JPH03155780A - フルクトシルアミン・オキシダーゼ、その製造法、該酵素を用いたアマドリ化合物の定量法及びその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規な酵素フルクトシルアミン・オキシダー
ゼとその製造法、及び該酵素を使用する試料中のアマド
リ化合物の定量法、並びにその試薬に関する。

′〈従来の技術及び問題点〉 フルクトシルアミン化合物は、アルドースとアミノ基を
持った化合物が接触した時からアマドリ化合物として非
酵素的に生産され、その濃度は両者の濃度と接触時間に
比例して増加することが知られている。つまりフルクト
シルアミン化合物の濃度は、糖とアミノ基を持った化合
物が、どの様な濃度または温度でどの位接触していたの
かという過去の情報を提供するものであり、従ってこの
化合物の定量は、糖やアミノ基を多量に含んだ製品、例
えば醤油や味噌あるいは輸液等の製造や貯蔵管理を行な
う上で有用である。また臨床検査においては、血液中に
おけるこの種の化合物のうち、ヘモグロビンに結合した
フルクトシルアミン化合物をグリコヘモグロビン（Ｈｂ
Ａ、）と呼び、また血清中に存在する主としてアルブミ
ンに結合したフルクトシルアミン化合物をフルクトサミ
ンと呼んで、それぞれ糖尿病の病態を現わすものとして
盛んに測定している。

しかしその測定法は高速液体クロマトグラフィーを利用
した方法（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　Ｓｃｉ、　１０６
５９（１９７９））　、ホウ酸を結合させた固体をカラ
ムにつめて吸着させた後、これを溶出する方法（Ｃ１ｉ
ｎ。

Ｃｈｅｍ、　２８２０８８　（１９８２））　、ゲルを
ベツドにして電気泳動を行なう方法（ＣＩｉｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、　２６１５９８（１９８０））などがあるが、い
ずれも操作性や精度の点、又は高価な機器を必要とする
など欠点が多い。

またフルクトサミンの測定法として最近になって急速に
発展した方法にフルクトシルアミン化合物の示すアルカ
リ性における還元作用を色素の発色に結びつける方法（
ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　１２７８７（１
９８３））があるが、その反応の特異性と標準品の選択
において問題がある。

本発明者等はこれらのフルクトシルアミン化合物を酵素
を用いて定量すべく、鋭意検討して来た。

その結果、土壌中のコリネバクテリウム属に属する細菌
から、フルクトシルアミノ酸に作用する酸化酵素フルク
トシルアミノ酸オキシダーゼを発見し、先に特許出願を
行なった。（特開昭６ｌ−２６８１７８） しかし、この酵素はα−アミノ酸のアマドリ化合物に対
しては良く作用するが、βやεのアミノ基についたフル
クトースに対する作用に極めて弱いか、又は認められな
い。生体中アミノ酸にはα−アミノ基の他にε−アミノ
基があり、どちらかというと後者に結合したフルクトー
ス化合物の方が多い。そのためリジンのε−アミノ基に
結合したフルクトースの定量をも目指す場合には、その
特異性の点でコリネバクテリウム属に属する細菌の酵素
は使用することができなかった。

本発明者等は、更に広く土壌中機生物の中に、これらの
化合物を分解する活性のある酵素を検索した結果、アミ
ノ酸のαのみならずεのアミノ基についたフルクトース
化合物をも分解することができる酵素を生産するアスペ
ルギルス属に属する糸状菌を発見し本発明を完成させた
。

く問題点を解決するための手段〉 以下本発明を具体的に説明する。

本発明の酵素フルクトシルアミン・オキシダーゼの理化
学的性質は下記の通りである。

（１）作用及び基質特異性 酸素の存在下でα−アミノ酸、β−アミノ酸、ε−アミ
ノ酸、Ｄ−アミノ酸のアマドリ化合物を分解して、グル
コソンと過酸化水素及び対応するα−アミノ酸、β−ア
ミノ酸、ε−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸を生成する反応を
触媒する。

この式中、Ｒ１は−（ＣＨ（ＯＲ）　）ｌｌ−ＣＩ（２
０Ｈであり、Ｒ２はＨ又はα−アミノ酸の側鎖残基、Ｒ
ｓは（ＣＨ２）、Ｈ、−（ＣＨ２＞−−Ｃｏｏｌ又は−
（ＣＨｉ）、−Ｃ１（ＮＯ３）　−Ｃ０ＯＨである。７
は０〜４の整数である。

なお、本酵素は含有するＮ原子にＮ原子が１つしかない
化合物であるイミノ酸（例えばプロリン）、Ｎ−メチル
アミノ酸（例えばザルコシン）、あるいはモルホリン等
のアマドリ化合物に対しては極めてわずかしか作用を示
さない。アミン部分がアンモニアであるフルクトシルア
ミンにも少し作用するが、フルクトース残基中のケトン
を還元したもの、例えばグルジトリルグリシンに対して
は作用しない。また、フルクトース以外の糖化合物に対
しての反応はフルクトースのものに比較すると格段に小
さい。

なお本酵素と特開昭６１−２６８１７８号記載のフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ）の各基質に対
する活性を第１表に示す。

第　　　　　１　　　　　表 酵素の基質特異性 Ｄ−フルクトシルグリシン Ｄ−フルクトシル−し−バリン Ｄ−フルクトシル−し−アラニン Ｄ−フルクトシル−し−ロイシン Ｄ−フルクトシル−Ｄ−ロイシン Ｄ−フルクトシル−〇−アラニン Ｄ−フルクトシル−β−アラニン ε−Ｄ−フルクトシル−し一すジン Ｄ−フルクトシルーε−カプロン酸 Ｄ−フルクトシル−グリシルグリシン Ｄ−フルクトシル−ポリリジン Ｄ−フルクトシル−メチルアミン Ｄ−フルクトシル−アミン Ｄ−タガトシルグリシン Ｄ−エリスロペンツロシルグリシン マルツロシルグリシン ＦＡＯＸ本酵素 １００　１００ １３２　２５０ １８０　２５１ １９５　２６７ １４２ ４６ ６５ ３３ ２５ ０２０ ０　５＊ ６ ４ １　　８ ６２ ３ 数値はそれぞれＤ−フルクトシルグリシンに対する活性
を１００とした場合の比である。

＊：反応液中に４　ｍｇ／ｍＲで測定した。

（２）至適ｐＨ： 本酵素の至適ｐＨはフルクトシルグリシンを基質とした
場合、第１図に示すごと（ｐ）１７．５〜８．２である
。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニターで計測す
ることにより行なった。なお図中の使用緩衝液は下記の
とおりである。

〇−〇：　０．Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液ｘ−ｘ：０
．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（３）　ｐＨ安定性： 本酵素０．１単位を含有する各種緩衝液０．４ｍｌを３
７℃、１０分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。そ
の結果は第２図に示す通りである。なお図中の使用緩衝
液は下記のとおりである。

Ｏ−○：　０．Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液Δ−Δ：０
．ＩＭ）リス−塩酸緩衝液 Ｘ−Ｘ：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（４）力価
の測定法： 第１法：生成される過酸化水素を発色定量する方法 ｏ、ｏｏｓ％４−アミノアンチピリン及び０．０１５％
２．４−ジクロロフェノールサルホネートを含有する　
０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８）２．８
ｍｌを試験管にとり、４００　Ｕ／ｒｄのパーオキシダ
ーゼ溶液ｌＯμ２を加える。温度平衡を３７℃に達せし
めたのち、適当な活性を有する酵素溶液０．１ｍｌを加
え、さらに０．５Ｍフルクトシルグリシン−０，１Ｔｄ
を加えて１０分間反応させ、生じた色素を光電比色計を
用いて５１０　ｎｍにおける吸光度を測定する。別にあ
らかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成色素
量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用
いて、３７℃、１分間当りに生成される過酸化水素のマ
イクロモルを計算し、この数字を使用酵素液中の活性単
位とする。

第２法：酵素反応にともなって吸収される酸素量を測定
する方法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）　　２．９　ｍｌ
！をＹＳＩ社製社製オキシセンモニタ一定容器にとり、
　０５Ｍフルクトシルグリシン−０，１ｍｌを加え３７
℃で３分間攪拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめ、
これに酸素電極を差し込み密閉したのち、酵素溶液３０
μ２を注入し、生じる酸素吸収をモニターに接続した記
録計で連続的に計測し、その最初の速度を測定する。あ
らかじめ同様にして容器内の酸素濃度と記録値の間で標
準曲線を作成し、これを用いて測定値から酸素濃度を求
める。３７°Ｃ１１分間当り　１マイクロモルの酸素吸
収を起こす酵素の活性を１単位とする。

（５）作用適温の範囲； フルクトシルグリシンを基質として、０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，８）中で、各温度における酵素反応によ
り生成したグリシンをアミノ酸分析計を用いて測定した
。その結果は第３図に示す通りで、本酵素の作用適温の
範囲は３０℃〜４３℃である。

（６）熱安定性： 精製酵素０．０２単位を含有する酵素液０．１ｍ１（０
，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，８）を各温度で１０分間
放置したのち、残存した酵素活性を調べた。

その結果は第４図に示す通りで、３７℃以下では安定で
あるが、５０℃で７０％が失活する。

（７）阻害、活性化及び安定化： ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）中で、酸素
吸収を測定することによりって調べた。濃度２ｍＭの各
物質の本酵素に対する影響は下記の通りである。

１ｇ＋４　　　（：ｄ＋＋　　　Ｎｉ＋＋　　　Ｚｎ４
４　　　Ｃ０４４Ｃｕ”＋は強く阻害し、Ｍｇ”＋は中
程度に阻害する。

ＮａＮ　Ｂ、ＰＣＭＢも酵素反応を強力に阻害する。ま
た本酵素に対する活性化剤及び安定化剤については未知
である。

（８）精製方法： 本酵素は後記の精製方法によって精製することができる
。

（９）分子量： 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−２００を用いた
カラムゲル濾過法で測定した結果、０．１Ｍ食塩含有０
．０５　Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）中で
は８０，０００〜１１１３．０００であった。

（１０）等電点 ディスク焦点電気泳動により測定した結果、ＰＩ　＝　
６．８であった。

（１１）ディスク電気泳動： デービスのｐ）ｌ　９．４のゲルを用いて４　ｍＡ／ゲ
ルで５℃、７０分泳動を行ない、酵素蛋白をクマジーブ
リリアントブルーＧ−２５０で染色した。

その結果、ゲルのアクリルアミド濃度７５％の時は陽極
側に２．５　ｍｍ　（ブロムフェノールブルーは４．９
　ｃｍ）　、５％の時には同じく陽極側に１１．５ｍｍ
の所に酵素活性を持つほぼ単一なバンドを認めた。

前記のように本酵素は、その作用及び基質特異性におい
て従来全く知られていない新規な酵素である。

次に本発明によるフルクトシルアミン・オキシダーゼの
製造法について説明する。

本発明において使用される微生物はアスペルギルス属に
属し、フルクトシルアミン・オキシダーゼ生産能を有す
るものであればいずれでもよいが、具体例としてはアス
ペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ
、）　１００５が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株
も用いられる。アスペルギルス・エスピー　１００５は
本発明者らが土壌中より新たに分離した菌株であり、そ
の菌学的性質は下記の通りである。

なお、菌の分類はおおむねレーバー（Ｋ　、　Ｂ　、　
Ｒａｐｅｒ）とフェンネル（Ｄ、１．Ｆｅｎｎｅｌｌ）
著の［ザ・ジーナス・アスペルギルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎ
ｕｓ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　Ｊ（Ｔｈｅ　　Ｗａ
ｖｅｒｋｙ　Ｐｒｅｓｓ）の記述に準拠した。

（１）培地における生育状況 ａ）　ＹｐＳｓ培地（２５°Ｃ生育） 生育は普通で４白目で直径３７ｍｍに広がり、白色の羊
毛状の厚いコロニーを作った。辺縁部は寒天面上にそっ
て無色の菌糸がうすく延びている。

中央部の直径２５ｍｍでは胞子の着生が見られ、その色
は周辺部では無色、中心部分でうすい黄土色（Ｃｏｌｏ
ｎｉａｌ　Ｂｕｆｆ）であった。裏面にはわずかにひだ
ができたが、色素の生成は見られなかった。

７日目で直径６７ｍｍ、辺縁部３　ｍｍは寒天面にそっ
たうすい菌糸が占めていた。その内側５　ｍｍの幅で白
色の羊毛状菌糸があり、それから内側は密に胞子が着生
していた。その色は辺縁部ではうす黄色（Ｐｒｉｍｒｏ
ｓｅ　Ｙｅｌｌｏｗ）であるが、更に内側は黄土色（Ｏ
ｌｉｖｅ　０ｃｈｅｒ）であり、中心部は濃い褐色（Ｂ
ｒｏｗｎｉｓｈ　０１ｉｖｅ）であった。コロニー表面
の色、形状による紋様は観察されなかった。裏面は中心
部直径１１ｍｍに灰褐色（Ｏｌｉｖｅ　Ｂｒｏｗｎ）の
着色が見られるが、ひだはほとんど生じていなかった。

菌糸はほふく性で、かつ、無色で隔壁を有し、幅は２．
７〜９．５μｍで分枝性である。分生子形成細胞は菌糸
の細胞膜が肥厚した細胞（Ｆｏｏｔ　ｃｅｌｌ）を有し
、隔壁を持たない。胞子柄は表面平滑で幅１０〜１２μ
ｍ、長さ　１．５〜２．４　ｍｍである。頂端に直径３
１〜３７μｍの球状の分生胞子のうを形成し、その表面
に放射状の検子を２段に形成し、その先端に芽胞子を着
生する。胞子は数珠状に連なって生じ、胞子頭は放射状
であり、直径０．２〜０．３５ｍｍのほぼ球状である。

芽胞子は直径３〜４μｍでほぼ球状であり、表面はほぼ
平滑で、ｌ細胞で構成されている。

ｂ）　ＣＹＡ　培地（ツアペック−イーストエキス−ア
ガー培地２５℃生育） 生育は普通で４日目で直径５２ｍｍのコロニーを形成し
、中央部の直径３４ｍｍの中では黒褐色（Ｏｌｉｖａｃ
ｅｏｕｓ　Ｂｌａｃｋ）の胞子を密に着生する。しかし
・、その外周部には羊毛状の密な白色の菌糸が見られ色
素の生成は見られない。頂のうは気中菌糸よりも上部に
伸長する。裏面にははっきりした放射状のひだができる
が、色素の生成は見られない。

６日目で直径８６ｍｎのシャーレ全面に広がり、７日目
では周辺の２　ｍｍがわずかに白い菌糸が見られる位で
、全面に黒褐色胞子がおおっている。

胞子の着生は極めて密であるが、表面の紋様は見られな
い。裏面は放射状の大きなひだが目立つが、色素は全く
生産されていない。

Ｃ）麦芽エキス寒天培地 ４日目で直径５０ｍｍのコロニーを作るが、他の培地に
比較して気中菌糸の伸長が少なく全体に平らである。中
央部３８ｍｍで胞子の形成が見られ、その色は濃い黄土
色（Ｂｕｆｆｙ　０１ｉｖｅ）であるが、中心部の古い
部分は濃いオリーブ色（ＤａｒｋＯｌｉｖｅ）である。

他の培地に比較して胞子柄が短く厚みが乏しい。また胞
子着生の密度が他の培地に比べると劣る。裏面にはひだ
は見られずＪ色素の生成も認められない。

７日目では直径７５ｍｍに広がり、はぼ全面に胞子の着
生が見られる。胞子の色は全体に黒褐色（Ｏｌｉｖａｃ
ｅｏｕｓ　Ｂｌａｃｋ）であり、中心部から同心円状に
胞子の着生状況が異なり、全体として同心円状の紋様が
認められる。この紋様は裏面からも認められるが、寒天
への色素の放出は認められない。

またひだも観察されない。

ｄ）生育条件 ｐｔｔ　２．０〜９．０（至適ｐＨ４，５付近）温度２
０℃〜４５℃（至適温度３７℃）（２）本菌株の分類学
上の位置について下記の本菌株の菌学的性質と前述の「
ザ・ジーナス・アスペルギルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）」に記述されたアスペルギル
ス属の菌学的性質を比較することによって、本菌は、ア
スペルギルス属に属する糸状菌であると判定された。

■胞子はｌ細胞からなり、直線状に連鎖するが分枝はし
ない。

■分生子柄は球状の頭部を持ち、２段の検子を生じ、胞
子はびん形の検子に生成される。

■分生子柄はＦｏｏｔ　ｃｅｌｌから生じ、隔壁を持た
ない。

■菌糸は、隔壁を有し無色である。

さらにツアペック−寒天培地に生育したコロニーの生育
状態からアスペルギルス属の分類記述に基づいて分類を
行なうと、下記の特徴からアスペルギルスΦニガーグル
ープに分類された。

■２段の検子を生じる。

■胞子の着生は放射状であり、胞子頭は全体としてほぼ
球状に形成されるが、古くなった胞子頭はゆるく分裂す
ることがある。

■頂のうけ球状（３１〜３７μｍ）であり、胞子柄は充
分長い。

■分生胞子は黒っぽい色をしている。

さらにアスペルギルス・ニガーグループの細かい記述に
従って分類すると、下記の点からアスペルギルス・ツリ
ンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｌｉｎｇｅｎ
ｓｉｓ）に近縁な菌であると思われた。

■２段の検子を生じる。

■分生胞子の色は若い状態の時−時的に灰褐色（Ｏｌｉ
ｖｅ　Ｂｒｏｗｎ）を示す時期がある■分生胞子は、最
初は無色透明であるが急速に着色して黒色に近くなる。

■分生胞子は直径３〜４　μｍで５　μｍ以下である。

■コロニーの裏側に着色は見られない。

■分生胞子柄は、多くは２〜３　ｍｍであり５ｍｍを越
えない。

本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研条寄第２６５１号　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６５
１）として寄託されている。

次に本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有していれば合成培地
、天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源として
は例えばグルコース、フラクトース、キシロース、グリ
セリン等を用いることができる。窒素源としてはペプト
ン、カゼイン消化物、あるいは酵母エキス等の窒素性有
機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム
、カリウム、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄
、コバルト等の塩類が使用できる。

本発明においては、フルクトシルアミノ酸を含有する培
地で培養したときに、フルクトシルアミン・オキシダー
ゼが最も収量よく得られる。該培養培地の好適な例とし
ては、例えばフルクトシルグリシン１．０％、酵母エキ
ス０．５％、ポリペプトン０．５％、燐酸水素１カリウ
ム０２％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウ
ム０，０１％、（ｐＨ６，５）の培地が挙げられる。培
養は通常２５〜３７℃の範囲で、好適には３０℃付近で
行なわれる。培養開始のｐＨは６〜８の範囲であるが、
好適には６．５付近である。この様な条件下で、３０〜
７２時間振盪又は深部攪拌培養すれば、培養物中にフル
クトシルアミン・オキシダーゼが効率良く生産され、蓄
積する。

本酵素は通常は菌体中に存在するので、培養物を濾過し
て菌体を集め、適量の緩衝液に懸濁して菌体を破壊する
ことによって酵素を可溶化することが必要である。こう
して得られた酵素含有液から、核酸、細胞壁断片等を取
り除くことによってフルクトシルアミン・オキシダーゼ
を得ることができる。更に本酵素は必要により酵素の単
離精製の常法に従って、例えば（１）　ＤＥＡＥ−セル
ロースカラムクロマトグラフィー　（２）硫安分画、（
３）フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー（
４）セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイ
ー等の方法、又はその他の方法を必要に応じて組み合わ
せて用いることにより、精製製品を得ることができる。

本酵素の精製の具体例を示すと下記の通りである。

培養物中から菌体を集めたのち、００２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨａ、ｏ）に懸濁し、１％量のトリトンＸ−１００
を加え溶解する。ミキサーを用いて軽く磨砕した後、ダ
イノミル〔シンマルエンタープライズ社（スウェーデン
）製〕を使用して菌体を破砕する。遠心分離して上清を
集め、ＤＥＡＥ　−セルロースカラム（０，０２Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，５に平衡化しである）にか
けて酵素を吸着させる。０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，５）で洗浄したのち、０．５Ｍ食塩濃度
にして酵素を溶出させる。活性画分を集め、これに硫安
粉末を６％濃度になるように加える。これを硫安を６％
含有した０、０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）に平衡化したフェニルセファロースカラムに通過さ
せて酵素を吸着させる。このカラムを２％硫安の入った
同じ緩衝液で洗った後に、２％硫安を含んだ０．０２　
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）と１０％エタノ
ールを含んだ０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９，０）をつなぐことによって形成した濃度勾配を持っ
た緩衝液で溶出する。活性部分を濃縮した後、０．０２
　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に平衡化した
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラムにかける。こ
れを同じ緩衝液中の０から０．５Ｍ食塩濃度勾配によっ
て溶出する。その活性部について、０．１Ｍ食塩を含有
したリン酸緩衝液、ｐＨ７，５で平衡化したセファデッ
クスＧ−２００のカラムクロマトグラフィーを行ない精
製酵素を得ることができる。

次に本発明によるアマドリ化合物の定量法について説明
する。

本発明の定量法は下記の反応を基礎としている。

この式中、Ｒ１は−（ＣＩ（ＯＨ））、−ＣＨ，ＯＨ。

はＯ〜４の整数、Ｒ３はα−アミノ酸の側鎖残基を示す
。またＲ３は−（ＣＨり、Ｈ，−（ＣＨ窒）。

Ｃ０ＯＨ又は−（ＣＨ＊）−ＣＨ（ＮＨｔ）　　Ｃ０Ｏ
Ｈである。

本発明の定量法における被検液としては、上記反応式中
に示されたアマドリ化合物を含有する液であればいかな
るものでもよく、例えば醤油や蜂蜜のような高濃度のア
ミノ酸又は糖を含有するものが好適に用いられる。また
生体試料などに由来する蛋白やポリペプチド鎖に存在す
るものについては、温和な条件で遊離させる手段に解決
すべき問題はあるが、定量の果たす効果が更に大きい。

上記のフルクトシルアミン・オキシダーゼをアマドリ化
合物の含有液に作用させる場合には、ｐＨ６，５〜１０
及び温度５０℃以下、好ましくはｐＨ７，５〜８．５及
び温度３０〜４０℃の条件で、通常はｌＯ〜２０分間程
度反応させる。ｐＨの調整には、前記反応のｐＨ範囲を
維持することができ、かつ酵素反応を阻害しない任意の
緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム緩衝液、リン
酸カリウム−炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソー
ダ緩衝液等が好ましい。フルクトシルアミン・オキシダ
ーゼの使用量は、終点分析法においては通常は０，５単
位／ｙｎｆ１以上である。

本発明においては、下記の何れかの測定法によりアマド
リ化合物を定量する。

（１）酵素反応により生成する過酸化水素の測定法： 反応により生成する過酸化水素を、過酸化水素定量の常
法、例えば発色方法、過酸化水素電極を用いる方法等に
より定量し、あらかじめ別に用意した過酸化水素量とア
マドリ化合物量との標準曲線よりアマドリ化合物を定量
する。なお発色法により過酸化水素を測定する場合には
、例えば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と同
様に操作する。

（２）酸素消費に基づく定量法： この定量法は、反応開始時の酸素量より反応終了時の酸
素量を差引いた値（酸素消費量）を測定し、あらかじめ
別に用意した酸素消費量とアマドリ化合物量との標準曲
線よりアマドリ化合物を定量するもので、酸素量の測定
は常法、例えばワールブ・ルグ検圧法、酸素電極法等に
より行なわれる。

なお酸素電極法により酸素消費量を測定する場合には、
例えば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と同様
に操作する。

本発明のアマドリ化合物定量用試薬は、フルクトシルア
ミン・オキシダーゼ及び酵素作用を行なわしめるに好適
なｐＨ範囲、一般にｐＨ６，５〜１０、好ましくはｐＨ
７，５〜８．５を与える緩衝剤、更に反応生成物を測定
する場合には、必要により発色剤等を適宜組合せて成る
。

フルクトシルアミン・オキシダーゼとしては、液状、粉
末状の何れでもよく、終点分析を行なうには１検体当り
の酵素量は通常は０．５単位／ｍ１以上である。緩衝剤
としては、例えばリン酸カリウム緩衝液、リン酸カリウ
ム−炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソーダ緩衝液
等が好ましい。

反応生成物を測定する際の発色剤としては、該生成物と
反応して発色する物質が用いられ、過酸化水素の発色剤
としては、パーオキシダーゼと例えば４−アミノアンチ
ピリン／　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノアン
チピリン／フェノール、４−アミノアンチピリン／　Ｎ
、Ｎ−ジエチルアニリン、　ＡＢＴＳ　、　　ＭＢＴＨ
／　Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、４−アミノアンチピリ
ン／２，４−ジクロロフェノールサルホネート等の組合
せか挙げられる。

本発明のアマドリ化合物定量用試薬は冷暗所、特に５℃
以下に保存することが好ましい。

〈発明の効果〉 本発明によれば、従来困難であったアマドリ化合物の測
定が容易になり醤油等の食品や輸液等の製造時及び保存
中の状態を反映するアマドリ化合物を効率良く測定する
ことができる。また、尿や血液及び生体に由来する蛋白
質やポリペプチド鎖に結合したものも、適当なペプチダ
ーゼを作用させ、遊離状態にしたのちには同様に測定す
ることができ、特に糖尿病の病態測定に利用できる。

次に本発明を実施例により説明する。

〈実施例〉 実施例１ アスペルギルス・エスピー１００５　　（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２６５１）をフルクトシルグリシン１．０％、イー
ストエキス０．５％、ポリペプトン０．５％、リン酸２
カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化
カルシウム０．０１％を含有した培地（ｐＨ６、５）１
００　ｍを入れた坂ロフラスコ（５００ｎｔ１２容量）
に植菌し、３０℃、２４時間、振盪培養した。この種培
養物を３息のミニジャーファーメン　ター中の同一培地
２息に植え、通気量２込／分、攪拌速度４００　ｒ、ｐ
、ｍ、の条件で３０℃、４８時間深部攪拌培養した。培
養物を濾過して菌体を集めた。

その培養菌体の一部（１００ｇ）に０．０２　Ｍ　）リ
ス−塩酸緩衝液（１％トリトンＸ−１００を含有する）
ｐＨ８，０，２５０１１１Ｆを加え菌を良く分散させ、
氷で４℃まで冷却した。これをミキサーで軽く磨砕した
後、ダイノミルによる菌体の破砕処理（３０００ｒ、ｐ
、ｍ、　、７分）を行なった。破砕容器は水冷水によっ
て充分冷却した。破砕液を１２００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で１５分遠心分離して上清部分を集め、２７５ｍ１の液
を得た。この液を０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ８，５で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースを充填した
カラム（直径９ｃｍＸ　長さ　３５ｃｍ）にかけて酵素
を吸着させた。０−０．５　Ｍ食塩濃度勾配による溶出
を行なって活性部位を集めた。次いでこの酵素液に６ｇ
／１００ｍＲの割合に硫安を溶解させたのち、あらかじ
め６％硫安含有００２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）で平衡化したフェニルセファロースを充填したカラ
ム（直径２５ｃｍＸ　長さ２３ｃｍ）を通過させて酵素
を吸着させた。これを硫安２％を含んだ同じ緩衝液で洗
浄して不要な蛋白を除いた後、２％硫安を含んだ０．０
２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）と　１０％
エタノールを含んだ０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９，０）をつなぐことによって作った濃度勾配を
持った緩衝液で溶出した。活性部分を濃縮した後、０．
０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に平衡化
したＤＥＡＥ−セファデックスを詰めたカラム（直径２
．５ｃｍＸ　長さ３５ｃｍ）にかけて酵素を吸着させた
。これを同じ緩衝液中の食塩濃度勾配（０から０．５　
Ｍ）によって溶出した。活性部をアミコン社製限外濾過
膜装置（分画膜１００００）にて濃縮したのち、〔あら
かじめ０．１Ｍ食塩含有の０．０５　Ｍ　トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化した〕セファデックスＧ
−２００を充填したカラム（直径１．２ｃｍ　Ｘ　長さ
　１００ｃｍ）にかけゲル濾過した。活性部を集めた結
果、４２単位／蛋白■の酵素が得られた。収率は２７％
であった。

実施例２ ４−アミノアンチピリン０，０５％　　０．３　ｒｌＬ
Ｉｌ！２．４−ジクロロフェノールサルホ ネート　０．１５％　　　　　　　　　　０．３ｍｌリ
ン酸緩衝液０．２　Ｍ　、　ｐＨ７，５１，５ＴＩＬｆ
！パーオキシダーゼ４００単位／１１ｔｉｌ　　　１０
μλフルクトシルバリン１．５ｍＭ　　　Ｏ〜１００μ
２蒸留水を加えて全量を２．８０　ｍ２に調整した。

゛上記反応液の入った試験管にフルクトシルアミン・オ
キシダーゼ（１６５単位／ｒｄ含有）２００μλづつを
加えて、３７℃にて１０分間反応させたのち、発色した
色素を５１０　ｎｍで比色定量した。

その結果、加えたフルクトシルバリンと吸光度の間に比
例関係が認められた。

実施例３ オキシゲンモニター（米国ＹＳＩ社製）の酸素測定容器
に０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を１．
５ｍｌ　とり、カタラーゼ（５００００単位／ｍｆり　
　２０μ息、フルクトシルアミン・オキシダーゼ（１６
５単位／ｍｌ含有）２００μ２及び蒸留水１．２ｍｌを
加えて、３７℃で３分間攪拌を続けて平衡に達せしめた
。酸素電極をさしこんで密閉したのち、醤油溶液（ｐＨ
７，０に調整後、水で２倍に希釈したもの）　　１０μ
２を加えて反応させた。反応経過はモニターに接続した
記録計ですべて記録し、１０分後に反応結果を測定した
ところ、反応前から７４目盛の酸素濃度の変化が読みと
れた。同様にしてフルクトシルアミン・オキシダーゼの
代りに水を用いて操作した場合には、１４目盛の変化が
読みとれた。その差は６０目盛であった。醤油溶液の代
りにフルクトシルグリシンの標準液を用いて同様に操作
して得た検量線から、この値は０．２５μｍｏｌと算出
された。

実施例４ 測定用試薬 試薬の調製 Ａ：５■／？５ｍ１２４−アミノアンチピリン（０，１
５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　）Ｂ：１５
■／１５　ｍｌ！　　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｃ：
１３２単位フルクトシルアミン・オキシダーゼ＋６６０
単位パーオキシダーゼ／１ＯｒＩＬｉ！使用に際しては
３種を混合し、試料溶液０．５　ｒＩＬ１２に対し試薬
溶液２．５ｍｌを使用する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２図
は本酵素の安定ｐＨを示すグラフであり、第３図は本酵
素の作用適温の範囲を示すグラフである。第４図は熱安
定性を示すグラフである。 なお、第１図及び第２図における使用緩衝液は下記のと
おりである。 ０−０：　０．Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液△−△：０
．ＩＭトリスー塩酸緩衝液 ｘ−ｘ：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液５　５　７
　９　９　１０　１１ Ｈ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有するフルクトシルアミン・
   オキシダーゼ。 （ａ）作用及び基質特異性 酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケトアル
   デヒド、アミン誘導体、及び過酸化水素を生成する反応
   を触媒する。アマドリ化合物がα−アミノ酸、β−アミ
   ノ酸、ε−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸の誘導体であるもの
   に良く作用する。 （ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨ範囲はフル
   クトシルグリシンを基質とした場合にｐＨ７．５〜８．
   ５（リン酸緩衝液）、安定ｐＨ範囲は７．５〜１１．０
   。 （ｃ）作用適温の範囲：３０℃〜４３℃。 （ｄ）熱安定性：３７℃、１０分間の加熱に対して安定
   であるが５０℃、１０分間の加熱により７０％以上失活
   する。 （ｅ）分子量：セファデックスＧ−２００カラムを用い
   たゲル濾過法で測定した値は約８０，０００〜８３，０
   ００である。 ２、アスペルギルス属に属しフルクトシルアミン・オキ
   シダーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
   りフルクトシルアミン・オキシダーゼを採取することを
   特徴とするフルクトシルアミン・オキシダーゼの製造法
   。 ３、アマドリ化合物を含有した試料にフルクトシルアミ
   ン・オキシダーゼを作用させ酸化反応により消費される
   酸素量を測定するか、又は該反応により生成する過酸化
   水素を測定することを特徴とするアマドリ化合物の定量
   法。 ４、フルクトシルアミン・オキシダーゼを含むアマドリ
   化合物測定用試薬。