DE69635444T2

DE69635444T2 - Gereinigte coprinus laccasen und nukleinsäuren welche dafür kodieren

Info

Publication number: DE69635444T2
Application number: DE69635444T
Authority: DE
Inventors: Sue Debbie YAVER; M. Kimberly BROWN; Sakari Kauppinen; Torben Halkier
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1996-08-20
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2016-08-21
Also published as: WO1997008325A2; EP0788547B1; US6207430B1; DE69635444D1; WO1997008325A3; ATE310090T1; US6242232B1; ZA967173B; EP0788547A2; US6008029A; AU6860396A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide mit Laccaseaktivität und isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide kodieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die sowohl die Nukleinsäuresequenzen als auch die Verfahren zur Herstellung der Polypeptide umfassen.
Beschreibung des Stands der Technik
Laccasen (Benzoldiol:Sauerstoff-Oxidoreduktasen) sind mehrfachen Kupfer enthaltende Enzyme, die die Oxidation von Phenolen katalysieren. Die durch Laccase vermittelten Oxidationen führen zur Herstellung von Aryloxyradikalzwischenprodukten von geeigneten Phenolsubstraten; die endgültige Kopplung der so hergestellten Zwischenprodukte liefert eine Kombination von dimeren, oligomeren und polymeren Reaktionsprodukten. Derartige Reaktionen sind in der Natur in Biosynthesepfaden bedeutend, die zur Bildung von Melanin, Alkaloiden, Toxinen, Ligninen und Huminsäuren führen. Laccasen werden von einer breiten Vielfalt von Pilzen, einschließlich der Ascomyceten wie z.B. Aspergillus, Neurospora und Podospora, der Deuteromyceten Botrytis und Basidiomyceten wie z.B. Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes und perfekten Formen von Rhizoctonia hergestellt. Laccasen bieten eine große Auswahl an Substratspezifität, und jede individuelle Pilzlaccase unterscheidet sich gewöhnlich von anderen nur quantitativ in ihrem Vermögen, Phenolsubstrate zu oxidieren. Auf Grund der Substratvielfältigkeit fanden Laccasen im Allgemeinen viele mögliche industrielle Anwendungen. Darunter befinden sich die Ligninmodifikation, die Papierverstärkung, die Hemmung der Farbstoffübertragung in Waschmitteln, die Phenolpolymerisati on, die Obstsaftherstellung, die Phenolharzherstellung und die Abwasserbehandlung.
Obwohl die katalytischen Fähigkeiten ähnlich sind, besitzen die von verschiedenen Pilzarten hergestellten Laccasen unterschiedliche Temperatur- und pH-Optima. Etliche dieser Pilzlaccasen wurden isoliert und von mehreren davon wurden die Gene kloniert. Zum Beispiel beschreibt Choi et al. (1992, Mol. Plant-Microbe Interactions 5: 119–128) die molekulare Charakterisierung und Klonierung des Gens, das die Laccase des Kastanienrindenkrebspilzes Cryphonectria parasitica kodiert. Kojima et al. (1990, Journal of Biological Chemistry 265: 15224–15230; JP 2-238885) stellen eine Beschreibung zweier Allelformen der Laccase der Weißfäule-Basidiomycete Coriolus hirsutus bereit.
Germann und Lerch (1985, Experientia 41: 801; 1986, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83: 8854–8858) berichteten von der Klonierung und teilweisen Sequenzierung des Laccase-Gens von Neurospora crassa. Saloheimo et al. (1985, Journal of General Microbiology 137: 1537–1544; WO 92/01046) offenbarten eine Strukturanalyse des Laccasegens von dem Pilz Phlebia radiata.
Kim et al. (1995, Journal of Microbiology 33: 146–148) offenbarten eine membranassozierte Laccase von Coprinus congregatus.
Giardina et al. (1996, European Journal of Biochemistry 235: 508–515) offenbarten ein Laccase-Isoenzym von Pleurotus ostreatus und das kodierende Gen, das in EMBL (Zugangsnr. Z344848) hinterlegt ist.
Coll et al. (1993, Appl. Environ. Microbiol. 59: 4129) offenbarten die cDNA und genomische DNA, die eine ligninolytische Basidiomycete kodiert. Die genomische DNA wurde in EMBL (Zugangsnr. Z12156) hinterlegt.
Oji Paper Co. offenbarten ebenfalls ein Phenoloxidase-Gen in JP02027985, das in GeneseqN (Zugangsnr. AAQ03573) hinterlegt wurde.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide mit Laccaseaktivität und Nukleinsäurekonstrukte, die diese Polypeptide kodieren, bereit zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu mindestens 65% mit der in 1 dargelegten Aminosäuresequenz identisch ist, oder die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu mindestens 70% mit der in 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz identisch ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide kodieren, und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die sowohl die Nukleinsäuresequenzen als auch die Verfahren zur Herstellung der Polypeptide umfassen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 veranschaulicht die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des lcc1-Gens von Coprinus cinereus.
2 veranschaulicht die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des lcc3-Gens von Coprinus cinereus.
3 veranschaulicht die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des lcc2-Gens von Coprinus cinereus.
4 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pDSY67.
5 veranschaulicht eine Karte des Plasmids pDSY68.
6 veranschaulicht die pH-Aktivitätsprofile der rekominanten und Laccasen von Coprinus cinereus vom Wildtyp, wobei (A) Syringaldazin und (B) 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) als Substrate verwendet wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Polypeptide mit Laccaseaktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Laccaseaktivität (nachstehend „Polypeptide").
In einer anderen Ausführungsform werden die Polypeptide von einem Stamm der Familie Coprinaceae, vorzugsweise einem Coprinus-Stamm und stärker bevorzugt einem Stamm von Coprinus cinereus, z.B. Coprinus cinereus IFO 8371 oder einem Mutantenstamm davon erhalten. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform weist das Polypeptid die in 1, 2 oder 3 dargelegte Aminosäuresequenz auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, die von Mikroorganismen erhalten werden, die mit Coprinus gleichbedeutend sind, wie zum Beispiel von Webster, 1980, in Introduction to the Fungi, zweite Auflage, Cambridge University Press, New York, definiert. Die Coprinus-Stämme sind für die Öffentlichkeit in etlichen Kultursammlungen leicht zugänglich, wie z.B. American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), z.B. von der American Type Culture Collection ATCC 12890, 36519, 38628, 42727, 48566 (Coprinus cinereus); 15744 (Coprinus clastophyllus); 12640, 22314 (Coprinus comatus); 46457, 46972 (Coprinus congregatus); 48096 (Coprinus cothurnatus); 48098 (Coprinus curtus); 46973 (Coprinus disseminatus); 26829 (Coprinus domesticus); 48100 (Coprinus ephemeroides); 36567 (Coprinus fimentarius); 48097 (Coprinus gonophyllus); 20122 (Coprinus micaceus); vom Institute for Fermentation (IFO, Osaka, Japan) IFO 8371, 30116 (Coprinus cinereus); vom Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Niederlande) CBS 147.39, 148.39, 175.51 (Coprinus angulatus); 147.29 (Coprinus astramentarius); 143.39 (Coprinus auricomus); 185.52 (Coprinus callinus); 159.39, 338.69 (Coprinus cinereus); 631.95 (Coprinus comatus); 629.95 (Coprinus friesii); 627.95 (Coprinus plicatilis); 628.95 (Psathyrella condolleana); 630.95 (Panaeolus papilionaceus), von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Deutschland) DSM 888 (Coprinus radians); 4916 (Coprinus xanthothrix); 3341 (Coprinus sterquilinius). Die Erfindung umfasst auch Polypeptide mit Laccaseaktivität von anderen Pilzen und anderen Vertretern der Familie Coprinaceae, zum Beispiel Laccasen der Gattung Podaxis, Montagnea, Macrometrula, Psathyrella, Panaeolina, Panaeolus, Copelandia, Anellaria, Limnoperdon, Panaelopsis und Polyplocium.
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „erhalten von", wie er hierin in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet wird, bedeuten, dass das Polypeptid von einer Quelle oder von einer Zelle, in die ein Gen von der Quelle eingesetzt worden ist, hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert sind, die unter Standardbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde hybridisieren können, die unter denselben Bedingungen sowohl mit der in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz als auch einem komplementären Strang davon oder einer Untersequenz davon hybridisiert (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York. Die Hybridisierung zeigt an, dass die analoge Nukleinsäuresequenz an die Oligonukleotidsonde entsprechend des Polypeptid-kodierenden Teils der in 1, 2, 3 gezeigten Nulleinsäuresequenz oder einer Untersequenz davon unter mittel- bis hochstringenten Bedingungen (zum Beispiel Prähybridisierng und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μg/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA und entweder 35 oder 50% Formamid für mittlere bzw. hohe Stringenz) entsprechend den Standard-Southern-Blotting-Verfahren hybridisiert.
Die in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenzen oder Untersequenzen davon können verwendet werden, um die Laccasen von anderen Stämmen verschiedener Gattungen oder Arten kodierende DNA gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zu identifizieren und zu klonieren. Daher kann eine genomische oder cDNA-Genbank, die von solch anderen Organismen hergestellt wurde, bezüglich der DNA, die mit der in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenzen oder Untersequenzen davon hybridisiert, durchgemustert werden. Die genomische oder andere DNA von solch anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder andere Trennverfahren aufgetrennt werden. Die DNA von Genbanken oder die aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder anderes geeignetes Trägermaterial übertragen und darauf immobilisiert werden. Um Klone oder DNA, die zu den in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenzen oder Untersequenzen davon homolog sind, zu. identifizieren, wird das Trägermaterial in einem Southern-Blot verwendet, wobei das Trägermaterial schließlich dreimal jeweils durch Verwenden von 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 40°C, stärker bevorzugt nicht höher als 45°C, stärker bevorzugt nicht höher als 50°C, stärker bevorzugt nicht höher als 55°C, noch stärker bevorzugt nicht höher als 60°C, insbesondere nicht höher als 65°C, 30 Minuten gewaschen wird. Die Moleküle, an die die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche mit der in 1, 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz einen Identitätsgrad von mindestens etwa 65%, vorzugsweise etwa 70%, vorzugsweise etwa 75%, vorzugsweise etwa 80%, vorzugsweise etwa 85%, stärker bevorzugt etwa 90%, noch stärker bevorzugt etwa 95% und am stärksten bevorzugt etwa 97% aufweist, und die quantitativ die Aktivität der Polypeptide (nachstehend „homologe Polypeptide") beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz auf, die sich durch fünf Aminosäuren, vorzugsweise durch vier Aminosäuren, stärker bevorzugt durch drei Aminosäuren, noch stärker bevorzugt durch zwei Aminosäuren und besonders bevorzugt durch eine Aminosäure von der in 1, 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz unterscheidet. Der Identitätsgrad zwischen zwei und mehreren Aminosäuresequenzen kann mit Hilfe von den auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen, wie z.B. GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt ist (Needleman und Wunsch, 1970, Journal of Molecular Biology 48: 443–453), bestimmt werden. Zum Zwecke der Bestimmung des Identitätsgrads zwischen zwei Aminosäuresequenzen für die vorliegende Erfindung wird das Clustal-Verfahren (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle, einer Lückenstrafe von 10 und einer Lückenlänge von 10 verwendet.
Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide unterscheiden sich von der in 1, 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz durch eine Einfügung oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten und/oder Austausch von einem oder mehreren Aminosäureresten gegen andere Aminosäurereste. Vorzugsweise sind die Aminosäureaustausche von untergeordneter Natur, das heißt konservative Aminosäureaustausche, die die Faltung und/oder Aktivität des Proteins nicht wesentlich beeinträchtigen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; kurze amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie z.B. ein aminoterminaler Methioninrest; ein kurzes Verbindungspeptid von bis zu etwa 20–25 Resten; oder eine kurze Verlängerung, die die Reini gung durch Änderung der Nettoladung oder einer anderen Funktion, wie z.B. ein Polyhistidintrakt, ein antigenisches Epitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtern.
Beispiele von konservativen Austauschen sind Austausche innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z.B. Arginin, Lysin und Histidin), der sauren Aminosäuren (wie z.B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), der polaren Aminosäuren (wie z.B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie z.B. Leucin, Isoleucin und Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie z.B. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie z.B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäureaustausche, die im Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht ändern, sind auf dem Fachgebiet bekannt und beschrieben, z.B. von H. Neurath und R. L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York. Die am häufigsten vorkommenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, die immunchemische Identität oder teilweise immunchemische Identität mit den natürlichen Polypeptiden von Caprinus cinereus IFO 8371 mit Laccaseaktivität aufweisen. Ein Polypeptid, das immunchemische Identität mit dem natürlichen Polypeptid von Caprinus cinereus IFO 8371 aufweist, bedeutet, dass ein Antiserum, das Antikörper gegen die Antigene des natürlichen Polypeptids enthält, mit den Antigenen des anderen Polypeptids in identischer Art und Weise reagiert, wie z.B. gänzliche Fusion von Niederschlägen, identische Niederschlagsmorphologie und/oder identische elektrophoretische Mobilität, wenn ein bestimmtes immunchemisches Verfahren verwendet wird. Eine weitere Erklärung der immunchemischen Identität ist von Axelsen, Bock und Krøll in N. H. Axelsen, J. Kroll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10 beschrieben. Teilweise immunchemische Identität bedeutet, dass ein Antiserum, das Antikörper gegen die Antigene des natürlichen Polypeptids enthält, mit den Antigenen des anderen Polypeptids in teilweise identischer Art und Weise reagiert, wie z.B. teilweise Fusion von Niederschlägen, teilweise identische Niederschlagsmorphologie und/oder teilweise identische elektrophoretische Mobilität, wenn ein bestimmtes immunchemisches Verfahren verwendet wird. Eine weitere Erklärung der teilweisen immunchemischen Identität ist von Bock und Axelsen in N. H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11 beschrieben. Die immunchemischen Eigenschaften werden durch immunologische Kreuzreaktivitätsidentitätstests mit dem bekannten Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren bestimmt.
Speziell wird ein Antiserum gegen das Polypeptid der Erfindung durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) gemäß den Verfahren, die von Harboe und Ingild in N. H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Herausgeber, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere die Seiten 27–31) beschrieben sind, erzeugt. Monoklonale Antikörper können z.B. gemäß der Verfahren von E. Harlow und D. Lane, Herausgeber, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Gereinigte Immunglobuline können von dem Antiserum z.B. durch Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie (z.B. DEAE-Sephadex) erhalten werden.
Homologe Polypeptide und Polypeptide mit identischen oder teilweise identischen immunologischen Eigenschaften können von Mikroorganismen beliebiger Gattung, vorzugsweise von einer Bakterien- oder Pilzquelle erhalten werden. Quellen für homologe Gene sind Stämme der Familie Coprinaceae, vorzugsweise der Gattung Coprinus und Arten davon, die bei öffentlichen Hinterlegungsstellen verfügbar sind. Des Weiteren können homologe Gene von anderen Quellen einschließ lich der Mikroorganismen, die aus der Natur (z.B. Boden, Kompost, Wasser, usw.) isoliert wurden, unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonden identifiziert und erhalten werden. Die Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen aus natürlichen Standorten sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann durch Durchmustern einer cDNA-Genbank von einem anderen Mikroorganismus in gleicher Weise abgeleitet werden. Sobald eine ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen worden ist, kann die Sequenz durch Verwenden von dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren isoliert oder kloniert werden (siehe z.B. Sambrook et al., vorstehend).
Wie hierin definiert, ist ein „isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen Nicht-Laccase-Polypeptiden ist, z.B. wie durch SDS-PAGE bestimmt mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein, am stärksten bevorzugt etwa 90% rein und aller stärksten bevorzugt etwa 95% rein ist.
Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte, von einem Coprinus-Stamm erhaltene Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nukleinsäuresequenz ein von Coprinus cinereus erhaltenes Polypeptid, und in einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz von Coprinus cinereus IFO 8371, z.B. die in 1, 2 oder 3 dargelegte Nukleinsäuresequenz, erhalten. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid kodieren, das die in 1, 2 oder 3 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, und die sich von der in 1, 2 bzw. 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden.
Wie vorstehend beschrieben, können die Nukleinsäuresequenzen von Mikroorganismen, die mit Coprinus gleichbedeutend sind, wie von Webster, 1980, vorstehend, definiert, erhalten werden.
Die Verfahren, die verwendet wurden, um eine Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz zu isolieren oder zu klonieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus der cDNA oder eine Kombination davon ein. Die Klonierung der Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung aus derartiger genomischer DNA kann z.B. durch Verwenden der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) bewerkstelligt werden; siehe z.B. Innis et al., 1990, A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Die Nukleinsäuresequenz kann von einem Polypeptid-herstellenden Coprinus-Stamm oder einem anderen oder verwandten Organismus kloniert werden und daher zum Beispiel eine allelische oder eine Artenvariante des Polypeptid kodierenden Bereichs der Nukleinsäuresequenz sein.
Der wie hierin verwendete Begriff „isolierte Nukleinsäuresequenz", betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert und die durch die in der Gentechnik verwendeten Standardklonierungsverfahren isoliert wird, um die Nukleinsäuresequenz von ihrem natürlichen Standort an einen anderen Ort zu verlagern, wo sie kopiert wird. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments, das die Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, das Einfügen des Fragments in ein Vektormolekül und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäure repliziert werden, umfassen. Bei der Nukleinsäuresequenz kann es sich um einen genomischen, cDNA-, RNA-, halbsynthetischen oder synthetischen Ursprung oder eine beliebige Kombinationen davon handeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, welche mit der in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder Untersequenzen davon einen Identitätsgrad von mindestens etwa 65%, vorzugsweise etwa 70%, vorzugsweise etwa 75%, vorzugsweise etwa 80%, vorzugsweise etwa 85%, stärker bevorzugt etwa 90%, noch stärker bevorzugt etwa 95% und am stärksten bevorzugt etwa 97% aufweist, und die ein aktives Polypeptid kodieren.
Der Identitätsgrad zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen kann mit Hilfe von den auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen, wie z.B. GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt ist (Needleman und Wunsch, 1970, Journal of Molecular Biology 48: 443–453), bestimmt werden. Zum Zwecke der Bestimmung des Identitätsgrads zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen für die vorliegende Erfindung wird das Clustal-Verfahren (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle, einer Lückenstrafe von 10 und einer Lückenlänge von 10 verwendet.
Die Modifikation der Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz kann für die Synthese von Polypeptiden, die im Wesentlichen dem Polypeptid ähneln, notwendig sein. Der Begriff „im Wesentlichen" dem Polypeptid „ähneln" betrifft die nicht natürlich vorkommenden Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich in etwas konstruierter Art und Weise vom aus seiner natürlichen Quelle isolierten Polypeptid unterscheiden. Zum Beispiel kann es interessant sein, Varianten des Polypeptids zu synthetisieren, wobei sich die Varianten in der spezifischen Aktivität, Thermostabilität, im pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden, indem z.B. die ortsspezifische Mutagenese verwendet wird.
Die analoge Sequenz kann auf der Basis der Nukleinsäuresequenz, die als Polypeptid-kodierender Teil der in 1, 2 oder 3 dargelegten Nukleinsäuresequenzen, z.B. eine Untersequenz davon, abgebildet ist, und/oder durch Einführung von Nukleotidaustauschen, die nicht zu einer anderen Aminosäurese quenz des durch die Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptids führen, die jedoch der Codonverwendung des für die Enzymherstellung vorgesehenen Wirtsorganismus entsprechen, oder durch Einführung von Nukleotidaustauschen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führen, konstruiert werden. Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotidaustauschen siehe z.B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95–107.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass derartige Austausche außerhalb der für die Funktion des Moleküls kritischen Bereiche durchgeführt werden können und immer noch zu einem aktiven Polypeptid führen. Die Aminosäurereste, die für die Aktivität des durch die isolierte Nukleinsäuresequenz der Erfindung kodierten Polypeptids wesentlich sind, und deshalb vorzugsweise nicht Ziel für den Austausch sind, können gemäß der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Durchmusterungsmutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085) identifiziert werden. In dem letzteren Verfahren werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt und die so erhaltenen Mutantenmoleküle werden auf Laccaseaktivität getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Die Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch die Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, wie sie z.B. durch solche Verfahren wie Kernspinresonanz-Analyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de Vos et al., 1992, Science 255, 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309, 59–64) bestimmt wird.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen auch fusionierte Polypeptide ein, in denen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder C-Terminus des Polypeptids oder ein Fragment davon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die (der) ein anderes Polypeptid kodiert, an die Nukleinsäuresequenz (oder einen Teil davon) der vorliegenden Erfindung hergestellt. Verfahren zum Herstellen von Fusionspolypeptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen das derartige Ligieren der kodierenden Sequenzen ein, die die Polypeptide kodieren, dass sie sich im Leseraster befinden und dass die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle desselben Promoters (derselben Promotoren) und Terminators steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde hybridisieren können, welche unter denselben Bedingungen mit der in 1, 2, 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz, einer Untersequenz davon oder ihrem komplementären Strang hybridisiert (Sambrook et al., vorstehend). Die Hybridisierung zeigt an, dass die analoge Nukleinsäuresequenz an die Oligonukleotidsonde, die dem Polypeptid kodierenden Teil der in 1, 2 oder 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz entspricht, unter Standardbedingungen hybridisiert.
Die in 1, 2 oder 3 dargelegte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäureteilsequenz davon kann dafür verwendet werden, um eine Oligonukleotidsonde zu entwerfen, oder ein Gen, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, oder eine Untersequenz davon kann auch als Sonde verwendet werden, um homologe Gene einer beliebigen Gattung oder Art zu isolieren. Insbesondere können derartige Sonden zur Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA der relevanten Gattung oder Art entsprechend der Standard-Southern-Blotting-Verfahren verwendet werden, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Derartige Sonden können beträchtlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollten jedoch mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 40 Nukleotide lang sein. Längere Sonden, vorzugsweise nicht länger als 1200 Nukleotide, können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden können zum Nachweisen des entsprechenden Gens typischerweise markiert werden (zum Beispiel mit ³²P, ³H, Biotin oder Avidin). Eine PCR-Reaktion unter Verwendung der hierin erwähnten degenerierten Sonden und der genomischen DNA oder Erststrang-cDNA von Coprinus cinereus kann auch ein für die Laccase von Coprinus cinereus spezifisches Produkt liefern, das dann als eine Sonde verwendet werden kann, um die entsprechende genomische oder cDNA zu klonieren.
Nuleleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, die funktionell mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verbunden ist, welche die Expression der kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen vereinbar sind, regulieren kann.
Das „Nukleinsäurekonstrukt" ist hierin als ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, definiert, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wurde oder das so modifiziert wurde, dass es Abschnitte der Nukleinsäure enthält, die in einer Art und Weise kombiniert und aneinander gefügt sind, die in der Natur sonst nicht existieren würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt kann mit dem Begriff Expressionskassette gleichgesetzt werden, wenn das Nukleinsäurekonstrukt all die Kontrollsequenzen enthält, die für die Expression einer kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung erforderlich sind. Der Begriff „kodierende Sequenz" ist wie hierin definiert eine Sequenz, die in eine mRNA transkribiert und in ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle der vorstehend erwähnten Kontrollsequenzen gestellt wird. Die Abgrenzungen einer kodierenden Sequenz werden im Allgemeinen durch ein Translationsstartcodon ATG am 5'-Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann eine DNA, eine cDNA und rekominante Nukleinsäuresequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in vielfältiger Art und Weise manipuliert werden, um die Ex pression des Polypeptids zu gewährleisten. Die Manipulation der Polypeptidkodierenden Nukleinsäuresequenz kann vor ihrer Einfügung in einen Vektor abhängig vom Expressionsvektor erwünscht oder notwendig sein. Die Verfahren zum Modifizieren der Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Klonierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" ist hierin so definiert, dass alle Komponenten, die für die Expression der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz notwendig oder vorteilhaft sind, eingeschlossen sind. Jede Kontrollsequenz kann für die Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz natürlich oder fremd sein. Derartige Kontrollsequenzen schließen eine Führungssequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promoter, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Mindestens schließen die Kontrollsequenzen einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können mit Verbindungsgruppen zum Zwecke der Einführung von bestimmten Restriktionsschnittstellen, die die Ligation der Kontrollsequenzen mit dem kodierenden Bereich der Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz erleichtern, versehen sein.
Bei der Kontrollsequenz kann es sich um eine geeignete Promotersequenz, eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird handeln. Die Promotersequenz enthält Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promoter kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, die Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, die zur Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind.
Beispiele geeigneter Promotoren zur Regulation der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung, insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren, die von dem lac-Operon von E. coli, dem Agara se-Gen (dagA) von Streptomyces coelicolor, dem Levansucrase-Gen (sacB) von Bacillus subtilis, dem alpha-Amylase-Gen (amyL) von Bacillus licheniformis, dem maltogenen Amylase-Gen von (amyM) von Bacillus stearothermophilus, dem alpha-Amylase-Gen (amyO) von Bacillus amyloliquefaciens, dem Penicillinase-Gen (penP) von Bacillus licheniformis, den xylA- und xylB-Genen von Bacillus subtilis und dem prokaryotischen beta-Lactamasegen (Villa-Karnaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731) sowie dem tac-Gen (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25) erhalten wurden. Weitere Promotoren sind in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94 und in Sambrook et al., 1989, vorstehend, beschrieben.
Beispiele geeigneter Promotoren zur Regulation der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung in einer Fadenpilzwirtszelle sind Promotoren, die von Genen, kodierend die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Aspartam-Proteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, die säurestabile alpha-Amylase von Aspergillus niger, die Glucoamylase (glaA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von Aspergillus oryzae, die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae, die Acetamidase Aspergillus nidulans, die trypsinähnliche Protease von Fusarium oxysporum (wie im U.S.-Patent Nr. 4,288,627, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben), und den Hybriden davon erhalten wurden. Besonders bevorzugte Promotoren zur Verwendung in Fadenpilzwirtszellen sind die TAKA-Amylase, NA2-tpi- (ein Hybrid der Promotoren von den Genen, die die neutrale α-Amylase von Aspergillus niger und die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren) und glaA-Promotoren.
In einem Hefewirt werden verwendbare Promotoren von dem Enolase(ENO-1)-Gen von Saccharomyces cerevisiae, dem Galactokinase-Gen (GAL-1) von Saccharomyces cerevisiae, den Alkoholdehydrogenase-/Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase-Genen (ADH2/GAP) von Saccharomyces cerevisiae und dem 3-Phosphoglyceratkinase-Gen von Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere verwendbare Promotoren für Hefewirtszellen sind von Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423–488, beschrieben.
In einer Säugerwirtszelle schließen verwendbare Promotoren virale Promotoren, wie z.B. jene vom Simian-Virus 40 (SV40), Rous-sarcoma-Virus (RSV), Adenovirus und Rinder-Papillomavirus (BPV) ein.
Bei der Kontrollsequenz kann es sich auch um eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine Sequenz, die von einer Wirtszelle zur Transkriptionstermination erkannt wird, handeln. Die Terminatorsequenz ist funktionell mit dem 3'-Terminus der Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verbunden. Jeder beliebige Terminator, der in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Terminatoren für Fadenpilzwirtszellen werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans, die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger und die trypsinähnliche Protease von Fusarium oxysporum kodieren.
Bevorzugte Terminatoren für Hefewirtszellen werden von den Genen erhalten, die die Enolase von Saccharomyces cervisiae, das Cytochrom C (CYC1) von Saccharomyces cerevisiae oder die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase von Saccharomyces cerevisiae kodieren. Andere verwendbare Terminatoren für Hefewirtszellen sind von Romanos et al., 1992, vorstehend, beschrieben. Die Terminatorsequenzen für Säugerwirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Bei der Kontrollsequenz kann es sich auch um eine geeignete Führungssequenz, einen nicht translatierten Bereich einer mRNA handeln, der für die Translation durch die Wirtszelle wichtig ist. Die Führungssequenz ist funktionell mit dem 5-Terminus der Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verbinden. Jede be liebige Sequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Führungssequenzen für Fadenpilzwirtszellen können von den Genen, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae und die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren, erhalten werden.
Geeignete Führungssequenzen für Hefewirtszellen werden von dem Enolase(ENO-1)-Gen von Saccharomyces cervisiae, dem 3-Phosphoglyceratkinase-Gen von Saccharomyces cerevisiae, dem alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae und den Alkoholdehydrogenase-/Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Genen (ADH2/GAP) von Saccharomyces cerevisiae erhalten.
Bei den Kontrollsequenzen kann es sich auch um eine Polyadenylierungssequenz, eine Sequenz, die funktionell mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz verbunden ist und die, wenn sie transkribiert wird, von der Wirtszelle als ein Signal zur Hinzufügung von Polyadenosinresten an die transkribierte mRNA erkannt wird, handeln. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für Fadenpilzwirtszellen werden von den Genen erhalten, die die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Glucoamylase von Aspergillus niger, die Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans und die alpha-Glucosidase von Aspergillus niger kodieren. Verwendbare Polyadenylierungssequenzen für Hefewirtszellen sind von Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983–5990, beschrieben. Polyadenylierungssequenzen für Säugerwirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Bei der Kontrollsequenz kann es sich auch um einen Signalpeptid-kodierenden Bereich handeln, der eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoterminus des Polypeptids verbunden ist und die das exprimierte Polypeptid in den sekretorischen Pfad der Zelle führen kann. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann schon an sich einen Signalpeptid-kodierenden Bereich enthalten, der naturgemäß im Translationsleseraster mit dem Abschnitt des kodierenden Bereichs, der das sezernierte Polypeptid kodiert, verbunden ist. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Signalpeptid-kodierenden Bereich enthalten, der zu dem das sezernierte Polypeptid kodierenden Teil der kodierenden Sequenz fremd ist. Der das fremde Signalpeptid kodierende Bereich kann dort erforderlich sein, wo die kodierende Sequenz in der Regel keinen Signalpeptid-kodierenden Bereich enthält. Alternativ kann der das fremde Signalpeptid kodierende Bereich einfach den Bereich ersetzen, der das natürliche Signalpeptid kodiert, um eine gesteigerte Sekretion der Laccase bezüglich des natürlichen Signalpeptid-kodierenden Bereichs, der normalerweise mit der kodierenden Sequenz verbunden ist, zu erhalten. Der Signalpeptid-kodierende Bereich kann von einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen von einer Aspergillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinasegen von einer Rhizoarucor-Spezies, dem Gen für den α-Faktor von Saccharomyces cerevisiae, einem Amylase- oder einem Proteasegen von einer Bacillus-Spezies oder dem Kalbspräprochymosin-Gen erhalten werden. Jedoch kann jeder beliebige Signalpeptid-kodierende Bereich, der die exprimierte Laccase in den sekretorischen Pfad einer Wirtszelle der Wahl führen kann, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bei einem ein wirksames Signalpeptid kodierenden Bereich für bakterielle Wirtszellen handelt es sich um den Signalpeptid-kodierenden Bereich, der von dem Gen der maltogenen Amylase von Bacillus NCIB 11837, dem alpha-Amylase-Gen von Bacillus stearothermophilus, dem Subtilisin-Gen von Bacillus licheniformis, dem beta-Lactamase-Gen von Bacillus licheniformis, den Genen der neutralen Proteasen (nprT, nprS, nprM) von Bacillus stearothermophilus und dem PrsA-Gen von Bacillus subtilis erhalten wird. Weitere Signalpeptide sind von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109–137, beschrieben.
Bei einem ein wirksames Signalpeptid kodierenden Bereich für Fadenpilzwirtszellen handelt es sich um den Signalpeptid-kodierenden Bereich, der von dem TAKA-Amylase-Gen von Aspergillus oryzae, dem Gen der neutralen Amalyse von Aspergillus niger, dem Aspartatproteinase-Gen von Rhizomucor miehei, dem Cellulase-Gen von Humicola lanuginosa oder dem Lipase-Gen von Rhizomucor miehei erhalten wird.
Verwendbare Signalpeptide für Hefewirtszellen werden von den Genen für den alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae und die Invertase von Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere verwendbare, Signalpeptid-kodierende Bereiche sind von Romanos et al., 1992, vorstehend, beschrieben.
Bei der Kontrollsequenz kann es sich auch um einen Propeptid-kodierenden Bereich handeln, der eine Aminosäuresequenz kodiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das so erhaltene Polypeptid ist als ein Proenzym oder Propolypeptid (oder in manchen Fällen Zymogen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids vom Propolypeptid zu einem reifen aktiven Polypeptid umgewandelt werden. Der Propeptid-kodierende Bereich kann von dem Gen der alkalischen Protease (aprE) von Bacillus subtilis, dem Gen der neutralen Protease (nprT) von Bacillus subtilis, dem alpha-Faktor-Gen von Saccharomyces cerevisiae oder dem Laccase-Gen von Myceliophthora thermophilum (WO 95/33836) erhalten werden.
Die Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung können auch eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die einen oder mehrere Faktoren kodieren, die für die Expression des Polypeptids vorteilhaft sind, z.B. einen Aktivator (z.B. einen trans-agierenden Faktor), ein Chaperon und eine verarbeitende Protease umfassen. Jeder beliebige Faktor, der in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die einen oder mehrere dieser Faktoren kodierenden Nukleinsäuren befinden sich nicht notwendigerweise in Tandemanordnung mit der Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz.
Ein Aktivator ist ein Protein, das die Transkription einerein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz aktiviert (Kudla et al., 1990, EMBO Journal 9: 1355–1364; Jarai und Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238–2244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271–297).
Die einen Aktivator kodierende Nukleinsäuresequenz kann von den Genen erhalten werden, die die NprA (nprA) von Bacillus stearothermophilus, das Hämaktivatorprotein 1 (hap1) von Succharomyces cervisiae, das Galaktose metabolisierende Protein 4 (gal4) von Saccharomomyces cerevisiae und das Ammoniakregulationsprotein (areA) von Aspergillus nidulans kodieren. Für weitere Beispiele siehe Verdier, 1990, vorstehend, und MacKenzie et al., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295–2307.
Ein Chaperon ist ein Protein, das ein anderes Polypeptid dabei unterstützt, sich richtig zu falten (Hartl et al., 1994, TIBS 19: 20–25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124–128, Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnolngy 32: 179–189; Craig, 1993, Science 260: 1902–1903; Gething und Sambrook, 1992, Nature 355: 33–45; Puig und Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764–7771; Wang und Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515–11157; Robinson et al., 1994, Bio/Technology 1: 381–384). Die ein Chaperon kodierende Nukleinsäuresequenz kann von den Genen erhalten werden, die die GroE-Proteine von Bacillus subtilis, die Proteindisulfidisomerase von Aspergillus oryzae, das Calnexin von Saccharomyces cervisiae, das BiP/GRP78 von Saccharomyces cervisiae und das Hsp70 von Saccharomyces cerevisiae kodieren. Für weitere Beispiele siehe Gething und Sambrook, 1992, vorstehend, und Hartl et al., 1994, vorstehend.
Eine verarbeitende Protease ist eine Protease, die ein Propeptid abspaltet, um ein reifes, biochemisch aktives Polypeptid zu erzeugen (Enderlin und Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67–79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434–1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075–1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839–852). Die eine verarbeitende Protease kodierende Nukleinsäuresequenz kann von den Genen erhalten werden, die die Dipeptidylaminopeptidase von Saccharomyces cerevisiae, das Kex2 von Saccharomyces cerevisiae und die zweibasig arbeitende Endoprotease (xpr6) von Yarrowia lipolytica kodieren.
Es kann auch erwünscht sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression des Polypeptids bezüglich des Wachstums der Wirtszellen erlauben. Beispiele von regulatorischen Systemen sind jene, die bewirken, dass die Expression des Gens als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich der Anwesenheit einer regulatorischen Verbindung, angeschaltet oder abgeschaltet ist. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen würden die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme einschließen. In der Hefe kann das ADH2-System oder GAL1-System verwendet werden. Im Fadenpilz können der TAKA-alpha-Amylase-Promoter, der Glucoamylase-Promoter von Aspergillus niger und der Glucoamylase-Promoter von Aspergillus oryzae als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Andere Beispiele regulatorischer Sequenzen sind jene, die die Genamplifikation ermöglichen. In eukaryotischen Systemen schließen diese das Dihydrofolatreduktase-Gen, das in Anwesenheit von Methotrexat amplifiziert wird, und die Metallothionein-Gene, die mit Schwermetallen amplifiziert werden, ein. In diesen Fällen wäre die Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz in Reihe mit der regulatorischen Sequenz angeordnet.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstoppsignale umfassen. Die verschiedenen, vor stehend beschriebenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen können zusammengefügt werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere günstige Restriktionsschnittstellen beinhalten kann, um die Einfügung oder den Austausch von Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen an derartigen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch Einfügen der Nukleinsäuresequenz oder eines die Sequenz umfassenden Nukleinsäurekonstrukts in einen geeigneten Vektor für die Expression exprimiert werden. Zur Erzeugung des Expressionsvektors wird die kodierende Sequenz in den Vektor so lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionell mit den geeigneten Kontrollsequenzen für die Expression und eventuell Sekretion verbunden ist.
Bei dem rekombinanten Expressionsvektor kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der den DNA-Rekombinationsverfahren in einfacher Weise unterzogen werden und die Expression der Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird üblicherweise von der Vereinbarkeit des Vektors mit der Wirtszelle abhängen, in die der Vektor eingeführt werden soll. Die Vektoren können lineare oder geschlossene, zirkuläre Plasmide sein. Bei dem Vektor kann es sich um einen selbstständig replizierenden Vektor, d.h. einen Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom handeln. Der Vektor kann beliebige Vorrichtungen, die die Selbstreplikation sicherstellen, enthalten. Alternativ kann es sich bei dem Vektor um einen Vektor handeln, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom integriert wird und zusammen mit dem(n) Chromosom(en), in das(die) er integriert wurde, repliziert wird. Bei dem Vektorsystem kann es sich um einen einzelnen Vektor oder ein Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte in das Genom der Wirtszelle einzuführende DNA enthalten, oder ein Transposon handeln.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise eine oder mehrere selektierbare Markierungen, die eine einfache Selektion der transformierten Zellen erlauben. Eine selektierbare Markierung ist ein Gen, dessen Produkt Biozid- oder virale Resistenz, Resistenz gegen Schwermetalle, den Auxotrophen Prototrophie, und dergleichen verleiht. Beispiele von bakteriellen selektierbaren Markierungen sind die dal-Gene von Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Markierungen, die eine Antibiotikum-Resistenz, wie z.B. Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Restistenz, verleihen.
Eine häufig verwendete Markierung bei Säugetieren ist das Dihydrofolatreduktase-Gen. Geeignete Markierungen für Hefewirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU3, LYS2, MET3, TRP1 und URA3. Eine selektierbare Markierung zur Verwendung in einer Fadenpilzwirtszelle kann ausgewählt sein aus der Gruppe, einschließend, jedoch nicht beschränkend auf, amdS (Acetamidase), argB (Ornithin-Carbamoyltransferase), bar (Phosphinothricin-Acetyltransferase), hygB (Hygromycin-Phosphotransferase), niaD (Nitrat-Reduktase), pyrG (Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase), sC (Sulfat-Adenyltransferase), trpC (Anthranilat-Synthase) und Glufosinat-Resistenz-Markierungen sowie Pendants von anderen Spezies. Zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle bevorzugt sind die amdS- und pyrG-Markierungen von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und die bar-Markierung von Streptomyces hygroscopicus. Des Weiteren kann die Selektion durch Kotransformation, z.B. wie in WO 91/17243 beschrieben, bei der die selektierbare Markierung sich auf einem separaten Vektor befindet, bewerkstelligt werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise (ein) Element(e), das (die) eine stabile Integration des Vektors in das Wirtszellgenom oder die selbstständige Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig vom Genom der Zelle erlaubt (erlauben).
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in das Wirtszellgenom integriert werden, wenn sie in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zur Integration kann der Vektor auf die Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein beliebiges anderes Element des Vektors für die stabile Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination angewiesen sein. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zur Regulation der Integration in das Genom der Wirtszelle durch homologe Rekombination enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an (einer) bestimmten Stelle(n) in dem (den) Chromosom(en) integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einer bestimmten Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäuren wie z.B. 100 bis 1500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1500 Basenpaare und am stärksten bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare enthalten, die zu der entsprechenden Zielsequenz hochgradig homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu erhöhen. Bei den Integrationselementen kann es sich um eine beliebige Sequenz handeln, die zu der Zielsequenz im Genom der Wirtszelle homolog ist. Des Weiteren kann es sich bei den Integrationselemnten um nicht kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen handeln. Andererseits kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nicht homologe Rekombination integriert werden. Diese Nukleinsäuresequenzen können eine beliebige Sequenz sein, die zu einer Zielsequenz im Genom der Wirtszelle homolog ist, und können darüber hinaus nicht kodierende oder kodierende Sequenzen sein.
Zur selbstständigen Replikation kann der Vektor des Weiteren einen Replikationsursprungspunkt umfassen, der es dem Vektor ermöglicht, in der fraglichen Wirtszelle selbstständig zu replizieren. Beispiele bakterieller Replikationsursprungspunkte sind die Replikationsursprungspunkte der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1. Beispiele von Replikationsursprungspunkten zur Verwendung in Hefewirtszellen sind der 2-Mikron-Replikationsursprungspunkt, die Kombination von CEN6 und ARS4 und die Kombination von CEN3 und ARS1. Bei dem Replikation sursprungspunkt kann es sich um einen Replikationsursprungspunkt handeln, der eine Mutation aufweist, die seine Funktion in der Wirtszelle temperaturempfindlich werden lässt (siehe z.B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Es kann mehr als eine Kopie einer ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodierenden Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle eingeführt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu verstärken. Die stabile Amplifikation der Nukleinsäuresequenz kann durch Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom durch Verwenden von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren und Selektieren von Transformanten erzielt werden.
Die Verfahren, die verwendet wurden, um die vorstehend beschriebenen Elemente zu ligieren, um den rekombinanten Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung zu konstruieren, sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, vorstehend).
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, die eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung umfassen und die für die rekombinante Herstellung der Polypeptide zweckmäßigerweise verwendet werden. Die Zelle ist vorzugsweise mit einem Vektor transformiert, der eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung umfasst, gefolgt von der Integration des Vektors in das Wirtschromosom. „Transformation" bedeutet das Einführen eines eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfassenden Vektors in eine Wirtszelle, so dass der Vektor als ein chromosomaler Bestandteil oder als ein selbst replizierender extrachromosomaler Vektor bewahrt wird. Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil angesehen, da es wahrscheinlicher ist, dass die Nukleinsäuresequenz in der Zelle stabil bewahrt wird. Die Integration des Vektors in das Wirtschromosom kann durch homologe oder nicht homologe Rekombination, wie vorstehend beschrieben, erfolgen.
Die Wahl einer Wirtszelle wird weitgehend vom Polypeptid kodierenden Gen und seiner Quelle abhängen. Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus oder ein nicht einzelliger Mikroorganismus sein. Verwendbare einzellige Zellen sind bakterielle Zellen, wie z.B. gram-positive Bakterien, einschließlich, jedoch nicht beschränkend auf, eine Bacillus-Zelle, z.B. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium und Bacillus thuringiensis oder eine Streptomyces-Zelle z.B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien, wie z.B. E. coli und Pseudomonas sp. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Bacillus lentus-, eine Zelle von Bacillus licheniformis-, eine Bacillus subtilis- oder eine Bacillus stearothermophilus. Die Transformation einer bakteriellen Wirtszelle kann zum Beispiel durch Protoplastentransformation (siehe z.B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111–115), durch Verwenden kompetenter Zellen (siehe z.B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnar und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), durch Elektroporation (siehe z.B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6: 742–751) oder durch Konjugation (siehe z.B. Koehler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771–5278) bewerkstelligt werden.
Bei der Wirtszelle kann es sich um einen Eukaryoten, wie z.B. eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder vorzugsweise eine Pilzzelle handeln. Verwendbare Säugerzellen umfassen Zellen des Eierstocks vom Chinesischen Zwerghamster (CHO), HeLa-Zellen, Zellen von Baby-Hamster-Nieren (BHK), COS-Zellen oder eine beliebige Anzahl anderer immortalisierter Zelllinien, die z.B. bei der American Type Culture Collection erhältlich sind. Bei den Pilzwirtszellen kann es sich um eine Hefezelle oder eine Fadenpilzzelle handeln.
„Hefe" schließt wie hierin verwendet die ascosporogene Hefe (Endomycetales), die basidiosporogene Hefe und die Hefe, die zu den Fungi Imperfecti (Blastomycetes) gehört, ein. Die ascosporogenen Hefen sind in die Familien der Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae unterteilt. Die Letztere umfasst vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (z.B. die Gattung Schizosaccharomyces), Nasonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z.B. die Gattungen Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die basidiosporogenen Hefen schließen die Gattungen Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella ein. Die Hefen, die zu den Fungi Imperfecti gehören, sind in zwei Familien, die Sporobolomycetaceae (z.B. die Gattungen Sporobolomyces und Bullera) und die Cryptococcaceae (z.B. die Gattung Candida) unterteilt.
Da die Unterteilung der Hefe sich zukünftig ändern kann, soll für die Zwecke dieser Erfindung die Hefe so definiert sein, wie es in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. und Davenport, R. R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium, Folge-Nr. 9, 1980) beschrieben ist. Die Biologie der Hefe und die Manipulation der Hefegenetik sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Biochemistry und Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B. J. und Stopani, A. O. M., Herausgeber, 2. Auflage, 1987; The Yeasts, Rose, A. H. und Harrison, J. S., Herausgeber, 2. Auflage, 1987; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., Herausgeber, 1981).
„Pilze" schließt wie hierin verwendet die Stämme Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie von Hawksworth et al., in Ainsworth und Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Auflage, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK, definiert), sowie die Oomycota (wie in Hawksworth et al., 1995, vorstehend, Seite 171 zitiert) und alle „Mitosporic Fungi" (Hawksworth et al., 1995, vorstehend) ein. Repräsentative Gruppen von Ascomycota schließen z.B. Neurospora, Eupenicillium (= Penicillium), Eimericella (= Aspergillus), Eurotium (= Aspergillus) und die echten, vorstehend aufgelisteten Hefen ein. Bei spiele von Basidiomycota schließen Champignons, Rostpilze und Brand ein. Repräsentative Gruppen von Chytridiomycota schließen z.B. Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces und Wasserpilze ein. Repräsentative Gruppen von Oomycota schließen z.B. saprolegniomycete Wasserpilze (Wasserschimmelpilze) wie z.B. Achlya ein. Beispiele von „Mitosporic Fungi" schließen Aspergillus, Penicillium, Candida und Alternaria ein. Repräsentative Gruppen von Zygomycota schließen z.B. Rhizopus und Mucor ein.
Die „Fadenpilze" schließen alle fadenförmige Formen der Unterabteilung Eumycota und Oomycota (wie von Hawksworth et al., 1995, vorstehend, definiert) ein. Die Fadenpilze sind durch ein vegetatives Myzel, das aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden zusammengesetzt ist, gekennzeichnet. Das vegetative Wachstum erfolgt durch Hyphenverlängerung, und der Kohlenstoffabbau ist obligat aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum von Hefen, wie z.B. Saccharomyces cervisiae, durch Knospung eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoffabbau kann fermentativ sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Pilzwirtszelle um eine Hefezelle. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Hefewirtszelle um eine Zelle der Spezies Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia oder Yarrowia. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Hefewirtszelle um eine Zelle von Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis. In einer anderen, am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Hefewirtszelle um eine Zelle von Kluyveromyces lactis. In einer anderen, am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Hefewirtszelle um eine Zelle von Yarrowia liplytica.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Pilzwirtszelle um eine Fadenpilzzelle. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilzwirtszelle eine Zelle der Spezies Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma, ist jedoch nicht darauf beschränkt In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Fadenpilzwirtszelle um eine Aspergillus-Zelle. In einer anderen noch stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Fadenpilzwirtszelle um eine Fusarium-Zelle. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Fadenpilzwirtszelle um eine Zelle von Aspergillus oryzae, Aspergillus nige-, Aspergillus foetidus oder Aspergillus japonicus. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Fadenpilzwirtszelle um eine Zelle von Fusarium oxysporum oder Fusarium graminearum.
Pilzzellen können durch ein Verfahren, das die Protoplastenbildung, die Transformation der Protoplasten und die Regeneration der Zellwand umfasst, in einer an sich bekannten Art und Weise transformiert werden. Geeignete Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474 beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Fusarium-Spezies ist von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in der mitanhängigen US-Serien-Nr. 08/269,449 beschrieben. Hefen können transformiert werden, indem die Verfahren, die von Becker und Guarente, in Abelson, J. N. und Simon, M. I., Herausgeber, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Band 194, S. 182–187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920, beschrieben sind, verwendet werden. Säugerzellen können durch direkte Aufnahme unter Verwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahrens von Graham und Van der Eb (1978, Virology 52: 546) transformiert werden.
Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, die (a) Züchten eines Coprinus-Stamms zur Herstellung eines das Polypeptid umfassenden Überstands und (b) Gewinnen des Polypeptids umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, die (a) Züchten einer Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids förderlich sind, und (b) Gewinnen des Polypeptids umfassen.
Bei beiden Verfahren werden die Zellen in einem für die Herstellung des Polypeptids geeigneten Nährmedium unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gezüchtet sind. Zum Beispiel können die Zellen durch Züchtung im Schüttelkolben, Fermentation im Klein- oder Großmaßstab (einschließlich kontinuierlicher, absatzweiser, absatzweiser mit Zufuhr, oder Festkörper Fermentationen) in Labor- oder Industriefermentern gezüchtet werden, die in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die das Exprimieren und/oder Isolieren des Polypeptids erlauben, durchgeführt werden. Die Züchtung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (siehe z.B. Literaturhinweise für Bakterien und Hefe; Bennett, J. W. und LaSure, L., Herausgeber, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Geeignete Medien sind bei kommerziellen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Zusammensetzungen (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, wird es aus Zelllysaten gewonnen.
Die Polypeptide können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, die für die Polypeptide spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren können die Verwendung spezifischer Antikörper, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Zum Beispiel kann ein Enzymtestverfahren verwendet werden, um die Aktivität des Polypeptids zu bestimmen. Verfahren zum Bestimmen der Laccase-Aktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen z.B. die Oxidation von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) (Childs et al., 1975, Biochemical Journal 145: 93–103) oder Syringaldazin (Bauer et al., 1971, Analytical Chemistry 43: 421–425) als Substrat ein.
Das so erhaltene Polypeptid kann durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch herkömmliche Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Verdampfung oder Fällung gewonnen werden. Das gewonnene Polypeptid kann dann weiter durch eine Vielfalt chromatographischer Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, gereinigt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielfalt von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Chromatographie (z.B. Ionenaustausch, Affinität, hydrophobe, Chromatofokussierung und Größenausschluss), elektrophoretische Verfahren (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung (IEF)), differenzielle Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfatfällung) oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Herausgeber, VCH Publishers, New York, 1989).
Verwendungen
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in etlichen verschiedenen industriellen Verfahren verwendet werden. Diese Verfahren schließen Polymerisation von Lignin, sowohl vom Kraft-Typ als auch Lignosulfate, in Lösung ein, um ein Lignin mit einem höheren Molekulargewicht herzustellen. Eine neutrale/alkalische Laccase ist besonders vorteilhaft, da das Kraft-Lignin bei höheren pH-Werten löslicher ist. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in Jin et al., 1991, Holzforschung 45: 467–468; US-Patent Nr. 4,432,921; EP 0 275 544 ; PCT/DK93/00217, 1993, beschrieben. Die Laccase ist auch für die Copolymerisation von Lignin mit Verbindungen niederen Molekulargewichts verwendbar, derart wie es von Milstein et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 760–767, beschrieben ist.
Die Laccase der vorliegenden Erfindung kann auch für die Depolymerisation in situ von Lignin in Kraft-Zellstoff verwendet werden und dabei einen Zellstoff mit niedrigerem Ligningehalt herstellen. Diese Verwendung der Laccase stellt eine Verbesserung gegenüber der derzeitigen Verwendung von Chlor zur Depolymerisierung von Lignin dar, das zur Herstellung von chlorierten aromatischen Verbindungen führt, die ein ökologisch unerwünschtes Abfallprodukt der Papierfabriken sind. Derartige Verwendungen sind zum Beispiel in Current Opinion in Biotechnology 3: 261–266, 1992; Journal of Biotechnology 25: 333–339, 1992; Hiroi et al., 1976, Svensk Papperstidning 5: 162–166, 1976, beschrieben. Da die Umgebung in einer Papierfabrik typischerweise alkalisch ist, ist die vorliegende Laccase für diesen Zweck besser verwendbar als andere bekannte Laccasen, die am besten unter sauren Bedingungen funktionieren.
Die Oxidation von Farbstoffen oder Farbstoffvorstufen und anderer farbgebender Verbindungen führt zur Entfärbung der Verbindungen. Die Laccase kann für diesen Zweck, der in einer Situation, in der eine Farbstoffübertragung zwischen Fasern unerwünscht ist, z.B. in der Textilindustrie und in der Waschmittelindustrie besonders vorteilhaft sein kann, verwendet werden. Verfahren zur Hemmunung der Farbstoffübertragung und Farbstoffoxidation sind in WO 92101406; WO 92/18683; WO 92/18687; WO 91/05839; EP 0495836 ; Calvo, 1991, Mededelingen van de Faculteit Landbouw-wetenschappen/Rijiksuniversitet Gent. 56: 1565–1567; Tsujino et al. 1991, J. Soc. Chem. 42: 273–282, zu finden. Die Laccasen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Oxidation bei einem hohen pH-Wert, d.h. über einem pH-Wert von 7 verwendbar, wie es in DIC 0982/94, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, offenbart ist. Die Verwendung der Laccase zur Oxidation von Farbstoffvorläufern zur Haarfärbung ist in dem U.S.-Patent Nr. 3,251,742 offenbart, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Die vorliegende Laccase kann auch zur Polymerisation oder Oxidation phenolischer Verbindungen, die in Flüssigkeiten vorliegen, verwendet werden. Ein Beispiel eines derartigen Gebrauchs ist die derartige Behandlung von Säften, wie z.B. Apfelsaft, dass die Laccase eine Fällung der phenolischen, im Saft vorliegenden Verbindungen beschleunigt und dabei einen stabileren Saft herstellt. Derartige Anwendungen wurden von Stutz, Fruit processing 7/93, 248–252, 1993; Maier et al., 1990, Dt. Lebensmittelrundschau 86: 137–142; Dietrich et al., 1990, Fluss. Obst. 57: 67–73, beschrieben.
Die Laccasen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Bodenentgiftung verwendbar (Nannipieri et al., 1991, J. Environ. Qual. 20: 510–517; Dec und Bollag, 1990, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19: 543–550).
Die vorliegende Erfindung ist weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht dahingehend ausgelegt werden sollten, den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Beispiele
Materialien und Stämme
Bei den Chemikalien, die als Puffer und Substrate verwendet wurden, handelt es sich um handelsübliche Produkte vom geringsten Reinheitsgrad. Bei den verwendeten Stämmen handelt es sich um Coprinus cinereus A3387 (IFO 8371), E. coli Y1090(ZL) (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), E. coli DH10B(ZL) (GIBCO BRL), E. coli DH5☐ (Stratagen, La Jolla, CA), Aspergillus oryzae HowB712, Aspergillus oryzae JeRS317 und Aspergillus oryzae JeRS316.
Beispiel 1: Reinigung und Charakterisierung der Laccase von Coprinus cinereus
Die Laccase wird zunächst aus der Kulturbrühe des Stamms A3387 von Coprinus cinereus durch Filtration (Propex 23 + HSC) und Konzentrierung (Filtron 2 × 10K) isoliert. Das kationische flockenartige Magnifloc^® 521C (American Cyanamid, Wallingford, CT) wird zu der so erhaltenen Präparation gegeben, 30 Minuten gemischt und dann zentrifugiert. Dieser Schritt entfernt gefärbte Substanzen aus der Präparation. Der Überstand wird dann mit Ammnoniumsulfat gefällt (55%ige Sättigung) und zweimal in Ammoniumsulfat (40%ige Sättigung) resuspendiert, was ebenso zur Farbbeseitigung führt. Die Resuspension wird weiter konzentriert, um das Volumen zu vermindern, und filtriert, jedoch nicht ausgewaschen. Das Konzentrat in Ammoniumsulfat (40%ige Sättigung) wird dann der hydrophoben Chromatographie an Butyl-ToyoPearl (Tosoh Corp., Tokyo, Japan) unterzogen und mit einem Ammoniumsulfatgradienten von 40 bis 0%iger Sättigung eluiert. Der Pufferaustausch auf 20 mM MES, pH 6,0 und die Konzentrierung mit einer Amicon-Zelle, die mit einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 20.000 ausgestattet ist, wird dann durchgeführt. Die so erhaltene Lösung wird dann einer Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (150 ml) in 20 mM MES, pH 6,0 mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl unterzogen. Die Probe wird schließlich durch Chromatographie an HPQ-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (50 ml) in 20 mM MES, pH 6,0 mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl rechromatographiert. Die Laccase eluiert bei 0,25–0,30 M NaCl.
Die gereinigte Laccase ist etwa 95% rein, wie es durch SDS-PAGE, die die Laccase als eine Bande von M_w = 63.000 zeigt, bestimmt wurde. Die isoelektrische Fokussierung zeigt zwei dominante Banden mit pI-Werten von 3,7 und 4,0.
Der N-terminale Aminosäurerest der gereinigten Laccase ist blockiert. Die Laccase wird daher reduziert, S-carboxymethyliert und mit Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und mit Chymotrypsin verdaut. Die so erhaltenen Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac-C18-Säule (Vyda, Inc., Hesperia, CA) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von entweder Acetonitril oder 2-Propanol in wässriger 0,1%iger Trifluoressigsäure eluiert. Die gereinigten Peptide werden auf einem Applied Biosystems 473A Protein Sequencer gemäß den Herstellerangaben sequenziert.
Einzelne ausgeprägte Peptide, die aus dem Proteaseverdau hervorgehen, sind nachstehend aufgelistet. In den folgenden Sequenzen repräsentiert Xaa einen nicht bestimmbaren Rest. Das Peptid 3 umfasst offensichtlich das Peptid 2. Bei den Peptiden 4 und 9 kennzeichnen die mit Xaa/Yaa bezeichneten Reste, dass beide Reste an dieser Position gefunden werden. Reste in Klammern sind ungewiss. Das Peptid 9 ist in dem Peptid 13 enthalten.
Peptid 1:

Glu-Val-Asp-Gly-Gln-Leu-Thr-Glu-Pro-His-Thr-Val-Asp-Arg-Leu-Gln-Ile-Phe-Thr-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Phe-Val-Leu-Asp-Ala-Asn-Gln-Pro-Val-Asp-Asn-Tyr-Trp-Ile-Arg-Ala

Peptid 2:

Xaa-Xaa-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro

Peptid 3:

Phe-Val-Thr-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro

Peptid 2 und 3 kombiniert:

Phe-Val-Thr-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Trp

Peptid 4:

Ile/Leu-Asp-Pro-Ala-Xaa-Pro-Gly-Ile-Pro-Thr-Pro-Gly-Ala-(Ala)-Asp-Val

Peptid 5:

Gly-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Gly-Ile

Peptid 6:

Xaa-Phe-Asp-Asn-Leu-Thr-Asn

Peptid 7:

Tyr-Arg-g-Xaa-Arg-Leu-Ile-Ser-Leu-Ser-Cys-Asn-Pro-Asp-(Trp)-Gln-Phe

Peptid 8:

Ala-Asp-Trp-Tyr

Peptid 9:

Ile-Pro-Ala/Asp-Pro-Ser-Ile-Gln

Peptid 10:

Glu-Ser-Pro-Ser-Val-Pro-Thr-Leu-Ile-Arg-Phe

Peptid 11:

Ala-Gly-Thr-Phe

Peptid 12:

Ser-Gly-Ala-Gln-Ser-Ala-Asn-Asp-Leu-Leu-Pro-Ala-Gly

Peptid 13:

Ile-Pro-Ala-Pro-Ser-Ile-Gln-Gly-Ala-Ala-Gln-Pro-Asx-Ala-Thr

Die meisten Peptide zeigen eine beträchtliche Homologie mit Teilen der Aminosäuresequenz einer Laccase von Polyporus pinsitus (Yaver et al., 1995, Applied and Environmental Microbiology 62: 834–841).
Beispiel 2: RNA-Isolierung
Der Stamm A3387 von Coprinus cinereus wird bei 26°C in FG4-Medium, das 30 g Sojabohnenmehl, 15 g Maltodextrin, 5 g Bactopepton und 0,2 g Pluronsäure pro Liter umfasst, gezüchtet. Die Myzelien werden nach sechs Tagen Wachstum geerntet, in flüssigem N₂ eingefroren und bei –80°C gelagert. Die Gesamt-RNA wird aus dem gefrorenen, pulverisierten Myzel von Coprinus cinereus A3387 durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von einer Ultrazentrifugation durch ein Kissen von 5,7 M Cäsiumchlorid (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294–5299), präpariert. Die Poly(A)+-RNA wird durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromatographie gemäß Aviv und Leder (1972, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69: 1408–1412) isoliert.
Beispiel 3: Konstruktion einer cDNA-Genbank
Doppelsträngige cDNA wird von 5 μg Coprinus cinereus-Poly(A)+-RNA aus Beispiel 2, wie von Gubler und Hoffman (1983, Gene 25: 263–269) und Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, synthetisiert, mit der Ausnahme, dass ein Oligo(dT)-NotI-Anker-Primer anstatt eines Oligo(dT)12-18-Primers für die Erststrangreaktion verwendet wird. Nach der Synthese wird die cDNA mit der Mungobohnen-Nuklease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) behandelt, die Enden mit der T4-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) geglättet und mit nicht palindromischen BstXI-Adaptoren (Invitrogen, San Diego, CA) unter Verwendung eines etwa 50-fachen molaren Überschusses der Adaptoren ligiert. Die adaptierte cDNA wird mit NotI verdaut, durch Agarosegelelektrophorese nach cDNAs mit 1,2–3,0 kb größenfraktioniert und in einen BstXI/NotI-gespaltenen pYES2.0-Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. Das Ligationsgemisch wird in elektrokompetente DH10B-Zellen von E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Herstellerangaben transformiert. Die Genbank, die aus 1 × 10⁶ unabhängigen Klonen besteht, wird als einzelne Pools (25.000–30.000 Kolonie-bildende Einheiten/Pool) in 20%igem Glycerin bei –80°C und als doppelsträngige cDNA und Ligationsgemisch bei –20°C gelagert.
Beispiel 4: Erzeugung einer cDNA-Sonde von einer cDNA von Coprinus cinereus unter Verwendung der PCR
Drei Oligonukleotide (Sense s1 und s2 und Antisense as1) mit niedriger Codon-Degeneration werden basierend auf zwei konservierten Motiven in Laccasen von Rhizoctonia, Phlebia, Polyporus und Coriolus entworfen. Die Oligos haben die folgenden Sequenzen:
Ein μg Plasmid-DNA des in Beispiel 3 beschriebenen Genbank-Pools von Coprinus cinereus wird in einem Thermozycler gemäß Frohman et al., 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85: 8998–9002, durch PCR ampli fiziert, indem jeweils 500 pmol Laccase-Sense-Primer in zwei Kombinationen (s1 und as1, s2 und as1) mit 500 pmol des Laccase-Antisense-Primers und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Branchburg, NJ) verwendet werden. Dreißig PCR-Zyklen werden durchgeführt, indem ein Zyklusprofil von 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 2 Minuten Hybridisierung bei 55°C und 3 Minuten Verlängerung bei 72°C verwendet wird. Die Analyse der PCR-Produkte offenbart ein PCR-Hauptprodukt von 1,2 kb mit einem Primer-Paar s1 und as1, wohingegen das andere Paar keinerlei Hauptprodukte amplifiziert. Das PCR-Fragment von Interesse wird in einen pUC18-Vektor unterkloniert und gemäß Siggaard-Andersen et al., 1991, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88: 4114–4118, sequenziert. Die Sequenzierung der Enden der beiden PCR-Unterklone in pUC18 offenbart eine cDNA-Sequenz, die ein Laccase-Polypeptid kodiert. Zusätzlich zu den Primer-kodierten Resten deckt sich die abgeleitete Aminosäuresequenz mit zwei Peptidsequenzen, die von der gereinigten Laccase vom Wildtyp erhalten wurden, was darauf hinweist, dass die PCR den gewünschten Bereich einer Coprinus cinereus-Laccase-cDNA spezifisch amplifiziert hat.
Beispiel 5: Unterklonierung und Sequenzierung von Teil-cDNAs
Das in Beispiel 4 beschriebene PCR-Produkt wird in pCRII unter Verwendung eines TA-Klonierungskits (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Herstellerangaben ligiert. Sieben Unterklone werden unter Verwendung des M13-Universal-21mer-Oligonukleotids und des M13-48-Revers-Oligonukleotids präpariert und sequenziert. Die Nukleotidsequenzen werden auf beiden Strängen durch Primerwandern unter Verwendung der Taq-Polymerase-Zyklussequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bestimmt und die Reaktionen werden auf einem Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer (Modell 373A, Version 2.0.1) elektrophoretisiert.
Basierend auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz und dem Prozentsatz der Identitäten zwischen ihnen scheinen die sieben Klone 3 Laccasen zu kodieren (Tabelle 1). Die Klone CCLACC4, 8 und 7 werden als Teil-cDNAs von Coprinus cinereus lcc1 (entsprechend der Nukleotide 1107–2481 in 1) bezeichnet. Die Klone CCLACC1, 3 und 11 (pDSY71) werden als Teil-cDNAs von Coprinus cinereus lcc2 (entsprechend der Nukleotide 875–2451 in 2) bezeichnet. Der Klon CCLACC15 (pDSY72) wird als eine Teil-cDNA von Coprinus cinereus lcc3 (entsprechend der Nukleotide 1005–2501 in 3) bezeichnet. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Teil-cDNAs von lcc1, lcc2 und lcc3 werden mit den vorstehend bestimmten Peptidsequenzen verglichen und die beste Übereinstimmung wird zwischen lcc1 und den Peptidsequenzen gefunden. Um einen Klon voller Länge zur heterologen Expression von lcc1 in Aspergillus oryzae zu erhalten, wird eine genomische Genbank von Coprinus cinereus A3387 in λZipLox konstruiert.
Tabelle 1. Identitätsprozentsätze zwischen cDNAs von Coprinus cinereus
Beispiel 6: Isolierung genomischer DNA
Eine Kultur von Coprinus cinereus A3387 wird bei Raumtemperatur 4 Tage unter Schütteln bei 200 UpM in YEG-Medium, das 0,5% Hefeextrakt und 2% Dextrose umfasst, gezüchtet. Die Myzelien werden über Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) geerntet, zweimal mit einem Puffer von 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 (TE) gewaschen und schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die DNA wird wie von Timberlake und Barnard, 1981, Cell 26: 29–37, beschrieben, isoliert.
Beispiel 7: Präparation einer genomischen Genbank von Coprinus cinereus
Eine genomische Genbank von Coprinus cinereus A3387 wird unter Verwendung eines λZipLox-Kits (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Herstellerangaben konstruiert. Die genomische DNA (~30 μg) wird mit Tsp509I (New England Biolabs, Beverly, MA) bei 65°C in einem Gesamtvolumen von 150 μl in dem von dem Anbieter bereitgestellten Puffer verdaut. Proben von 30 μl werden bei 3, 5, 7, 8 und 9 Minuten entnommen und auf einem 1%igen präparativen Agarosegel elektrophoretisiert. Die Banden einer Größe von 3 bis 8 kb werden aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wird dann aus den Gelstücken unter Verwendung eines Qiaex-Kits (Qiagen, San Diego, CA) isoliert. Die größenfraktionierte DNA wird über Nacht bei Raumtemperatur an die λZipLox-EcoRI-Arme gemäß den Protokollen, die mit dem Kit bereitgestellt sind, ligiert. Die Ligationen werden in Phagen unter Verwendung eines Giga Pak Gold Packaging Kits (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt und die Verpackungsreaktionen werden unter Verwendung von Y1090-Zellen von E. coli titriert. Insgesamt werden 6 × 10⁵ pfu erhalten. Der Verpackungsextrakt wird ausplattiert, um die Genbank zu amplifizieren, und der Titer der Genbank wird so festgesetzt, dass er 1 × 10¹¹ pfu/ml aufweist. Zwanzig einzelne Plaques werden gepickt und die Plasmide werden aus den Plaques durch eine Passage durch E. coli DH10B isoliert. Die Plasmid-DNA wird aus den Kulturen isoliert und mit PstI/NotI verdaut, um den Prozentsatz von Molekülen in der Genbank zu bestimmen, die eine Einfügung aufweisen. Acht von den zwanzig oder 40% der getesteten weisen eine Einfügung auf, deren Größe von 3 bis 6 kb reicht.
Beispiel 8: Sondenpräparation zur Genbank-Durchmusterung
Eine DIG-markierte Sonde zum nicht radioaktiven Durchmustern der Genbank wird durch PCR präpariert, indem die in Beispiel 5 beschriebene lcc1-Teil-cDNA von Coprinus cinereus als Matrize verwendet wird. Die für die Reaktion verwendeten Primer sind nachstehend gezeigt:
Die PCR-Bedingungen sind 1 Zyklus bei 95°C 5 Minuten, 50°C 1 Minute und 72°C 1,5 Minuten; 29 Zyklen jeweils bei 95°C 1 Minute, 50°C 1 Minute und 72°C 1,5 Minuten; und 1 Zyklus bei 95°C 30 Sekunden, 50°C 1 Minute und 72°C 3 Minuten. Die Reaktion enthält 0,1 μg der lcc1-Teil-cDNA von Coprinus cinereus, 10 μl 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer, Branchburg, NJ), 5 μl 10 × DIG-Markierungsgemisch (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), jeweils 75 pmol Primer und 0,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ). Eine Sondenkonzentration von 250 ng/μl wird nach der PCR gemäß der Protokolle, die mit dem Genius-Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bereitgestellt sind, festgesetzt.
³²P-markierte Sonden der lcc2- und lcc3-Teil-cDNAs von Coprinus cinereus werden unter Verwendung eines RadPrime-Kits (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß der Herstellerangaben präpariert.
Beispiel 9: Durchmusterung der genomischen Genbank
Geeignete Verdünnungen der genomischen λZipLox-Genbank von Coprinus cinereus werden mit Y1090-Zellen von E. coli auf NZY-Platten, die 0,5% NaCl, 0,2% MgSO₄, 0,5% Hefeextrakt und 1% NZ-Amin, pH 7,5, pro Liter mit 0,7% Top-Agarose umfassen, ausplattiert. Die Plaques werden an Hybond N+-Filtern (Amersham Co., Amersham, UK) unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, vorstehend) aufgesammelt. Die Filter werden im Engler-Blue-Hybridisierungspuffer bei 65°C 1 Stunde hybridisiert. Nach der Prähybridisierung wird die DIG-markierte Sonde von Beispiel 8 bis zu einer Endkonzentration von 3 ng/ml zugegeben und über Nacht bei 65°C hybridisiert. Die Filter werden bei 65°C zweimal 5 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS, zweimal 15 Minuten in 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und werden dann verarbeitet, um die hybridisierte DIG-Markierung nachzuweisen, indem der Genius-Kit und das Lumi-Phos 530-Substrat gemäß der Herstellerangaben verwendet werden. Gemäß dem Nachweisprotokoll wird der Film 2 Stunden auf die Filter gelegt.
Zum Durchmustern der Genbank unter Verwendung der ³²P-markierten Sonden, die in Beispiel 8 beschrieben sind, werden die Filterabhebungen wie vorstehend präpariert und bei 65°C in 2 × SSPE, 1% SDS, 0,5% fettfreie Trockenmilch und 200 μg denaturierte Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Nach 1 Stunde Vorhybridisierung werden die ³²P-markierten Sonden bis zu einer Endkonzentration von 10⁶ cpm/ml zugegeben und die Hybridisierungen über Nacht bei 65°C fortgesetzt. Die Filter werden zweimal bei 65°C 15 Minuten in 0,2 × SSC, 1% SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat gewaschen.
Die genomische Genbank wird mit dem DIG-makierten Fragment von lcc1 untersucht. Annähernd 200.000 Plaques werden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgemustert, und 9 positive Klone werden erhalten. Die Plasmide werden von den Klonen durch eine Passage durch E. coli DH10B(ZL) isoliert und dann durch Verdau mit PstI/NotI charakterisiert. Alle 9 Klone enthalten Einfügungen. Basierend auf der Nukleotidsequenz der lcc1-Teil-cDNA werden die genomischen Klone, bei denen es sich um genomische Klone von lcc1 handeln kann, bestimmt. Alle 8 einzelne Klone werden mit BamHI/PstI und PstI/BsmI verdaut, bei denen Fragmente von jeweils 205 Bp und 382 Bp erwartet werden (weder lcc2- noch lcc3-Teil-cDNAs enthalten diese Fragmente). Vier von den 8 einzelnen Klonen enthalten beide vorhergesagte Fragmente. Die DNA-Sequenzierungsreaktionen werden bei allen vier Klonen unter Verwendung der Universal-Sequenzierungs-Primer wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, um zu bestimmen, welche Klone die volle Länge aufweisen.
Die Nukleotidsequenz von Klon 4-19 (pDSY73) wird auf beiden Strängen komplett bestimmt und es wird gezeigt, dass sie das lcc1-Gen in voller Länge enthalten (1). Die abgeleitete Aminosäuresequenz (1) des genomischen lcc1 stimmt zu 100% mit der ermittelten N-terminalen Sequenz (siehe Beispiel 14) überein, obwohl die vorhergesagte Signalpeptidspaltstelle sich zwischen A18 und Q19 befindet, während die Peptidsequenz 4 Reste stromabwärts bei S23 beginnt. Das lcc1-Gen enthält 7 Introns, deren Größe von 54 bis 77 Bp reicht. Das abgeleitete Protein enthält 3 potenzielle N-Glykosylierungsstellen (AsnXaaThr/Ser), und das vorhergesagte reife Protein weist nach Entfernung des Signalpeptids eine Länge von 521 Aminosäuren auf. Die Identitätsprozentsätze des Lcc1-Proteins zu anderen Pilz-Laccasen sind in Tabelle 2 gezeigt. Der höchste Identitätsprozentsatz, 57,8%, wird gefunden, wenn es mit der Laccase der nicht identifizierten Basidiomycete PM1 (Coll et al., 1993, vorstehend) verglichen wird. Wenn Anordnungen von Lcc1 und anderen Basidiomyceten-Laccasen durchgeführt werden, geht hervor, dass Lcc1 entweder eine C-terminale Verlängerung oder ein C-terminales Peptid aufzuweisen kann, welche/s durch die Verarbeitung entfernt wird.
Die genomische Genbank wird auch mit den ³²P-markierten Sonden bezüglich lcc2- und lcc3-Teil-cDNAs von Coprinus cinereus durchgemustert. Zum Durchmustern mit der lcc2-Sonde werden annähernd 50.000 Plaques mit der Sonde hybridisiert und 4 positive Klone erhalten. Zum Durchmustern der Genbank mit der lcc3-Sonde werden annähernd 35.000 Plaques getestet und 2 positive Klone erhalten. Nach Passage durch E. coli und Isolierung der Plasmid-DNA wird die Nukleotidsequenz von einem der lcc3-Klone (pDSY100) durch Primerwandern bestimmt, wie in Beispiel 5 (2) beschrieben. Das lcc3-Gen enthält 13 Introns (wie durch die Kleinbuchstaben in 2 gekennzeichnet ist). Die Positionen der Introns 4 bis 10 werden von der Teil-cDNA bestätigt, während die Posi tionen der anderen 6 Introns auf der Basis der Konsensussequenzen, die an den 5'- und 3'-Spleißstellen der Pilz-Introns vorgefunden werden, und durch die Homologie der abgeleiteten Aminosäuresequenz (2) zu anderen Laccasen abgeleitet werden. Das lcc3-Gen kodiert ein Vorläuferprotein mit 517 Aminosäuren. Es existiert eine potenzielle N-Glykosylierungsstelle, und das reife Protein weist nach der vorhergesagten Signalpeptidspaltung (durch einen Pfeil gekennzeichnet) eine Länge von 501 Aminosäuren auf.
Bei den Nukleotidsequenzen der 4 positiven lcc2-Klone wird beobachtet, dass keiner der Klone die volle Länge aufweist. Dem Klon mit der größten Einfügung (CCLACC1-4) fehlt die Sequenz, die die letzten ungefähr 100 Aminosäuren basierend auf der Homologie zu anderen Pilz-Laccasen kodiert. Tabelle 2. Identitätsprozentsätze des Coprinus cinereus lcc1 mit anderen Pilz-Laccasen*

* Cc = Coprinus cinereus; Tv = Trametes villosa; Ch = Coriolus hirsutus; PM1 = nicht identifizierte Basidiomycete; Pr = Phlebia radiata; Nc = Neurospora crassa; Ab = Agaricus bisporus; und lcc = Laccase-Gen.

Beispiel 10: Sondenpräparation zur Genbank-Durchmusterung, um das lcc2-Gen der vollen Länge zu erhalten
Eine DIG-markierte Sonde zur nicht radioaktiven Durchmusterung der Genbank wird durch PCR präpariert, indem der genomische lcc2-Teil-Klon von Coprinus cinereus als Matrize verwendet wird, um einen lcc2-Klon de vollen Länge zu erhalten. Die in der Reaktion verwendeten Primer sind nachstehend gezeigt:
Die PCR-Bedingungen sind 1 Zyklus bei 95°C 1 Minute; und 30 Zyklen jeweils bei 94°C 1 Minute, 55°C 1 Minute und 72°C 2 Minuten. Die Reaktion enthält 0,1 μg des genomischen Coprinus cinereus-lcc2-Teil-Klons (CCLACC1-4), 10 ☐l 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer, Branchburg, NJ), 5 μl 10 × DIG-Markierungsgemisch (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), jeweils 75 pmol Primer und 0,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase. Die Konzentration der DIG-markierten Sonde wird unter Verwendung des Genius-Kits gemäß den Herstellerangaben bestimmt.
Beispiel 11: Durchmusterung der genomischen Genbank, um das lcc2-Gen der vollen Länge zu erhalten
Geeignete Verdünnungen der genomischen λZipLox-Genbank von Coprinus cinereus, die wie in Beispiel 7 beschrieben präpariert wird, werden mit Y1090-Zellen von E. coli auf NZY-Platten (0,5% NaCl, 0,2% MgSO₄, 0,5% Hefeextrakt und 1% NZ-Amin, pH 7,5) mit 0,7% Top-Agarose ausplattiert. Die Plaques werden an Hybond N+-Filtern unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, vorstehend) aufgesammelt. Die Filter werden im Easy-Hyb-Hybridisierungspuffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bei 42°C 1 Stunde vorhybridisiert, und nach der Vorhybridisierung wird die vorstehend erwähnte DIG-markierte Sonde bis zu einer Endkonzentration von 1 ng/ml zugegeben. Die Filter und die Sonde werden über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Filter werden dann zweimal bei Raumtemperatur 5 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS und zweimal bei 68°C 15 Minuten in 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Die Filter werden weiter verarbeitet, um die hybridisierte DIG-Markierung unter Verwendung des Genius-Kits und von CSPD-Ready-To-Use (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) als Substrat gemäß der Herstellerangaben zu detektieren. Gemäß dem Nachweisprotokoll wird der Film auf die Filter 20 Minuten bis 2 Stunden gelegt.
Um einen Klon der vollen Länge zu erhalten, wird die genomische Genbank (42.000 Plaques) durchgemustert, indem ein DIG-markiertes Fragment, das die 3'-äußersten 400 Bp der CCLACC1-4-Einfügung enthält, verwendet wird. Fünf positive Klone werden isoliert und gereinigt. Die Plasmid-DNA wird aus allen 5 Klonen durch eine Passage durch E. coli DH10B isoliert. Unter Verwendung eines spezifischen Primers für das 3'-Ende der CCLACC1-4-Einfügung in Sequenzierungsreaktionen, wie in Beispiel 5 beschrieben, wird bestimmt, dass nur einer der Klone (LCC2-5B-1) den fehlenden 3'-Teil des lcc2-Gens enthält. Jedoch beweist die weitere Sequenzierung, dass (LCC2-5B-1) nicht das gesamte Gen enthält, sondern dass ein Teil des 5'-Endes fehlt. Die Überlappung der CCLACC1-4- und CCLACC2-5B-1-Sequenzen liefert die Sequenz des gesamten Gens (3).
Ein Plasmid pDSY105, das den genomischen lcc2-Klon der vollen Länge enthält, wird konstruiert, indem die Fragmente aus den LCC2-5B-1- und CCLACC1-4-Klonen zusammenligiert werden. Der Klon LCC2-5B-1 wird mit EagI und BglII verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisiert. Das Gelstück, das das 1,3-kb-EagI/BglII-Fragment enthält, wird ausgeschnitten und die DNA unter Verwendung einer Spin Bind-Säule (FMC) isoliert. Es wird eine PCR-Reaktion durchgeführt, um ein EcoRI/BglII-Fragment, das die N-terminale Hälfte von lcc2 enthält, zu erhalten. Das PCR-Reaktionsgemisch enthält 0,1 μg der CCLACC1-4-DNA, jeweils 50 pmol der Oligonukleotide 96-0545 und 96-0546, jeweils 0,01 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 0,5 U Taq-DNA-Polymerase. Die PCR-Bedingungen sind 1 Zyklus bei 95°C 5 Minuten, 55°C 1 Minute und 72°C 1 Minute; und 30 Zyklen jeweils bei 95°C 30 Sekunden, 55°C 1 Minute und 72°C 1 Minute. Die für die Reaktion verwendeten Primer sind:
Das gewünschte Produkt von 1,6 kb wird in pCRII unter Verwendung des TA Cloning-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) unterkloniert. Die Teil-Nukleotidsequenzen der Unterklone werden unter Verwendung der M13-20-Universal- und M13-48-Revers-Universal-Primer bestimmt. Das endgültige Plasmid wird durch Verdauen von pBluescript SK- mit EcoRI/EagI und Ligieren mit dem EagI/BglII-Fragment von LCC2-5B-1 und dem BglII/EcoRI-Fragment des pCRII-Subklons konstruiert. Die so erhaltenen Unterklone werden durch Restriktionsverdaue durchgemustert und das gewünschte Produkt wird pDSY105 bezeichnet.
Das lcc2-Gen enthält 13 Introns (durch Kleinbuchstaben in 3 gekennzeichnet). Die Positionen der Introns 4 bis 10 werden von der Teil-cDNA bestätigt, während die Positionen der anderen 6 Introns auf der Basis der Konsensussequenzen, die an den 5'- und 3'-Spleißstellen der Pilz-Introns vorgefunden werden, und durch die Homologie der abgeleiteten Aminosäuresequenz (3) zu anderen Laccasen abgeleitet werden. Das lcc2-Gen kodiert ein Vorläuferprotein mit einer Länge von 517 Aminosäuren. Es existiert eine potenzielle N-Glykosylierungsstelle, und das reife Protein weist nach der vorhergesagten Signalpeptidspaltung eine Länge von 499 Aminosäuren auf.
Aus der Anordnung der vorhergesagten reifen Lcc1-, Lcc2- und Lcc3-Proteine geht hervor, dass im Gegensatz zu Lcc1 weder Lcc2 noch Lcc3 die bei Lcc1 vor liegende Verlängerung von 23 Aminosäuren enthalten. Lcc1 teilt 59,3% und 57,5% Identität mit Lcc2 bzw. Lcc3 (Tabelle 2). Verglichen mit anderen Pilz-Laccasen weisen Lcc2 und Lcc3 die höchste Identität (79,6%) untereinander auf. Die mit anderen Pilz-Laccasen geteilten Identitätsprozentsätze reichen von einem Höchstwert von 62,8% für Lcc2 und die Basidiomyceten-PM1-Laccase bis zu einem Tiefstwert von 21,9% für die Laccase von Neospora crassa.
Beispiel 12: Konstruktion von pDSYG7 und pDSY68 zur heterologen Expression von lcc1 in Aspeergillus oryzae
pDSY67 (4) und pDSY68 (5) werden zur Expression des lcc1-Gens von Coprinus cinereus konstruiert. Das lcc1-Gen von Coprinus cinereus wird in den Expressionsvektor pKS4 kloniert, der einen TAKA-Promoter, einen AMG-Terminator und das pyrG von Aspergillus nidulas zur Selektion enthält. Das lcc1-Gen wird in Form von 3 Fragmenten in den mit SwaI/NotI verdauten pKS4 eingefügt, um pDSY67 (4) zu erhalten. Die Sequenzierung von pDSY67 offenbart die Anwesenheit von 32 zusätzlichen Basenpaaren zwischen dem Stopp-Codon und dem AMG-Terminator. pDSY68 wird durch Entfernen der zusätzlichen zweiunddreißig Basenpaare erzeugt. Um die zusätzlichen Basenpaare zu entfernen, wird pDSY67 mit PacI/NotI verdaut und die Enden unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase geglättet. Der Vektor mit glatten Enden wird mit sich selbst ligiert und das so erhaltene Plasmid pDSY68 sequenziert, um zu bestätigen, dass die zusätzlichen Basenpaare entfernt sind.
Beispiel 13: Transformation von Aspergillus oryzae
Die Stämme HowB712, JeRS316 und JeRS317 von Aspergillus oryzae werden 18 Stunden in YEG-Medium bei 34°C gezüchtet, und die Protoplasten werden wie von Christensen et al. (1988, Biotechnology 6: 1419–1422) beschrieben erzeugt und transformiert. Die Protoplasten werden mit 10 μg entweder pDSY67 oder pDSY68 transformiert. Die Transformanten werden auf Minimalmediumplatten, die 1,0 M Saccharose enthalten, selektioniert. Die Minimalmdediumplatten umfassen 6,0 g NaNO₃, 0,52 g KCl, 1,52 g KH₂PO₄, 1,0 ml Spurenelementelösung, 20 g Nobel-Agar (Difco), 20 ml 50%ige Glucose, 20 ml Methionin (50 g/l), 20 ml Biotin (200 mg/l), 2,5 ml 20%iges MgSO₄·7H₂O und 1,0 ml mg/ml Streptomycin pro Liter. Das Agarmedium wird vor dem Autoklavieren auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, und Glucose, Methionin, Biotin, MgSO₄·7H₂O und Streptomycin werden dann als sterile Lösungen zum abgekühlten autoklavierten Medium zugegeben und in Platten gegossen. Die Spurenelementelösung umfasst 22 g ZnSO₄·7H₂O, 11 g H₃BO₃, 5 g MnCl₂·4H₂O, 5 g FeSO₄·7H₂O, 1,6 g CoCl₂·5H₂O, 1,6 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ und 50 g Na₄EDTA pro Liter.
Beispiel 14: Durchmusterung der Laccase-Transformanten
Die Primärtransformanten werden zuerst auf Minimalmediumplatten durchgemustert, die 1% Glucose als Kohlenstoffquelle und 1 mM 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) zum Testen der Laccase-Herstellung enthalten. Die Transformanten, die grüne Höfe auf den ABTS-Platten herstellen, werden gepickt und vor der Schüttelkolbenanalyse von den Sporen gereinigt. Für die Schüttelkolbenanalyse werden die gereinigten Transformanten bei 37°C in MY51-Medium, umfassend 30 g Maltose, 2 g MgSO₄, 10 g KH₂PO₄, 2 g K₂SO₄, 2 g Zitronensäure, 10 g Hefeextrakt, 0,5 ml Spurenelementelösung, 1 g Harnstoff, 2 g (NH₄)₂SO₄, pH 6,0, pro Liter, gezüchtet. Die Spurenelementelösung umfasst 14,3 g ZnSO₄·7H₂O, 2,5 g CuSO₄·5H₂O, 11 g NiCl₂·6H₂O, 13,8 g FeSO₄·7H₂O, 8,5 g MnSO₄·H₂O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Es werden Proben in verschiedenen Intervallen entnommen und zentrifugiert. Die Überstände werden verdünnt und unter Verwendung von ABTS als Substrat getestet.
Die Laccase-Aktivität wird durch Syringaldazin-Oxidation bestimmt. Im Speziellen werden 60 μl der Syringaldazin-Stammlösung (0,28 mM in 50%igem Ethanol) und 20 μl Laccase-Probe mit 0,8 ml vorgewärmter Britton-Robinson-Pufferlösung gemischt und bei 20°C inkubiert. Die Oxidation wird bei 530 nm über 5 Minuten verfolgt und die Aktivität als „SOU" μmol oxidiertes Syringaldazin pro Minute („SOU") ausgedrückt. Es werden Britton-Robinson-Puffer mit verschiedenen pH-Werten verwendet. Die ABTS-Oxidationstests werden bei 20°C unter Verwendung von 1 mM ABTS, des Britton-Robinson-Puffers (1,1fach verdünnt) durch Verfolgen von ΔA₄₀₅ in 96-Lochplatten durchgeführt.
Es werden mit pDSY67 3, 8 und 64 Transformanten, die auf ABTS positiv sind, in Aspergillus oryzae JeRS3l6, JeRS317 bzw. HowB712 erhalten. Mit pDSY68 werden 34 und 56 Transformanten, die auf den ABTS-Platten positiv sind, in JeRS317 bzw. HowB712 erhalten. Im Durchschnitt sind > 90% der Primärtransformanten auf den ABTS-Platten positiv. Alle Transformanten werden von Sporen gereinigt und in Schüttelkolben auf die Herstellung der Laccase getestet, wie vorstehend beschrieben. Die Laccase-Aktivitätstests bestätigen, dass die Transformanten, die auf den ABTS-Platten positiv sind, tatsächlich Laccase herstellen.
Beispiel 15: Reinigung und Charakterisierung der rekombinanten Lcc1 von Coprinus cinereus
Aspergillus oryzae JeRS317 (pDSY68, lcc1) wird in einem 10-Liter-Laborfermenter angeimpft, der ein Medium enthält, umfassend Nutriose, Hefeextrakt, (NH₄)₂HPO₄, MgSO₄·7H₂O, Zitronensäure, K₂SO₄, CaCl₂·H₂O und Spurenelementelösung und ergänzt mit CuSO₄, und bei 31°C, pH 7, 600–700 Upm 7 Tage fermentiert. Die Brühe wird dann gewonnen und durch ein Seihtuch filtriert.
Die über ein Seihtuch filtrierte Brühe (pH 7,2, 15 mS) wird durch ein Whatman #2-Filterpapier filtriert, dann auf einem Spiral Concentrator (Amicon) mit einer S1Y30-Membran (16fach, 0,8 mS) konzentriert und gewaschen. Die Brühe wird über Nacht bei –20°C eingefroren, am nächsten Tag aufgetaut, erneut über ein Whatman #2-Papier filtriert und auf eine Q-Sepharose XK26-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) von 120 ml, die mit 10 mM Tris pH 7,7, 0,9 mS (Puffer A) voräquilibriert ist, geladen. Nach dem Laden und Waschen mit Puffer A wird ein linearer Gradient mit Puffer B (Puffer A plus 2 M NaCl) angelegt und die aktiven Fraktionen werden bei ungefähr 7% Puffer B eluiert. Die aktiven Fraktionen werden in Puffer A dialysiert und dann auf eine Mono-Q 16/10-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) von 40 ml, die mit Puffer A voräquilibriert ist, geladen. Die aktiven Fraktionen laufen durch die Säule.
Die sequenzielle Ionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose und Mono-Q liefert eine Präparation von rekombinanter Laccase von Coprinus cinereus mit einer durch SDS-PAGE-Analyse sichtbaren Homogenität. Eine insgesamt 64fache Reinigung und eine Ausbeute von 23% werden erzielt.
Es wird ein Molekulargewicht von 66 kDa für die rekombinante Laccase durch SDS-PAGE-Analyse ähnlich wie das der Laccase von Wildtyp beobachtet. Der Unterschied zwischen dem beobachteten Molekulargewicht und dem aus der DNA-Sequenz abgeleiteten (56 kDa) legt nahe, dass die Laccase zu 18% glykosyliert ist. Das chromatographische Elutionsmuster der rekombinanten Laccase ähnelt sehr dem der rekombinanten Laccase von Myceliophthora thermophilia unter denselben Bedingungen, wobei die rekombinante Laccase von Coprinus cinereus einen ähnlichen pI-Wert aufweist wie der pI-Wert von 4,2 der rekombinanten Laccase von Myceliophthora thermophilia, der ebenfalls dem pI-Wert der Coprinus cinereus vom Wildtyp Laccase (3,7–4,0) ähnelt.
Die Kupfer(Cu)-Titration der gereinigten rekombinanten Laccase mit 2,2'-Bichinolin wird durchgeführt wie von Felsenfeld, 1960, Archives of Biochemistry and Biophysics 87: 247–251, beschrieben. Die photometrische Titration mit 2,2'-Bichinolin ergibt eine Cu-zu-Protein(untereinheit)-Stöchiometrie von 3,4 ± 0,2, was auf die Vier-Cu-Oxidase-Natur der rekombinanten Laccase vom Coprinus cinereus hindeutet.
Die gereinigte rekombinante Laccase vom Coprinus cinereus zeigt ein UV-/sichtbares Spektrum mit zwei Maxima bei 278 und 614 nm. Das Verhältnis der Absorption bei 280 nm zu der bei 600 nm ist 22.
Der Extinktionskoeffizient für das Enzym wird durch die Aminosäureanalyse bestimmt und das Molekulargewicht von der DNA-Sequenz abgeleitet. Die Aminosäureanalyse legt einen Extinktionskoeffizienten von 1,6 l/(g·cm) nahe, ähnlich dem vorhergesagten Wert von 1,2.
Das Redoxpotenzial wird durch Verfolgen der Absorptionsänderung der rekombinanten Laccase von Coprinus cinereus bei 600 nm mit dem K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆-Paar (0,433 V) und mit dem I₂/NaI-Paar (0,536 V) in einem Puffer von 9 mM MES-NaOH, pH 5,3 gemessen. Bei einem pH-Wert von 5,3 wird ein Redoxpotenzial von 0,55 ± 0,06 V für die rekombinante Laccase von Coprinus cinereus beobachtet.
Die Aktivität der rekombinanten Laccase von Coprinus cinereus wird mit Syringaldazin und ABTS getestet. Mit Syringaldazin als Substrat zeigt die rekombinante Laccase von Coprinus cinereus eine LACU/A₂₈₀ von 2,7 oder eine LACU/mg bei 4. Die rekominante Laccase weist ein pH-Aktivitätsprofil in dem pH-Bereich von etwa 4 bis etwa 9 mit einer optimalen Aktivität bei einem pH-Wert von 6 bis 7 ähnlich dem der Laccase von Coprinus cinereus vom Wildtyp (6A) auf, bei dem deren SOU/A₂₈₀ = 5,6. Bei einem pH-Wert von 5,3 zeigt Syringaldazin einen K_m-Wert von 26 ± 6 μM und einen k_cat-Wert von 180 ± 20 min^–1. Mit ABTS als Substrat zeigt die rekombinante Laccase ein pH-Aktivitätsprofil in dem pH-Bereich von etwa 2,7 bis etwa 7 mit einer optimalen Aktivität bei pH 4 ähnlich der Laccase von Coprinus cinereus vom Wildtyp (6B). Bei einem pH-Wert von 5,3 wird für die ABTS-Oxidation ein K_m-Wert von 23 ± 3 μM und ein k_cat-Wert von 1090 ± 30 min^–1 beobachtet. Die Werte für K_m und k_cat werden durch Einpassen der Anfangsgeschwindigkeiten (v = ΔA/Δt/Δe; Δe: Änderung des Extinktionskoeffizienten), der Laccase-Konzentration (E) und der Substratkonzentra tion (S) in v = k_cat·E·S/(K_m + S) mit dem Prism-Computerprogramm für nichtlineare Regression (GraphPad, San Diego, CA) bestimmt. Die Gesamtaminosäureanalyse, aus der der Extinktionskoeffizient ermittelt wird, wird mit einem HP AminoQuant-Gerät durchgeführt.
Beispiel 16: N-terminale Sequenzierung
Die Laccase von Coprinus cinereus vom Wildtyp wird mit einer Reihe von Entblockungsmitteln behandelt, um den blockierten N-Terminus zu entfernen. Der Pufferaustausch der Proben wird mit der BioSpin(P-6)-Vorrichtung von BioRad durchgeführt. Die Proben werden mit Pyroglutamat-Aminopeptidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN und Sigma, St. Louis, MO), Acylaminosäure-Peptidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und Acylase I (Sigma, St. Louis, MO) mit Entblockungsprotokollen basierend auf den Herstellerempfehlungen folgendermaßen behandelt: Zur Pyroglutamat-Aminopeptidase-Behandlung wird eine Laccase-Probe auf 5% Glycerin, 10 mM EDTA, 0,1 M Natriumphosphat, pH 8 gewechselt, dann mit Dithiothreitol (DTT) bis 0,7 mM und Pferdeleber-Peptidase (Sigma, St. Lois, MO) bis 1/216 (Gewicht/Gewicht Laccase) gemischt. Das Gemisch (~6,2 mg/ml an Laccase) wird in drei Aliquots aufgeteilt, wobei eines auf 1 M Harnstoff und ein anderes auf 0,5 M Guanidinium-HCl eingestellt wird. Jede Probe wird bei 4°C 16 Stunden inkubiert. Für die Acylaminosäure-Peptidase wird eine Laccase-Probe auf 0,2 M NH₄HCO₃, pH 7,8 gewechselt, dann mit EDTA bis 1 mM, 2-Mercaptoethanol bis 1 mM und Peptidase bis 1/5 (Gewicht/Gewicht Laccase) gemischt. Das Gemisch (~14 mg/ml an Laccase) wird in drei Aliquots aufgeteilt, wobei eines auf 0,01% SDS, eines auf 0,08 M Guanidinium-HCl und ein anderes auf 0,7 M Harnstoff eingestellt wird. Jede Probe wird bei 37°C 20 Stunden inkubiert. Zur Behandlung mit Acylase I wird eine Laccase-Probe auf 0,1 M Natriumphosphat, pH 7 gewechselt, dann mit Acylase bis 1/3 (Gewicht/Gewicht Laccase) gemischt. Das Gemisch (~15 mg/ml an Laccase) wird bei 37°C 22 Stunden inkubiert.
Die enzymbehandelten Laccase-Proben werden unter Verwendung einer Microcon-10-Vorrichtung von Amicon konzentriert. Die konzentrierten Proben werden auf einem SDS-PAGE gefahren und auf eine PVDF-Membran von Sequenzierqualität (Novex, San Diego, CA) elektrisch geblottet. Die PVDF-Membran wird mit Coomassie Blue R-250 gefärbt, um die Banden der behandelten Laccase sichtbar zu machen. Die PVDF-Membran wird zerschnitten, um die Stücke, die die einzelnen Banden enthalten, zu isolieren. Mehrere Spuren werden kombiniert und direkt der N-terminalen Sequenzierung mit einem ABI 476 Sequencer unter Verwendung einer Blot-Kartusche und TFA-Flüssigkeit-Zuführung unterworfen.
Die gereinigte Laccase von Coprinus cinereus vom Wildtyp weist einen blockierten N-Terminus auf. Jedoch führt die Behandlung sowohl mit Acylaminosäure-Peptidase als auch Acylase I zu einem identischen, sequenzierbaren N-Terminus. Die so erhaltene N-terminale Sequenz ist nachstehend gezeigt, wobei es unsicher ist, ob S den tatsächlichen N-Terminus der reifen Laccase repräsentiert, da es, wenn dies der Fall ist, eine unerwartete Deacylase-Funktion durch die Acylaminopeptidase erfordern würde.
Unter den beschriebenen Bedingungen wurde keine Entblockung mit der Pyroglutamat-Aminopeptidase beobachtet.
Die direkte N-terminale Sequenzierung der rekombinanten Laccase von Coprinus cinereus liefert einen blockierten N-Terminus, wahrscheinlich auf Grund derselben Acylierung an einem Ser wie bei der Wildtyp-Laccase beobachtet wurde.
Hinterlegung des biologischen Materials
Die folgenden biologischen Materialien wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt und mit den folgenden Zugangsnummern versehen.

Claims

Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 65% mit der in 1 dargelegten Aminosäuresequenz oder zu mindestens 70% mit der in 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz identisch ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine wie in 1 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine wie in 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine wie in 3 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das von einem Pilzstamm erhalten wird.
Polypeptid nach Anspruch 1, das von einem Pilzstamm der Familie Coprinaceae erhalten wird.
Polypeptid mit Laccaseaktivität, das durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die unter hochstrengen Bedingungen mit (a) den Nukleotiden 726 bis 2792 der in 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz, den Nukleotiden 588 bis 2940 der in 2 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder den Nukleotiden 456 bis 2775 der in 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz, (b) ihrem komplementären Strang oder (c) einer Untersequenz von (a) oder (b) hybridisieren kann; wobei die hochstrengen Bedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 mg/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA und 50% Formamid definiert sind.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 65% mit der in 1 dargelegten Aminosäuresequenz oder zu mindestens 70% mit der in 2 oder 3 dargelegten Aminosäuresequenz identisch ist.
Nukleinsäuresequenz, die ein aktives Polypeptid kodiert, das mit der in 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder einer Untersequenz davon einen Identitätsgrad von mindestens 65% oder mit der in 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder einer Untersequenz davon einen Identitätsgrad von mindestens 65% oder mit der in 2 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder einer Untersequenz davon einen Identitätsgrad von mindestens 70% aufweist.
Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit Laccaseaktivität kodiert, die unter hochstrengen Bedingungen mit a) den Nukleotiden 726 bis 2792 der in 1 dargelegten Nukleinsäuresequenz, den Nukleotiden 588 bis 2940 der in 2 dargelegten Nukleinsäuresequenz oder den Nukleotiden 456 bis 2775 der in 3 dargelegten Nukleinsäuresequenz, (b) ihrem komplementären Strang oder (c) einer Untersequenz von (a) oder (b) hybridisieren kann; wobei die hochstrengen Bedingungen durch Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 mg/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA und 50% Formamid definiert sind.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die in pDSY73 in Escherichia coli NRRL-B 21497 enthalten ist.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die in pDSY100 in Escherichia coli NRRL-B 21589 enthalten ist.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die in pDSY105 in Escherichia coli NRRL-B 21602 enthalten ist.
Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 11 kodiert ist.
Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 12 kodiert ist.
Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 kodiert ist.
Nulcleinsäurekonstrukt, umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die funktionsfähig an eine oder mehrere Kontrollsequenzen gebunden ist, die die Expression des Polypeptids in einem geeigneten Expressionswirt leiten können.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 17, einen Promoter und Transkriptions- und Translationsstopsignale.
Vektor nach Anspruch 18, des Weiteren umfassend eine selelktierbare Markierung.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 17.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend (a) Züchten eines Coprinus-Stamms zur Herstellung eines das Polypeptid umfassenden Überstands und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend (a) Züchten einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, unter die Expression des Polypeptids leitenden Bedingungen und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zum Polymerisieren eines Lignin- oder Lignosulfatsubstrats in Lösung, das das Inkontaktbringen des Substrats mit einer Laccase nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zur Entpolymerisation in situ in Kraftzellstoff, das das Inkontaktbringen des Zellstoffs mit einer Laccase nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zum Oxidieren von Farbstoffen oder Farbstoffvorläufern, das das Inkontaktbringen des Farbstoffs oder des Farbstoffvorläufers mit einer Laccase nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zum Polymerisieren oder Oxidieren einer Phenolverbindung, das das Inkontaktbringen der Phenolverbindung mit einer Laccase nach Anspruch 1 umfasst.