WO2022270589A1 - ラッカーゼ - Google Patents

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WO2022270589A1
WO2022270589A1 PCT/JP2022/025137 JP2022025137W WO2022270589A1 WO 2022270589 A1 WO2022270589 A1 WO 2022270589A1 JP 2022025137 W JP2022025137 W JP 2022025137W WO 2022270589 A1 WO2022270589 A1 WO 2022270589A1
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laccase
protein
amino acid
present
acid sequence
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PCT/JP2022/025137
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French (fr)
Inventor
寛之 谷内
杏匠 酒井
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03002—Laccase (1.10.3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a novel laccase.
  • Laccase is an enzyme that belongs to multicopper oxidase, and catalyzes a reaction that oxidizes a substrate and uses the surplus electrons to reduce oxygen to four electrons to produce water.
  • Substrates to be oxidized by laccase typically include diphenols, as well as methoxy-substituted phenols and diamines. Since such catalytic ability can be applied to various chemical reactions, it is expected to be used in many industrial fields. Laccase is known to exist in microorganisms, plants and animals.
  • Patent Document 1 describes a thermostable laccase derived from the Trametes versicolor TV-1 strain, which exhibits the best laccase activity at pH 2.
  • WO 2005/010000 discloses the pH range in which laccases derived from Botrytis cinerea, Trametes versicolor, or other microbial sources, as well as laccases that can be purchased from commercial sources and/or produced using recombinant technology, exhibit activity. is described as being between pH 3 and pH 7.
  • Patent Document 3 describes that the optimum pH of laccase derived from microorganisms belonging to the genus Streptomyces is about 4.5, and that the activity is lost at pH 6.5.
  • laccase is expected to be widely applied in industry. Its application mode also includes the case of catalyzing an oxidation reaction under alkaline conditions.
  • laccases produced on an industrial scale and put into practical use have an action pH in the acidic to weakly acidic range, and cannot be used in the alkaline range in particular.
  • conventional laccases are limited in the pH range in which they exhibit activity, and thus cannot sufficiently meet the application conditions expected in the industrial world.
  • an object of the present invention is to provide a laccase that exhibits excellent activity in a pH range including an alkaline range.
  • Section 1 A laccase consisting of a polypeptide shown in any of the following (a) to (c): (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (b) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, inserted or deleted, and in a pH range including an alkaline range, wherein (a) A polypeptide having laccase activity equivalent to the polypeptide shown in; (c) a polypolypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 70% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a laccase activity equivalent to that of the polypeptide shown in (a) above in a pH range including an alkaline range; peptide.
  • Section 2. A DNA encoding the laccase according to Item 1.
  • Item 3. An expression cassette or recombinant vector containing the DNA according to item 2.
  • Section 4. A transformant obtained by transforming a host with the expression cassette or recombinant vector according to item 3.
  • Item 5. A method for producing laccase, comprising a step of culturing the transformant according to item 4.
  • Item 6. Item 1. An enzyme preparation containing the laccase according to item 1.
  • Item 7. The enzyme preparation according to Item 6, which is used as a protein cross-linking agent.
  • Item 8. Item 7.
  • Item 9 A method for producing a crosslinked protein, comprising the step of allowing the laccase of Item 1 to act on the protein.
  • Item 10. The production method according to Item 9, wherein the step is performed under alkaline conditions.
  • Item 11. Item 11.
  • Item 12. Oxidatively modified food or food or food material, which comprises the step of allowing the laccase described in Item 1 to act on food or food or food or food material, industrial material or industrial waste component, or pharmaceutical or scientific analysis material. , industrial materials or industrial waste components, or methods of manufacturing pharmaceutical or scientific analytical materials.
  • laccase that exhibits excellent activity in a pH range including an alkaline range is provided.
  • Paramyrothecium sp This is the result of confirming the cross-linking activity of the derived laccase for pea protein under various pH conditions including alkaline pH.
  • Paramyrothecium sp This is the result of confirming the cross-linking activity of the derived laccase for soybean protein under various pH conditions including alkaline pH.
  • Paramyrothecium sp This is the result of confirming the cross-linking activity of the derived laccase for wheat protein under various pH conditions including alkaline pH.
  • Paramyrothecium sp It is the result of examining the protein cross-linking activity when using various mediators together with the derived laccase.
  • Paramyrothecium sp. pH stability of derived laccase (MM13-F2103) is shown.
  • Paramyrothecium sp Temperature stability of derived laccase (MM13-F2103) is shown. Paramyrothecium sp. Optimum pH of derived laccase (MM13-F2103) is shown. Paramyrothecium sp. Optimal temperature of derived laccase (MM13-F2103) is shown. Paramyrothecium sp. The appearance of the meat-like processed food (MM13-derived) produced using the derived laccase is shown in comparison with the appearance of the meat-like processed food (without enzyme treatment) produced without using the laccase.
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • Laccase The laccase of the present invention comprises a polypeptide shown in any one of (a) to (c) below.
  • SEQ ID NO: 1 is Paramyrothecium sp. 1 is the amino acid sequence of the laccase from which it was derived.
  • polypeptides (b) and (c) are laccases similar in sequence to the amino acid sequence of the polypeptide (a) as a basic skeleton.
  • the amino acid modification introduced into the polypeptide of (b) above may include only one type of modification (e.g., substitution) selected from substitutions, additions, insertions, and deletions. may include modifications (eg, substitutions and insertions) of
  • the number of amino acids to be substituted, added, inserted or deleted may be one or more or several, for example 1 to 10, preferably 1 to 8, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1, 2, or 1.
  • sequence identity may be 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98%. Above, more preferably 99% or more, particularly preferably 99.5% or more, most preferably 99.8% or more.
  • sequence identity refers to the sequence identity calculated by comparison with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity refers to the bl2seq program of BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] Microbiol.Lett., Vol.174, p247-250, 1999).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • amino acid substitutions introduced into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include, for example, if the amino acid before substitution is a nonpolar amino acid, other nonpolar amino acids If the amino acid before substitution is a non-charged amino acid, it is substituted with another non-charged amino acid, if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, it is substituted with another acidic amino acid, and the amino acid before substitution is If it is a basic amino acid, it may be substituted with other basic amino acids.
  • amino acid addition When amino acid addition is introduced into the polypeptides of (b) and (c) above, examples of aspects of amino acid addition include addition of a methionine residue to the N-terminus, purification tags (e.g., binding properties such as oligohistidine) oligopeptide), and the like.
  • purification tags e.g., binding properties such as oligohistidine
  • polypeptides of (b) and (c) include not only polypeptides obtained by artificial mutation, but also naturally occurring mutations (mutants) based on individual differences in organisms from which the polypeptides are derived or differences in species. or variants) are also included.
  • alkaline range refers to a pH range of more than 8.5, preferably pH 9 or higher.
  • laccase activity refers to at least an activity that catalyzes a reaction that produces a crosslinked protein when a protein is used as a substrate (that is, protein crosslinking activity). Specifically, protein cross-linking activity is measured as follows.
  • a supernatant is obtained as a protein solution by suspending and mixing the protein material in an alkaline pH buffer solution to 15% (w/v) and centrifuging. 100 ⁇ l of this protein solution, 97 ⁇ l of alkaline pH buffer, and 3 ⁇ l of 200 mM DL-catechin (as a mediator) are mixed to obtain a substrate solution. 20 ⁇ l of this substrate solution and 10 ⁇ l of enzyme (used so that the concentration of laccase is 1.7 ⁇ g/ml in protein concentration) are mixed and reacted at 37° C. for 18 hours. Thereafter, the reaction solution is diluted 10-fold and subjected to SDS-PAGE. The degree of protein cross-linking activity can be evaluated by the amount of high-molecular weight protein (that is, protein polymerized by cross-linking, appearing as a band at the origin) in SDS-PAGE.
  • DNA A DNA encoding the laccase of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the DNA of the present invention") can be appropriately prepared and designed by those skilled in the art according to the amino acid sequence of the laccase of the present invention. .
  • examples of the DNA encoding the laccase of the present invention include DNA shown in any of (i) to (iii) below.
  • DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2; (ii) a DNA comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2; (iii) A DNA comprising a nucleotide sequence having 70% or more homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the DNAs (ii) and (iii) are DNAs similar in sequence to the base sequence of the DNA (i).
  • stringent conditions means 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhartz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400] and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA in 6xSSC (1xSSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) at 50-65°C. Refers to conditions for keeping warm for 4 hours to overnight.
  • Hybridization under stringent conditions is specifically performed by the following method. That is, a nylon membrane on which a DNA library or cDNA library was immobilized was prepared and incubated at 65° C. in a prehybridization solution containing 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardts, 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA. Block the nylon membrane. After that, each 32 P-labeled probe is added and incubated overnight at 65°C. This nylon membrane was placed in 6 ⁇ SSC at room temperature for 10 minutes, in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes, and in 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at 45° C. for 30 minutes. After washing, autoradiography can be performed to detect DNA specifically hybridizing with the probes.
  • the homology may be 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, even more preferably 95% or higher, still more preferably 98% or higher, and more preferably 98% or higher. More preferably 99% or more, particularly preferably 99.5% or more, most preferably 99.8% or more.
  • the "homology" of the nucleotide sequence refers to the BLAST PACKAGE [sgi32 bitedition, Version 2.0.12; Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, 247-250, 1999).
  • the parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • a base sequence encoding a purification tag for example, a binding oligopeptide such as oligohistidine
  • a purification tag for example, a binding oligopeptide such as oligohistidine
  • the DNA of the present invention can be prepared, for example, by using, as a template, a DNA encoding any of the polypeptides of (a) to (c), and at least one of the polypeptides of (a) to (c). can be obtained by obtaining the region encoding the by PCR or the like.
  • the DNA encoding the laccase of the present invention can be artificially synthesized by a gene synthesis method.
  • a specific mutation is introduced into a specific site of a base sequence
  • the method of introducing mutation is known, and for example, site-specific mutagenesis of DNA can be used.
  • a specific method for converting bases in DNA for example, a commercially available kit can be used.
  • DNA with mutations introduced into the base sequence can be confirmed using a DNA sequencer. Once the nucleotide sequence is determined, then chemical synthesis, PCR using the cloned probe as a template, or hybridization using a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe to obtain the DNA encoding the laccase. can be done.
  • the DNA of the present invention is preferably one whose codon usage frequency is optimized for the host.
  • a DNA whose codon usage frequency is optimized for E. coli is suitable.
  • expression cassette or recombinant vector containing DNA encoding the laccase of the present invention (hereinafter also referred to as "expression cassette of the present invention” or “recombinant vector of the present invention”) is It includes DNA encoding the laccase of the invention.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating a promoter and a terminator to the DNA of the present invention, or by inserting the expression cassette or the DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention may contain transcription elements such as promoters and terminators, as well as enhancers, CCAAT boxes, TATA boxes, and SPI sites, as required. These regulatory factors need only be operably linked to the DNA of the present invention.
  • operably linked means that various control factors that regulate the DNA of the present invention and the DNA of the present invention are linked in a state in which they are operable in host cells.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention may be configured to further contain a protease recognition sequence and an N-terminal sequence and/or a C-terminal sequence.
  • expression vector those constructed for genetic recombination from phages, plasmids, or viruses that are capable of autonomous replication within the host are suitable. Such expression vectors are known, and suitable combinations with host cells can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • pBluescript (pBS) II SK (-) manufactured by Stratagene
  • pSTV-based vector manufactured by Takara Bio
  • pUC-based vector manufactured by Takara Bio
  • pET-based vector Merck
  • pGEX vector GE Healthcare
  • pHY300PLK Tekara Bio
  • pUB110 Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15 (2 ), pp.
  • pBR322 manufactured by Takara Bio
  • pRS403 manufactured by Stratagene
  • pMW218/219 manufactured by Nippon Gene.
  • pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • P66 Chlamydomonas Center
  • P-322 Cholamydomonas Center
  • pPha-T1 Yangmin Gong, et al., Journal of Basic Microbiology, 2011, vol.51, p.666-672
  • pJET1 manufactured by Cosmo Bio
  • pRI-based vectors manufactured by Takara Bio
  • pBI-based vectors manufactured by Clontech
  • IN3-based vectors manufactured by Implanta Innovations
  • Transformant A transformant (hereinafter sometimes referred to as “the transformant of the present invention") is obtained by transforming a host with the expression cassette or recombination vector of the present invention.
  • the host used for the production of the transformant is not particularly limited as long as it can introduce a gene, can grow autonomously, and can express the trait of the gene of the present invention.
  • Examples include Escherichia coli.
  • Preferable examples include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Bacillus subtilis, Pseudomonas such as Pseudomonas putida; , but animal cells, insect cells, plant cells and the like may also be used. Among these, Escherichia coli is particularly preferred.
  • Paramyrothecium sp. may be
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression cassette or recombinant vector of the present invention into a host.
  • the place where the DNA of the present invention is introduced is not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and may be on a plasmid or genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention include, for example, recombinant vector methods and genome editing methods.
  • the conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector of the present invention into the host may be appropriately set according to the type of host.
  • the host is a microorganism, for example, a method using competent cells by calcium ion treatment, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like can be used.
  • the host is an animal cell, for example, the electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.
  • the host is an insect cell, for example, the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like can be used.
  • the host is a plant cell, for example, the electroporation method, the Agrobacterium method, the particle gun method, the PEG method and the like can be used.
  • the laccase of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention. Moreover, the laccase of the present invention is Paramyrothecium sp. It can also be produced by culturing itself (not transformed).
  • the culture conditions for the transformants or derived bacteria or derived cells of the present invention may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the host or derived bacteria or derived cells, preferably liquid culture. Further, in the case of industrial production, aeration and agitation culture is preferable.
  • the transformant or derived bacteria or derived cells of the present invention are cultured, and the culture solution is collected by a method such as centrifugation to recover the culture supernatant or cultured cells or cultured cells. If the laccase of the present invention is accumulated in cultured bacteria or cultured cells, the bacteria or cells are treated with ultrasonic waves, a mechanical method such as French press, or a lytic enzyme such as lysozyme.
  • the water-soluble fraction containing the laccase of the present invention can be obtained by solubilization by using an enzyme such as protease or a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the expressed laccase of the present invention may be secreted into the culture medium.
  • the culture medium, the water-soluble fraction, or the protease-treated product containing the laccase of the present invention obtained as described above may be directly subjected to a purification treatment, but the culture medium, the water-soluble fraction, or the protease-treated product may be purified. After concentrating the laccase of the present invention in the product, it may be subjected to a purification treatment.
  • Concentration can be performed, for example, by vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment, fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent (eg, methanol, ethanol, and acetone), or the like.
  • a hydrophilic organic solvent eg, methanol, ethanol, and acetone
  • the purification treatment of the laccase of the present invention can be performed, for example, by appropriately combining methods such as gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the laccase of the present invention thus purified may be pulverized by freeze-drying, vacuum-drying, spray-drying, etc., if necessary.
  • the laccase of the present invention can be provided in the form of an enzyme preparation. Accordingly, the present invention also provides an enzyme preparation containing the above-described laccase of the present invention.
  • the content of the laccase of the present invention in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set within a range in which the laccase activity is exhibited.
  • the enzyme preparation of the present invention may contain other ingredients in addition to the laccase of the present invention to the extent that the effects of the present invention are not affected.
  • examples of other components include enzymes other than the laccase of the present invention, mediators, additives, and culture residue produced by the above production method.
  • enzymes can be appropriately determined depending on the intended use. galactosidase, ⁇ -galactosidase), protease (acid protease, neutral protease, alkaline protease), peptidase (leucine peptidase, aminopeptidase), lipase, esterase, cellulase, phosphatase (acid phosphatase, alkaline phosphatase), nuclease, deaminase, oxidase, Dehydrogenase (other than the above active ingredients), glutaminase, pectinase, catalase, dextranase, transglutaminase, protein deamidase, pullulanase and the like. These other enzymes may be contained singly or in combination of multiple types.
  • mediators examples include 3-(3,4-dihydroxyphenyl)alanine (DOPA), catechin, and caffeine. These mediators may be contained singly or in combination of multiple types.
  • DOPA 3-(3,4-dihydroxyphenyl)alanine
  • catechin catechin
  • caffeine caffeine
  • the additive can be appropriately determined according to the use of the laccase of the present invention and the formulation form of the enzyme preparation. Salt solution etc. are mentioned.
  • Excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol, pectin and the like.
  • Buffers include phosphate, citrate, acetate and the like.
  • Stabilizers include propylene glycol, ascorbic acid and the like.
  • Preservatives include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like.
  • antiseptics include ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like.
  • the culture residue includes medium-derived components, contaminant proteins, fungal components, cell components, and the like.
  • the formulation form of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquid and solid forms (powder, granules, etc.). These formulation forms of enzyme preparations can be prepared by generally known methods.
  • the enzyme preparation of the present invention can be used as a cross-linking agent for proteins, and can also be used for the oxidative modification of foods and beverages, materials for foods and beverages, industrial materials, industrial waste components, or materials for pharmaceuticals or scientific analysis. It can also be used as a substance.
  • the target of oxidative modification and the details of oxidative modification are as described in "7. Use of laccase" below.
  • laccases of the present invention can be used in any application that utilizes a variety of incidental chemical reactions resulting from oxidation of a substrate and/or radical species of reaction intermediates produced by the oxidation.
  • oxidation reactions or concomitant chemical reactions are oxidation of phenolic compounds such as o-, p-diphenol, urushiol, laccol; oxidation of aromatic amines such as p-phenylenediamine; decomposition of lignin. ; tyrosine side chain (phenolic hydroxyl group), cysteine side chain (sulfhydryl group), lysine side chain ( ⁇ -amino group), histidine side chain (imidazole group), etc. be done.
  • chemically changing a substrate by such an oxidation reaction of laccase and accompanying chemical reactions is also referred to as "oxidative modification”.
  • the present invention also provides a method for producing a crosslinked protein, comprising the step of allowing the laccase of the present invention to act on the protein.
  • mediators such as 3-(3,4-dihydroxyphenyl)alanine (DOPA), catechin, and caffeine are replaced with laccase in the process. It is preferable to use in combination with These mediators may be contained singly or in combination of multiple types.
  • the reaction conditions e.g., amount of enzyme, reaction time, reaction pH, reaction temperature, etc.
  • the reaction conditions e.g., amount of enzyme, reaction time, reaction pH, reaction temperature, etc.
  • the desired degree of protein crosslinking is achieved.
  • those skilled in the art can appropriately set it according to the type and/or concentration of the laccase of the present invention, the type and/or concentration of the protein, and/or the desired degree of protein cross-linking.
  • the reaction pH is preferably above 8.5, more preferably 9 or above.
  • the upper limit of the reaction pH is, for example, 12 or less, preferably 11 or less, more preferably 10 or less, and still more preferably 9.5 or less.
  • the laccase used in the method for producing a crosslinked protein of the present invention preferably exhibits excellent laccase activity not only in the alkaline range but also in the neutral range. , or 8 or more.
  • the upper limit of the reaction pH is, for example, 12 or less, preferably 11 or less, more preferably 10 or less, still more preferably 9.5 or less, 9 or less, or 8.5 or less.
  • reaction temperature is 4 to 45°C, more preferably 25 to 40°C.
  • Process for producing oxidatively modified foods and beverages, materials for foods, industrial materials, industrial waste components, or materials for pharmaceuticals or scientific analysis examples include industrial materials or industrial waste components, or materials for pharmaceuticals or scientific analysis. Therefore, the present invention further provides an oxidatively modified food or drink material, an industrial material or an industrial waste component, or a pharmaceutical or scientific analysis material, which comprises the step of allowing the laccase of the present invention to act. Also provided is a method for producing food or beverage materials, industrial materials or industrial waste components, or pharmaceutical or scientific analysis materials.
  • Examples of oxidative modification of food or food materials include cross-linking of proteins, improvement of binding properties of textured vegetable proteins, thickening or gelling of foods, browning treatment of black tea, removal of bitterness and astringency of foods. etc.
  • Examples of oxidative modification of industrial materials or components of industrial waste include production of artificial lacquer, removal of lignin from pulp, detoxification of waste liquids containing highly toxic phenolic compounds and/or aromatic amines, and synthesis of organic compounds. , production of adhesives, and synthesis of concrete admixtures.
  • Examples of oxidative modification of materials for pharmaceuticals or scientific analysis include conversion of analyte components into sensing components, cross-linking of analyte proteins, and the like.
  • the step Preferably, the mediator is used in combination with laccase.
  • mediators that can be used are as described above in “7-1. Production method of crosslinked protein”.
  • reaction conditions for example, the amount of enzyme, reaction time, reaction pH, reaction temperature, etc.
  • reaction pH and reaction temperature are as described in the above “7-1. Method for producing crosslinked protein”.
  • Test Example 1 Culture and Enzyme Purification (1-1) Culture and Filtration Paramyrothecium sp. grown on potato dextrose agar medium at 30° C. for 3 days in a 500 ml shake flask containing 100 ml of the laccase production medium shown in Table 1. A 1 cm square section of a colony of the MM13-F2103 strain (country of origin: Sri) was inoculated and cultured with reciprocating shaking (140 r/min) at 30° C. for 3 days. After solid-liquid separation of the culture solution by centrifugation, the supernatant was filtered off, and the collected filtrate was used as a crude enzyme solution.
  • ⁇ Confirmation of laccase activity-oxidation of ABTS 20 ⁇ l of a 50 mM solution of ABTS (2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) as substrate, 160 ⁇ l of 125 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the enzyme 20 ⁇ l of the solution was added to a microplate, mixed, reacted at 37°C for 15 minutes, and the absorbance at 405 nm was measured before and after the reaction. The presence of laccase activity was confirmed by confirming the oxidation of ABTS.
  • Test Example 2 Evaluation of enzyme properties (2-1) Evaluation of laccase activity (protein cross-linking activity) Paramyrothecium sp.
  • the purified laccase obtained from the MM13-F2103 strain and the comparative laccase "Laccase Y120" manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd. (also referred to as LC-Y120) were obtained from the three plants shown in Table 2, respectively.
  • Plant protein powder was adjusted to 15% (w/v) with a predetermined pH buffer [50 mM Na citrate buffer (pH 3.0 or 5.0), 50 mM Na phosphate buffer (pH 7.0), 0), or 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)] and mixed well, followed by solid-liquid separation by centrifugation at 12,000 x g for 5 minutes to obtain a supernatant as a protein solution. . 100 ⁇ l of this protein solution, 97 ⁇ l of the above-mentioned predetermined pH buffer solution, and 3 ⁇ l of 200 mM DL-catechin (mediator) were mixed to obtain a substrate solution.
  • a predetermined pH buffer 50 mM Na citrate buffer (pH 3.0 or 5.0), 50 mM Na phosphate buffer (pH 7.0), 0), or 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)
  • the amount of the crosslinked protein was evaluated by the number of "+". The greater the number of "+”s, the greater the amount of crosslinked protein produced. The results are shown in Figures 1-3.
  • the amount of the crosslinked protein can also be quantified using image analysis software such as imageJ.
  • the leftmost lane (lane 1 in FIGS. 1 and 2, blank lane in FIG. 3) represents the results of a control to which no enzyme was added, and the middle lane (lane 2 in FIGS. 1 and 2) , "LCY120" lane in FIG. 3) represents the results when the laccase for comparison was used, and the rightmost lane (lane 3 in FIGS. 1 and 2, "MM2103" lane in FIG. 3) represents Paramyrothecium sp. Shows the results when using the purified laccase obtained from the MM13-F2103 strain.
  • the relative value of the enzyme activity value after pH treatment was derived as the residual activity (%) when the enzyme activity value at the treatment pH that showed the highest residual activity was taken as 100%.
  • the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 5, Paramyrothecium sp.
  • the laccase obtained from the MM13-F2103 strain had significantly improved stability in the alkaline region compared to the commercially available laccase LC-Y120.
  • the enzymatic activity value was measured by defining the enzymatic activity that catalyzes the oxidation of 1 ⁇ mol of ABTS per minute as 1 unit (U).
  • a relative activity value was derived when the enzyme activity value at the optimum temperature of LC-Y120 was taken as 100%. The results are shown in FIG.
  • Test Example 3 Sequence identification Paramyrothecium sp. Laccase obtained from strain MM13-F2103 was sequenced. As a result, the sequence (2018 bp) shown in SEQ ID NO: 3 as the gene sequence, the sequence (1764 bp) shown in SEQ ID NO: 2 as the coding region sequence, and the sequence (587 aa) shown in SEQ ID NO: 1 as the amino acid sequence were determined.
  • Test Example 4 Improving Adhesion of Textured Vegetable Protein Granular soybean protein (manufactured by Marukome Co., Ltd.) was added with warm water (40° C.) of 5 times its weight and allowed to stand for 10 minutes to swell. After removing moisture, 25 g of swollen granular soybean protein was weighed. The swollen granular soybean protein was mixed with 2.75 g of powdered pea protein (NUTRALYS F85M manufactured by Rocket Co.), and Paramyrothecium sp. About 250 U (about 10 U per gram of swollen granular soy protein) of purified laccase obtained from strain MM13-F2103 was added to prepare a soy protein mixture. The soy protein mixture was mixed well and formed into a hamburger shape and allowed to stand at 25°C for 60 minutes. After baking in an oven at 190°C for 15 minutes, a meat-like processed food was obtained.
  • NUTRALYS F85M powdered pea protein
  • FIG. 9 shows a meat-like processed food (without enzyme treatment) obtained in the same manner except that laccase was not used. As shown in FIG. 9, no binding was observed in the case of no enzyme treatment, whereas binding was confirmed in the case of treatment with the laccase derived from the MM13 strain.
  • Test Example 5 Thickening of protein solution
  • the pea protein powder used in Test Example 2 was adjusted to 15% (w/v) with a buffer solution of a predetermined pH [50 mM Na citrate buffer (pH 3.0 or 5 .0), 50 mM Na phosphate buffer (pH 7.0), or 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)] to obtain a pea protein suspension.
  • Paramyrothecium sp. was added to this pea protein suspension.
  • Purified laccase obtained from MM13-F2103 strain or laccase LC-Y120 for comparison 0.1 mg / ml in terms of protein weight and 5 mg / ml protein glutaminase are added, pH 3, 5, 7, or The reaction was carried out at 37° C. for 18 hours under the conditions of 9.
  • the properties of the reactants were evaluated as "-" when there was no change in physical properties, and as "+” when thickening was observed. Table 4 shows the results.

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Abstract

本発明は、アルカリ域を含むｐＨ領域で優れた活性を呈するラッカーゼを提供する。Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来のラッカーゼのアミノ酸配列からなるラッカーゼ及び当該アミノ酸配列を基本骨格とする配列類似のラッカーゼは、アルカリ域を含むｐＨ領域で優れた活性を呈する。

Description

ラッカーゼ
　本発明は、新規のラッカーゼに関する。
　ラッカーゼは、マルチ銅オキシダーゼに属する酵素であり、基質を酸化し、余った電子によって酸素を４電子還元して水を生成する反応を触媒する。ラッカーゼの酸化対象基質としては、典型的にはジフェノールが挙げられるほか、メトキシ置換されたフェノール及びジアミン等も挙げられる。このような触媒能力は、様々な化学反応に応用できるため、多くの産業界で利用できることが期待されている。ラッカーゼは、微生物、植物、動物において存在することが知られている。
　例えば、特許文献１には、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　ＴＶ－１株由来の熱安定性ラッカーゼが記載されておりｐＨ２で最良のラッカーゼ活性を呈することが記載されている。
　特許文献２は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ又はその他の微生物源由来のラッカーゼ、ならびに商業的販売源から購入することができるラッカーゼ及び／又は組換え技術を用いて生成されたラッカーゼが活性を呈するｐＨ範囲が、ｐＨ３～ｐＨ７であることが記載されている。
　特許文献３には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物由来のラッカーゼの至適ｐＨが約４．５であり、ｐＨ６．５で活性が無くなることが記載されている。
国際公開第９８／５５６２８号 特開２００１－１０３９８９号公報 特開２００２－１７１９６８号公報
　上述のとおり、ラッカーゼは産業界で広く適用されることが期待されている。そして、その適用態様には、アルカリ条件下での酸化反応を触媒する場合も含まれる。しかしながら、現状、工業規模で生産され実用化されたラッカーゼの作用ｐＨは酸性域から弱酸性域にあり、特にアルカリ性域では使用不可である。このように、これまでのラッカーゼでは活性を呈するｐＨ領域が限定されるため、産業界で期待される適用態様に十分追随できない。
　そこで、本発明は、アルカリ域を含むｐＨ領域で優れた活性を呈するラッカーゼを提供することを目的とする。
　本発明者は、鋭意検討の結果、非公知の菌株ライブラリの中から、偶然にも、アルカリ域で活性を呈するラッカーゼを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに示すポリペプチドからなる、ラッカーゼ：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド。
項２．　項１に記載のラッカーゼをコードするＤＮＡ。
項３．　項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
項４．　項３に記載の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項５．　項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ラッカーゼの製造方法。
項６．　項１に記載のラッカーゼを含む酵素製剤。
項７．　タンパク質の架橋剤として用いられる、項６に記載の酵素製剤。
項８．　飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の酸化改質剤として用いられる、項６に記載の酵素製剤。
項９．　タンパク質に、項１に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む、架橋タンパク質の製造方法。
項１０．　前記工程をアルカリ性条件下で行う、項９に記載の製造方法。
項１１．　前記工程において、前記ラッカーゼに、３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）アラニン、カテキン、及びカフェイン酸からなる群より選択されるメディエータを併用する、項９または１０に記載の製造方法。
項１２．　飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材に、項１に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む、酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法。
　本発明によれば、アルカリ域を含むｐＨ領域で優れた活性を呈するラッカーゼが提供される。
Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼの、エンドウタンパク質に対する架橋活性を、アルカリ域ｐＨを含む様々なｐＨ条件下で確認した結果である。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼの、大豆タンパク質に対する架橋活性を、アルカリ域ｐＨを含む様々なｐＨ条件下で確認した結果である。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼの、小麦タンパク質に対する架橋活性を、アルカリ域ｐＨを含む様々なｐＨ条件下で確認した結果である。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼに様々なメディエータを併用した場合のタンパク質架橋活性を調べた結果である。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼ（ＭＭ１３－Ｆ２１０３）のｐＨ安定性を示す。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼ（ＭＭ１３－Ｆ２１０３）の温度安定性を示す。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼ（ＭＭ１３－Ｆ２１０３）の至適ｐＨを示す。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼの至適温度（ＭＭ１３－Ｆ２１０３）を示す。 Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来ラッカーゼを用いて製造した肉様加工食品（ＭＭ１３由来）の外観を、ラッカーゼを用いずに製造した肉様加工食品（酵素処理なし）の外観と対比して示す。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
１．ラッカーゼ
　本発明のラッカーゼは、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに示すポリペプチドからなる。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド。
　以下、（ａ）～（ｃ）のポリペプチドからなるラッカーゼについて詳述する。
　配列番号１は、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．由来のラッカーゼのアミノ酸配列である。
　（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドは、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列を基本骨格とする配列類似のラッカーゼである。
　前記（ｂ）のポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変については、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（ｂ）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１０個、好ましくは１～８個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
　また、前記（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、一層好ましくは９８％以上、より一層好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
　ここで、前記（ｃ）のポリペプチドにおいて、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における第１２６位、第１２８位、第１６６位、第１６８位、第４２９位、第４３２位、第４３４位、第４８４位、第４８５位、第４８６位、第４９０位、第４９５位のアミノ酸は、活性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドにアミノ酸付加が導入される場合、アミノ酸付加の態様として、例えば、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加、精製用タグ（例えば、オリゴヒスチジン等の結合性オリゴペプチド）の付加等が挙げられる。
　前記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドには、人為的に変異させて得られるポリペプチドのみならず、ポリペプチドが由来する生物の個体差又は種の違いに基づく、天然に生じる変異（ミュータント又はバリアント）によって生じるポリペプチドも含まれる。
　前記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドについて、「アルカリ域」とは、ｐＨ８．５超、好ましくはｐＨ９以上の領域をいう。
　また、本発明において「ラッカーゼ活性」とは、少なくとも、タンパク質を基質とした場合に架橋タンパク質を生成する反応を触媒する活性（つまり、タンパク質架橋活性）をいう。具体的には、タンパク質架橋活性は、次のように測定される。
　タンパク質材料を１５％（ｗ／ｖ）となるよう、アルカリ域ｐＨの緩衝液に懸濁混合し、遠心分離を行うことで、上清をタンパク質溶液として得る。このタンパク質溶液１００μｌと、アルカリ域ｐＨの緩衝液９７μｌと、２００ｍＭのＤＬ－カテキン（メディエータとして）３μｌとを混合し、これにより基質溶液を得る。この基質溶液２０μｌと酵素１０μｌ（ラッカーゼの濃度が、タンパク質濃度で１．７μｇ／ｍｌとなるように用いる。）とを混合し、３７℃、１８時間にて反応させる。その後、反応液を１０倍希釈してＳＤＳ－ＰＡＧＥに供する。タンパク質架橋活性の程度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける高分子タンパク質（つまり、架橋により高分子化したタンパク質。原点におけるバンドとして表れる。）の量で評価できる。
　さらに、「（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有する」とは、タンパク質を基質とした場合に、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの作用により生じさせる架橋タンパク質の量が、（ａ）のポリペプチドが生じさせる架橋タンパク質の量の８０～１２０％であることをいう。
２．ＤＮＡ
　本発明のラッカーゼをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、当業者であれば、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列に従って適宜調製及び設計することができる。
２－１．ＤＮＡの設計
　本発明のラッカーゼをコードしているＤＮＡの塩基配列については、当業者であれば、本発明のラッカーゼにおいて述べたアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。
　具体的には、本発明のラッカーゼをコードしているＤＮＡの例としては、以下の（i）～（iii）のいずれかに示すＤＮＡが挙げられる。
（i）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ii）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列からなるＤＮＡ；
（iii）配列番号２に示される塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
　以下、（i）～（iii）のＤＮＡについて詳述する。
　配列番号２に示される塩基配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
　（ii）及び（iii）のＤＮＡは、（i）のＤＮＡの塩基配列を基本骨格とする配列類似のＤＮＡである。
　前記（ii）のＤＮＡにおいて、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　前記（iii）のＤＮＡにおいて、上記相同性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、一層好ましくは９８％以上、より一層好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
　ここで、塩基配列の「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．　Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７－２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（ii）及び（iii）のＤＮＡにおいては、前記（i）のＤＮＡに、精製用タグ（例えば、オリゴヒスチジン等の結合性オリゴペプチド）をコードする塩基配列の少なくともいずれかがさらに付加していてもよい。
２－２．ＤＮＡの調製
　本発明のＤＮＡは、例えば、前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードしているＤＮＡを鋳型として、少なくとも前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードしている領域をＰＣＲ等によって取得することにより得ることができる。また、本発明のラッカーゼをコードしているＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
　また、塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する場合、変異導入方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ラッカーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
　また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ラッカーゼをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ラッカーゼをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
　本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
３．発現カセット又は組換えベクター
　本発明のラッカーゼをコードしているＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター（以下、「本発明の発現カセット」又は「本発明の組換えベクター」とも表記する）は、本発明のラッカーゼをコードするＤＮＡを含む。本発明の発現カセット又は組換えベクターは、本発明のＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本発明の発現カセット若しくは本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の発現カセット又は組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。また、本発明の発現カセット又は組換えベクターは、さらにプロテアーゼ認識配列とＮ末端配列及び／又はＣ末端配列とを含むように構成されてもよい。
　発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、宿主細胞との適切な組み合わせを当業者が適宜選択して用いることができる。例えば、微生物を宿主とする場合には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）　ＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＴＶ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ　１５（２），ｐ．９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＲＳ４０３（ストラタジーン社製）、及びｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、Ｐ６６（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｐ－３２２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＰｈａ－Ｔ１（Ｙａｎｇｍｉｎ　Ｇｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．５１，ｐ．６６６－６７２参照）、又はｐＪＥＴ１（コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。植物細胞を宿主とする場合には、ｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ社製）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック社製）、及びＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。
４．形質転換体
　本発明の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって、形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本発明の遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；放線菌等；酵母等；糸状菌等の微生物が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、本発明のラッカーゼの由来菌又は由来細胞であるＰａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．であってもよい。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の発現カセット又は組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。
　宿主に本発明の発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が微生物の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
５．ラッカーゼの製造方法
　本発明のラッカーゼは、前記本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。また、本発明のラッカーゼは、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．そのもの（形質転換されていないもの）を培養することによって製造することもできる。
　本発明の形質転換体若しくは由来菌又は由来細胞の培養条件は、宿主若しくは由来菌又は由来細胞の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
　本発明の形質転換体若しくは由来菌又は由来細胞を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清若しくは培養菌体又は培養細胞を回収する。本発明のラッカーゼが培養菌体内又は培養細胞内に蓄積されている場合であれば、菌体又は細胞を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のラッカーゼを含む水溶性画分を得ることができる。
　また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のラッカーゼを培養液中に分泌させてもよい。
　上記のようにして得られた本発明のラッカーゼを含む培養液、水溶性画分、又はプロテアーゼ処理物は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液、水溶性画分、又はプロテアーゼ処理物中の本発明のラッカーゼを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
　濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　本発明のラッカーゼの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　このようにして精製された本発明のラッカーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．酵素製剤
　本発明のラッカーゼは、酵素製剤の形態で提供されることができる。したがって、本発明は、上記本発明のラッカーゼを含む酵素製剤も提供する。
　本発明の酵素製剤における上記本発明のラッカーゼの含有量としては特に限定されず、ラッカーゼ活性が発揮される範囲で適宜設定することができる。
　本発明の酵素製剤は、上記本発明のラッカーゼ以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、上記本発明のラッカーゼ以外の他の酵素、メディエータ、添加剤、上記製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
　他の酵素としては、その用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ（上記有効成分以外）、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、タンパク質脱アミド酵素、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　メディエータとしては、例えば、３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）アラニン（ＤＯＰＡ）、カテキン、及びカフェイン等が挙げられる。これらのメディエータは、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　添加剤としては、上記本発明のラッカーゼの用途及び酵素製剤の製剤形態に応じて適宜決定することができるが、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール、ぺクチン等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分、細胞成分等が挙げられる。
　本発明の酵素製剤の製剤形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。これらの製剤形態の酵素製剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
　本発明の酵素製剤は、具体的には、タンパク質の架橋剤として用いることができ、また、飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の酸化改質剤としても用いることができる。酸化改質の対象及び酸化改質の詳細については、後述の「７．ラッカーゼの使用」において述べる通りである。
７．ラッカーゼの使用
　本発明のラッカーゼは、基質の酸化反応及び／又は当該酸化反応により生成される反応中間体のラジカル種に起因する多様な付随的化学反応を利用する任意の用途に用いることができる。このような酸化反応又は付随的化学反応の例としては、ｏ－，ｐ－ジフェノール、ウルシオール、ラッコール等のフェノール性化合物の酸化；ｐ－フェニレンジアミン等の芳香族アミンの酸化；リグニンの分解；チロシン側鎖（フェノール性水酸基）、システイン側鎖（スルフヒドリル基）、リジン側鎖（ε－アミノ基）、ヒスチジン側鎖（イミダゾール基）等の酸化されやすい官能基を有するタンパク質の架橋等が挙げられる。本明細書では、このようなラッカーゼの酸化反応及び付随的化学反応により基質を化学的に変化させることを、「酸化改質」とも記載する。
７－１．架橋タンパク質の製造方法
　上記の酸化改質の態様の中でも、特に好ましくは、タンパク質の架橋により変化させることが挙げられる。従って、本発明は、タンパク質に上記の本発明のラッカーゼを作用させる工程を含む、架橋タンパク質の製造方法も提供する。
　本発明の架橋タンパク質の製造方法においては、反応効率をより一層向上させる観点から、当該工程において、３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）アラニン（ＤＯＰＡ）、カテキン、及びカフェイン等のメディエータをラッカーゼと併用することが好ましい。これらのメディエータは、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　本発明の架橋タンパク質の製造方法において、ラッカーゼとタンパク質との反応条件（例えば、酵素量、反応時間、反応ｐＨ、反応温度等）については、所望の程度にタンパク質架橋が達成される限り特に制限されず、本発明のラッカーゼの種類及び／又は濃度、タンパク質の種類及び／又は濃度、並びに／若しくは、所望のタンパク質架橋の程度等に応じて当業者が適宜設定することができる。
　本発明の架橋タンパク質の製造方法において用いられるラッカーゼは、少なくともアルカリ域で優れたラッカーゼ活性を呈するため、反応ｐＨとしては、好ましくは８．５超、より好ましくは９以上が挙げられる。当該反応ｐＨの上限としては、例えば１２以下、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは９．５以下が挙げられる。
　なお、本発明の架橋タンパク質の製造方法において用いられるラッカーゼは、好ましくは、アルカリ域だけでなく中性域でも優れたラッカーゼ活性を呈するため、反応ｐＨとしては、例えば５以上、６以上、７以上、又は８以上であってもよい。当該反応ｐＨの上限としては、例えば１２以下、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは９．５以下、９以下、又は８．５以下が挙げられる。
　また、反応温度の好ましい例としては、４～４５℃、より好ましくは２５～４０℃が挙げられる。
７－２．酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法
　上記の酸化改質の対象物としては、飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材等が挙げられる。従って、本発明は、さらに、飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材に、上記の本発明のラッカーゼを作用させる工程を含む、酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法も提供する。
　飲食品又は飲食品用素材の酸化改質の例としては、タンパク質の架橋、組織状植物性タンパク質の結着性向上、食品の増粘又はゲル化、紅茶の褐変処理、食品の苦渋味の除去等が挙げられる。産業用素材又は産業廃棄成分の酸化改質の例としては、人工漆の製造、パルプからのリグニン除去、毒性の強いフェノール性化合物及び／又は芳香族アミンを含む廃液の無毒化、有機化合物の合成、接着剤の製造、及びコンクリート混和剤の合成等が挙げられる。医薬又は科学分析用素材の酸化改質の例としては、検査対象成分のセンシング可能な成分への変換、分析対象タンパク質の架橋等が挙げられる。
　本発明の、酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法においては、反応効率をより一層向上させる観点から、当該工程において、メディエータをラッカーゼと併用することが好ましい。用いることができるメディエータの例については、上記「７－１．架橋タンパク質の製造方法」で述べた通りである。
　本発明の、酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法において、ラッカーゼと酸化改質の対象物（つまり、飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材）との反応条件（例えば、酵素量、反応時間、反応ｐＨ、反応温度等）については、所望の程度に酸化改質が達成される限り特に制限されず、本発明のラッカーゼの種類及び／又は濃度、酸化改質対象の種類及び／又は濃度、並びに／若しくは、所望の酸化改質の程度等に応じて当業者が適宜設定することができる。また、反応ｐＨ及び反応温度の好ましい例については、上記「７－１．架橋タンパク質の製造方法」で述べた通りである。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１：培養と酵素精製
（１－１）培養及びろ過
　表１に示すラッカーゼ生産培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容振とうフラスコに、ポテトデキストロース寒天培地にて３０℃で３日間生育させたＰａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株（原産地国：ミャンマー）コロニーの１ｃｍ角切片を接種し、３０℃で３日間、往復振盪培養（１４０ｒ／ｍｉｎ）した。培養液を遠心分離により固液分離後、上清を濾別し、回収した濾液を粗酵素液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－２）１次精製（陰イオンクロマトグラフィー）
　粗酵素液を限外濾過により濃縮後、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．３Ｍ　ＮａＣｌに対して透析し、透析内液を得た。この透析内液を、上記緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ　Ｑ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｉ．Ｄ．×Ｌ＝１．６×２．５ｃｍ；Ｃｙｔｉｖａ社製）に供した。上記カラムを同緩衝液５０ｍｌで洗浄後、ＮａＣｌ濃度のリニアグラジエント（０．３～０．６Ｍ、５０ｍｌ）により、カラムに吸着したラッカーゼを溶出させ、分画した。得られた各画分の一部について以下に示す方法でラッカーゼ活性の確認（ＡＢＴＳの酸化及びタンパク質の架橋）を行い、両活性を有する画分を回収し、１次精製液とした。
（１－３）２次精製（ゲルろ過クロマトグラフィー）
　１次精製液を、限外濾過により濃縮後、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．５Ｍ　ＮａＣｌに対して透析し、透析内液を得た。この透析内液を、ＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ（Ｉ．Ｄ．×Ｌ＝１．６×６０ｃｍ；Ｃｙｔｉｖａ社製）に供し、活性を有する画分を合わせて、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、精製ラッカーゼ溶液を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥにて、精製を確認した。
＜ラッカーゼ活性の確認－ＡＢＴＳの酸化＞
　基質としてのＡＢＴＳ（２，２´－アジノ－ビス－（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））の５０ｍＭ溶液を２０μｌと、１２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１６０μｌと、酵素液２０μｌとをマイクロプレートに添加して混合し、３７℃で１５分反応を行い、反応前後における４０５ｎｍでの吸光度を測定した。ＡＢＴＳの酸化を確認することで、ラッカーゼ活性の存在を確認した。
＜ラッカーゼ活性の確認－タンパク質の架橋＞
　後述表２の３種の植物タンパク質粉末について、それぞれ、以下の操作を行った。植物タンパク質粉末を、１５％（ｗ／ｖ）となるよう、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁してよく混合した後、１２，０００×ｇ、５分間の遠心により固液分離し、上清をタンパク質溶液として得た。このタンパク質溶液１００μｌと、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）９７μｌと、２００ｍＭのＤＬ－カテキン（メディエータ）３μｌとを混合し、これにより基質溶液を得た。この基質溶液２０μｌと酵素１０μｌ（ラッカーゼの濃度が、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて定量されるタンパク質濃度で１．７μｇ／ｍｌとなるように用いた。）とを混合し、３７℃、１８時間にて反応させた。その後、反応液を１０倍希釈し、表２中に示したアプライ量をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。タンパク質架橋活性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける高分子タンパク質（架橋により高分子化したタンパク質。原点におけるバンドとして表れる。）の存在により確認した。
試験例２：酵素性質評価
（２－１）ラッカーゼ活性（タンパク質架橋活性）の評価
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼと、比較用のラッカーゼである天野エンザイム（株）製「ラッカーゼ　Ｙ１２０」（ＬＣ－Ｙ１２０とも記載する。）とについて、それぞれ、表２に示す３種の植物タンパク質それぞれに対する所定のｐＨ（ｐＨ３．０、５．０、７．０及び９．０）でのタンパク質架橋活性を評価した。
　表２の３種の植物タンパク質粉末について、それぞれ、以下の操作を行った。植物タンパク質粉末を、１５％（ｗ／ｖ）となるよう、所定のｐＨの緩衝液［５０ｍＭのクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ３．０又は５．０）、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）、又は５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）］に懸濁してよく混合した後、１２，０００×ｇ、５分間の遠心により固液分離し、上清をタンパク質溶液として得た。このタンパク質溶液１００μｌと、上記所定のｐＨの緩衝液９７μｌと、２００ｍＭのＤＬ－カテキン（メディエータ）３μｌとを混合し、これにより基質溶液を得た。この基質溶液２０μｌと酵素１０μｌ（ラッカーゼの濃度が、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて定量されるタンパク質濃度で１．７μｇ／ｍｌとなるように用いた。）とを混合し、３７℃、１８時間にて反応させた。その後、反応液を１０倍希釈し、表２中に示したアプライ量をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。タンパク質架橋活性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける架橋タンパク質（架橋により高分子化したタンパク質。原点におけるバンドとして表れる。）の量を、比較用のラッカーゼ（ＬＣ－Ｙ１２０）を用いた場合での量を基準に目視で評価した。当該架橋タンパク質の存在が確認される場合については、架橋タンパク質の量の程度を、「＋」の数で評価した。「＋」の数が多いほど、架橋タンパク質の生成量が多い。結果を図１～３に示す。なお、当該架橋タンパク質の量は、ｉｍａｇｅＪ等の画像解析ソフトを用いて定量することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１～３において、最も左のレーン（図１，２におけるレーン１、図３におけるブランクレーン）は、酵素を添加しなかったコントロールの結果を表し、真ん中のレーン（図１，２におけるレーン２、図３における「ＬＣＹ１２０」のレーン）は、比較用のラッカーゼを用いた場合の結果を表し、最も右のレーン（図１，２におけるレーン３、図３における「ＭＭ２１０３」のレーン）は、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼを用いた場合の結果を示す。
　図１～３から明らかな通り、いずれの植物性タンパク質に対しても、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０（図１，２におけるレーン２、図３における「ＬＣＹ１２０」のレーン）を用いた場合は、アルカリ領域（ｐＨ９）においてほとんどタンパク質架橋活性が認められなかったことに対し、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼを用いた場合（図１，２におけるレーン３、図３における「ＭＭ２１０３」のレーン）は、アルカリ領域（ｐＨ９）においては優れたタンパク質架橋活性が認められた。また、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼは、アルカリ領域だけでなく、ｐＨ５～７の領域でも優れたタンパク質架橋活性を示すため、汎用性が高いことも分かった。
（２－２）メディエータによるタンパク質架橋促進効果の評価
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼについて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）のみを用いた点、メディエータを表３に記載のもの（但し１００ｍＭの濃度となるように用いた。）に変更した点、ラッカーゼの濃度をタンパク質濃度で３３μｇ／ｍｌとなるように用いた点、及び反応時間を１時間とした点を除き、上記「（１－２）ラッカーゼ活性（タンパク質架橋活性）の評価方法」と同様の操作を行うことで、各種メディエータによるタンパク質架橋促進効果を評価した。結果を図４に示す。図４中、各レーンの数字は、表３における数字に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図４から明らかな通り、Ｌ－ＤＯＰＡ、ＤＬ－カテキン、及びカフェイン酸を用いた場合に、タンパク質架橋促進効果が認められた。また、これらのメディエータの中でも、Ｌ－ＤＯＰＡ及びＤＬ－カテキン（特にＬ－ＤＯＰＡ）を用いた場合に、タンパク質架橋促進効果が顕著であった。
（２－３）ｐＨ安定性
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼと、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０とを、それぞれｐＨが異なる５０ｍＭ　Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ２～１２）に溶解し、得られた酵素液を、４℃、１時間インキュベートすることでｐＨ処理した。それぞれの酵素液について、上記（１－３）の「＜ラッカーゼ活性の確認－ＡＢＴＳの酸化＞」と同様の操作を行った。１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳの酸化を触媒する酵素活性を１ユニット（Ｕ）と定義して、酵素活性値を測定した。
　最も高い残存活性を示した処理ｐＨにおける酵素活性値を１００％とした場合のｐＨ処理後における酵素活性値の相対値を、残存活性（％）として導出した。結果を図５に示す。図５から明らかな通り、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼは、アルカリ域での安定性が市販のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０に比べて顕著に向上していた。
（２－４）温度安定性
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼと、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０とを、それぞれ５０ｍＭ　Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、得られた酵素液を、４℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃又は８０℃にて１時間インキュベートすることで温度処理した。温度処理前と処理後とにおけるそれぞれの酵素液について、酵素活性値を、上記（２－３）に記載した方法と同様にして測定し、温度処理前の酵素活性値を１００％とした場合の温度処理後における酵素活性値の相対値を、残存活性（％）として導出した。結果を図６に示す。図６から明らかな通り、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼは、４０℃未満で高い安定性を示した。
（２－５）至適ｐＨ
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼと、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０とをそれぞれ用い、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに、ｐＨが異なる５０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ２～１２）を用いたことを除いて、上記（１－３）の「＜ラッカーゼ活性の確認－ＡＢＴＳの酸化＞」と同様の操作を行った。１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳの酸化を触媒する酵素活性を１ユニット（Ｕ）と定義して、酵素活性値を測定した。ＬＣ－Ｙ１２０の至適ｐＨにおける酵素活性値を１００％とした場合の相対活性値を導出した。結果を図７に示す。図７から明らかな通り、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼは、アルカリ域でも活性を呈していた。
（２－６）至適温度
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼと、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０とを用い、反応温度を３７℃の代わりに、４℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃又は７０℃で行い、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに、各ラッカーゼの至適ｐＨである５０ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液を使用した点を除いて、上記（１－３）の「＜ラッカーゼ活性の確認－ＡＢＴＳの酸化＞」と同様の操作を行った。１分間に１μｍｏｌのＡＢＴＳの酸化を触媒する酵素活性を１ユニット（Ｕ）と定義して、酵素活性値を測定した。ＬＣ－Ｙ１２０の至適温度における酵素活性値を１００％とした場合の相対活性値を導出した。結果を図８に示す。
試験例３：配列の同定
　Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られたラッカーゼのシーケンスを行った。その結果、遺伝子配列として配列番号３に示す配列（２０１８ｂｐ）、コーディング領域配列として配列番号２に示す配列（１７６４ｂｐ）、及びアミノ酸配列として配列番号１に示す配列（５８７ａａ）を決定した。
試験例４：組織状植物性タンパク質の結着性向上
　粒状大豆蛋白（マルコメ株式会社製）に５倍重量の温水（４０℃）を加え、１０分間静置して膨潤させた。水分を除き、膨潤した粒状大豆蛋白を２５ｇ秤量した。膨潤した粒状大豆蛋白に、２．７５ｇの粉末状エンドウ蛋白（ロケット社製ＮＵＴＲＡＬＹＳ　Ｆ８５Ｍ）を混ぜ、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼを約２５０Ｕ（膨潤粒状大豆蛋白１ｇ当たり約１０Ｕ）添加し、大豆タンパク質混合物を調製した。大豆タンパク質混合物をよく混合してハンバーグ状に成形し、２５℃にて６０分間静置した。オーブンにて１９０℃、１５分の焼成工程を経て、肉様加工食品を得た。
　得られた肉様加工食品の外観写真を図９に示す。図９では、比較用に、ラッカーゼを用いなかったことを除いて同様にして得た肉様加工食品（酵素処理なし）も示している。図９に示されるとおり、酵素処理なしの場合では全く結着しなかったのに対して、ＭＭ１３株由来ラッカーゼで処理した場合では結着性を確認できた。
試験例５：タンパク質溶液の増粘
　試験例２で用いたエンドウ蛋白粉末を１５％（ｗ／ｖ）となるように所定のｐＨの緩衝液［５０ｍＭのクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ３．０又は５．０）、５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）、又は５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）］に懸濁して、これをエンドウ蛋白懸濁液とした。このエンドウ蛋白懸濁液に、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼ、又は、比較用のラッカーゼＬＣ－Ｙ１２０をタンパク質重量換算量で０．１ｍｇ／ｍｌと、プロテイングルタミナーゼを５ｍｇ／ｍｌとを加え、ｐＨ３、５、７、又は９の条件下で、３７℃にて１８時間反応させた。反応物の性状について、物性に変化がない場合を「－」、増粘が認められた場合を「＋」として評価した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示されるとおり、Ｐａｒａｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｓｐ．　ＭＭ１３－Ｆ２１０３株から得られた精製ラッカーゼによれば、アルカリ域で処理することで、タンパク質溶液の増粘が認められた。

Claims (12)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに示すポリペプチドからなる、ラッカーゼ：
    （ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド；
    （ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、アルカリ域を含むｐＨ領域で、前記（ａ）に示すポリペプチドと同等のラッカーゼ活性を有するポリペプチド。
  2. 　請求項１に記載のラッカーゼをコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  4. 　請求項３に記載の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 　請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ラッカーゼの製造方法。
  6. 　請求項１に記載のラッカーゼを含む酵素製剤。
  7. 　タンパク質の架橋剤として用いられる、請求項６に記載の酵素製剤。
  8. 　飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の酸化改質剤として用いられる、請求項６に記載の酵素製剤。
  9. 　タンパク質に、請求項１に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む、架橋タンパク質の製造方法。
  10. 　前記工程をアルカリ性条件下で行う、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記工程において、前記ラッカーゼに、３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）アラニン、カテキン、及びカフェイン酸からなる群より選択されるメディエータを併用する、請求項９に記載の製造方法。
  12. 　飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材に、請求項１に記載のラッカーゼを作用させる工程を含む、酸化改質された飲食品又は飲食品用素材、産業用素材又は産業廃棄成分、若しくは医薬又は科学分析用素材の製造方法。
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