JPH0533997B2 - - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
による新規なアマドリ化合物の定量法及びそれに
用いられる定量用試薬に関する。 食品や生体内では還元性の糖、特にアルドース
と呼ばれるアルデヒド基を有する糖と蛋白質、ペ
プチド、アミノ酸等のようにアミノ基を有する物
質が共存する場合、両者が不可逆的に結合してケ
トアミン化合物が生成してくる。この化合物はア
ルデヒド基とアミノ基の結合物がアマドリ転移を
起こした結果生成されることからアマドリ化合物
と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンか
らは次式Aのフルクトシルアラニンが生成する。
またグリセルアルデヒドとグリシンからは次式B
のハイドロキシアセトニルグリシンが生成する。 このようにアルドースとα−アミノ酸が結合し
てアマドリ転移を起こした化合物は、その分子内
に共通にイミノ2酢酸の基本骨格を含有してお
り、一般的に構造は次式で表わされる。 式中Xは基−〔CH(OH)〕o−CH2OH、nは0
〜4の整数、Yはα−アミノ酸の側鎖残基を示
す。一方アマドリ化合物はアルデヒド基を有する
物質とアミノ基を有する物質が接触した瞬間から
化学的にかつ不可逆的に生成蓄積されてくる。そ
の生成速度は原料物質の濃度、接触時間、温度な
どの関数で表わされる。それ故、その蓄積量を測
定することによつて、過去の糖及びアミノ化合物
の濃度、接触時間、保持温度などを推定すること
ができるが、その定量は比較的困難であり、処理
中の分解に起因する精度の低下を免れなかつた。 従来の定量法としては例えば下記の方法が知ら
れている。アミノ酸分析計を用いる方法(ジヤー
ナル・アグリカルチユアル・フード・ケミストリ
ー、24巻1号(1976)70頁参照)、アルドリ化合
物を水素化ホウ素ナトリウムで還元したのち塩酸
分解してカラムクロマトグラフイーで分離する方
法(アチーブス・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフイジツクス(1977)181、542〜
549頁参照)、アマドリ化合物を弱酸と加熱して生
成する5−ハイドロキシメチル−2−フルフラル
デヒドをチオバルビツール酸によつて比色定量す
る方法(FEBSレター(1976)71、356〜360頁参
照)など。しかしこれらの方法は操作の容易性及
び精度の点で満足できるものでなかつた。 そこで当業界では、食品や生体中に含まれるア
マドリ化合物を簡易に精度良く測定する方法の開
発が特に要望されている。このような実情に鑑
み、本発明者らは、迅速かつ正確なアマドリ化合
物の定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成した。 本発明はアマドリ化合物含有液に、酸素の存在
下でフルクトシルアアミノ酸オキシダーゼを作用
させ、酸化反応により消費される酸素量を測定す
るか、あるいは該反応により生成する過酸化水素
を測定することを特徴とする、アマドリ化合物の
定量法である。 本発明は更に、フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼを含有することを特徴とする、アマドリ化合
物の定量用試薬である。 本発明の定量法は下記の反応を基礎としてい
る。 この式中、R1は基−OH、−〔CH(OH)〕o−CH2
OH又は−(CH2)o−CH3、nは0〜4の整数、
R2はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 本発明の定量法における被検液としては、上記
反応式中に示されたアマドリ化合物を含有する液
であればいかなるものでもよく、例えば醤油や蜂
蜜のようて高密度のアミノ酸又は糖を含有するも
のが好適に用いられる。また生体試料などに由来
する蛋白やポリペプチド鎖中に存在するものにつ
いては、温和な条件で遊離させる手段に解決すべ
き問題はあるが、定量の果たす効果が更に大き
い。 本発明の定量に用いられるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼとしては、如何なる起源のもので
も使用できるが、例えば微生物、殊にコリネバク
テリウム属に属する細菌から選ばれた菌を培養し
て得られるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを
用いることが好ましい。コリネバクテリウム属に
属する上記酵素生産菌としては、例えばコリネバ
クテリウム・sp・No.2−3−1〔微工研菌寄第
8245号(FERM p−8245)〕等があげられる。
コリネバクテリウム・sp・No.2−3−1は本発明
者らが土壌中より分離した新菌株であり、その菌
学的性質は下記のとおりである。 (a) 形態:顕微鏡的観察(肉汁寒天培地30℃、1
〜3日間の観察) (1) 細菌の大きさ:0.3×0.9〜0.3×1.0ミクロ
ンの桿菌 (2) 細胞の多形性:わずかにわん曲した形態を
持つ、菌糸状の生育、分枝は認められない。 (3) 運動性:認められない。 (4) 胞子の有無:認められない。 (5) グラム染色性:陽性 (6) 抗酸性:陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養:30℃、48時間の培養で
直径1.5ミリメートルの円型で表面平滑で光
沢のあるコロニーを作り、半透明で淡黄色を
帯びる。培養時間の経過とともに不透明にな
つていく、拡散性の色素は作らない。 (2) 肉汁寒天斜面培養:生育は良好で(1)に同
じ。 (3) 肉汁液体培地:静置培養では、生育悪くわ
ずかな混濁と菌の沈澱を認めるだけであるが
振盪すると均一に良く生育する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養:25℃、3日程では
菌の生育はわずかに認められるが、溶解は認
められない。6日目程度になると菌の周囲だ
けわずかに液化する。 (5) リトマスミルク:紫色になり長時間の培養
を行うと凝固せずペプトン化する。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元:陰性 (2) 脱窒反応:陰性 (3) MRテスト:陰性 (4) VPテスト:陰性 (5) インドールの生成:陰性 (6) 硫化水素の生成:弱い陽性 (7) 殿粉の加水分解:陰性 (8) クエン酸の利用:コーザー及びクリステン
センの両方で陽性 (9) 無機窒素源:NH4 +及びNO3 -の両方とも
利用する。 (10) 色素の生成:淡黄色色素を作る。 (11) ウレアーゼ:陽性 (12) オキシダーゼ:陰性 (13) カタラーゼ:陽性 (14) 生育の範囲温度:10〜39℃ PH:4.2〜10.0 (15) 酸素に対する態度:好気的 (16) O−Fテスト:極めて弱い酸化的 (17) 糖から酸及びガスの生成
による新規なアマドリ化合物の定量法及びそれに
用いられる定量用試薬に関する。 食品や生体内では還元性の糖、特にアルドース
と呼ばれるアルデヒド基を有する糖と蛋白質、ペ
プチド、アミノ酸等のようにアミノ基を有する物
質が共存する場合、両者が不可逆的に結合してケ
トアミン化合物が生成してくる。この化合物はア
ルデヒド基とアミノ基の結合物がアマドリ転移を
起こした結果生成されることからアマドリ化合物
と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンか
らは次式Aのフルクトシルアラニンが生成する。
またグリセルアルデヒドとグリシンからは次式B
のハイドロキシアセトニルグリシンが生成する。 このようにアルドースとα−アミノ酸が結合し
てアマドリ転移を起こした化合物は、その分子内
に共通にイミノ2酢酸の基本骨格を含有してお
り、一般的に構造は次式で表わされる。 式中Xは基−〔CH(OH)〕o−CH2OH、nは0
〜4の整数、Yはα−アミノ酸の側鎖残基を示
す。一方アマドリ化合物はアルデヒド基を有する
物質とアミノ基を有する物質が接触した瞬間から
化学的にかつ不可逆的に生成蓄積されてくる。そ
の生成速度は原料物質の濃度、接触時間、温度な
どの関数で表わされる。それ故、その蓄積量を測
定することによつて、過去の糖及びアミノ化合物
の濃度、接触時間、保持温度などを推定すること
ができるが、その定量は比較的困難であり、処理
中の分解に起因する精度の低下を免れなかつた。 従来の定量法としては例えば下記の方法が知ら
れている。アミノ酸分析計を用いる方法(ジヤー
ナル・アグリカルチユアル・フード・ケミストリ
ー、24巻1号(1976)70頁参照)、アルドリ化合
物を水素化ホウ素ナトリウムで還元したのち塩酸
分解してカラムクロマトグラフイーで分離する方
法(アチーブス・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフイジツクス(1977)181、542〜
549頁参照)、アマドリ化合物を弱酸と加熱して生
成する5−ハイドロキシメチル−2−フルフラル
デヒドをチオバルビツール酸によつて比色定量す
る方法(FEBSレター(1976)71、356〜360頁参
照)など。しかしこれらの方法は操作の容易性及
び精度の点で満足できるものでなかつた。 そこで当業界では、食品や生体中に含まれるア
マドリ化合物を簡易に精度良く測定する方法の開
発が特に要望されている。このような実情に鑑
み、本発明者らは、迅速かつ正確なアマドリ化合
物の定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成した。 本発明はアマドリ化合物含有液に、酸素の存在
下でフルクトシルアアミノ酸オキシダーゼを作用
させ、酸化反応により消費される酸素量を測定す
るか、あるいは該反応により生成する過酸化水素
を測定することを特徴とする、アマドリ化合物の
定量法である。 本発明は更に、フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼを含有することを特徴とする、アマドリ化合
物の定量用試薬である。 本発明の定量法は下記の反応を基礎としてい
る。 この式中、R1は基−OH、−〔CH(OH)〕o−CH2
OH又は−(CH2)o−CH3、nは0〜4の整数、
R2はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 本発明の定量法における被検液としては、上記
反応式中に示されたアマドリ化合物を含有する液
であればいかなるものでもよく、例えば醤油や蜂
蜜のようて高密度のアミノ酸又は糖を含有するも
のが好適に用いられる。また生体試料などに由来
する蛋白やポリペプチド鎖中に存在するものにつ
いては、温和な条件で遊離させる手段に解決すべ
き問題はあるが、定量の果たす効果が更に大き
い。 本発明の定量に用いられるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼとしては、如何なる起源のもので
も使用できるが、例えば微生物、殊にコリネバク
テリウム属に属する細菌から選ばれた菌を培養し
て得られるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを
用いることが好ましい。コリネバクテリウム属に
属する上記酵素生産菌としては、例えばコリネバ
クテリウム・sp・No.2−3−1〔微工研菌寄第
8245号(FERM p−8245)〕等があげられる。
コリネバクテリウム・sp・No.2−3−1は本発明
者らが土壌中より分離した新菌株であり、その菌
学的性質は下記のとおりである。 (a) 形態:顕微鏡的観察(肉汁寒天培地30℃、1
〜3日間の観察) (1) 細菌の大きさ:0.3×0.9〜0.3×1.0ミクロ
ンの桿菌 (2) 細胞の多形性:わずかにわん曲した形態を
持つ、菌糸状の生育、分枝は認められない。 (3) 運動性:認められない。 (4) 胞子の有無:認められない。 (5) グラム染色性:陽性 (6) 抗酸性:陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養:30℃、48時間の培養で
直径1.5ミリメートルの円型で表面平滑で光
沢のあるコロニーを作り、半透明で淡黄色を
帯びる。培養時間の経過とともに不透明にな
つていく、拡散性の色素は作らない。 (2) 肉汁寒天斜面培養:生育は良好で(1)に同
じ。 (3) 肉汁液体培地:静置培養では、生育悪くわ
ずかな混濁と菌の沈澱を認めるだけであるが
振盪すると均一に良く生育する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養:25℃、3日程では
菌の生育はわずかに認められるが、溶解は認
められない。6日目程度になると菌の周囲だ
けわずかに液化する。 (5) リトマスミルク:紫色になり長時間の培養
を行うと凝固せずペプトン化する。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元:陰性 (2) 脱窒反応:陰性 (3) MRテスト:陰性 (4) VPテスト:陰性 (5) インドールの生成:陰性 (6) 硫化水素の生成:弱い陽性 (7) 殿粉の加水分解:陰性 (8) クエン酸の利用:コーザー及びクリステン
センの両方で陽性 (9) 無機窒素源:NH4 +及びNO3 -の両方とも
利用する。 (10) 色素の生成:淡黄色色素を作る。 (11) ウレアーゼ:陽性 (12) オキシダーゼ:陰性 (13) カタラーゼ:陽性 (14) 生育の範囲温度:10〜39℃ PH:4.2〜10.0 (15) 酸素に対する態度:好気的 (16) O−Fテスト:極めて弱い酸化的 (17) 糖から酸及びガスの生成
【表】
その他セルロースの分解能は認められない。
前記の菌学的性質を有するコリネバクテリウ
ム・エスピーNo.2−3−1の分類学上の位置につ
いて、「バージエイズ・マニユアル・オブ・デタ
ミネイテイブ・バクテリオロジイ」第8版(1974
年)の分類と対比検討した結果、本菌株はグラム
陽性の好気的無胞子桿菌であり、カタラーゼ陽
性、運動性がない、ゼラチン、カゼインをわずか
ながら分解する、糖から酸の生成を行わない、生
活環にともなつて極端な細胞の多形性を示されな
い、セルロースを分解したことからコリネバクテ
リウム属に属するものと判定される。さらに本菌
株の分離源が動物質に由来しないこと、ゼチラン
を溶解すること、ウレアーゼを生産すること、37
℃で生育することから、コリネバクテリウム・フ
アシアンス(Corynebacterium fascians)に近
縁な菌株と認められるが、本菌株が土壌から分離
したものであり、植物病源菌でなく、グロスフア
クターを必要とせず、通常培地で良く生育する点
で異なつており、コリネバクテリウム属に属する
新菌種の菌と判定され、本菌株をコリネバクテリ
ウム・エスピーNo.2−3−1と命名した。なお、
コリネバクテリウム・エスピーNo.2−3−1は、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研菌寄第8245号(FERM P−8245)として
寄託されている。 上記菌株を培養する培地としては、炭素源、窒
素源、無機塩、その他栄養素を適宜含有していれ
ば合成培地、天然培地いずれでも使用可能であ
る。炭素源としては、例えばグルコース、フルク
トース、キシロース、グリセリン等を用いること
ができる。窒素源としては、ペプトン、カゼイン
消化物、大豆粉等の蛋白質又はその消化物、ある
いは酵母エキス等の窒素性有機物が好適に利用で
きる。無機物としては、ナトリウム、カリウム、
タルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバ
ルト等の塩類が使用できる。本発明においては、
フルクトシルアミノ酸を含有する培地で培養した
ときには、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが
最も収量よく得られる。該培地の好適な例として
は、例えばグルコース0.3%、フルクトシルグリ
シン0.5%、酵母エキス0.2%、ポリペプトン0.2
%、燐酸水素1カリウム0.2%、硫酸マグネシウ
ム0.05%、塩化カルシウム0.01%、硫酸第1鉄
0.01%(PH6.5)の培地が挙げられる。培養は通
常25〜37℃の範囲で、好適には30℃付近で行われ
る。培養開始のPHは6〜8の範囲であるが、好適
には6.5付近である。このような条件下で16〜24
時間振盪又は深部攪拌培養すれば、培養物中にフ
ルクトルシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生
産され、蓄積する。 本酵素は、培養時間を長くすると菌が溶解して
菌体外にも存在するようになるが、通常は菌体中
に存在するので、培養物を遠心分離又は過して
菌体を集め、適量の緩衝液に懸濁して菌体を破壊
することによつて酵素を可溶化することが必要で
ある。こうして得られた酵素含有液から、核酸、
細胞壁断片等を取り除くことによつてフルクトシ
ルアミノ酸オキジダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に
従つて、例えば(1)DEAE−セルロースカラムクロ
マトグラフイー、(2)硫安分画、(3)フエニルセフア
ロースカラムクロマトグラフイー、(4)セフアデツ
クスG−200カラムクロマトグラフイー等の方法、
又はその他の方法を必要に応じて組み合わせて用
いることにより精製酵素を得ることができる。本
酵素の精製の具体例を示すと下記のとおりであ
る。 培養物中から菌体を集めたのち、0.02Mリン酸
緩衝液PH7.5に懸濁し、10%量のグリセリンと1
%量のトリトンX−100を加え溶解したのち、ダ
イノミル(シンマルエンタープライブ社(スウエ
ーデン)製)を使用して菌体を破砕する。遠心分
離して上清を集め、DEAE−セルロースカラム
(0.02Mリン酸緩衝液PH7.5に平衡化してある)に
かけて酵素を吸着させる。食塩0.25Mを含んだ
0.02Mリン酸緩衝液PH7.5で洗浄したのち、0.5M
食塩濃度にして酵素を溶出させる。活性画分を集
め、16%になるように硫安粉末を加える。これを
16%硫安を含有した0.1Mリン酸緩衝液PH7.5に平
衡化したフエニルセフアロースカラムに通過させ
て酵素を吸着させる。この酵素を硫安濃度で16%
→0%の逆濃度勾配とエチレングリコール濃度で
0→25%の濃度勾配をあわせ持つた0.1Mリン酸
緩衝液で溶出し、その活性部について、0.1M食
塩を含有したリン酸緩衝液PH7.5で平衡化したセ
フアデツクスG−200のカラムクロマトグラフイ
ーを行い精製酵素を得ることができる。 上記の精製手段により得られた酵素の理化学的
性質は下記のとおりである。 (1) 作用及び基質特異性: 酸素の存在下で、イミノ3酢酸又はその誘導体
を酸化して、グリオキシル酸又はα−ケトアルデ
ヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する下
記の酵素反応を触媒する酵素である。 この式中、R1は基−OH、−〔CH(OH)〕o−CH2
OH又は−(CH2)o−CH3、nは0〜4の整数、
R2はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−アラニ
ン等、イミノ酸例えばプロリン等、メチルアミ
ン、エタノールアミン等のアマドリ化合物に対し
ては作用しない。またケトンを還元したもの例え
ばグルシトリルグリシン等にも作用しない。 (2) 至適PH: 本酵素の至適PHは、フルクトシルグリシンを基
質とした場合、第1図に示すごとくPH8.0〜8.5で
ある。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニタ
ーで計測することにより行つた。なお図中の使用
緩衝液は下記のとおりである。 ○−○:0.1Mリン酸カリウム緩衝液 ×−×:0.1Mベロナール−塩酸緩衝液 △−△:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (3) PH安定性: 本酵素0.1単位を含有する各種緩衝液0.2mlを40
℃、10分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。
その結果は第4図に示すとおりである。なお図中
の使用緩衝液は下記のとおりである。 ○−○:0.1Mリン酸カリウム緩衝液 △−△:0.1Mリン酸ナトリウム−0.1M炭酸ナ
トリウム緩衝液 ×−×:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (4) 力価の測定法: 第1法:生成される過酸化水素を発色定量する方
法 0.05%4−アミノアンチピリン及び0.015%2,
4−ジクロロフエノールサルホネートを含有する
0.1Mリン酸緩衝液(PH8.0)2.8mlを試験管にと
り、400U/mlのパーオキシダーゼ溶液10μを加
える。温度平衡を37℃に達せしめたのち、適当な
活性を有する酵素溶液0.1mlを加え、さらに0.5M
フルクトシルグリシン−0.1mlを加えて10分間反
応させ、生じた色素を光電比色計を用いて510nm
における吸光度を測定する。別にあらかじめ過酸
化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との
関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用
いて、37℃、1分間当りに生成される過酸化水素
のマイクロモルを計算し、この数字を使用酵素液
中の活性単位とする。 第2法:酵素反応にともなつて吸収される酸素量
を測定する方法 0.1Mリン酸緩衝液(PH8.0)2.9mlをYSI社製オ
キシゲンモニターの測定容器にとり、0.5Mフル
クトシルグリシン0.1mlを加え、37℃で10分間攪
拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる。これ
に酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液
50μを注入し、生じる酸素吸収をモニターに接
続した記録計で連続的に計測し、その最初の速度
を測定する。あらかじめ同様にして容器内の酸素
濃度と記録値の間で標準曲線を作成し、これを用
いて測定値から酸素濃度を求める。37℃、1分間
当り1マイクロモルの酸素吸収を起こす酵素の活
性を1単位とする。 (5) 作用適温の範囲: フルクトシルグリシンを基質にして、0.1Mリ
ン酸緩衝液(PH8.0)中で、酵素反応により生成
するグリシンを液体クロマトグラフイで分離定量
する方法によつて測定した。その結果は第2図に
示すとおりで、本酵素の作用適温の範囲は35〜45
℃である。 (6) 熱安定性: 精製酵素0.1単位を含有する酵素液0.5ml(0.1M
リン酸緩衝液、PH8.0)を各温度で10分間放置し
たのち、残存した酵素活性を調べた。その結果は
第3図に示すとおりで、35℃以下では安定である
が、45℃で90%が失活する。 (7) 阻害活性化及び安定化: 0.1Mトリス−塩酸緩衝液(PH8.0)中で、酸素
吸収を測定することによつて調べた。濃度2mM
の各物質の本酵素に対する影響は、下記のとおり
である。Hg++、Pb++、SDSは強く阻害し、
Ni++、Zn++は中程度に阻害する。各種キレータ
ー及びSH試薬は微弱な阻害しか与えなかつた。
また本酵素に対する活性化剤及び安定化剤につい
ては未知である。 (8) 精製方法: 本酵素は前記の精製方法によつて精製すること
ができる。 (9) 分子量: 本酵素の分子量は、セフアデツクスG−200を
用いたカラムゲル過法で測定した結果、0.1M
食塩含有0.05Mリン酸緩衝液中では65000であつ
た。 (10) 等電点: デイスク焦点電気泳動法により測定した結果、
PI=4.6であつた。 (11) デイスク電気泳動: デービスのPH9.4のゲルを用いて3mA/ゲルで
5℃、80分泳動を行い、酵素蛋白をクマジ−ブリ
リアントブルーG−250で染色した。その結果、
ゲルのアクリルアミド濃度7.5%の時は陽極側に
4.1cm(ブロムフエノールブルーは4.5cm)、15%
の時には同じく陽極側に1.7cmの所に酵素活性を
持つ単一なバンドを認めた。 以上のように本酵素は、その作用及び基質特異
性において従来全く知られていない新規な酵素で
ある。 上記のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをア
マドリ化合物の含有液に作用させる場合には、PH
6.5〜10及び温度50℃以下、好ましくはPH7.5〜9
及び温度37〜45℃の条件で、通常は10〜20分間程
度反応させる。PHの調整には、前記反応のPH範囲
を維持することができ、かつ酵素反応を阻害しな
い任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウ
ム緩衝液、ベロナール緩衝液、リン酸カリウム−
炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソーダ緩衝
液等が好ましい。フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼの使用量は、通常は0.5単位/ml以上である。 本発明においては、下記の何れかの測定法によ
りアマドリ化合物を定量する。 (1) 酵素反応により生成する過酸化水素の測定
法: 反応により生成する過酸化水素を、過酸化水素
定量の常法に従つて、例えば発色方法、過酸化水
素電極を用いる方法等により定量し、あらかじめ
別に用意した過酸化水素量とアマドリ化合物量と
の標準曲線よりアマドリ化合物を定量する。なお
発色法により過酸化水素を測定する場合には、例
えば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と
同様に操作する。 (2) 酸素消費に基づく定量法: この定量法は、反応開始時の酸素量より反応終
了時の酸素量を差引いた値(酸素消費量)を、測
定し、あらかじめ別に用意した酸素消費量とアマ
ドリ化合物量との標準曲線よりアマドリ化合物含
有量を定量するもので、酸素量の測定は常法に従
つて、例えばワールブルグ検圧法、酸素電極法等
により行われる。なお酸素電極法により酸素消費
量を測定する場合には、例えば前記の「力価の測
定法」に記載した測定法と同様に操作する。 本発明のアマドリ化合物定量用試薬は、フルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ及び酵素作用を行わ
しめるに好適なPH範囲、一般にPH6.5〜10好まし
くはPH7.5〜9を与える緩衝剤、更に反応生成物
を測定する場合には、必要により発色剤等を適宜
組合せて成る。 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、
液状、粉末状の何れでもよく、1検体当りの酵素
量は通常は0.5単位/ml以上である。緩衝剤とし
ては、例えばリン酸カリウム緩衝液、ベロナール
緩衝液、リン酸カリウム−炭酸ソーダ緩衝液、ク
エン酸−リン酸ソーダ緩衝液等が好ましい。反応
生成物を測定する際の発色剤としては、該生成物
として反応して発色する物質が用いられ、過酸化
水素の発色剤としては、パーオキシダーゼと例え
ば4−アミノアンチピリン/N,N′−ジエチル
アミン、4−アミノアンチピリン/フエノール、
4−アミノアンチピリン/N,N′−ジメチルア
ニリン、ABTS、MBTH/N,N′−ジメチルア
ニリン、4−アミノアンチピリン/2,4−ジク
ロロフエノールサルホネート等の組合せがあげら
れる。本発明のアマドリ化合物定量用試薬は冷暗
所、特に5℃以下に保存することが好ましい。 本発明によれば、従来困難であつたアマドリ化
合物の測定が容易になり醤油等の食品や輸液等の
製造時及び保存中の状態を反映するアマドリ化合
物を効率良く測定することができる。また、尿や
血液及び生体に由来する蛋白質やポリペプチド鎖
に結合したものも、適当なペプチダーゼを作用さ
せ、遊離状態にしたのちには同様に測定すること
ができ、特に糖尿病の病態測定に利用できる。 実施例 1 4−アミノアンチピリン 0.5% 0.3ml 2.4−ジクロロフエノールサルホネート 0.15
% 0.3ml リン酸緩衝液 0.2M、PH8.0 1.5ml パーオキシダーゼ 400単位/ml 10μ フルクトシルバリン1.5mM 0〜100μ 蒸留水を加えて全量を2.95mlに調整した。 上記反応液の入つた試験管にフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ(198単位/ml含有)50μづ
つを加えて、37℃にて10分間反応させたのち、発
色した色素を510nmで比色定量とした。その結
果、加えたフルクトシルバリンと吸光度の間に比
例関係が認められた。 実施例 2 オキシゲンモニター(米国YSI社製)の酸素測
定容器に0.2Mリン酸カリウム緩衝液(PH7.2)を
1.5mlとり、カタラーゼ(50000単位/ml)10μ、
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(198単位/
ml含有)50μ及び蒸留水1.25mlを加えて37℃で
10分間攪拌を続けて平衡に達せしめた。酸素電極
をさしこんで密閉したのち、醤油溶液(PH7.0に
調整後、水で2倍に希釈したもの)20μを加え
て反応させた。反応経過はモニターに接続した記
録計ですべて記録し、20分後に反応結果を測定し
たところ、反応前から11.8目盛の酸素濃度の変化
が読みとれた。同様にしてフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼの代りに水を用いて操作した場合に
は、1.2目盛の変化が読みとれた。その差は10.6
目盛であつた。醤油溶液の代りにフルクトシルグ
リシンの標準液を用いて同様に操作して得た検量
線から、この値は0.26μモルと算出された。 実施例 3 4−アミノアンチピリン6mg、0.2Mリン酸カ
リウム水溶液32ml及び02M炭酸ナトリウム水溶液
28mlを混合して分析用キツトAとした。また添付
液として0.1%2,4−ジクロロフエノールサル
ホネート水溶液B18ml並びにフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ300単位及びパーオキシダーゼ132
単位を含有する60%グリセリン液C5mlを調製し
た。使用に際しては3者を混合して蒸留水を加え
全量100mlとした。試料溶液0.5mlに対し試薬溶液
2.5mlを使用する。
ム・エスピーNo.2−3−1の分類学上の位置につ
いて、「バージエイズ・マニユアル・オブ・デタ
ミネイテイブ・バクテリオロジイ」第8版(1974
年)の分類と対比検討した結果、本菌株はグラム
陽性の好気的無胞子桿菌であり、カタラーゼ陽
性、運動性がない、ゼラチン、カゼインをわずか
ながら分解する、糖から酸の生成を行わない、生
活環にともなつて極端な細胞の多形性を示されな
い、セルロースを分解したことからコリネバクテ
リウム属に属するものと判定される。さらに本菌
株の分離源が動物質に由来しないこと、ゼチラン
を溶解すること、ウレアーゼを生産すること、37
℃で生育することから、コリネバクテリウム・フ
アシアンス(Corynebacterium fascians)に近
縁な菌株と認められるが、本菌株が土壌から分離
したものであり、植物病源菌でなく、グロスフア
クターを必要とせず、通常培地で良く生育する点
で異なつており、コリネバクテリウム属に属する
新菌種の菌と判定され、本菌株をコリネバクテリ
ウム・エスピーNo.2−3−1と命名した。なお、
コリネバクテリウム・エスピーNo.2−3−1は、
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研菌寄第8245号(FERM P−8245)として
寄託されている。 上記菌株を培養する培地としては、炭素源、窒
素源、無機塩、その他栄養素を適宜含有していれ
ば合成培地、天然培地いずれでも使用可能であ
る。炭素源としては、例えばグルコース、フルク
トース、キシロース、グリセリン等を用いること
ができる。窒素源としては、ペプトン、カゼイン
消化物、大豆粉等の蛋白質又はその消化物、ある
いは酵母エキス等の窒素性有機物が好適に利用で
きる。無機物としては、ナトリウム、カリウム、
タルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバ
ルト等の塩類が使用できる。本発明においては、
フルクトシルアミノ酸を含有する培地で培養した
ときには、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが
最も収量よく得られる。該培地の好適な例として
は、例えばグルコース0.3%、フルクトシルグリ
シン0.5%、酵母エキス0.2%、ポリペプトン0.2
%、燐酸水素1カリウム0.2%、硫酸マグネシウ
ム0.05%、塩化カルシウム0.01%、硫酸第1鉄
0.01%(PH6.5)の培地が挙げられる。培養は通
常25〜37℃の範囲で、好適には30℃付近で行われ
る。培養開始のPHは6〜8の範囲であるが、好適
には6.5付近である。このような条件下で16〜24
時間振盪又は深部攪拌培養すれば、培養物中にフ
ルクトルシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生
産され、蓄積する。 本酵素は、培養時間を長くすると菌が溶解して
菌体外にも存在するようになるが、通常は菌体中
に存在するので、培養物を遠心分離又は過して
菌体を集め、適量の緩衝液に懸濁して菌体を破壊
することによつて酵素を可溶化することが必要で
ある。こうして得られた酵素含有液から、核酸、
細胞壁断片等を取り除くことによつてフルクトシ
ルアミノ酸オキジダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に
従つて、例えば(1)DEAE−セルロースカラムクロ
マトグラフイー、(2)硫安分画、(3)フエニルセフア
ロースカラムクロマトグラフイー、(4)セフアデツ
クスG−200カラムクロマトグラフイー等の方法、
又はその他の方法を必要に応じて組み合わせて用
いることにより精製酵素を得ることができる。本
酵素の精製の具体例を示すと下記のとおりであ
る。 培養物中から菌体を集めたのち、0.02Mリン酸
緩衝液PH7.5に懸濁し、10%量のグリセリンと1
%量のトリトンX−100を加え溶解したのち、ダ
イノミル(シンマルエンタープライブ社(スウエ
ーデン)製)を使用して菌体を破砕する。遠心分
離して上清を集め、DEAE−セルロースカラム
(0.02Mリン酸緩衝液PH7.5に平衡化してある)に
かけて酵素を吸着させる。食塩0.25Mを含んだ
0.02Mリン酸緩衝液PH7.5で洗浄したのち、0.5M
食塩濃度にして酵素を溶出させる。活性画分を集
め、16%になるように硫安粉末を加える。これを
16%硫安を含有した0.1Mリン酸緩衝液PH7.5に平
衡化したフエニルセフアロースカラムに通過させ
て酵素を吸着させる。この酵素を硫安濃度で16%
→0%の逆濃度勾配とエチレングリコール濃度で
0→25%の濃度勾配をあわせ持つた0.1Mリン酸
緩衝液で溶出し、その活性部について、0.1M食
塩を含有したリン酸緩衝液PH7.5で平衡化したセ
フアデツクスG−200のカラムクロマトグラフイ
ーを行い精製酵素を得ることができる。 上記の精製手段により得られた酵素の理化学的
性質は下記のとおりである。 (1) 作用及び基質特異性: 酸素の存在下で、イミノ3酢酸又はその誘導体
を酸化して、グリオキシル酸又はα−ケトアルデ
ヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する下
記の酵素反応を触媒する酵素である。 この式中、R1は基−OH、−〔CH(OH)〕o−CH2
OH又は−(CH2)o−CH3、nは0〜4の整数、
R2はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。 なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−アラニ
ン等、イミノ酸例えばプロリン等、メチルアミ
ン、エタノールアミン等のアマドリ化合物に対し
ては作用しない。またケトンを還元したもの例え
ばグルシトリルグリシン等にも作用しない。 (2) 至適PH: 本酵素の至適PHは、フルクトシルグリシンを基
質とした場合、第1図に示すごとくPH8.0〜8.5で
ある。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニタ
ーで計測することにより行つた。なお図中の使用
緩衝液は下記のとおりである。 ○−○:0.1Mリン酸カリウム緩衝液 ×−×:0.1Mベロナール−塩酸緩衝液 △−△:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (3) PH安定性: 本酵素0.1単位を含有する各種緩衝液0.2mlを40
℃、10分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。
その結果は第4図に示すとおりである。なお図中
の使用緩衝液は下記のとおりである。 ○−○:0.1Mリン酸カリウム緩衝液 △−△:0.1Mリン酸ナトリウム−0.1M炭酸ナ
トリウム緩衝液 ×−×:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液 (4) 力価の測定法: 第1法:生成される過酸化水素を発色定量する方
法 0.05%4−アミノアンチピリン及び0.015%2,
4−ジクロロフエノールサルホネートを含有する
0.1Mリン酸緩衝液(PH8.0)2.8mlを試験管にと
り、400U/mlのパーオキシダーゼ溶液10μを加
える。温度平衡を37℃に達せしめたのち、適当な
活性を有する酵素溶液0.1mlを加え、さらに0.5M
フルクトシルグリシン−0.1mlを加えて10分間反
応させ、生じた色素を光電比色計を用いて510nm
における吸光度を測定する。別にあらかじめ過酸
化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との
関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用
いて、37℃、1分間当りに生成される過酸化水素
のマイクロモルを計算し、この数字を使用酵素液
中の活性単位とする。 第2法:酵素反応にともなつて吸収される酸素量
を測定する方法 0.1Mリン酸緩衝液(PH8.0)2.9mlをYSI社製オ
キシゲンモニターの測定容器にとり、0.5Mフル
クトシルグリシン0.1mlを加え、37℃で10分間攪
拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる。これ
に酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液
50μを注入し、生じる酸素吸収をモニターに接
続した記録計で連続的に計測し、その最初の速度
を測定する。あらかじめ同様にして容器内の酸素
濃度と記録値の間で標準曲線を作成し、これを用
いて測定値から酸素濃度を求める。37℃、1分間
当り1マイクロモルの酸素吸収を起こす酵素の活
性を1単位とする。 (5) 作用適温の範囲: フルクトシルグリシンを基質にして、0.1Mリ
ン酸緩衝液(PH8.0)中で、酵素反応により生成
するグリシンを液体クロマトグラフイで分離定量
する方法によつて測定した。その結果は第2図に
示すとおりで、本酵素の作用適温の範囲は35〜45
℃である。 (6) 熱安定性: 精製酵素0.1単位を含有する酵素液0.5ml(0.1M
リン酸緩衝液、PH8.0)を各温度で10分間放置し
たのち、残存した酵素活性を調べた。その結果は
第3図に示すとおりで、35℃以下では安定である
が、45℃で90%が失活する。 (7) 阻害活性化及び安定化: 0.1Mトリス−塩酸緩衝液(PH8.0)中で、酸素
吸収を測定することによつて調べた。濃度2mM
の各物質の本酵素に対する影響は、下記のとおり
である。Hg++、Pb++、SDSは強く阻害し、
Ni++、Zn++は中程度に阻害する。各種キレータ
ー及びSH試薬は微弱な阻害しか与えなかつた。
また本酵素に対する活性化剤及び安定化剤につい
ては未知である。 (8) 精製方法: 本酵素は前記の精製方法によつて精製すること
ができる。 (9) 分子量: 本酵素の分子量は、セフアデツクスG−200を
用いたカラムゲル過法で測定した結果、0.1M
食塩含有0.05Mリン酸緩衝液中では65000であつ
た。 (10) 等電点: デイスク焦点電気泳動法により測定した結果、
PI=4.6であつた。 (11) デイスク電気泳動: デービスのPH9.4のゲルを用いて3mA/ゲルで
5℃、80分泳動を行い、酵素蛋白をクマジ−ブリ
リアントブルーG−250で染色した。その結果、
ゲルのアクリルアミド濃度7.5%の時は陽極側に
4.1cm(ブロムフエノールブルーは4.5cm)、15%
の時には同じく陽極側に1.7cmの所に酵素活性を
持つ単一なバンドを認めた。 以上のように本酵素は、その作用及び基質特異
性において従来全く知られていない新規な酵素で
ある。 上記のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをア
マドリ化合物の含有液に作用させる場合には、PH
6.5〜10及び温度50℃以下、好ましくはPH7.5〜9
及び温度37〜45℃の条件で、通常は10〜20分間程
度反応させる。PHの調整には、前記反応のPH範囲
を維持することができ、かつ酵素反応を阻害しな
い任意の緩衝液が用いられ、例えばリン酸カリウ
ム緩衝液、ベロナール緩衝液、リン酸カリウム−
炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソーダ緩衝
液等が好ましい。フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼの使用量は、通常は0.5単位/ml以上である。 本発明においては、下記の何れかの測定法によ
りアマドリ化合物を定量する。 (1) 酵素反応により生成する過酸化水素の測定
法: 反応により生成する過酸化水素を、過酸化水素
定量の常法に従つて、例えば発色方法、過酸化水
素電極を用いる方法等により定量し、あらかじめ
別に用意した過酸化水素量とアマドリ化合物量と
の標準曲線よりアマドリ化合物を定量する。なお
発色法により過酸化水素を測定する場合には、例
えば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と
同様に操作する。 (2) 酸素消費に基づく定量法: この定量法は、反応開始時の酸素量より反応終
了時の酸素量を差引いた値(酸素消費量)を、測
定し、あらかじめ別に用意した酸素消費量とアマ
ドリ化合物量との標準曲線よりアマドリ化合物含
有量を定量するもので、酸素量の測定は常法に従
つて、例えばワールブルグ検圧法、酸素電極法等
により行われる。なお酸素電極法により酸素消費
量を測定する場合には、例えば前記の「力価の測
定法」に記載した測定法と同様に操作する。 本発明のアマドリ化合物定量用試薬は、フルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ及び酵素作用を行わ
しめるに好適なPH範囲、一般にPH6.5〜10好まし
くはPH7.5〜9を与える緩衝剤、更に反応生成物
を測定する場合には、必要により発色剤等を適宜
組合せて成る。 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、
液状、粉末状の何れでもよく、1検体当りの酵素
量は通常は0.5単位/ml以上である。緩衝剤とし
ては、例えばリン酸カリウム緩衝液、ベロナール
緩衝液、リン酸カリウム−炭酸ソーダ緩衝液、ク
エン酸−リン酸ソーダ緩衝液等が好ましい。反応
生成物を測定する際の発色剤としては、該生成物
として反応して発色する物質が用いられ、過酸化
水素の発色剤としては、パーオキシダーゼと例え
ば4−アミノアンチピリン/N,N′−ジエチル
アミン、4−アミノアンチピリン/フエノール、
4−アミノアンチピリン/N,N′−ジメチルア
ニリン、ABTS、MBTH/N,N′−ジメチルア
ニリン、4−アミノアンチピリン/2,4−ジク
ロロフエノールサルホネート等の組合せがあげら
れる。本発明のアマドリ化合物定量用試薬は冷暗
所、特に5℃以下に保存することが好ましい。 本発明によれば、従来困難であつたアマドリ化
合物の測定が容易になり醤油等の食品や輸液等の
製造時及び保存中の状態を反映するアマドリ化合
物を効率良く測定することができる。また、尿や
血液及び生体に由来する蛋白質やポリペプチド鎖
に結合したものも、適当なペプチダーゼを作用さ
せ、遊離状態にしたのちには同様に測定すること
ができ、特に糖尿病の病態測定に利用できる。 実施例 1 4−アミノアンチピリン 0.5% 0.3ml 2.4−ジクロロフエノールサルホネート 0.15
% 0.3ml リン酸緩衝液 0.2M、PH8.0 1.5ml パーオキシダーゼ 400単位/ml 10μ フルクトシルバリン1.5mM 0〜100μ 蒸留水を加えて全量を2.95mlに調整した。 上記反応液の入つた試験管にフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ(198単位/ml含有)50μづ
つを加えて、37℃にて10分間反応させたのち、発
色した色素を510nmで比色定量とした。その結
果、加えたフルクトシルバリンと吸光度の間に比
例関係が認められた。 実施例 2 オキシゲンモニター(米国YSI社製)の酸素測
定容器に0.2Mリン酸カリウム緩衝液(PH7.2)を
1.5mlとり、カタラーゼ(50000単位/ml)10μ、
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(198単位/
ml含有)50μ及び蒸留水1.25mlを加えて37℃で
10分間攪拌を続けて平衡に達せしめた。酸素電極
をさしこんで密閉したのち、醤油溶液(PH7.0に
調整後、水で2倍に希釈したもの)20μを加え
て反応させた。反応経過はモニターに接続した記
録計ですべて記録し、20分後に反応結果を測定し
たところ、反応前から11.8目盛の酸素濃度の変化
が読みとれた。同様にしてフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼの代りに水を用いて操作した場合に
は、1.2目盛の変化が読みとれた。その差は10.6
目盛であつた。醤油溶液の代りにフルクトシルグ
リシンの標準液を用いて同様に操作して得た検量
線から、この値は0.26μモルと算出された。 実施例 3 4−アミノアンチピリン6mg、0.2Mリン酸カ
リウム水溶液32ml及び02M炭酸ナトリウム水溶液
28mlを混合して分析用キツトAとした。また添付
液として0.1%2,4−ジクロロフエノールサル
ホネート水溶液B18ml並びにフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ300単位及びパーオキシダーゼ132
単位を含有する60%グリセリン液C5mlを調製し
た。使用に際しては3者を混合して蒸留水を加え
全量100mlとした。試料溶液0.5mlに対し試薬溶液
2.5mlを使用する。
第1図は本発明に用いられる酵素の一例につい
ての至適PHを示すグラフ、第2図は至適温度を示
すグラフ、第3図は各温度における失活を示すグ
ラフ、第4図は各PHにおける失活を示すグラフで
ある。
ての至適PHを示すグラフ、第2図は至適温度を示
すグラフ、第3図は各温度における失活を示すグ
ラフ、第4図は各PHにおける失活を示すグラフで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 アマドリ化合物含有液に、酸素の存在下にフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、酸
化反応により消費される酸素量を測定するか、あ
るいは該反応により生成する過酸化水素を測定す
ることを特徴とする、アマドリ化合物の定量法。 2 アマドリ化合物が、アルドースとα−アミノ
酸から生成された化合物であることを特徴とす
る、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 3 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有す
ることを特徴とする、アマドリ化合物の定量用試
薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP11978285A JPS61280297A (ja) | 1985-06-04 | 1985-06-04 | アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬 |
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JP11978285A JPS61280297A (ja) | 1985-06-04 | 1985-06-04 | アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬 |
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JPS61280297A JPS61280297A (ja) | 1986-12-10 |
JPH0533997B2 true JPH0533997B2 (ja) | 1993-05-20 |
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