CN113388660A - 一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法 - Google Patents

一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，属于微生物选育方法技术领域，包括菌体选择培养、不同pH缓冲液配置、显色反应底物溶液配置、菌种显色能力测定、漆酶溶液制备和菌种产漆酶能力测定，具体方法为：吸取ABTS溶液于试管中，加入菌体，25℃静置反应，记录反应液显绿时间，本发明通过对菌种类型、底物溶液、温度和菌体用量等方面对显色反应的影响进行试验，并通过菌体显色能力与产酶能力进行比较，证明了菌体催化底物显色能力与菌种液体发酵产酶能力之间呈正相关，因此，仅通过菌体直接与底物溶液发生显色反应一步，在短时间内就可以检验出菌种有与无产漆酶能力和产酶能力高与低，利用该方法能够一步完成筛选，方法简单、快速灵敏。

Description

一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法
技术领域
本发明属于微生物选育方法技术领域，具体涉及一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法。
背景技术
漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，在白腐菌中普遍存在，多为分泌型的糖蛋白。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白咖2、环境保护、毒物降解等方面。由于漆酶应用广泛，高酶活菌株的筛选就显得尤其重要。在我国，漆酶产生菌筛选普遍采用发酵法和平板显色法。发酵法需要较长的培养过程和测定过程，费时费力；平板显色法虽然可直接在分离平板上认定菌种是否具有产酶能力，但由于所生成的有色物质处于培养基中，影响菌落周边所形成有色环带的可见度和清晰度。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在问题，利用微生物菌体中所存在的漆酶能使底物溶液显色的作用，提供了一种简单、快速、灵敏的筛选漆酶产生菌的液体显色方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，包括如下步骤：
S1：菌体选择培养：在培养皿中配置培养基，并在培养基上进行菌种接种培养，得到菌体；
S2：缓冲液配置：分别配置pH为4.5、5.0的0.05mol/L醋酸缓冲液和pH为7.0、8.0、9.0的0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
S3：显色反应底物溶液配置：根据步骤S2配置的缓冲液分别进行ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液配置，具体步骤如下：
ABTS底物溶液：按比例分别称取ABTS和pH为4.5的醋酸缓冲液，以1ml pH为4.5的醋酸缓冲液对应1mg ABTS进行混合，摇匀静置，制得ABTS底物溶液；
愈创木酚底物溶液：按比例分别称取愈创木酚和pH为5.0的醋酸缓冲液，以1ml pH为5.0的醋酸缓冲液对应1mg愈创木酚进行混合，摇匀静置，制得愈创木酚底物溶液；
丁香醛连氮底物溶液：按比例分别称取丁香醛连氮和pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1mlpH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应0.4mg丁香醛连氮进行混合，摇匀静置，制得丁香醛连氮底物溶液；
邻联甲苯胺底物溶液：按比例分别称取邻联甲苯胺和pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻联甲苯胺进行混合，摇匀静置，制得邻联甲苯胺底物溶液；
邻苯二酚底物溶液：按比例分别称取邻苯二酚和pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻苯二酚进行混合，摇匀静置，制得邻苯二酚底物溶液；
S4：菌种显色能力测定：分别吸取步骤S3中制得的ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液放入试管中，并在试管中加入步骤S1中培养的菌体，25℃下静置反应，记录反应液显色时间；
S5：漆酶溶液制备：按比例称取麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉，并将称取的麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉置于三角瓶中，在瓶中加入含0.2％硫酸铵、1.5％玉米浆和0.005％硫酸铜的混合溶液，调pH至6.5，在121℃下灭菌30min，接种步骤S1中培养的菌体，以280r/min在摇床上振荡培养，培养滤液即为漆酶溶液；
S6：菌种产漆酶能力测定：将步骤S4中加入菌体的底物溶液和稀释的漆酶溶液在25℃的条件下保温5min，用1cm光径比色杯于420nm波长测光吸收。
所述步骤S1中菌种包括细菌和真菌。
所述步骤S4中，当菌种为细菌时，需在35℃的条件下培养48h；当菌种为真菌时，需在30℃的条件下培养96h。
所述步骤S5中麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉的质量比为6:4:3。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对菌种类型、底物溶液、温度和菌体用量等方面对显色反应的影响进行试验，并通过菌体显色能力与产酶能力进行比较，证明了菌体催化底物显色能力与菌种液体发酵产酶能力之间呈正相关，因此，仅通过菌体直接与底物溶液发生显色反应一步，在短时间内就可以检验出菌种有与无产漆酶能力和产酶能力高与低，利用该方法能够一步完成筛选，方法简单、快速灵敏。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，包括如下步骤：
S1：菌体选择培养：在培养皿中配置培养基，并在培养基上进行菌种接种培养，得到菌体，所述菌种为细菌或/和真菌；
S2：缓冲液配置：分别配置pH为4.5、5.0的0.05mol/L醋酸缓冲液和pH为7.0、8.0、9.0的0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
S3：显色反应底物溶液配置：根据步骤S2配置的缓冲液分别进行ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液配置，具体步骤如下：
ABTS底物溶液：按比例分别称取ABTS和pH为4.5的醋酸缓冲液，以1ml pH为4.5的醋酸缓冲液对应1mg ABTS进行混合，摇匀静置，制得ABTS底物溶液；
愈创木酚底物溶液：按比例分别称取愈创木酚和pH为5.0的醋酸缓冲液，以1ml pH为5.0的醋酸缓冲液对应1mg愈创木酚进行混合，摇匀静置，制得愈创木酚底物溶液；
丁香醛连氮底物溶液：按比例分别称取丁香醛连氮和pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应0.4mg丁香醛连氮进行混合，摇匀静置，制得丁香醛连氮底物溶液；
邻联甲苯胺底物溶液：按比例分别称取邻联甲苯胺和pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻联甲苯胺进行混合，摇匀静置，制得邻联甲苯胺底物溶液；
邻苯二酚底物溶液：按比例分别称取邻苯二酚和pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻苯二酚进行混合，摇匀静置，制得邻苯二酚底物溶液；
S4：菌种显色能力测定：分别吸取步骤S3中制得的ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液放入试管中，并在试管中加入步骤S1中培养的菌体，25℃下静置反应，记录反应液显色时间；
S5：漆酶溶液制备：按质量比为6:4:3的比例称取麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉，并将称取的麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉置于三角瓶中，在瓶中加入含0.2％硫酸铵、1.5％玉米浆和0.005％硫酸铜的混合溶液，调pH至6.5，在121℃下灭菌30min，接种步骤S1中培养的菌体，以280r/min在摇床上振荡培养，当菌种为细菌时，需在35℃的条件下培养48h；当菌种为真菌时，需在30℃的条件下培养96h，培养滤液即为漆酶溶液；
S6：菌种产漆酶能力测定：将步骤S4中加入菌体的底物溶液和稀释的漆酶溶液在25℃的条件下保温5min，用1cm光径比色杯于420nm波长测光吸收。每小时光吸收增加1.0所需酶量定义为1个酶活力单位(u)。
试验例
1、材料和方法
1.1、试验菌
11株细菌和12株真菌，均为中国科学院微生物研究所提供。
1.2、缓冲液
pH4.5和5.0，0.05mol/L醋酸缓冲液；pH7.0、8.0、9.0，0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
1.3、显色反应底物溶液
1mg ABTS/ml pH4.5缓冲液，1mg愈创木酚/ml pH5.0缓冲液，0.4mg丁香醛连氮/mlpH7.0缓冲液，1mg邻联甲苯胺/ml pH8.0缓冲液，1mg邻本二酚/ml pH9.0缓冲液。
1.4、菌种显色能力测定方法即菌种筛选方法
吸取0.5ml ABTS溶液于1.5cm×15cm试管中，加入一环(约0.1mg)菌体，25℃静置反应。记录反应液显绿时间。
1.5、菌种产漆酶能力的测定
250ml三角瓶装1.8g麦麸，1.2g纤维质粉和0.9g甘蔗渣粉，加入30ml含0.2％硫酸铵，1.5％玉米浆和0.005％硫酸铜溶液，调pH6.5，121℃灭菌30min，接种1环菌体，280r/min摇床上振荡培养，细菌35℃培养48h，真菌30℃培养96h。培养滤液即为漆酶溶液。2.4mlABTS溶液和0.1ml适当稀释的酶溶液25℃保温5min，用1cm光径比色杯于420nm波长测光吸收。每小时光吸收增加1.0所需酶量定义为1个酶活力单位(u)。
2、结果
2.1、菌种显色能力和产酶能力之间的相关性
测定了11株细菌和12株真菌使ABTS溶液显色能力和液体发酵产酶能力。
表1不同菌种显色和产酶能力
Figure BDA0003137640950000061
表1中—表示24h未显绿色。
由表1可以看出，能使反应液显绿的菌株的培养滤液有漆酶活力，并且显绿速度越快酶活力越高，不能使反应液显绿的菌株的培养滤液没有漆酶活力。
2.2、底物对显色反应的影响
将Bacillus altitudinis CA411菌株菌体加入不同pH的不同底物溶液中，在25℃进行显色反应。选取每种底物显色最适pH的数据列于表2。
表2不同底物对显色反应的影响
Figure BDA0003137640950000071
结果表明，所试5种底物，显色最适pH和显色速度均不相同。ABTS显色最快，15s反应液显现了绿色；邻联甲苯胺显色最慢，反应液显现红紫色用时4h。
2.3、温度对显色反应的影响
将Bacillus altitudinis CA411菌株菌体加入不同温度的ABTS溶液中，进行显色反应。
表3不同温度对显色反应的影响
Figure BDA0003137640950000072
表3结果表明，在所试温度范围内，显色反应速度随着温度的升高而加快。
2.4、菌体用量对显色反应速度的影响
取不同量的Bacillus altitudinis CA411菌株菌体进行显色反应。
表4菌体用量对显色反应速度的影响
Figure BDA0003137640950000073
由表4结果可以看出，菌体用量对显色反应速度没有影响。
3、结论
本发明关于漆酶产生菌筛选的液体显色法的建立是基于漆酶催化底物氧化生成有色物质的作用。微生物菌体通过体内所存在的漆酶起作用。表1菌体显色能力与产酶能力比较表明，菌体催化底物显色能力与菌种液体发酵产酶能力之间呈正相关。因此，仅通过菌体直接与底物溶液发生显色反应一步，在短时间内就可以检验出菌种有与无产漆酶能力和产酶能力高与低。
CA12和CA411两菌株液体发酵滤液漆酶活力分别为3u/ml和1866u/ml(见表1)，前者酶活力约为后者的六百分之一。产酶能力如此低的CA12菌株竟能使底物溶液显色，充分表明本研究所建立的液体显色法具有较高的灵敏度。
ABTS、愈创木酚、丁香醛连氮、邻联甲苯胺和邻苯二酚等漆酶作用底物均可作为显色反应底物。这些化合物在显色反应中所反映出的最适pH值各不相同(见表2)。试验出的最适pH值不可能是固定不变的，换了另外的试验菌，也许因为所产酶性质不同而变化。ABTS溶液在高pH条件下不稳定，反应须在低pH条件下进行。ABTS对漆酶较为敏感(见表2)，首选其作为显色反应底物。
表3结果说明，本研究液体显色法，对操作所采用温度要求不甚严格，可在较广泛的温度范围内任选。只是较高的温度会使反应速度过快，以致来不及判断显色反应结果。就ABTS作为显色反应底物的筛选方法而言，采用低于35℃的温度条件较适宜。
反应液显色首先从靠近菌体(包括所形成的碎片)表面的溶液开始，逐渐向外扩展。本研究所标显色时间是指显色反应开始到观察到颜色开始出现的那一段时间。由表4结果可以看出显色反应所取菌体量不影响显色速度，表明菌体用量对筛选结果不会造成显著影响。至于胞内酶，因为有底物溶液进入细胞和生成有色物质溶液渗透出细胞的一个时间过程，因此对胞内酶和胞外酶应区别分析。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理。

Claims (4)

1.一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：菌体选择培养：在培养皿中配置培养基，并在培养基上进行菌种接种培养，得到菌体；
S2：缓冲液配置：分别配置pH为4.5、5.0的0.05mol/L醋酸缓冲液和pH为7.0、8.0、9.0的0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
S3：显色反应底物溶液配置：根据步骤S2配置的缓冲液分别进行ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液配置，具体步骤如下：
ABTS底物溶液：按比例分别称取ABTS和pH为4.5的醋酸缓冲液，以1ml pH为4.5的醋酸缓冲液对应1mg ABTS进行混合，摇匀静置，制得ABTS底物溶液；
愈创木酚底物溶液：按比例分别称取愈创木酚和pH为5.0的醋酸缓冲液，以1ml pH为5.0的醋酸缓冲液对应1mg愈创木酚进行混合，摇匀静置，制得愈创木酚底物溶液；
丁香醛连氮底物溶液：按比例分别称取丁香醛连氮和pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应0.4mg丁香醛连氮进行混合，摇匀静置，制得丁香醛连氮底物溶液；
邻联甲苯胺底物溶液：按比例分别称取邻联甲苯胺和pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻联甲苯胺进行混合，摇匀静置，制得邻联甲苯胺底物溶液；
邻苯二酚底物溶液：按比例分别称取邻苯二酚和pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，以1ml pH为9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液对应1mg邻苯二酚进行混合，摇匀静置，制得邻苯二酚底物溶液；
S4：菌种显色能力测定：分别吸取步骤S3中制得的ABTS底物溶液、愈创木酚底物溶液、丁香醛连氮底物溶液、邻联甲苯胺底物溶液和邻苯二酚底物溶液放入试管中，并在试管中加入步骤S1中培养的菌体，25℃下静置反应，记录反应液显色时间；
S5：漆酶溶液制备：按比例称取麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉，并将称取的麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉置于三角瓶中，在瓶中加入含0.2％硫酸铵、1.5％玉米浆和0.005％硫酸铜的混合溶液，调pH至6.5，在121℃下灭菌30min，接种步骤S1中培养的菌体，以280r/min在摇床上振荡培养，培养滤液即为漆酶溶液；
S6：菌种产漆酶能力测定：将步骤S4中加入菌体的底物溶液和稀释的漆酶溶液在25℃的条件下保温5min，用1cm光径比色杯于420nm波长测光吸收。
2.根据权利要求1所述的一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，其特征在于：所述步骤S1中菌种包括细菌和真菌。
3.根据权利要求1所述的一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，其特征在于：所述步骤S4中，当菌种为细菌时，需在35℃的条件下培养48h；当菌种为真菌时，需在30℃的条件下培养96h。
4.根据权利要求1所述的一种快速筛选漆酶产生菌的液体显色方法，其特征在于：所述步骤S5中麦麸、纤维质粉和甘蔗渣粉的质量比为6:4:3。
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