로부터 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)로부터 수득할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
7. 제1항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 포함된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
8. 제1항에 있어서, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 포함된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
9. 제1항에 있어서, 서열번호 3 또는 서열번호 4로서 나타낸 아미노산 서열의 티로시나제 활성 단편을 포함하는 단백질.
10. 제1항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 나타낸 서열을 갖는 핵산에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
11. 제1항에 있어서, 약 42.9kDa의 분자량, 약 9의 pI, 약 8 내지 8.5의 최적 pH 및 알칼리 또는 중성 pH에서의 활성을 갖는 천연 단백질인 단백질.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
13. 제12항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 포함된 서열을 갖거나 서열 번호 1 또는 서열번호 2내에 포함된 서열과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
14. 제12항 또는 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
15. 제14항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 cbh1과 같은 강력한 프로모터 하에 삽입된 발현 벡터.
16. 제14항 또는 제15항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
17. 제16항에 있어서, 사상진균 또는 효모 종인 숙주 세포.
18. 제17항에 있어서, 트리코더마 종, 바람직하게 트리코더마 리세이인 숙주 세포.
19. a) 제1항에 따른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 삽입시키는 단계,

    b) 상기 숙주 세포를 상기 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계 및

    c)임의로, 생산된 상기 단백질을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 에 따른 단백질의 생산 방법.
20. 제19항에 있어서,

    a) 서열번호 5 및 서열번호 6, 또는 서열번호 7 및 서열번호 8로서 나타낸 서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용한 증폭에 의해 트리코더마 종의 DNA로부터 수득할 수 있는, 세포외 티로시나제를 암호화하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입시키는 단계,

    b) 상기 숙주 세포를 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및

    c) 배양 배지로부터 분비된 단백질을 회수하고, 임의로 이를 정제하는 단계를 포함하는 방법.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 삽입된 DNA가 티. 리세이로부터 수득되는 방법.
22. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 트리코더마 종, 바람직하게는 티. 리세이인 방법.
23. 세포외 티로시나제 유전자의 발현을 증강시키는데 효과적인 프로모터를 숙주 세포에 삽입하는 단계, 상기 프로모터를 상기 유전자에 작동가능하게 연결시키는 단계, 상기 숙주 세포를 제1항에 따른 단백질의 발현에 적합한 조건하에 성장시키 는 단계 및 임의로 생산된 상기 단백질을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 단백질의 생산 방법.
24. 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 단백질.
25. 단백질 함유-물질을 변형시키기 위한, 티로시나제 활성을 갖는 제1항에 따른 단백질의 용도.
26. 제25항에 있어서, 단백질이 티로신-함유 단백질의 가교결합을 위해 이용되는 용도.
27. 제26항에 있어서, 단백질이 육류, 유제품, 야채 및 곡류 물질과 같은 식품 단백질의 가교결합을 위해 이용되는 용도.
28. 제25항에 있어서, 단백질이 실크, 울, 캐시미어, 알파카, 또는 사람 모발과 같은 단백질성 섬유 또는 섬유-유도된 중합체의 가교결합을 위해 이용되는 용도.
29. 티로신-함유 펩티드의 변형을 위한 제1항에 따른 단백질의 용도.
30. 티로신을 L-도파(L-Dopa)로 산화시키기 위한 제1항에 따른 단백질의 용도.
31. 단백질-함유 물질을 티로시나제 활성을 갖는 제1항에 따른 단백질과 접촉시키는, 단백질-함유 물질을 변형시키는 방법.
32. 제31항에 있어서, 티로신-함유 단백질을 가교결합시킴을 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 육류, 유제품, 야채 및 곡류 물질과 같은 식품 단백질을 가교결합시킴을 포함하는 방법.
34. 제31항에 있어서, 실크, 울, 캐시미어, 알파카, 또는 사람 모발과 같은 단백질성 섬유 또는 섬유-유도된 중합체를 가교결합시킴을 포함하는 방법.
35. 티로신-함유 펩타이드를 티로시나제 활성을 갖는 제1항에 따른 단백질과 접촉시키는, 티로신-함유 펩타이드를 변형시키는 방법.
36. 티로신을 티로시나제 활성을 갖는 제1항에 따른 단백질과 접촉시키는, 티로신을 L-도파로 산화시키는 방법.
37. 제1항에 따른 단백질을 포함하는 효소 제제.
38. 티로시나제 활성을 갖는 제1항에 따른 단백질에 의해 변형된 단백질-함유 물질.

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