KR101942476B1 - 신규한 염료탈색균주 트라메테스 베지컬러 nibrkdfpfgc000002677 균주 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법 - Google Patents

신규한 염료탈색균주 트라메테스 베지컬러 nibrkdfpfgc000002677 균주 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 염료탈색균주 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 염료를 포함하는 시료에 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83005BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 염료 탈색 균주, 상기 균주의 배양 방법, 상기 균주를 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법 및 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주는 종래의 트라메테스 베지컬러 균주와 구별되는 염료의 탈색활성을 나타내므로, 보다 효과적인 염색폐수의 정화방법에 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 염료탈색균주 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법{Novel dye-decolorizing fungus, Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677, and method for treating dye wastewaters using the same}
본 발명은 신규한 염료탈색균주 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 염료를 포함하는 시료에 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83005BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 염료 탈색 균주, 상기 균주의 배양 방법, 상기 균주를 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법 및 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물에 관한 것이다.
염색폐수의 색도는 심미적으로 불쾌감을 야기할 뿐 아니라 수체의 투명도와 가스 용해도에 영향을 미치고, 발암성 물질 등 유해물질이 포함되어 있어 수생태계와 인간의 건강에 악영향을 미칠 수 있다. 이러한, 염색폐수를 처리하기 위해 응집-부상법, 막여과, 전기분해, 흡착, 펜톤산화, 오존산화, 이온교환, 침전 등 다양한 물리-화학적 방법이 사용되고 있으나, 낮은 경제성, 2차 오염물질 발생, 및 적용 가능한 염색폐수 범위가 제한적인 점 등의 문제가 있다. 예를 들면, 화학응집처리, 활성탄에 의한 흡착 처리 등은 염색폐수 내의 오염물질을 광범위하게 처리할 수 있으나, 많은 슬러지를 발생시켜 2차 처리를 해야 하는 단점이 있다. 또한, 펜톤 산화법(Fenton oxidation)을 사용하는 방법은 미반응 물질이 폐수 내에 존재하는 위험성을 내포하고 있으며, 오존(ozone) 처리법은 오존 발생을 위한 경제적 비용이 많이 들고 위험성이 높다는 문제점이 있다. 따라서, 물리-화학적 방법 이외에 염료를 흡착하거나 생분해할 수 있는 곰팡이를 이용한 생물학적 방법이 개발되고 있다. 이러한 생물학적 방법은 물리-화학적 방법보다는 물사용량이 적고 환경친화적이고 경제적이며, 슬러지 발생이 적고 최종분해산물의 독성이 없다는 장점이 있다.(Rai, H. S. et al., Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 35: 219-238, 2005).
이를 위하여, 생물학적 방법으로 염료를 탈색시킬 수 있는 미생물을 개발하려는 연구가 국내외에서 꾸준하게 진행되어 왔고 이와 관련된 많은 생물자원들이 지속적으로 보고되고 있다. 예를 들어, 영(Young L.) 및 유(Yu J.)는 곰팡이의 일종인 트라메테스 베지컬러 균주(Trametes versicolor ATCC 12679)가 산성 염료인 blue 25, orange 74, black 24 또는 violet 7 또는 반응성 염료인 blue 15 또는 black 5와 같은 다양한 염료에 대한 탈색능을 나타냄을 보고하였다(Young L. and Yu J. 1997. Ligninase-catalysed decolorization of synthethic dyes, Water Research, 31(5), 1187-1193). 그러나, 지금까지 개발된 염료탈색용 미생물은 특정 염료에 대하여만 탈색능을 나타낸다는 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 보다 범용적으로 사용될 수 있는 미생물의 개발이 요구되고 있다. 즉, 염료의 종류와 화학적 구조가 매우 다양하기 때문에 이들 염료들을 모두 분해할 수 있는 미생물을 개발하는 것은 불가능하다고 할 수 있지만, 다양한 염료에 대하여 비교적 폭 넓은 분해활성을 나타낼 수 있는 미생물을 개발하는 것은 가능하다고 예상되고 있으며, 이처럼 개발된 미생물은 다양한 염색폐수의 정화에 범용적으로 사용될 수 있을 것으로 예측되고 있으나, 이같은 미생물은 아직까지는 소수에 불과한 실정이다.
이러한 배경하에서, 염료를 포함하는 염색폐수의 탈색시키기 위한 기술을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 신규한 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주가 다양한 염료(산성, 분산성, 반응성)에 대해 탈색능을 나타내고, 종래의 균주와는 다른 염료특이성을 갖고 우수한 탈색능을 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염료를 포함하는 시료에 기탁번호 KACC83005BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염료 탈색능을 나타내는 상기 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 염료를 포함하는 염색폐수의 탈색시키기 위한 기술을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 새로이 발굴한 트라메테스 베지컬러 균주가 종래의 균주에 비하여 염료에 대한 새로운 탈색활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명자에 의하여 분리동정된 신규한 트라메테스 베지컬러 균주는 18s rDNA 서열의 측면에서 볼 때, 지금까지 보고되지 않았던 새로운 균주이며, 종래의 트라메테스 베지컬러 균주와는 달리, orange 74, violet 7, black 5 등의 염료에 대하여 2.4 내지 6배 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 신규한 트라메테스 베지컬러 균주를 "트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677)"이라 명명하고, 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83005BP를 부여받았다. 상기 균주는 종래의 유사한 균주와 명확히 구별되는 염료 특이적 탈색활성을 나타내므로, 종래의 균주와 조합하여 사용할 경우, 보다 넓은 범위의 염료를 탈색시킬 수 있어, 보다 효과적인 염료탈색에 활용될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 하나의 양태로서, 본 발명은 염료를 포함하는 시료와, 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677) 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "염료"는 현재 염색 염료 공장에서 염료 생산 공정 또는 염색 가공 공정에서 사용되는 염료를 의미하는 것으로, 구체적으로, 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 산성 염료는 red 114, blue 62, orange 7 또는 black 172 일 수 있고, 상기 분산성 염료는 red 1, blue 79, orange 3 또는 black 1 염료일 수 있고, 상기 반응성 염료는 red 120, blue 4, orange 16), black 5, blue 38 또는 violet 5 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 염료탈색능을 분석한 결과, Orange 7을 제외한 산성 염료에 대하여는 대체로 2 내지 4일이 경과된 후, 80% 이상의 탈색능을 나타내고(도 5a 및 5b), Blue 79를 제외한 분산성 염료에 대하여는 대체로 6일이 경과된 후, 20% 이상의 탈색능을 나타내며(도 5c 및 5d), 반응성 염료에 대하여는 대체로 4일이 경과된 후, 60% 이상의 탈색능을 나타냄을 확인하여(도 5e 및 5f), 본 발명에서 제공하는 균주가 우수한 탈색능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
또한, 염료에 의하여 균주의 성장이 저해되는데, 대체로 산성 염료가 포함된 배지에서는 상기 균주의 성장이 약 50% 수준으로 저해되었으나, 분산성 염료와 반응성 염료가 포함된 배지에서는 염료의 종류에 따라 균주의 성장면에서 다양한 차이를 나타내고(표 1 및 도 2a 내지 2c), 배양후 배지의 pH는 전체적으로 감소됨을 확인하였다(도 3a 내지 3c).
본 발명의 용어 "염료를 포함하는 시료"는 상기 염료를 포함하고, 본 발명에서 제공하는 균주에 의해 상기 염료를 탈색시켜야 하는 대상을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 시료는 염료를 포함하는 배지, 염료를 포함하는 염색폐수 등이 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주의 배양 결과 얻어지는 물질로, 배지, 배양되는 균주, 및 배양되는 미생물로부터 분비되는 물질을 모두 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 균체를 배양하기 위해 필요한 영양 공급원, 예를 들어 탄소원, 질소원 등 이외에 무기염 성분, 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 용어 "혼합하는 단계"는 염료를 포함하는 시료에 본 발명에서 제공하는 균주 또는 그의 배양물을 가하여 상기 염료를 탈색시키는 과정을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 20 내지 35 ℃의 온도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 혼합하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 25 내지 30 ℃, 보다 구체적으로 28 ℃의 온도조건일 수 있다. 본 발명자들은 28 ℃의 온도조건에서 혼합할 경우 가장 빠른 탈색속도를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, Blue 62는 28℃에서 가장 빠른 탈색속도(296.4 mg/ℓ/d)를 나타내었고; Black 172 역시 28℃에서 가장 빠른 탈색속도(39.5 mg/ℓ/d)를 나타내었다(도 7a). 특히, 본 발명의 균주는 염료의 종류와 온도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타내었으나, 공통적으로 25 내지 30℃ 조건에서 비교적 높은 수준의 탈색속도를 나타내었으며, 28℃에서 가장 빠른 탈색속도를 나타냄을 알 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 pH 4 내지 6의 산도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 혼합하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 pH 4.5 내지 5.5의 산도조건, 보다 구체적으로 pH 5의 산도조건일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, Blue 62는 pH 5에서 가장 빠른 탈색속도(296.4 mg/ℓ/d)를 나타내었고; Black 172는 pH 7에서 가장 빠른 탈색속도(42.1 mg/ℓ/d)를 나타냄을 확인하였다(도 7b)..
본 발명에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료농도가 700 mg/ℓ 미만이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 상기 혼합하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 혼합하는 단계는 구체적으로, 시료 내 염료농도가 300 내지 700 mg/ℓ, 보다 구체적으로, 시료 내 염료농도가 400 내지 600 mg/ℓ, 가장 구체적으로 시료 내 염료농도가 550 mg/ℓ이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 300 내지 700 mg/ℓ의 시료내 염료농도조건에서 탈색활성을 나타내지만, 염료의 종류 및 농도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타내며, 대체로 시료 내 염료농도가 550 mg/ℓ인 경우에 최적의 탈색속도를 나타냄을 확인하였다(도 7c). 이때, 상기 전처리는 적절한 배지 또는 용매를 이용하여 시료를 희석하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, Blue 62와 Black 172 모두 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 증가하는 경향을 나타내었으나, 고농도의 염료농도에서는 차이를 나타냄을 확인하였다(도 7c). 즉, Black 172는 고농도의 염료농도에서 탈색속도의 증가율이 다소 감소되는 경향이 있으나, 탈색속도 자체는 지속적으로 증가하는 반면, Blue 62는 550 mg/ℓ을 기준으로 하여 그 이상의 염료농도에서는 탈색속도 자체가 감소됨을 확인하였다.
특히, 본 발명에서 제공하는 염료의 탈색방법은 상기 균주를 사용하거나 또는 상기 균주를 배양한 배양물을 사용할 수 있는데, 특히, 상기 균주의 배양물에서 분리된 배양상등액을 사용할 경우에도, 일정 수준의 탈색효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양 상등액 역시 탈색활성을 나타내는데, 상기 균주를 배양하여 수득한 배양물의 배양상등액은 Blue 62, Blue 4, Red 114, Black 172 등의 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타내고(도 10), 대체로 200 mg/ℓ의 염료 농도에서는 염료의 농도가 증가할 수록 비 탈색속도가 증가함(도 11a 내지 11f)을 확인하였다. 이러한 배양상등액의 탈색활성은 상기 균주로부터 발현되어 세포밖으로 분비되는 탈색효소에 의하여 나타나는 것으로 분석되었는데, 실제로 트라메테스 베지컬러 균주에서 발현 및 분비되는 것으로 알려진 탈색효소인 라카아제, 리그닌 페록시다제 및 망간의존성 페록시다제 중에서, 라카아제와 망간의존성 페록시다제의 활성은 본 발명에서 제공하는 균주가 성장함에 따라 이에 비례하여 증가되었고, 배지내 C/N 비율이 증가된 경우에는 리그닌 페록시다제의 활성 역시 증가됨을 확인하였다(도 9a 내지 9c).
다른 양태로서, 본 발명은 염료 탈색능을 나타내는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주를 제공한다.
상기 염료에 대한 정의 및 설명은 상기한 바와 같다.
본 발명의 용어 "트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677) 균주"란, 트라메테스 베지컬러 균주의 일종으로서 서열번호 1의 18s rDNA 서열을 갖고, 염료를 분해할 수 있는 효소인 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase), 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase) 등의 탈색효소를 발현시켜서 세포외로 분비할 수 있으며, 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료에 속하는 적색(Red 114, Red 1 또는 Red 120), 청색(Blue 62, Blue 79 및 Blue 4), 오렌지색(Orange 7, Orange 3 및 Orange 16) 또는 검정색(Black 172, Black 1 및 Black 5) 염료 등의 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타내며, orange 74, violet 7, black 5 등의 염료에 대하여 종래의 트라메테스 베지컬러 균주 보다도 현저하게 우수한 탈색활성을 나타내는 균주를 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 균주의 배양상등액 역시 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타낼 수 있다. 상기 균주는 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83005BP를 부여받았다.
본 발명에 있어서, 상기 균주 또는 그의 배양물은 염료를 탈색시키기 위한 핵심적인 수단으로 사용될 수 있다.
상기 균주는 리그닌 퍼옥시다아제, 망간 퍼옥시다아제 및 리가아제를 포함하는 세포 외 효소 활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주는 다양한 염료에 대하여 탈색활성을 나타내고(도 2), 종래의 트라메테스 베지컬러 균주에 비하여 orange 74, violet 7 및 black 5에 대하여 현저히 우수한 탈색능을 나타내며(표 1), 탈색활성을 나타낸다고 알려진 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase) 및 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase)과 같은 다양한 탈색효소를 발현시킬 수 있음(도 8)을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양방법은 상기 균주를 1 내지 10 g/ℓ의 효모추출물이 포함된 배지에 접종하고, 20 내지 35℃의 온도조건 및 pH 5 내지 7의 산도조건에서 배양하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 효모추출물은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로, 3 내지 10 g/ℓ 인 배지에 접종하여 배양하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 6 내지 10 g/ℓ 배지에 접종하여 배양하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 상기 균주를 효모추출물이 1 내지 10 g/ℓ인 배지에 접종하는 경우, 효모추출물이 증가할수록 균주의 성장 및 세포 외 효소 활성이 증가하는 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 상기 균주의 생장수준을 향상시키기 위하여는 상기 배지내 효모추출물의 농도를 10 g/ℓ로 적정하고, 산도조건을 pH 6으로 적정하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 배양시 pH, 온도, 효모 추출물(yeast extract) 첨가 조건 외에는 당업자에게 널리 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 배양 시 배지는 적당한 탄소원 또는 질소원을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 탄소원은 주로 CO2와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 아울러, 상기 배지는 아미노산, 비타민, 인원, 무기화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양특성을 분석한 결과, 25℃ 이상의 온도에서 안정적으로 성장하고(도 1a 및 1b), pH 6의 조건에서 최대 성장속도를 나타내며(도 1c 및 1d), 배지내 효모 추출물의 함량이 증가할 수록, 균주의 성장이 촉진됨을 확인하였다(도 1e).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주, 그의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리된 탈색효소를 포함하는 염료탈색용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주는 그 자체로도 염료에 대한 탈색활성을 나타낼 수 있고, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 배양상층액 또는 상기 배양상층액에서 분리된 탈색효소를 사용하여도 염료를 탈색시킬 수 있다. 이때, 상기 탈색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase) 및 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "라카아제(laccase)"란, 거의 대부분의 담자균류의 의해 생산되고, 60~390 kDa의 분자량을 갖는 리그닌 분해효소의 일종을 의미하는데, 활성화 부위(active site)에 4개의 구리이온을 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 상기 효소는 산소를 물로 환원하는 동시에 다양한 종류의 방향족 화합물을 산화할 수 있는데 이 기작에 의해 염료가 분해될 수 있다.
본 발명의 용어 "리그닌 페록시다제(lignin peroxidase)"란, 비페놀성 방향성 리그닌(nonphenolic aromatic lignin)과 구조적으로 유사한 물질을 산화시킬 수 있고, 38~47 kDa의 분자량을 갖는 효소를 의미하는데, 활성화 부위(active site)에 헴(heme)을 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 상기 효소는 다른 효소에 의해 생성된 리그닌 단편을 분해하는 역할을 수행한다.
본 발명의 용어 "망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase)"란, 철 프로토포르피린 보결그룹(Fe protoporphyrin prosthetic group)을 가지고, 32~62.5 kDa의 분자량을 갖는 글라이코실화된 당단백질(glycosylated glycoproteins) 효소를 의미한다. 상기 효소는 2가 망간을 3가 망간으로 산화시키고, 산화된 3가 망간은 곰팡이에 의해 생성된 옥살산(oxalic acid)에 의해 안정적인 착화합물로 전환되며, 상기 전환된 착화합물은 염료와 같은 난분해성물질을 산화하고 분해시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양 상등액 역시 탈색활성을 나타내는데, 상기 균주를 배양하여 수득한 배양물의 배양상등액은 Blue 62, Blue 4, Red 114, Black 172 등의 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타내고(도 10), 대체로 200 mg/ℓ의 염료 농도에서는 염료의 농도가 증가할 수록 비 탈색속도가 증가함(도 11a 내지 11f)을 확인하였다. 이러한 배양상등액의 탈색활성은 상기 균주로부터 발현되어 세포밖으로 분비되는 탈색효소에 의하여 나타나는 것으로 분석되었는데, 실제로 트라메테스 베지컬러 균주에서 발현 및 분비되는 것으로 알려진 탈색효소인 라카아제, 리그닌 페록시다제 및 망간의존성 페록시다제 중에서, 라카아제와 망간의존성 페록시다제의 활성은 본 발명에서 제공하는 균주가 성장함에 따라 이에 비례하여 증가되었고, 배지내 C/N 비율이 증가된 경우에는 리그닌 페록시다제의 활성 역시 증가됨을 확인하였다(도 9a 내지 9c)
본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주는 종래의 트라메테스 베지컬러 균주와 구별되는 염료의 탈색활성을 나타내므로, 보다 효과적인 염색폐수의 정화방법에 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양온도에 따른 균총크기의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양온도에 따른 성장속도의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 pH에 따른 균총크기의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 pH에 따른 성장속도의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1e는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배지내 C/N 비율에 따른 성장수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 산성 염료를 반응시킨 후, 상기 균주의 성장능을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 분산성 염료를 반응시킨 후, 상기 균주의 성장능을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 반응성 염료를 반응시킨 후, 상기 균주의 성장능을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 산성 염료를 반응시킨 후, 배지의 pH 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 분산성 염료를 반응시킨 후, 배지의 pH 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 반응성 염료를 반응시킨 후, 배지의 pH 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 염료탈색능을 시험한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 산성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 잔류하는 염료의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 산성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 탈색율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 분산성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 잔류하는 염료의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 분산성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 탈색율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5e는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 반응성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 잔류하는 염료의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5f는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 반응성 염료를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따른 탈색율의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 산성 염료를 반응시킨 후, 중간대사산물의 형성여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 분산성 염료를 반응시킨 후, 중간대사산물의 형성여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주와 반응성 염료를 반응시킨 후, 중간대사산물의 형성여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 Blue 62 또는 Black 172에 대한 본 발명에서 제공하는 균주의 탈색능 수준을 반응온도의 변화에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 Blue 62 또는 Black 172에 대한 본 발명에서 제공하는 균주의 탈색능 수준을 반응pH의 변화에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 Blue 62 또는 Black 172에 대한 본 발명에서 제공하는 균주의 탈색능 수준을 염료의 농도변화에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액에 포함된 탈색효소의 반응시간의 변화에 따른 효소활성의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액에 포함된 라카아제의 배지내 C/N 비율의 변화에 따른 효소활성의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액에 포함된 리그닌 페록시다제의 배지내 C/N 비율의 변화에 따른 효소활성의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액에 포함된 망간의존성 페록시다제의 배지내 C/N 비율의 변화에 따른 효소활성의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 산성 염료 또는 반응성 염료를 반응시킨 결과를 나타내는 사진이다.
도 11a는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Blue 62를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따라 반응액내 잔류하는 염료의 수준변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Blue 62를 반응시킨 후, 염료의 농도변화에 따른 초기 비 탈색속도와 평균 비 탈색속도의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11c는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Black 172를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따라 반응액내 잔류하는 염료의 수준변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11d는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Black 172를 반응시킨 후, 염료의 농도변화에 따른 초기 비 탈색속도와 평균 비 탈색속도의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11e는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Blue 4를 반응시킨 후, 반응시간의 경과에 따라 반응액내 잔류하는 염료의 수준변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11f는 본 발명에서 제공하는 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액과 Blue 4를 반응시킨 후, 염료의 농도변화에 따른 초기 비 탈색속도와 평균 비 탈색속도의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 분리 및 동정
천마산의 토양(37°40'51.4"N 127°16'21.5"E, 2015년 5월 30일 채집)에서 채취한 토양미생물을 분리하고, 그의 18s rDNA 서열(서열번호 1)을 분석한 후, Blast(NCBI)를 이용하여 동정하였다.
그 결과, 상기 18s rDNA 서열은 트라메테스 베지컬러 균주의 염기서열과 높은 상동성을 나타냄을 확인하여, 상기 균주를 "트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677)"이라 명명하고, 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83005BP를 부여받았다.
아울러, 상기 서열을 트라메테스 베지컬러 균주(Trametes versicolor)에 속하는 "CBR 43" 균주의 "partial 18s rDNA"라 명명하여 NCBI에 등록번호 SRX1315520로 등재하였다.
실시예 2: 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 성장 및 세포활성 조건 규명
상기 실시예 1에서 확인된 트라메테스 베지컬러 균주의 성장에 미치는 온도, pH 및 배지내 효모 추출물 농도의 효과를 확인하였다.
실시예 2-1: 성장에 있어 온도 조건에 따른 영향
상기 균주를 다양한 온도(15, 20, 25, 28 또는 35℃)에서 배양하고, 배양온도에 따른 균총의 크기 및 성장속도를 비교하였다(도 1a 및 1b).
도 1a에서 보듯이, 25℃ 이상의 온도에서는 거의 비슷하게 성장하였으나, 20℃에서는 균총의 크기가 감소하고, 15℃에서는 성장이 저해됨을 확인하였다.
도 1b에서 보듯이, 20℃ 이상의 온도에서는 최대 성장속도의 94.3%를 나타내었으나, 15℃에서는 최대 성장속도의 31.1%에 불과함을 확인하였다.
따라서, 바람직한 배양온도는 20 내지 35℃임을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 성장에 있어 pH 조건에 따른 영향
상기 균주를 다양한 pH(4, 5, 6 또는 7)에서 배양하고, 배양 pH에 따른 균총의 크기 및 성장속도를 비교하였다(도 1c 및 1d).
도 1c에서 보듯이, 배지의 pH 조건에 따른 균총의 크기는 별다른 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
도 1d에서 보듯이, pH 6의 조건에서 최대 성장속도를 보였고, pH 7, 5, 4에서의 성장속도는 각각 최대 성장속도의 98.4%, 91.7% 및 84.1%에 해당함을 확인하였다.
따라서, 바람직한 배양 pH 조건은 pH 5 내지 7임을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 성장에 있어 효모 추출물의 농도에 따른 영향
PDB 배지에 효모 추출물(yeast extract)을 0, 1, 5, 10 g/ℓ가 되도록 첨가하여 각각의 배지를 제조하고, 이들 배지에서 상기 균주를 6일 동안 배양한 다음,
각 균사체를 수득하였으며, 수득한 균사체를 70 ℃에서 1일 동안 건조하고 바이오매스 중량(배양액 부피당 바이오매스 중량)을 측정하였다(도 1e).
도 1e에서 보듯이, PDB 배지에 포함된 효모 추출물의 함량이 증가할수록, 균주의 성장이 촉진됨을 확인하였다.
실시예 2-4: 세포성장에 있어 염료가 미치는 영향
염료가 실시예 1에서 동정된 균주의 성장에 미치는 효과를 분석하고자 하였다.
구체적으로, 염색 염료 공장에서 시판중인 염료 중에서 산성(Acid) 염료, 분산성(Disperse) 염료 또는 반응성(Reactive) 염료에 속하는 적색(Red 114, Red 1 또는 Red 120), 청색(Blue 62, Blue 79 및 Blue 4), 오렌지색(Orange 7, Orange 3 및 Orange 16) 또는 검정색(Black 172, Black 1 및 Black 5) 염료를 200 mg/ℓ의 농도로 첨가한 PDB 배지를 250 ㎖ 플라스크에 100 ㎖씩 분주하고, 이에 상기 실시예 1에서 동정된 트라메테스 베지컬러 균주를 접종하였으며, 28℃ 배양기에서 140rpm으로 9일간 진탕배양하였다. 배양이 종료된 후, 균주의 농도를 측정하고 비교하였다(표 1 및 도 2a 내지 2c).
염료의 종류에 따른, 균주의 농도 변화
염료 균주의 농도(g/ℓ)
대조군 7.06
산성 염료 Red 114
Blue 62
Orange 7
Black 172		 3.64
3.71
2.95
3.00
분산성 염료 Red 1
Blue 79
Orange 3
Black 1		 6.86
3.39
4.74
4.47
반응성 염료 Red 120
Blue 4
Orange 16
Black 5		 5.23
3.65
2.73
3.79
상기 표 1 및 도 2a 내지 2c에서 보듯이, 전체적으로 산성 염료가 포함된 배지에서는 상기 균주의 성장이 약 50% 수준으로 저해되었으나, 분산성 염료와 반응성 염료가 포함된 배지에서는 염료의 종류에 따라 균주의 성장면에서 다양한 차이를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 균주는 염료에 의하여 성장에 영향을 받음을 알 수 있었다.
실시예 2-5: 세포활성에 있어 염료가 미치는 영향
실시예 1에서 동정된 균주를 이용하여 염료를 탈색시킬 경우 균주의 세포 활성의 변화를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 동정된 균주를 실시예 2-4의 방법으로 9일 동안 배양하고, 배양이 종료된 후, 배지의 pH 변화를 확인하였다. (도 3a 내지 3c).
도 3a 내지 3c에서 보듯이, 9일 동안 배양한 후 배지의 pH는 전체적으로 감소되었고, 감소되는 수준은 최대 pH 1.0 이상이었으며, 각 염료에 따라 감소수준이 변화됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 균주는 염료에 의하여 활성에 영향을 받음을 알 수 있었다.
실시예 3: 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 염료탈색 활성
트라메테스 베지컬러 균주는 염료에 대한 탈색활성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 상기 실시예 1에서 동정된 균주가 다양한 염료에 대하여 탈색활성을 나타낼 수 있는지의 여부와 다른 동종의 균주 대비 탈색능 향상 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 3-1: 고체배지에서 염료 탈색능 평가
실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능을 확인하기 위하여, 시판중인 염료(Sigma Aldrich)인 하기 표 2의 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료는 200 mg/ℓ의 농도가 되도록 PDA 배지에 첨가하였고, 12웰 플레이트에 2 mL씩 부어 탈색평가 배지를 제작하였다. 이어, 상기 제작된 탈색평가 배지에, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균사체는 동일한 양으로 접종하고, 28 ℃에서 7 일간 암배양하여, 각 염료에 대한 탈색능을 평가하였다(도 4).
염료의 종류
산성 염료 Red 114
Blue 62
Orange 7
Black 172
분산성 염료 Red 1
Blue 79
Orange 3
Black 1
반응성 염료 Red 120
Blue 4
Orange 16
Black 5
도 4에서 보듯이, 실시예 1에서 동정된 균주가 접종되지 않은 대조군과 비교하여, 실시예 1에서 동정된 균주가 12종의 염료를 모두 탈색시키는 것을 확인하여, 염료에 대해 우수한 탈색능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 액체배지에서 염료 탈색능 평가
실시예 1에서 동정된 균주의 우수한 탈색능을 확인하기 위하여, 표 2의 총 12종의 염료에 대해 탈색능을 평가하였다.
실시예 2-4의 방법으로 상기 각 12종의 염료가 포함된 PDB 배지에 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하고, 진탕배양하여 배양물을 수득하였으며, 이를 원심분리하여 상등액을 얻은 후 상등액의 흡광도를 UV/VIS Spectrophotometer(Mecasys, Optizen 2120 UV Plus)로 측정하였다. 상기 흡광도는 하기식에 대입하여 탈색율(Decolorization Index, %)을 산출하였다(도 5a 내지 5f).
탈색율(Decolorization Index, %) = (Ao-At) × 100/Ao
상기 식에서 Ao는 배양시작시에 측정한 흡광도이고, At는 배양 t일째 측정한 흡광도이다.
도 5a 및 5b에서 보듯이, 산성 염료 중에서, Red 114가 첨가된 배지는 배양 4일차 이후에 94.8% 이상의 탈색율을 나타내었고; Blue 62가 첨가된 배지 역시 배양 4일차에 95.4% 이상의 탈색율을 나타내었으며; Orange 7가 첨가된 배지는 배양 9일차에서도 67.2%의 탈색율을 나타내었고; Black 172가 첨가된 배지는 배양 6일차 이후에 91.2% 이상의 탈색율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, Orange 7을 제외한 산성 염료에 대하여는 대체로 2 내지 4일이 경과된 후, 80% 이상의 탈색능을 나타냄을 알 수 있었다.
도 5c 및 5d에서 보듯이, 분산성 염료 중에서, Red 1이 첨가된 배지는 배양 9일차에서도 52.3 %의 탈색율을 나타내었고; Blue 79가 첨가된 배지는 탈색되지 않았으며; Orange 3가 첨가된 배지는 배양 9일차에서도 51%의 탈색율을 나타내었고; Black 1이 첨가된 배지는 배양 9일차에 80.2%의 탈색율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 분산성 염료에 대하여는 Blue 79에 대하여만 탈색능을 나타냄을 알 수 있었다.
도 5e 및 5f에서 보듯이, 반응성 염료 중에서, Red 120이 첨가된 배지는 배양 4일차 이후에 69.5% 이상의 탈색율을 나타내었고; Blue 4가 첨가된 배지는 배양 2일차 이후에 86.4% 이상의 탈색율을 나타내었으며; Orange 16이 첨가된 배지는 배양 4일차 이후에 73.1% 이상의 탈색율을 나타내었고; Black 5가 첨가된 배지는 배양 4일차 이후에 90.1% 이상의 탈색율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 반응성 염료에 대하여는 대체로 4일이 경과된 후, 69% 이상의 탈색능을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 중간대사산물 분석
상기 실시예 3-2에서 수득한 상등액 중에서, 배양전과 후의 상등액의 흡광도를 400 ~ 700 nm 범위에서 측정하여 중간대사산물 형성 여부를 평가하였다(도 6a 내지 6c).
상기 도 6a 내지 6c에서 보듯이, blue 62, Blue 79, Blue 4 및 Black 1이 첨가된 배지에서는 보라 색의 대사산물을 생성함을 확인하였다.
실시예 3-4: 다른 동종의 균주와 염료탈색 활성 비교
실시예 1에서 동정된 균주와 동종의 균주인 트라메테스 베지컬러 ATCC 12679를 9일동안 배양할 경우 산성 염료인 blue 25, orange 74, black 24 또는 violet 7 또는 반응성 염료인 blue 15 또는 black 5와 같은 다양한 염료에 대한 탈색능을 나타낸다고 보고되었으므로(Young L. and Yu J. 1997. Ligninase-catalysed decolorization of synthethic dyes, Water Research, 31(5), 1187-1193), 실시예 1에서 동정된 균주와 상기 다른 동종의 균주의 탈색능을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 산성 염료인 blue 25, orange 74, black 24 또는 violet 7 또는 반응성 염료인 blue 15 또는 black 5를 50mg/ℓ의 농도로 첨가한 PDB 배지에 상기 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하고, 28℃에서 140rpm의 속도로 6일 동안 진탕배양하여 배양물을 수득하였다, 이를 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 실시예 3-2의 방법으로 각 염료에 대한 탈색율을 산출하였으며, 이를 트라메테스 베지컬러 ATCC 12679 균주의 탈색율과 비교하였다(표 3).
종래 균주 대비 본 발명 균주의 탈색율 비교(단위: %)
염료 Trametes versicolor ATCC 12679 실시예 1에서 동정된 균주
blue 25
orange 74
black 24
violet 7
blue 15
black 5		 69
7.3
96.6
12.4
91.4
15.6		 97.7
30.4
97.1
30.2
96.5
97
상기 표 3에서 보듯이, 실시예 1에서 동정된 균주는는 종래의 균주에 비하여, orange 74, violet 7 및 black 5에 대하여 현저히 우수한 탈색능을 나타내었다. 특히, black 5에 대하여는 종래의 균주에 비하여 6배 이상의 탈색능을 나타내고, orange 74에 대하여도 4배 이상의 탈색능을 나타내며, violet 7에 대하여도 2.4배 이상의 탈색능을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 실시예 1에서 동정된 균주가 다른 동종의 균주보다 염료 탈색능이 우수함을 알 수 있었다.
이처럼, 실시예 1에서 동정된 균주는 다른 동종의 균주에 비하여 우수한 탈색능을 나타내었으므로, 다른 동종의 균주와는 구별되는 새로운 균주임을 확인하였다.
실시예 3-5: 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 최적 염료 탈색 조건 규명
실시예 1에서 동정된 균주가 다른 동종의 균주보다 우수한 탈색능을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 탈색능에 영향을 미치는 온도, pH 및 염료 농도를 조사하고자 하였다. 이를 위해, blue 62 또는 black 172 염료를 첨가한 PDB 배지에 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하여 배양시킨 후 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 이용하여 배양시간별 염료의 흡광도를 측정한 후(blue 640 mm, black 570 mm), 상기 흡광도 값을 흡광도-농도와의 검량식에 적용하여 염료농도로 환산하였다. 상기 염료농도를 통해 배양시간별 염료 탈색량을 계산한 후 배양 온도별 염료의 탈색속도(mg-dye/L/D)를 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같다.
실시예 3-5-1: 염료 탈색에 미치는 온도 영향
실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 온도에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
300 mg/ℓ의 Blue 62 또는 150 mg/ℓ의 Black 172를 포함하는 PDB 배지에, 실시예 1에서 동정된 균주를 접종한 후, 20, 25, 28 및 35 ℃의 온도 조건에서, 150 rpm으로 6일 동안 배양하여, 배양 온도별 염료의 탈색속도(mg L-1 d-1)를 평가하였다.(도 7a).
도 7a에서 보듯이, Blue 62는 28℃에서 가장 빠른 탈색속도(296.4 mg L-1 d-1)를 나타내었고; Black 172 역시 28℃에서 가장 빠른 탈색속도(39.5 mg L-1 d-1)를 나타내내었다.
따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 염료의 종류와 온도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타내었으나, 공통적으로 25 내지 30℃ 조건에서 비교적 높은 수준의 탈색속도를 나타내었으며, 28℃에서 가장 빠른 탈색속도를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-5-2: 염료 탈색에 미치는 pH 영향
실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 pH에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
300 mg/ℓ의 Blue 62 또는 150 mg/ℓ의 Black 172를 포함하는 PDB 배지에, 2 N HCl 혹은 2 N NaOH 용액을 첨가하여 pH를 4, 5, 6 또는 7로 맞춘 PDB-염료 배지를 제조하고, 실시예 1에서 동정된 균주를 접종한 후, 28℃에서 150 rpm으로 6일 동안 배양하여, 배양 pH별 염료의 탈색속도(mg L-1 d-1)를 평가하였다(도 7b).
도 7b에서 보듯이, Blue 62는 pH 5에서 가장 빠른 탈색속도(296.4 mg L-1 d-1)를 나타내었고; Black 172는 pH 7에서 가장 빠른 탈색속도(42.1 mg L-1 d-1)를 나타내었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 균주는 염료의 종류와 pH에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-5-3: 염료 탈색에 미치는 염료농도 영향
실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 염료농도에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 다양한 농도의 blue 62(150, 300, 550 또는 700 mg/L) 또는 black 172(100, 150, 400 또는 800 mg/L)를 포함하는 PDB 배지에 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하고 28℃에서 150 rpm의 조건하에 6일 동안 진탕배양하면서, 탈색속도의 변화를 비교하였다.(도 7c).
도 7c에서 보듯이, Blue 62와 Black 172 모두 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 증가하는 경향을 나타내었으나, 고농도의 염료농도에서는 차이를 나타내었다. 즉, Black 172는 고농도의 염료농도에서 탈색속도의 증가율이 다소 감소되는 경향이 있으나, 탈색속도 자체는 지속적으로 증가하는 반면, Blue 62는 550 mg/ℓ을 기준으로 하여 그 이상의 염료농도에서는 탈색속도 자체가 감소됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 균주는 염료의 종류 및 농도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 신규한 트라메테스 베지컬러 균주의 배양상등액의 탈색활성 분석
상기 실시예 3의 결과로부터 실시예 1에서 동정된 균주가 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 균주의 배양상등액 역시 유사한 활성을 나타내는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: 배양상등액에 포함된 탈색효소의 활성분석
상기 균주를 28℃ 및 150 rpm의 조건으로 6일 동안 진탕배양한 배양물을 원심분리하여 배양상등액을 수득하고, 상기 배양상등액에 포함된 탈색효소(라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase) 및 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase))의 활성을 배양시간 별로 비교하였다(도 8).
도 8에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 균주의 성장에 따라, 라카아제와 망간의존성 페록시다제의 활성은 증가되었으나, 리그닌 페록시다제의 활성은 증가하지 않음을 확인하였다.
이러한 탈색효소의 활성이 배지의 효모 추출물의 함량에 의해 변화되는지를 확인하고자, PDB 배지에 효모 추출물이 0, 1, 5, 10 g/ℓ의 함량으로 포함된 각각의 배지를 제조하고, 이들 배지에서 상기 균주를 6일 동안 배양한 다음, 이로부터 분리된 배양상등액에 포함된 탈색효소의 배양시간에 따른 활성변화를 분석하였다(도 9a 내지 9c).
도 9a 내지 9c에서 보듯이, 배지내 효모 추출물의 함량이 탈색효소의 활성에 미치는 효과는 탈색효소별로 상이함을 확인하였다. 구체적으로, 라카아제와 망간의존성 페록시다제의 경우에는 배지내 효모 추출물의 함량에 따른 효소활성의 차이가 거의 나타나지 않았으나, 리그닌 페록시다제는 배지내 효모 추출물의 함량이 증가할 수록 그의 활성이 증가됨을 확인하였다.
실시예 4-2: 배양상등액의 탈색활성
상기 실시예 4-1에서 수득한 배양상등액 800 ㎕에 400 mg/ℓ의 염료용액 200 ㎕를 가하고 상온에서 12시간 반응시킨 후, 탈색활성을 비교하였다(도 10). 이때, 사용된 염료는 산성 염료에 속하는 4종의 염료(Red 114, Blue 62, Orange 7 또는 Black 172) 또는 반응성 염료에 속하는 4종의 염료(Red 120, Blue 4, Orange 16 또는 Black 5)를 사용하였다.
도 10에서 보듯이, Blue 62와 Blue 4는 가장 높은 수준으로 탈색되었고, Red 114와 Black 172 역시 현저하게 탈색됨을 확인하였다.
실시예 4-3: 배양상등액의 탈색활성에 미치는 염료농도의 효과
상기 실시예 4-2에서 본 발명에서 제공하는 균주의 배양상등액에 의하여 탈색효과를 나타내는 3종의 염료(Blue 62, Blue 4 또는 Black 172)를 이용하여, 상기 염료의 농도가 상기 배양상등액의 탈색활성에 미치는 효과를 분석하였다.
구체적으로, 상기 3종의 염료(Blue 62, Blue 4 또는 Black 172)를 다양한 농도(160, 320, 480, 640, 800 또는 1600 mg/ℓ)로 포함하는 각각의 염료용액을 제조하고, 상기 염료용액 50 ㎕와 배양상등액 350 ㎕를 혼합하여 수득한 최종 염료농도(20, 40, 60, 80, 100 또는 200 mg/ℓ)의 반응물을 28℃에서 1시간 동안 반응시키면서, 반응액의 흡광도를 측정하고, 이를 반응물 내의 잔류하는 염료의 수준으로 환산하였다. 또한, 상기 환산된 반응물 내에 잔류하는 염료 수준의 변화량과 상기 배양상등액의 단백질 농도를 이용하여 초기 비 탈색속도(initial specific decolorization rate, mg-dye/min/g-protein)와 평균 비 탈색속도(average specific decolorization rate, mg-dye/min/g-protein, rate)를 산출하였다(도 11a 내지 11f). 이때, 초기 비 탈색속도 산출시 사용된 반응시간은 각각 Blue 62 4분, Blue 4 10분, Black 172 10분으로 설정하였고, 평균 비 탈색속도 산출시 사용된 반응시간은 각각 Blue 62 35분, Blue 4과 Black 172은 65분으로 설정하였다.
도 11a 및 11b에서 보듯이, Blue 62는 3분 이내의 짧은시간 동안 빠르게 탈색되었고, 염료의 농도가 증가할 수록 비 탈색속도 역시 증가하였으므로, 200 mg/ℓ의 염료 농도에서도 염료농도에 의하여 탈색활성이 저해되지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 200 mg/ℓ의 염료 농도조건에서 초기 비 탈색속도는 158.3 mg-dye/min/g-protein이고, 평균 비 탈색속도는 19.3 mg-dye/min/g-protein임을 확인하였다.
도 11c 및 11d에서 보듯이, Blue 4는 1시간의 반응시간 동안 서서히 탈색되었고, 염료의 농도가 증가할 수록 비 탈색속도 역시 증가하였으므로, 200 mg/ℓ의 염료 농도에서도 염료농도에 의하여 탈색활성이 저해되지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 200 mg/ℓ의 염료 농도조건에서 초기 비 탈색속도는 24.4 mg-dye/min/g-protein이고, 평균 비 탈색속도는 10.5 mg-dye/min/g-protein임을 확인하였다.
도 11e 및 11f에서 보듯이, Black 172는 초기 5분 동안에만 급격히 탈색되었고, 염료의 농도가 증가할 수록 비 탈색속도 역시 증가하였으므로, 200 mg/ℓ의 염료 농도에서도 염료농도에 의하여 탈색활성이 저해되지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 200 mg/ℓ의 염료 농도조건에서 초기 비 탈색속도는 39.1 mg-dye/min/g-protein이고, 평균 비 탈색속도는 6.8 mg-dye/min/g-protein임을 확인하였다.
상기 실시예 4-1 내지 4-3의 결과를 종합하면, 본 발명의 균주의 배양상등액은 본 발명의 균주에 비하여 상대적으로 낮은 탈색활성을 나타내기는 하지만, 염료에 대한 탈색활성을 나타냄을 알 수 있었다.
농업생명공학연구원 KACC83005BP 20151028
<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation Soongsil University Research Consortium techno-PARK National Institute of Biological Resources <120> Novel dye-decolorizing fungus, Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677, and method for treating dye wastewaters using the same <130> KPA151314-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rDNA <400> 1 gtggatgggg agtcattcct ctctttgcta atattgcgcg agagaccgat agcgaactag 60 taccgtgagg agaagatgag aagcactttg gaaagagagt taaacagtac gtgaaattgc 120 taaaagggaa acgcttgaag tcagtcgcgt cgtccggaac tcagctttgc ttcggcttag 180 tgcactttcc ggttgacggg ccagcatcga ttttgaccgc tggcaaaggg ctggaggaat 240 gtggcacctt cgggtgtgtt atagccttca gtcgcataca gcggttggga tccaggaacg 300 cagcgagcct cagggctggc gttcgcccac attcgcgctt agtatgctgg tataatggct 360 tttaacgacc cgtcttgaaa tacgtaccaa ggagtctaac atgcctgcga gcgcttgggt 420 ggaaaacccg agcgcgtaat gtaagtgaaa gtcgagacct ctgttgcgca gggcttccca 480 caaattggga ccaaattttg taggatctgg ggcagagctt tccaaaaaat tacacaaaag 540 ggggggtttg tggggg 556

Claims (14)

  1. 염료를 포함하는 시료와, 염료 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83005BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677) 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법으로서,
    상기 염료는 산성 염료 또는 반응성 염료이며,
    상기 산성 염료는 주황색 74(orange 74) 또는 보라색 7(violet 7)이고, 상기 반응성 염료는 흑색 5(black 5) 염료인 것인, 탈색방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염료를 포함하는 시료는 염색폐수인 것인, 탈색방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계는 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 수행되는 것인, 탈색방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계는 pH 4 내지 6의 산도에서 수행되는 것인, 탈색방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료농도가 700 mg/ℓ 미만이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것인, 탈색방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배양물은 상기 균주로부터 분비된 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase), 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 탈색방법.
  9. 염료 탈색능을 나타내고,
    상기 염료는 산성 염료 또는 반응성 염료이며,
    상기 산성 염료는 주황색 74(orange 74) 또는 보라색 7(violet 7)이고, 상기 반응성 염료는 흑색 5(black 5) 염료인 것인,
    기탁번호 KACC83005BP로 기탁된 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677(Trametes versicolor NIBRKDFPFGC000002677) 균주.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 균주는 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase), 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase) 또는 이들의 조합인 탈색효소를 발현시키고 세포외로 분비시키는 것인 균주.
  11. 제9항의 균주를 1 내지 10g/ℓ의 효모 추출물을 포함하는 배지에 접종하고, 이를 배양하는 단계를 포함하는, 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주의 배양방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양은 20 내지 35℃의 온도조건 및 pH 5 내지 7의 산도조건에서 수행되는 것인, 방법.
  13. 제9항의 트라메테스 베지컬러 NIBRKDFPFGC000002677 균주, 그의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리된 탈색효소를 포함하는 염료탈색용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 탈색효소는 라카아제(laccase), 리그닌 페록시다제(lignin peroxidase), 망간의존성 페록시다제(Mn dependent peroxidase) 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
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