JP2001069973A - アルカリラッカーゼおよびその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アルカリ側に至適ｐＨを有し、かつアルカリ
側での安定性が極めて高いアルカリラッカーゼ、ならび
にその安価で大量な生産方法およびその生産菌を提供す
ること。 【解決手段】 以下の特性：（１）分子量：約６２，０
００；（２）至適ｐＨ：約９．０；および（３）基質特
異性：リアクティブブルー２、アシッドブルー８０、も
しくはダイレクトブルー５３の酸化的脱色反応を強く触
媒する；リグニンの酸化的重合反応を強く触媒する；ま
たはカテコール、グアヤコール、ヒドロカフェイン酸も
しくは２，６−ジメトキシフェノールの４−アミノアン
チピリンとの酸化的カップリングによる発色反応を強く
触媒する；を、有するアルカリラッカーゼ。このアルカ
リラッカーゼを生産する糸状菌を培養する工程、およ
び、培養物よりこのアルカリラッカーゼを分離精製する
工程を包含する、方法。ならびに、このアルカリラッカ
ーゼを生産する、糸状菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルカリ側に至適
ｐＨを有し、かつアルカリ側での安定性が極めて高いラ
ッカーゼ、ならびにこのようなアルカリラッカーゼを糸
状菌培養物から生産する方法およびアルカリラッカーゼ
を生産する糸状菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラッカーゼは、フェノールオキシダーゼ
またはポリフェノールオキシダーゼとも呼ばれる。ラッ
カーゼは、分子状酸素を用いて種々の基質の一電子酸化
を触媒する酵素であり、反応中間体としてのラジカル種
の生成に起因する多様な化学反応の触媒能力を有する。

【０００３】この触媒能力は、発色、脱色、化学発光、
難分解性芳香族化合物の分解、ハロゲン化物の生成およ
び分解、フェノール化合物の重合および分解のような化
学現象に機能している。それゆえ、臨床分析、バイオセ
ンサー、パルプおよび繊維の漂白、ホルムアルデヒドを
含まない合成板の製造、フェノール樹脂の製造、人工漆
塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成、染色お
よび抜染、洗濯時の色移り防止、廃液中のフェノールお
よびアニリン系化合物の除去、毒性化合物の解毒、内分
泌撹乱物質の分解、ジュースの混濁防止、食品の苦渋味
の除去、家畜飼料の体内消化の促進、化石燃料の脱硫な
ど、多方面へのラッカーゼの幅広い応用が期待されてい
る。

【０００４】例えば、毛髪の染色、洗濯時の色移り防
止、パルプ製造処理等におけるリグニン除去への用途が
意図される。特に、洗濯時の色移り防止には、アルカリ
側に至適ｐＨを有するラッカーゼを使用することが望ま
しい。また、クラフトパルプ製造処理におけるリグニン
除去でも、アルカリ側に至適ｐＨを有するラッカーゼを
使用することがコスト低減の点で重要とされる。以上の
ように、ラッカーゼの利用は、アルカリ側でなされるこ
とが多い。

【０００５】従来から、種々の菌類に由来するラッカー
ゼが知られている。例えば、子嚢菌類のモノシリウム・
インディカム（Ｇ．Ｄ．Ｔｈａｋｋｅｒら、Ａｐｐｌｉ
ｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３７、３２１〜３２３（１９
９２））およびノイロスポラ・クラッサ（Ｓ．Ｃ．Ｆｒ
ｏｅｈｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１２０、Ｎｏ．１、４５８〜４
６５（１９７４））、不完全糸状菌類のボトリチス・シ
ネレア（Ｎ．Ｚｏｕａｒｉら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、Ｖｏｌ．１５、２１３〜２２５（１９８７））お
よびリゾクトニア・ソラニ（ＷＯ９５／０７９８８）に
由来するラッカーゼが知られている。この他、動物およ
び植物にもラッカーゼの存在が知られている。

【０００６】しかしながら、現在公知のいずれのラッカ
ーゼも、酸性から中性の間に至適ｐＨを有することか
ら、上記用途への実用化がほとんどなされていないのが
現状である。これまで、アルカリ側に至適ｐＨを有する
ラッカーゼおよびこれを生産する菌類は知られていな
い。なお、ここでいう「アルカリ側」とは、ｐＨ９．０
以上の範囲を指す。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題の解決を意図するものであり、その目的とするとこ
ろは、アルカリ側に至適ｐＨを有し、かつアルカリ側で
の安定性が極めて高いアルカリラッカーゼ、その生産方
法および生産菌を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ミロセシ
ウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する、新たに単
離した糸状菌から、新規なラッカーゼを見いだし、これ
に基いて本発明を完成した。

【０００９】本発明のアルカリラッカーゼは、次の特性
を有する：（１）分子量：約６２，０００である；
（２）至適ｐＨ：約９．０；および（３）基質特異性：
リアクティブブルー２、アシッドブルー８０、もしくは
ダイレクトブルー５３の酸化的脱色反応を強く触媒す
る；リグニンの酸化的重合反応を強く触媒する；または
カテコール、グアヤコール、ヒドロカフェイン酸もしく
は２，６−ジメトキシフェノールの４−アミノアンチピ
リンとの酸化的カップリングによる発色反応を強く触媒
する。

【００１０】本明細書中で「強く触媒する」とは、吸光
度測定による場合、レマゾールブリリアントブルーＲま
たはフェノールを基質とする反応における活性より約３
倍、好ましくは約４倍、より好ましくは約５倍、さらに
より好ましくは約８倍、最も好ましくは約１０倍以上高
い活性でその反応を触媒することをいう。

【００１１】１つの実施態様では、上記アルカリラッカ
ーゼは、以下の特性：（４）作用適温の範囲：至適温度
は約７０℃である；（５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０
分間保持した場合に、約５０℃まで安定である；および
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する。上記
アルカリラッカーゼは、好ましくはミロセシウム属に属
する糸状菌、より好ましくはＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、最も好ましくはＭｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託
番号：ＦＥＲＭＰ−１７５２５）により生産される。

【００１２】本発明のアルカリラッカーゼを生産する方
法は、以下の特性：（１）分子量：約６２，０００；
（２）至適ｐＨ：約９．０；および（３）基質特異性：
リアクティブブルー２、アシッドブルー８０、もしくは
ダイレクトブルー５３の酸化的脱色反応を強く触媒す
る；リグニンの酸化的重合反応を強く触媒する；または
カテコール、グアヤコール、ヒドロカフェイン酸もしく
は２，６−ジメトキシフェノールの４−アミノアンチピ
リンとの酸化的カップリングによる発色反応を強く触媒
する；を有するアルカリラッカーゼを生産する糸状菌を
培養する工程、および、培養物より該アルカリラッカー
ゼを分離精製する工程を包含する。

【００１３】１つの実施態様では、上記アルカリラッカ
ーゼは、以下の特性：（４）作用適温の範囲：至適温度
は約７０℃である；（５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０
分間保持した場合に、約５０℃まで安定である；および
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する。上記
アルカリラッカーゼは、好ましくはミロセシウム属に属
する糸状菌、より好ましくはＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、最も好ましくはＭｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託
番号：ＦＥＲＭＰ−１７５２５）により生産される。

【００１４】本発明の糸状菌は、以下の特性：（１）分
子量：約６２，０００；（２）至適ｐＨ：約９．０；お
よび（３）基質特異性：リアクティブブルー２、アシッ
ドブルー８０、もしくはダイレクトブルー５３の酸化的
脱色反応を強く触媒する；リグニンの酸化的重合反応を
強く触媒する；またはカテコール、グアヤコール、ヒド
ロカフェイン酸もしくは２，６−ジメトキシフェノール
の４−アミノアンチピリンとの酸化的カップリングによ
る発色反応を強く触媒する；を、有するアルカリラッカ
ーゼを生産する。

【００１５】１つの実施態様では、上記アルカリラッカ
ーゼは、以下の特性：（４）作用適温の範囲：至適温度
は約７０℃である；（５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０
分間保持した場合に、約５０℃まで安定である；および
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する。上記
糸状菌は、好ましくはミロセシウム属に属し、より好ま
しくはＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ
であり、最も好ましくはＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅ
ｒｒｕｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１７５２５）である。

【００１６】このことによって上記目的が達成される。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１８】（１）アルカリラッカーゼ 本発明のアルカリラッカーゼは、以下の表１に示す種々
の特性を有する。

【００１９】

【表１】

【００２０】本明細書では、「酵素が安定である」と
は、ある処理をした場合に、酵素が、約４０％以上、好
ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上の
相対残存活性を有することをいう。

【００２１】上記特性を有するアルカリラッカーゼは、
これまで知られていない。

【００２２】（２）アルカリラッカーゼの起源 本発明のアルカリラッカーゼは、糸状菌、好ましくはミ
ロセシウム属の糸状菌、より好ましくはＭｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、最も好ましくは平成
１１年８月２０日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（生命研と略称する）に寄託したＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託番号：
ＦＥＲＭ Ｐ−１７５２５）（以下、２４Ｇ−４株と略
称する）により生産される。２４Ｇ−４株は、発明者ら
が土壌、腐朽木片およびその他等からラッカーゼを生産
する菌類を広くスクリーニングした結果、新たに京都府
内の土壌から単離された新菌株である。

【００２３】本発明のアルカリラッカーゼを生産する糸
状菌は、例えば、以下のようにして取得され得る。土
壌、腐朽木片、落ち葉、海水、淡水、海浜または河原で
見られる泡塊、底泥、活性汚泥、アルカリ性の工場廃液
などの試料を採取する。採取した試料を、生理食塩水ま
たは滅菌水とよく混合した後に静置し、上清液を得る。
上清液をアルカリ性の固形培地に接種し、28℃にて数日
間静置培養する。出現した微生物コロニーの上に、フェ
ノールおよび４−アミノアンチピリンを含む緩衝液をし
み込ませた濾紙を載せてしばらく放置する。その後、赤
色の発色スポットが検出されるコロニーを、アルカリラ
ッカーゼ生産菌として単離する。

【００２４】単離されるアルカリラッカーゼ生産菌は、
当業者に周知の方法を用いて、生産するアルカリラッカ
ーゼについてさらに詳細に特徴付けられ得る。

【００２５】本発明者らにより単離された２４Ｇ−４株
の菌学的性質は以下の通りである。

【００２６】（ｉ）形態および培養 本発明のアルカリラッカーゼ生産菌である２４Ｇ−４株
は、分生子座を形成すること、フィアロ型分生子を形成
すること、無隔壁の紡錘形の分生子を形成すること、な
らびに分生子は暗橄欖色〜黒緑色の粘塊となること、等
の菌学的性質を有することにより、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍ属に分類される。さらに、種については分生子表面
にストライプの模様がないこと、一端に扇状の付属糸を
持つ紡錘形の分生子を形成すること、分生子の長さは１
０μｍ以下であること、フィアライドは円柱形であるこ
と、先端が球状の周縁菌糸を形成しないこと、ならびに
剛毛を形成しないこと、等の菌学的性質を有することに
より、本菌はＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａ
ｒｉａ（ミロセシウム・ベルキャリア）と同定される。
従って、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉ
ａ ２４Ｇ−４と命名された。

【００２７】２４Ｇ−４株のさらに詳細な菌学的性質
は、以下の通りである。

【００２８】（ｉｉ）ポテト・グルコース寒天培地での
培養的・形態的性質 ３０℃で培養を開始後４日目において、コロニーの表面
および裏面は共に白色であり、直径１０〜２０ｍｍに成
長し、気中菌糸は短く密でビロード状である。分生子形
成構造は、黒色〜暗緑色の分生子座に集まり、約２週間
で分生子の形成が観察される。

【００２９】菌糸は滑面、薄壁で、隔壁がある。幅は、
１．５〜３μｍである。

【００３０】２４Ｇ−４株の生育範囲は、ポテトグルコ
ース寒天培地（ポテトエキス粉末４ｇ、ブドウ糖２０ｇ
および寒天２０ｇを、１リットルの蒸留水中に溶解す
る）において、温度は４〜約４０℃、ｐＨは約２〜１３
であり、生育好適温度は２５〜３５℃、生育好適ｐＨは
５．０〜９．０である。特に好ましい生育条件は、温度
３０℃でｐＨが７．０である。

【００３１】（３）アルカリラッカーゼを生産させるた
めの培養条件 本発明のアルカリラッカーゼを生産する糸状菌を培養す
る条件を説明する。本発明の糸状菌は、液体培養または
固体培養のいずれでも、培養され得る。本発明の糸状菌
を培養する培地としては、特に限定されず、通常の液体
培地または固体培地が用いられ得る。炭素源の例として
は、本発明の糸状菌が同化し得るものなら何でもよく、
グルコース、ショ糖、糖蜜、澱粉等の糖類、ふすま、み
かんパルプなどが単独で、または組み合わせて用いられ
得る。窒素源の例としては、おから、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキス、麦芽エキス、脱脂大豆粉、コーンステ
ィープリカー、尿素などの有機窒素源の他、硝酸カリウ
ム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源も、単独で、また
は組み合わせて使用し得る。必要に応じて、リン酸塩、
硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、カリウム、カルシ
ウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト等の無機塩
類、ビタミン類等が添加され得る。これらの培地成分
は、本菌の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源
は０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％、窒
素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％で
ある。

【００３２】培地のｐＨを、２．０から１３．０、好ま
しくは、４．０〜１０．０に調整し、滅菌して使用す
る。培養温度は、糸状菌類が生育し得る温度であればよ
く、実用上、１０〜約４０℃、好ましくは２５〜３５℃
である。本菌を液体培養する場合は、通気培養または振
盪培養が好ましい。培養時間は、種々の培養条件によっ
て異なるが、通気または振盪培養の場合は、通常２〜６
日間が好ましい。

【００３３】（４）培養液からのアルカリラッカーゼの
分離精製 本菌の培養液からの本発明のアルカリラッカーゼを分離
精製するには、既知の精製法、例えば、透析、塩析、各
種カラムクロマトグラフィー、等電点沈殿、ゲル濾過が
単独もしくは併用して利用され得る。

【００３４】本発明のアルカリラッカーゼは、菌体外に
分泌生産され、培養液中に蓄積される。従って、培養
後、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙または濾布などに
よる濾過等により除去し、アルカリラッカーゼを含む培
養液（粗酵素液）を回収し得る。得られた粗酵素液を脱
色、濃縮、塩析（例えば、硫安分画）、透析、各種クロ
マトグラフィー、ゲル濾過などの一般的に用いられる酵
素の精製方法により、アルカリラッカーゼが精製され得
る。例えば、上記で得られた粗酵素液を限外濾過、脱
色、硫安分画後、透析、各種クロマトグラフィーに順次
供試することにより、精製された高活性のアルカリラッ
カーゼを含有する画分が得られる。

【００３５】（５）アルカリラッカーゼ活性の測定 本発明のアルカリラッカーゼの活性は、本発明のアルカ
リラッカーゼが触媒する、４−アミノアンチピリンと、
水素供与体との酸化縮合による発色反応で測定し得る。

【００３６】水素供与体の例としては、フェノール系化
合物類（フェノール、カテコール、レゾルシノール、ヒ
ドロキノン、グアヤコール、ピロガロール、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、カフェイン酸、ヒドロカフェイン酸、ｏ
−クレゾール，ｐ−トルイジン、ｏ−クロロフェノー
ル、ｍ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノー
ル、２，６−ジクロロフェノール、２，６−ジメトキシ
フェノール、ｎ−プロピルガレート）、アニリン系化合
物類（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミ
ン）、および複素環化合物（２，２’−アジノービス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）が挙
げられる。

【００３７】４−アミノアンチピリンおよび任意の水素
供与体を含む、酸化縮合による発色反応系において、５
００ｎｍ（フェノール系化合物類および複素環化合物）
または５５５ｎｍ（アニリン系化合物類）における、酵
素添加後の吸光度の変化を測定することにより、アルカ
リラッカーゼの活性を測定し得る。例えば、０．４μｍ
ｏｌのフェノールおよび０．４μｍｏｌの４−アミノア
ンチピリンを含む１０５．３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）１９０μｌを３０℃にて、１分間プレインキ
ュベートした後、酵素液１０μｌを混合して、５００ｎ
ｍの吸光度の変化を測定し、１分間に吸光度を１増加さ
せる酵素活性を１単位（Ｕ；ユニット）とする。なお、
１単位は１分間の酸素消費量０．０３７５μｍｏｌに相
当する。

【００３８】

【実施例】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説
明するが、これは何ら、本発明を限定するものではな
い。

【００３９】（実施例１） （アルカリラッカーゼ生産菌のスクリーニング）以下の
表２に示す組成のプレート培養用スクリーニング培地を
用いて、アルカリラッカーゼを菌体外に生産する好アル
カリ性微生物のスクリーニングを行った。

【００４０】

【表２】

【００４１】詳細には、日本各地から採集した土壌また
は腐朽木片１ｇを滅菌水５ｍｌを含有する３４ｍｌ容試
験管に入れ、よく混合し、しばらく静置した。その後、
上澄液０．２ｍｌを採取し、上記培地に塗り広げ、２８
℃で、数日間静置培養した。出現した微生物コロニーの
上に、１ｍｌ中に２μｍｏｌのフェノールおよび２μｍ
ｏｌの４−アミノアンチピリンを含む１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を滲み込ませた濾紙を載せ
た。しばらく放置した後、赤色の発色スポットが検出さ
れたコロニーを、アルカリラッカーゼ生産菌と判断し
て、常法に従って単離し、いくつかのアルカリラッカー
ゼ生産菌株を得た。

【００４２】以下の表３に示す組成を有する液体培養用
スクリーニング培地５ｍｌを含有する３４ｍｌ容試験管
に、単離した菌株の一白金耳を接種し、２８℃で数日
間、往復振盪培養（３００往復／分）した。

【００４３】

【表３】

【００４４】培養後、培養液を濾別して得られた、各単
離菌株の培養濾液について、アルカリラッカーゼ活性を
調べた。すなわち、０．４μｍｏｌのフェノールおよび
０．４μｍｏｌの４−アミノアンチピリンを含む、１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０またはｐＨ８．
５）１２０μｌを３０℃にて１分間プレインキュベート
した後、培養濾液を８０μｌを混合して５００ｎｍの吸
光度の変化を測定した。１分間に吸光度を１増加させる
酵素活性を１単位（Ｕ；ユニット）とした。

【００４５】スクリーニングの結果を図１に示す。な
お、１単位は、１分間の酸素消費量０．０３７５μｍｏ
ｌに相当する。図１は、縦軸に菌株を、横軸にラッカー
ゼ活性（Ｕ/ｌ）を示す。斜線の棒はｐＨ１０．０で
の、白棒はｐＨ８．５での測定の結果を示す。

【００４６】図１から、２４Ｇ−４株（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ２４Ｇ−４株に相当）
が、他の菌株（ＭＰ−１、Ｒｃ−６０Ａ、Ｒｃ−７２
ｂ、Ｒｃ−９６、Ｒｃ−１１３、Ｒｃ−１１４、Ｒｄ−
２０ａ、Ｒｄ−２０ｂ、Ｒｄ−２３、および３２−ＲＳ
８）と比較して著しく多量のアルカリラッカーゼを生産
することがわかる。

【００４７】（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃ
ａｒｉｎ ２４Ｇ−４の培養）以下の表４に示す組成の
液体培養用培地５ｍｌを含有する３４ｍｌ容試験管に２
４Ｇ−４株の一白金耳を接種し、２８℃で４日間、往復
振盪培養（３００往復／分）した。次いで、この培養液
全量を、５００ｍｌの上記培地を含む２ｌ容坂口フラス
コに植菌し、２８℃で４日間往復振盪培養（１５０往復
／分）した。

【００４８】

【表４】

【００４９】（実施例２） （アルカリラッカーゼの精製）上記実施例１で得られた
２４Ｇ−４株の培養液を遠心分離により固液分離後、上
清を濾紙で濾過し、回収した濾液を粗酵素液とした。

【００５０】この粗酵素液を限外濾過により、濃縮後、
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析
し、透析内液を得た。

【００５１】上記透析内液を、上記緩衝液で平衡化した
ＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０カラム（１．０×１０ｃ
ｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供試した。上記カラム
を同緩衝液で洗浄後、同緩衝液に塩化ナトリウム濃度を
０Ｍから１Ｍへの濃度勾配をかけた溶出により、上記カ
ラムに吸着されたアルカリラッカーゼを溶出し、分画回
収した。

【００５２】得られた各画分の一部をアルカリラッカー
ゼ活性の測定に供試し、活性を有する画分を合わせ、次
いで２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して
透析し、透析内液を得た。

【００５３】上記透析内液を、上記緩衝液で平衡化した
セファクリルＳ−２００ ＨＲカラム（１．５×９０ｃ
ｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供試し、活性を有する
画分を合わせて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に対して透析し、透析内液を得た。

【００５４】上記透析内液を、上記緩衝液で平衡化した
ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラム（０．５×５ｃｍ；Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社製）に供試した。上記カラムを同緩
衝液で洗浄後、同緩衝液に塩化ナトリウム濃度を０Ｍか
ら１Ｍへの濃度勾配をかけた溶出により、さらに分画精
製されたアルカリラッカーゼ精製液を得た。

【００５５】上記の各精製工程におけるアルカリラッカ
ーゼの全活性およびタンパク質当たりの比活性を表５に
示す。

【００５６】

【表５】

【００５７】（実施例３） （アルカリラッカーゼの分子量）ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９
７０））で本発明のアルカリラッカーゼの分子量を測定
した。

【００５８】上記実施例２で得られたアルカリラッカー
ゼ精製液および分子量マーカーとして既知の６種のタン
パク質（分子量約９７，４００、６６，３００、４２，
４００、３０，０００、および２０，１００）を同時に
泳動した。泳動終了後、クーマシーブリリアントブルー
で染色し、アルカリラッカーゼと各分子量マーカーとの
相対泳動距離より、アルカリラッカーゼの分子量を測定
した。結果を図２に示す。

【００５９】左側のレーンは、本発明のアルカリラッカ
ーゼ、右側のレーンは、同時に泳動した各分子量マーカ
ーである。右外側の数値は分子量マーカーの分子量サイ
ズ（ｋＤａ）を表す。本ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アル
カリラッカーゼは、単一バンドを示した。このことか
ら、実施例２で精製されたアルカリラッカーゼが実質的
に純粋であることが確認された。アルカリラッカーゼの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量は、約６２，０００で
ある。

【００６０】（実施例４） （アルカリラッカーゼの作用適温範囲および熱安定性） （１）作用適温の範囲 上記実施例２で得られたアルカリラッカーゼ精製液の活
性を、種々の温度条件（２５、３０、４０、５０、６
０、７０、および８０℃）下で測定した。詳細には、ガ
ラスセル内で、０．４μｍｏｌのフェノールおよび０．
４μｍｏｌの４−アミノアンチピリンを含む、１０５．
３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１９０μｌを３
０℃にて５分間プレインキュベートした後、アルカリラ
ッカーゼ精製液１０μｌを混合した。混合液の５００ｎ
ｍの吸光度の変化を分光光度計にて測定し、１分間に吸
光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とし
て、酵素活性を調べた。

【００６１】比較のため、コリオラス・ベルシカラー由
来のラッカーゼおよびトラメテス属Ｈａ１株由来のラッ
カーゼについても、トリス塩酸緩衝液の代わりに１０
５．３ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に置き
換えて、同様に調べた。

【００６２】結果を図３に示す。図中の横軸は反応温度
（℃）を表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の
相対活性（％）を表す。図中の黒四角はアルカリラッカ
ーゼを、黒菱形はコリオラス・ベルシカラー由来のラッ
カーゼ（天野製薬（株）製）を、そして白丸はトラメテ
ス属Ｈａ１株由来のラッカーゼ（大和化成（株）製）
を、それぞれ示す。

【００６３】アルカリラッカーゼの至適温度は、約７０
℃であり、相対活性の変化は他の２つのラッカーゼより
も大きい。

【００６４】（２）熱安定性 上記実施例２で得られたアルカリラッカーゼ精製液を、
種々の温度条件（３０、４０、５０、６０、７０、およ
び８０℃）下にてトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で
６０分間インキュベートして前処理をした後、上記実施
例４（１）に記載されるのと同じ発色反応系において活
性を測定した。

【００６５】比較のため、コリオラス・ベルシカラー由
来のラッカーゼおよびトラメテス属Ｈａ１株由来のラッ
カーゼについても、同様に調べた。

【００６６】結果を図４に示す。図中の横軸は処理温度
（℃）を表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の
相対残存活性（％）を表す。図中の黒四角はアルカリラ
ッカーゼを、黒菱形はコリオラス・ベルシカラー由来の
ラッカーゼを、そして白丸はトラメテス属Ｈａ１株由来
のラッカーゼを、それぞれ示す。

【００６７】本ラッカーゼは、処理温度条件が５０℃の
場合においても酵素活性の７５％以上が保持され、安定
である。

【００６８】（実施例５） （本ラッカーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲） （１）至適ｐＨ 上記実施例４（１）の１０５．３ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）の代わりに、ｐＨ領域に応じて、１０
５．３ｍＭ酢酸ナトリウム塩酸緩衝液、１０５．３ｍＭ
酢酸緩衝液、１０５．３ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１
０５．３ｍＭトリス塩酸緩衝液または１０５．３ｍＭグ
リシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いて、ｐＨを３．０
〜１１．５（ｐＨ３．０、４．０、および４．２には、
１０５．３ｍＭ酢酸ナトリウム塩酸緩衝液；ｐＨ４．
２、４．６、５．０、および５．５には１０５．３ｍＭ
酢酸緩衝液；ｐＨ５．６、６．３、６．６、７．０、
７．８、および８．２には１０５．３ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液；ｐＨ８．０、８．２、８．８、９．２、およ
び９．４には１０５．３ｍＭトリス塩酸緩衝液；ならび
にｐＨ９．０、９．４、１０．２、１０．８、１１．
０、および１１．５には１０５．３ｍＭグリシン水酸化
ナトリウム緩衝液）に調整し、上記実施例２で得られた
アルカリラッカーゼ精製液の活性を測定した。

【００６９】結果を図５に示す。図中の横軸は反応ｐＨ
を表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活
性（％）を表す。白丸は終濃度１００ｍＭ酢酸ナトリウ
ム塩酸緩衝液（ＡｃＯＮａ−ＨＣｌ）を、黒菱形は終濃
度１００ｍＭ酢酸緩衝液（ＡｃＯＮａ−ＡｃＯＨ）を、
半分白い四角は終濃度１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ＫＰＢ）を、白三角は終濃度１００ｍＭトリス塩酸緩
衝液を、そして逆黒三角は終濃度１００ｍＭグリシン水
酸化ナトリウム緩衝液（グリシンＮａＯＨ）を用いて行
った測定の結果を示す。

【００７０】アルカリラッカーゼの至適ｐＨは、約９．
０である。

【００７１】（２）安定ｐＨ範囲 実施例２で得られたアルカリラッカーゼ精製液のｐＨを
５．０〜１１．５（ｐＨ５．０、５．２および６．０：
酢酸緩衝液；ｐＨ７．８および８．２：リン酸カリウム
緩衝液；ｐＨ８．５および９．３：トリス塩酸緩衝液；
ならびにｐＨ１０．０、１０．８、および１１．５：グ
リシン水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用；ｐＨ処
理液における緩衝液の終濃度はいずれも１００ｍＭ）に
調整し、３０℃で１時間または１７時間インキュベート
してｐＨ処理液を得た。次いで、各ｐＨ処理液１０μｌ
に０．４μｍｏｌのフェノールおよび０．４μｍｏｌの
４−アミノアンチピリンを含む１０５．３ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）１９０μｌを添加して混合し
た。混合液の５００ｎｍの吸光度の変化を分光光度計に
て測定し、１分間に吸光度を１増加させる量を１単位
（Ｕ；ユニット）として、相対残存酵素活性を調べた。

【００７２】比較のため、コリオラス・ベルシカラー由
来のラッカーゼおよびトラメテス属Ｈａ１株由来のラッ
カーゼについても、活性測定に使用する緩衝液を１０
５．３ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に置き
換えて、同様に調べた。

【００７３】結果を図６（Ａ）および（Ｂ）に示す。図
６（Ａ）は、３０℃にて１時間処理した場合の結果を示
し、そして図６（Ｂ）は、３０℃にて１７時間処理した
場合の結果を示す。図中の横軸は処理ｐＨを表し、縦軸
は、最大活性値を１００とした場合の相対残存活性
（％）を表す。図中の黒四角はアルカリラッカーゼを、
黒菱形はコリオラス・ベルシカラー由来のラッカーゼ
を、そして白丸はトラメテス属Ｈａ１株由来のラッカー
ゼを、それぞれ示す。

【００７４】アルカリラッカーゼの安定ｐＨ範囲は、３
０℃にて１時間処理した場合において、５．０〜１１．
５、３０℃にて１７時間処理した場合において８．０〜
１１．５である。本発明のアルカリラッカーゼは、他の
２種のラッカーゼと比較して、アルカリ条件（特に、ｐ
Ｈ９．０以上）での安定性に優れている。

【００７５】（実施例６） （アルカリラッカーゼの基質特異性：脱色活性）上記
実施例２で精製されたアルカリラッカーゼの基質特異性
（脱色活性）は、アルカリラッカーゼの作用により生じ
た種々の基質の化学的変化を、各基質を含む緩衝液の吸
光度の変化を測定することにより調べた。基質として
は、１３種類の市販の色素（レマゾールブリリアントブ
ルーＲ、リアクティブブルー２、リアクティブブルー
５、アシッドブルー８０、：リアクティブブルー２、ア
シッドブルー８０、もしくはダイレクトブルー５３、ア
シッドオレンジ、ポリＲ４７８、ポリＳ１１９、アシッ
ドバイオレット１７、フェノールレッド、ナチュラルオ
レンジ６、アズールＢ、およびアシッドレッド５２）、
ならびにリグニンを用いた。各基質についての測定波長
を、表６に示す。

【００７６】

【表６】

【００７７】詳細には、９６穴のマイクロプレートのウ
ェル内で反応開始時、表６に記した終濃度となるよう調
整した基質を含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
９．５）にて、本ラッカーゼの脱色活性を、マイクロプ
レート分光光度計にて測定し、１分間に吸光度を１増加
させる量を１単位（Ｕ；ユニット）として、脱色活性を
調べた。すなわち、基質を含む１１１．１ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９．５）１８０μＬを３０℃にて、５分
間プレインキュベートした後、酵素液２０μｌを混合し
て、吸光度の変化を測定した。

【００７８】比較のために、トラメテス属Ｈａｌ株由来
ラッカーゼおよびコリオラス・ベルシカラー由来ラッカ
ーゼについても、上記の緩衝液を１１１．１ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に置き換えて、同様に調
べた。

【００７９】レマゾールブリリアントブルーＲを基質と
した場合の測定値を１００とした、各基質についての相
対値（％）を表７に示す。なお、括弧内の数値はレマゾ
ールブリリアントブルーＲに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）
である。

【００８０】

【表７】

【００８１】本発明のアルカリラッカーゼは、アルカリ
条件下でアントラキノン系色素、アゾ系色素、およびポ
リマー色素の酸化的脱色反応、リグニンの酸化的重合反
応を触媒した。アントラキノン系色素では、特に、リア
クティブブルー２およびアシッドブルー８０の酸化的脱
色反応を強く触媒した。アゾ系色素では、特に、ダイレ
クトブルー５３の酸化的脱色反応を強く触媒した。ま
た、アルカリラッカーゼは、比較のために用いた酸性ラ
ッカーゼ（トラメテス属Ｈａｌ株由来ラッカーゼおよび
コリオラス・ベルシカラー由来ラッカーゼ）とは、リア
クティブブルー５、ダイレクトブルー５３、ポリマー色
素、フェノールレッドおよびアシッドレッド５２に対す
る特異性が大きく異なる。

【００８２】（実施例７） （アルカリラッカーゼの基質特異性：発色活性）上記
実施例２で精製されたアルカリラッカーゼの基質特異性
（発色活性）は、本発明のアルカリラッカーゼが触媒す
る、基質（水素供与体）と４−アミノアンチピリンとの
酸化縮合による発色反応で測定する。基質としては、フ
ェノール系化合物類（フェノール、カテコール、レゾル
シノール、ヒドロキノン、グアヤコール、ピロガロー
ル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、カフェイン酸、ヒドロカ
フェイン酸、ｏ−クレゾール，ｐ−トルイジン、ｏ−ク
ロロフェノール、ｍ−クロロフェノール、２，４−ジク
ロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，６
−ジメトキシフェノール、ｎ−プロピルガレート）、ア
ニリン系化合物類（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレ
ンジアミン）、または、複素環化合物（２，２’−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）を用いた。そして、反応後の５００ｎｍ（フェノー
ル系化合物類または複素環化合物）または５５５ｎｍ
（アニリン系化合物類）における吸光度を測定した。

【００８３】詳細には、９６穴のマイクロプレートのウ
ェル内で、０．４μｍｏｌの基質および０．４μｍｏｌ
の４−アミノアンチピリンを含む、１０５．３ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）１９０μｌを、３０℃にて
５分間プレインキュベートした。次いで、アルカリラッ
カーゼ精製液１０μｌを混合し、５００ｎｍまたは５５
５ｎｍの吸光度の変化をマイクロプレート分光光度計に
て測定し、発色活性を調べた。１分間に吸光度を１増加
させる量を１単位（Ｕ；ユニット）とした。

【００８４】比較のために、トラメテス属Ｈａｌ株由来
ラッカーゼおよびコリオラス・ベルシカラー由来ラッカ
ーゼについても、上記緩衝液を１０５．３ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４．０）に置き換えて、同様に調べ
た。

【００８５】フェノールを基質とした場合の測定値を１
００とした、各基質についての相対値（％）を表８に示
す。なお、括弧内の数値はフェノールに対する比活性
（Ｕ／ｍｇ）である。

【００８６】

【表８】

【００８７】本発明のアルカリラッカーゼは、アルカリ
条件下で種々のフェノール系化合物類およびアニリン系
化合物類の４−アミノアンチピリンとの酸化的カップリ
ングによる発色反応を触媒した。フェノール系化合物類
においては特に、カテコール、レゾルシノール、ヒドロ
キノン、グアヤコール、ピロガロール、カフェイン酸、
ヒドロカフェイン酸、ｏ−クレゾール、ｐ−トルイジ
ン、または２，６−ジメトキシフェノールとの発色反応
が強く触媒され、この中でも特にカテコール、グアヤコ
ール、ヒドロカフェイン酸または２，６−ジメトキシフ
ェノールとの発色反応が強く触媒された。アニリン系化
合物類においては特に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニ
レンジアミンおよびｐ−フェニレンジアミンの４−アミ
ノアンチピリンとの酸化的カップリングによる発色反応
が強く触媒された。また、本発明のアルカリラッカーゼ
は、他の酸性ラッカーゼとは、グアヤコール、ピロガロ
ール、ｏ−クレゾール、および２，６−ジメトキシフェ
ノールに対する特異性が異なる。

【００８８】（実施例８） （ビリルビンオキシターゼとの比較：Ｎ末端アミノ酸
配列）上記実施例２で得られた精製されたアルカリラッ
カーゼのＮ末端アミノ酸配列について、パルス液相法プ
ロテインシーケンサー（４７６Ａ型；ＰＥＲＫＩＮＥＬ
ＭＥＲ社製）を用い、自動化エドマン分解法にて、調べ
た。その結果を図７および配列番号１に示す。

【００８９】上記の方法にて、Ｎ末端アミノ酸残基から
数えて、１７残基数のＮ末端アミノ酸配列がわかった。
比較として、ミロセシウム・ベルキャリアＭＴ−１株の
ビリルビンオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列を、図７
および配列番号２にあわせて記載した。

【００９０】本発明のアルカリラッカーゼは、ビリルビ
ンオキシダーゼとＮ末端アミノ酸配列において、１７残
基中２残基が異なる。

【００９１】（実施例９） （ビリルビンオキシダーゼとの比較：基質特異性） （１）各基質に対する酸素消費量 上記実施例２で精製された、アルカリラッカーゼの基質
特異性を、ビリルビンまたはＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フ
ェニレンジアミンを基質として供試し、これらの基質の
酸化に伴う酸素消費量を、酸素電極により電気信号に変
換する酸素電極法を用いて測定することにより調べた。

【００９２】詳細には、０．５μｍｏｌのビリルビンま
たは８．０μｍｏｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレ
ンジアミンを含む、１５０．６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）２４９０μｌを、３０℃で、１０分間、空気で
平衡化した。次いで、酵素液１０μｌを添加することに
より反応を開始し、クラーク型酸素電極で酸素消費量を
測定した。比較のために、ミロセシウム・ベルキャリア
ＭＴ−１株由来のビリルビンオキシダーゼについても、
同様に調べた。ビリルビンを基質とした場合の測定値を
１とした、相対値を表９に示す。

【００９３】

【表９】

【００９４】酸素消費量は、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フ
ェニレンジアミンでは、アルカリラッカーゼの方が、Ｍ
Ｔ−１ビリルビンオキシダーゼよりも１．５倍酸素消費
量が多いことが示された。

【００９５】（２）吸光度変化 上記実施例２で精製されたアルカリラッカーゼの基質特
異性を、ビリルビン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレ
ンジアミンまたはフェノールを基質として供試した。こ
こで、ビリルビン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレン
ジアミンについては、これらの基質の酸化によって生じ
る化学構造上の変化を各基質の極大吸収波長における吸
光度の変化として測定することにより調べ、フェノール
については、フェノールと４−アミノアンチピリンとの
酸化縮合により生じたキノンイミン色素をキノンイミン
色素の極大吸収波長における吸光度の変化として測定す
ることにより調べた。

【００９６】詳細には、０．１２５μｍｏｌのビリルビ
ンあるいは２μｍｏｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニ
レンジアミンを含む１５０．６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）６２２．５μｌを、３０℃で、５分間、プレイ
ンキュベートした。次いで、酵素液２．５μｌを混合
し、４５０ｎｍ（ビリルビン）の吸光度における減少、
または５５０ｎｍ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレン
ジアミン）の吸光度における増加を測定する。あるい
は、フェノールを基質とする場合は、６．２５μｍｏｌ
のフェノールおよび６．２５μｍｏｌの４−アミノアン
チピリンを含む１５０．６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）６２２．５μｌを３０℃で、５分間、プレインキュ
ベートする。次いで、酵素液２．５μｌを混合し、５０
０ｎｍの吸光度の変化を測定する。

【００９７】本実施例において活性度はビリルビンを基
質にした場合については、１分間に吸光度を１減少させ
る量を、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを
基質にした場合については、１分間に吸光度を１増加さ
せる量を、そしてフェノールを基質にした場合について
は、１分間に吸光度を１増加させる量を１単位（Ｕ；ユ
ニット）とした。

【００９８】比較のために、ミロセシウム・ベルキャリ
アＭＴ−１株由来のビリルビンオキシダーゼについても
同様に調べた。ビリルビンを基質とした場合の測定値を
１とした、相対値を表１０に示す。

【００９９】

【表１０】

【０１００】本発明のアルカリラッカーゼは、Ｎ，Ｎ−
ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはフェノールに
対する活性度が、ビリルビンオキシダーゼより約１０倍
以上高く、ビリルビンオキシダーゼとは基質特異性が異
なる。

【０１０１】

【発明の効果】本発明によれば、アルカリ側に至適ｐＨ
を有する新規ラッカーゼであるアルカリラッカーゼ、な
らびにその生産方法および生産菌が提供される。本発明
のアルカリラッカーゼは、従来のラッカーゼに比べてア
ルカリ側に至適ｐＨを有し、かつアルカリ側での安定性
が極めて高いので、洗剤および染毛剤の製造、パルプ製
造処理工程等に有用である。本発明のアルカリラッカー
ゼは、糸状菌の培養によって生産されるため、安価に大
量にアルカリラッカーゼを提供することができ、試薬ま
たは工業用途に広く利用され得る。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAIWA KASEI K.K. <120> Alkaline laccase and production method thereof <130> J199120479 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Myrothecium verrucaria <400> 1 Ala Pro Gln Ile Ser Pro Gln Tyr Pro Met Phe Thr Val Pro Leu Pro 1 5 10 15 Ile <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Myrothecium verrucaria <400> 2 Val Ala Gln Ile Ser Pro Gln Tyr Pro Met Phe Thr Val Pro Leu Pro 1 5 10 15 Ile

【図面の簡単な説明】

【図１】スクリーニングにより得られた各種菌株の菌体
外ラッカーゼ活性を示すグラフである。

【図２】本発明のアルカリラッカーゼのＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による泳
動パターンを示す、ゲル電気泳動写真である。

【図３】２５〜８０℃の範囲で本発明のアルカリラッカ
ーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。

【図４】本発明のアルカリラッカーゼを、３０〜８０℃
の条件下、６０分インキュベーション後に測定した相対
残存活性を示す。

【図５】ｐＨ３．０〜１１．５の範囲で本発明のアルカ
リラッカーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。

【図６】本発明のアルカリラッカーゼを、ｐＨ５．０〜
１１．５の条件下、３０℃で（Ａ）１時間、および
（Ｂ）１７時間インキュベーションした後に測定した相
対残存活性を示す。

【図７】本発明のアルカリラッカーゼおよびミロセシウ
ム・ベルキャリアＭＴ−１株のビリルビンオキシダーゼ
のＮ末端アミノ酸配列の１７アミノ酸残基を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD03 FF11E FF12E LL01 LL02 LL10 4B065 AA58X CA28 CA41 CA44 CA46 CA57 CA60

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の特性： （１）分子量：約６２，０００； （２）至適ｐＨ：約９．０；および （３）基質特異性：リアクティブブルー２、アシッドブ
   ルー８０もしくはダイレクトブルー５３の酸化的脱色反
   応を強く触媒する；リグニンの酸化的重合反応を強く触
   媒する；またはカテコール、グアヤコール、ヒドロカフ
   ェイン酸もしくは２，６−ジメトキシフェノールの４−
   アミノアンチピリンとの酸化的カップリングによる発色
   反応を強く触媒する；を、有するアルカリラッカーゼ。
2. 【請求項２】 以下の特性： （４）作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である； （５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０分間保持した場合
   に、約５０℃まで安定である；および （６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
   おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する、請求
   項１に記載のアルカリラッカーゼ。
3. 【請求項３】 ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
   ｍ）属に属する糸状菌が生産する、請求項１または２に
   記載のアルカリラッカーゼ。
4. 【請求項４】 Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃ
   ａｒｉａが生産する、請求項３に記載のアルカリラッカ
   ーゼ。
5. 【請求項５】 Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃ
   ａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
   ７５２５）が生産する、請求項４に記載のアルカリラッ
   カーゼ。
6. 【請求項６】 以下の特性： （１）分子量：約６２，０００； （２）至適ｐＨ：約９．０；および （３）基質特異性：リアクティブブルー２、アシッドブ
   ルー８０もしくはダイレクトブルー５３の酸化的脱色反
   応を強く触媒する；リグニンの酸化的重合反応を強く触
   媒する；またはカテコール、グアヤコール、ヒドロカフ
   ェイン酸もしくは２，６−ジメトキシフェノールの４−
   アミノアンチピリンとの酸化的カップリングによる発色
   反応を強く触媒する；を有するアルカリラッカーゼを生
   産する方法であって、該アルカリラッカーゼを生産する
   糸状菌を培養する工程、および、培養物より該アルカリ
   ラッカーゼを分離精製する工程を包含する、方法。
7. 【請求項７】 前記アルカリラッカーゼが、以下の特
   性： （４）作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である； （５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０分間保持した場合
   に、約５０℃まで安定である；および （６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
   おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する、請求
   項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記糸状菌が、ミロセシウム属に属す
   る、請求項６または７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記糸状菌が、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
   ｖｅｒｒｕｃａｒｉａである、請求項８に記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 前記糸状菌が、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
    ｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託番号：
    ＦＥＲＭ Ｐ−１７５２５）である、請求項９に記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 以下の特性： （１）分子量：約６２，０００； （２）至適ｐＨ：約９．０；および （３）基質特異性：リアクティブブルー２、アシッドブ
    ルー８０もしくはダイレクトブルー５３の酸化的脱色反
    応を強く触媒する；リグニンの酸化的重合反応を強く触
    媒する；またはカテコール、グアヤコール、ヒドロカフ
    ェイン酸もしくは２，６−ジメトキシフェノールの４−
    アミノアンチピリンとの酸化的カップリングによる発色
    反応を強く触媒する；を、有するアルカリラッカーゼを
    生産する、糸状菌。
12. 【請求項１２】 前記アルカリラッカーゼが、以下の特
    性： （４）作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である； （５）熱安定性：ｐＨ９．０で６０分間保持した場合
    に、約５０℃まで安定である；および （６）安定ｐＨ範囲：３０℃で１７時間処理する場合に
    おいて、ｐＨ８．０〜１１．５；をさらに有する、請求
    項１１に記載の糸状菌。
13. 【請求項１３】 ミロセシウム属に属する、請求項１１
    または１２に記載の糸状菌。
14. 【請求項１４】 前記糸状菌が、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
    ｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａである、請求項１３に記載の
    糸状菌。
15. 【請求項１５】 Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕ
    ｃａｒｉａ ２４Ｇ−４株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
    １７５２５）である、請求項１４に記載の糸状菌。