JPH09503126A

JPH09503126A - 精製▲ｐＨ▼中性リゾクトニア・ラッカーゼ及びそれをコードする核酸

Info

Publication number: JPH09503126A
Application number: JP7509287A
Authority: JP
Inventors: アンジェラウォーレイスナー，ジル; エッゲルトクリステンセン，ビョルン; シュナイデル，パレ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1997-03-31
Also published as: US5480801A; CN1324882A; EP0719337A1; FI961250A; CA2171288A1; BR9407511A; AU698423B2; AU7833694A; FI961250A0; WO1995007988A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、中性又は塩基性pHにおいて最適活性をもつリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ラッカーゼをコードする配列を含む単離核酸断片、及びそれによりコードされるラッカーゼ・タンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】精製pH中性リゾクトニア・ラッカーゼ及びそれをコードする核酸関連出願本出願は、同時係属中の米国逐次番号第08／122,230号、第08／122,827号、及び第08／162,827号の一部継続である（これらの内容を全体として本明細書中に取り込む。）。発明の分野本発明は、真菌酸化還元酵素をコードする単離された核酸断片及びそれにより作り出された精製された酵素に関する。より特に、本発明は、中性pHにおいて働く、フェノール・オキシダーゼ、特にラッカーゼ(laccase)をコードする核酸断片に関する。発明の背景ラッカーゼ（ベンゼンジオール：酸素酸化還元酵素）は、フェノール類の酸化を触媒する多−銅含有酵素である。ラッカーゼ−仲介酸化は、好適なフェノール性基質からのアリールオキシ、基中間体の生産をもたらす；そのように生産された中間体の最終的なカップリングは、ダイマー、オリゴマー、及びポリマー反応生成物の組合せを提供する。このような反応は、メラニン、アルカロイド、毒素（toxins）、リグニン、及び腐植酸（humicacids）の形成を導く生合成系路において天然で重要である。ラッカーゼは、子嚢菌類（ascomycetes）、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（アカパンカビ）（Neurospora ）、及びポドスポラ（Podospora）、不完全菌類（deuteromycetes）ボトリティス（Botrytis）、及び担子菌類（basidiomycetes）例えばコリビア（Collybia）、Fomes（ツリガネタケ）、Lentinus（マツオウジ・シイタケ）、Pleurotus（ヒラタケ）、Tra metes （ホウロクタケ）、並びにリゾクトニア（Rhizoctonia）の完全型を含むさまざまな真菌により生産される。ラッカーゼは、広いレンジの基質特異性を示し、そして各々の異なる真菌ラッカーゼは、通常、フェノール性基質を酸化するその能力において他と定量的にのみ異なる。その基質多様性のために、ラッカーゼは一般的に、多くの潜在的な工業用途が見い出されている。これらの中に、リグニン修飾、紙補強、洗剤中の染料移り阻害、フェノール重合、ジュース製造、フェノール樹脂製造、及び廃水処理がある。これらの触媒能力は類似するけれども、異なる真菌種により作られたラッカーゼは、異なる最適温度とpHをもち、そしてそれらは、特定の基質に依存して異なることもできる。多数のこれらの真菌ラッカーゼが単離され、そしてこれらのいくつかについての遺伝子がクローン化されている。例えば、Choi et al．（Mol ．Plant-Microbe Interactions ５：119-128，1992）は、クリの胴枯れ病(ches tnut blight)真菌、クリフォネクトリア・パラシティカ（Cryphonectria paras itica ）のラッカーゼをコードする遺伝子の分子特徴付け及びクローニングについて記載している。Kojima et al．（J．Biol．Chem．265：15224-15230，1990 ；JP2-238885）は、白枯れ(white-rot)担子菌コリオラス・ヒルスタス（Coriolu s hirsutus）のラッカーゼの２つの対立遺伝子形態の記載を提供している。Ger mann and Lerch（Experientia 41 801，1985；PNAS USA 83：8854-8858，1986 ）は、Neurospora crassa（アカパンカビ）ラッカーゼ遺伝子のクローニングと部分的配列決定について報告した。Saloheimo et al．(J．Gen．Microbiol．137 ：1537-1544，1985； WO 92／01046)は、真菌フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）からのラッカーゼ遺伝子の構造分析について開示した。しかしながら、公知の真菌ラッカーゼの事実上全てが酸性pH（例えば、pH3.0〜6.0の間）において最良に働き、そして典型的には中性又は塩基性pHにおいて不活性である。多くの上述の潜在的な工業的方法は、中性又は塩基性pHにおいて主に行われるので、ほとんどの真菌ラッカーゼはこのような方法においてはほとんど働かない。従って、上記の利用可能な真菌ラッカーゼは多くの重要な商業的方法における利用に不適当である。上記規則の例外は、リゾクトニア（Rhizoctonia）の特定種により作られる細胞外ラッカーゼである。Bollag et al．は、リゾクトニア・プラティコラ（Rhiz octonia praticola）により作られた約7.0の最適pHをもつラッカーゼについて報告している。このタイプのラッカーゼは、先に知られたラッカーゼよりも中性 pHを要求する工業的方法においてかなり有用であろう。しかしながらR．pratico la 酵素は、精製されておらず、またさらに特徴付けられておらず、そして今日までこの特性をもつ他のラッカーゼのいずれも精製又は特徴付けされていない。その上、他のラッカーゼ遺伝子が、上述のように、単離されているけれども、これらは、酸性pHにおいて最良に働く酵素をコードする遺伝子であった。pH中性又は塩基性ラッカーゼの組換え生産及び商業的に適当な収率は、従って、その酵素自体又はそのような酵素をコードするラッカーゼ遺伝子のいずれも先に単離され、そして／又は精製され、そして配列決定されていないという事実から未だ達成されていない。本発明は、今般、これらの問題の各々に対する解決策を提供する。発明の要約本発明は、pH6.0と8.5の間において最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼをコードする核酸配列を含んで成る単離核酸断片に関する。“最適に働く（functioning optimally）”は、その酵素が、基質、例えばシリンガルダジン（Syringaldazine），ABTS，2.6−ジメトキシフェノール、又は４−アンチアミノピリン＋Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンについての１以上の標準的なラッカーゼ検定における活性により測定されるとき、約6.0〜8.5の間のpHレンジ内でかなりの（すなわち、最大値の少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約50％、そして最も好ましくは50％〜最大値の）活性を示すことを意味する。本発明に係るラッカーゼのための好ましい基質はシリンガルダジンである。好ましい態様においては、ラッカーゼはリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctoni a solani）ラッカーゼである。本発明は、新規の核酸配列によりコードされた実質的に純粋なラッカーゼにも関する。“実質的純粋（substantially pure）” は、他の非−ラッカーゼ・タンパク質を本質的に含まない（すなわち≧90％）であるラッカーゼを意味する。新規のラッカーゼの生産を容易にするために、本発明は、請求に係る核酸断片を含んで成るベクター及び宿主細胞であって、そのラッカーゼの組換え生産に有用であるものをも提供する。この核酸断片は、選ばれた宿主細胞内でそのラッカーゼ・タンパク質の発現を指令することができる転写及び翻訳シグナルに作用可能な状態で連結される。好ましい宿主細胞は、真菌細胞、最も好ましくはアスペルギルス属(genus Aspergillus)にある。本発明に係るラッカーゼの組換え生産は、そのラッカーゼ・タンパク質の発現に好適な条件下、本発明に係る核酸断片により形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞、又はそれらの子孫を培養し、そしてそのカルチャーからそのラッカーゼ・タンパク質を回収することにより達成される。本発明に係るラッカーゼは、フェノール類の酸化が必要とされる多くの工業的方法において有用である。これらの方法は、リグニン操作、ジュース製造、フェノール重合及びフェノール樹脂製造を含む。好ましい態様においては、本発明に係る酵素は、その最大効率のために中性又はいくぶん塩基性のpHを必要とする方法において使用される。図面の簡単な説明図１は、RSlac1のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図示する。ヌクレオチド配列中の小文字はイントロンの位置を示す。図２は、RSlac2のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図示する。ヌクレオチド配列中の小文字はイントロンの位置を示す。図３は、プラスミドpMWR-1の制限酵素マップを図示する。図４は、RSlac3の翻訳された領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図示する。図５は、RSlac1のシリンガルダジン・オキシダーゼ活性を図示する（90mMバッファー、20μＭシリンガルダジン、20℃）。図６は、RSlac2のシリンガルダジン・オキシダーゼ活性を図示する（93mMバッファー、20μＭシリンガルダジン、20℃）。発明の詳細な説明リゾクトニア属の中の特定の種がラッカーゼを生産するものとして報告されている；それ故、最初の調査は、さまざまなリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）単離物中のこれらの酵素の存在を同定することに集中した。サンプルが培養され、そして以下に記載するようなABTS法によりラッカーゼの存在について定期的に分析される。ラッカーゼは、リゾクトニア・カルチャーの全てにおいて観察される。収穫されたラッカーゼは電気泳動により分離され、そしてABTSにより染色される。１の単離物、RS22は、塩基性pIをもつラッカーゼを生産し、そしてさらなる研究のために選択される。残りの研究は、RS22からの酵素の精製及び特徴付けに焦点を合わせる。要約すれば、発酵ブロスを濾過し、そして約10,000の膜カット・オフをもつVFにより濃縮する。最初のイオン交換クロマトグラフィー段階を、NaClの段階溶出を用いて、酢酸塩バッファー中pH4.5において行う。この溶出液を次に限外濾過し、そして再びクロマトグラフィーにかけ、そしてNaClグラジエントにより溶出する。活性画分をさらなる研究のためにプールする。このように単離され、そして精製された無傷のタンパク質（以下、RSlac3という。）を最初に部分的配列決定に供し、そしてその得られたＮ−末端配列は以下のようなものである：このタンパク質をさらに、リシン−又はグルタミン酸−特異的プロテアーゼによる消化に供し、そしてこのタンパク質から得られた追加のペプチドは、以下の配列をもち、これは、コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)における配列と並べられることができる：以下のペプチドも発見されたが、コリオラスの配列とは一致しない。上記配列中、Ｂは、アスパラギン酸又はアスパラギンのいずれかの残基を示し、そしてＸは同定されていない残基を示す。リゾクトニア・ラッカーゼ遺伝子についてのスクリーニングを開始するために、R．solaniゲノム・ライブラリーを調製する。生DNAを制限酵素San3Aにより部分消化し、そしてサイズ８〜21kbの間のDNA断片を単離するためにアガロース・ゲル中で電気泳動する。分画された断片を、BamHI末端をもつλファージEMBL３アームにライゲートし、そして得られたファージをインビトロにおいてパッケージングする。これらのファージを大腸菌（E．coli）において170,000プラークのライブラリーを創出するためのライブラリーとして使用し、そして将来の使用のために100倍に増幅する。 R．solaniラッカーゼ遺伝子の単離のためのプローブを開発するために、５つの公知のラッカーゼのタンパク質配列を分析してコンセンサス配列を決定し、そして２つの縮重オリゴヌクレオチドを観察されたコンセンサス配列（Choi et al ．前掲；Germann and Lerch，前掲；Saloheimo et al．前掲；Kojima et al．前掲）基づいて構築した。これらのオリゴをR．solaniゲノムDNAと混合し、そして220ヌクレオチド断片のDNA断片を、taqポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅する。次に220−ヌクレオチド断片をプラスミド・ベクター内にクローン化する。このPCR断片を、上記増幅されたゲノム・ライブラリーから25,000プラークをスクリーンするためのプローブとして使用する。このスクリーンからの陽性クローンは、DNA配列分析により、２つの異なるラッカーゼ遺伝子、RSlac1とRSlac2 をコードすることがその後に示される２つのクラスに分けられる。これらの遺伝子の各々についてのヌクレオチド配列（配列番号：１と３）、並びに各々のタンパク質についての予想アミノ酸配列（配列番号：２と４）を、それぞれ図１と２に表す。この２つの配列の間の相同性は約63％である。コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、クリフォネクトリア・パラシティカ（Cryphonectria parasitica）、及びニューロスポラ・クラッサ（Neu rospora crassa）からの公知のラッカーゼ配列に比較して、このRSラッカーゼは約30−40％の間の相同性を示す。２つのコーディング配列の各々をアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のtaka-アミラーゼ転写及び翻訳シグナルに作用可能な状態で連結された発現ベクター内にクローン化する（図３参照）。この２つのラッカーゼ発現ベクターのそれぞれをアスペルギルス・オリザエ及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）宿主細胞内に形質転換し、そしてその宿主細胞をラッカーゼの存在についてスクリーニングする。 RSlac3遺伝子の単離のために、ポリＡ RNAを、アニシジン（anisidine）の存在中で増殖させたR．solani菌糸体から精製する。このRNAを、cDNA合成のための鋳型として使用する。このcDNAを分画し、そして1.7〜3.5kbの間の断片を集め、そしてcDNAライブラリーを、その分画されたDNAを酵母ベクター内にクローニングすることにより創出する。このライブラリーからの3000の形質転換体をABTSについてスクリーニングする。24時間後、単一コロニーが陽性に現われる。このコロニーからのプラスミドを単離し、そしてその挿入物を配列決定する。その予想アミノ酸配列の一部は、前掲中に記載されたRS22から得られた断片の配列と一致した。この完全ヌクレオチドとアミノ酸配列を図４中に、そしてそれぞれ配列番号：13と14中に示す。RSlac3はRSlac1との48％の相同性をもち、そしてRSlac2との50％の相同性をもつ。また、RSlac3は、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）ラッカーゼ遺伝子との48％の相同性を示す。本発明に従って、pH中性又は塩基性ラッカーゼをコードするリゾクトニア（Rh izoctonia ）遺伝子を、上記の方法により又は、本明細書中に提供する情報を使用して、本分野において知られたいずれかの他の方法により得ることができる。この遺伝子を、発現ベクターを使用して、活性形態で、発現させることができる。有用な発現ベクターは、宿主細胞ゲノム内へのそのベクターの安定した組み込み又はその宿主細胞のゲノムに独立した宿主細胞内のベクターの自律的複製を許容する要素、並びに好ましくは、形質転換された宿主細胞の容易な選択を許容する１以上の表現型マーカーを含む。この発現ベクターは、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、並びに場合によりレプレッサー遺伝子又はさまざまなアクチベーター遺伝子をコードする制御配列をも含むことができる。発現されたタンパク質の分泌を許容するために、シグナル配列をコードするヌクレオチドを、その遺伝子のコーディング配列の前に挿入することができる。制御配列の指令下での発現のために、本発明に従って処理されるべきラッカーゼ遺伝子が、適当なリーディング・フレーム内の制御配列に作用可能な状態で連結される。プラスミド・ベクター内に取り込まれることができ、そして上記ラッカーゼ遺伝子の転写を指令することができるプロモーター配列は、非限定的に、原核生物のβ−ラクタマーゼ・プロモーター（Vi lla-kamaroff，et al.，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．75．3727-3731 ）及びtacプロモーター（De Boer，et al.，1953，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S .A.80：21-25）を含む。さらなる参考文献は、“Useful proteins from recombi nant bacteria”in Scientific American，1980，242：74-94；及びSambrook et al.，Molecular Cloning，1989中にも見られる。本発明に係るDNA構築物を担持する発現ベクターは、便利には、組換えDNA手順に供されることができるいずれかのベクターであることができ、そしてそのベクターの選択は、典型的には、それが導入されるであろう宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち、染色体外存在物として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター、例えばプラスミド、又は染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であることができる。あるいは、このベクターは、宿主細胞内に導入されたとき、その宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製されるものであることができる。ベクター内では、DNA配列は、好適なプロモーター配列に作用可能な状態で持続されなければならない。プロモーターは、選ばれた宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であり、そしてその宿主細胞に同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得られることができる。特にバクテリア宿主内で、本発明に係るDNA構築物の転写を指令するための好適なプロモーターの例は、大腸菌（E ．coli ）のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Str eptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dag Ａプロモーター、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amy Ｌ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermo philus ）麦芽生成アミラーゼ遺伝子（amy Ｍ）のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ（amy α）のプロモーター、又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）xyl Ａ及びxyl Ｂ遺伝子のプロモーターである。酵母宿主においては、有用なプロモーターはeno-１プロモーターである。真菌宿主における転写について、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（A．oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコー・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（A．niger）中性α−アミラーゼ、A．niger酸安定性α− アミラーゼ、A．niger又はアスペルギルス・アワムシ（A．awamsii）グルコアミラーゼ（glu Ａ）、リゾムコー・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、A ．oryzae アルカリ性プロテアーゼ、A．oryzaeトリオース・ホスフェート−イソメラーゼ又はアスペルギルス・ニジュランス（A．nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるものである。好ましいものは、上記TAKA−アミラーゼ及びglu Ａプロモーターである。本発明に係る発現ベクターは、好適な転写ターミネーター及び、真核細胞においては、ポリアデニレーション配列であって本発明に係るラッカーゼをコードするDNA配列に作用可能な状態で結合されているものをも含んで成ることができる。終結及びポリアデニレーション配列は、好適には、そのプロモーターも同一の源から得られることができる。このベクターはさらに、着目の宿主細胞内でこのベクターが複製することを可能にするDNA配列を含んで成ることができる。この配列の例は、プラスミドpVC 19，pACYC177，pVB110，pE194，pAMB1及びpIJ702の複製起点である。このベクターは、選択マーカー、例えばその生成物がその宿主細胞内での検出を補償する遺伝子、例えばB．subtilis又はB．licheniformisからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するものをも含んで成ることができる。アスペルギルス（Aspergillus）選択マーカーの例は、amd Ｓ，pyr Ｇ，arg Ｂ，nia Ｄ及びsC、ハイグロマイシン耐性を生じるマーカー、を含む。アスペルギルス宿主細胞内での使用に好ましいものは、A．nidulans又はA．oryzaeのamd Ｓとpyr Ｇマーカーである。頻繁に使用される哺乳類マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子である。さらに、選択は、例えばWO 91／17243中に記載されたような、同時形質転換により達成されることができる。発現が細胞外であることが一般的に好ましい。本発明に係るラッカーゼは従って、その培養基中へのその発現されたタンパク質の分泌を許容する前領域を含んで成ることができる。適宜、この前領域は、本発明に係るラッカーゼに対して生来のものであることができ又は異なる前領域又はシグナル配列により置換されることができ、便利には対応の前領域をコードするDNA配列の置換により達成される。例えば、この前領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、バチルス種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコー・ミエヘイからのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエからのα− ファクターの遺伝子又はウシ・プロキモシン遺伝子から得られることができる。特に好ましくは、その宿主が真菌細胞であるとき、A．oryzae TAKAアミラーゼ、A．niger中性アミラーゼ、Bacillus NCIB 11837からの麦芽生成（maltogenic）アミラーゼ、B．stearother mophilus α−アミラーゼ、又はBacillus licheniformisサブチリシン（subtili sin）のための前領域である。有効なシグナル配列は、A．oryzae TAKAアミラーゼ・シグナル、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ・シグナル及びRhizomucor mieheiリパーゼ・シグナルである。本発明に係るDNA構築物、上記プロモーター、ターミネーター及び他の要素をそれぞれライゲートするために、そして複製のために必要な情報を含む好適なベクター内にそれらを挿入するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えは、SambrooK et al．Molecular Cloning，1969を参照のこと。）。先に定めたような本発明に係るDNA構築物又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明に係る細胞は、有利には、本発明に係る酵素の組換え生産における宿主細胞として使用される。この細胞は、便利には、その宿主染色体内にDNA構築物を組み込むことにより、本発明に係るDNA構築物により形質転換されることができる。この組み込みは、一般的に、有利であると考えられる。なぜなら、そのDNA配列がその細胞内でより安定して維持される傾向があるからである。宿主染色体内へのDNA構築物の組み込みは、慣用法に従って、例えば相同的又は異種組換えにより行われることができる。あるいは、細胞は、異なるタイプの宿主細胞との関連で先に記載したような発現ベクターにより形質転換されることができる。宿主細胞は、原核細胞：例えばバクテリア細胞から選ばれることができる。好適なバクテリアの例は、グラム陽性バクテリア、例えばバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus len tus ）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Ba cillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus am yloliquefaciens ）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillu s lantus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Strept omyces murinus）、又はグラム陰性バクテリア、例えば大腸菌（E．coli）である。これらのバクテリアの形質転換は、例えばプロトプラスト形質転換により又はそれ自体公知のやり方でコンピテント細胞を使用することにより行われることができる。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は好ましくは真菌細胞であって酵母と糸状菌を含むものであることができる。例えば、有用な哺乳類細胞は、CHO又はCOS細胞を含む。酵母宿主細胞は、サッカロミセス（Sa ccharomyces ）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の種から選ばれることができる。有用な糸状菌は、アスペルギルス（Aspergillus）の種、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Asp ergillus niger）から選ばれることができる。あるいは、フザリウム（Fusariu m ）種の株、例えばフザリウム・オキシスポラム（F．oxysporum）が宿主細胞として使用されることができる。真菌細胞は、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換その後のそれ自体公知のやり方での細胞壁の再生を含む方法により形質転換されることができる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のために好適な手順は、EP 238 023中に記載されている。フザリウム種を形質転換するのに好適な方法は、Malardier et al.，1989により記載されている。従って、本発明は、本発明に係る組換えラッカーゼの製造方法であって、その酵素の製造を誘導する条件下で上記のような宿主細胞の培養し、そしてその細胞及び／又は培養基からその酵素を回収することを含んで成る方法を提供する。これらの細胞を培養するために使用される培地は、着目の宿主細胞を増殖させ、そして本発明に係るラッカーゼの発現を得るために好適ないずれかの慣用の培地であることができる。好適な培地は、商業的な提供者から入手可能であり、又は公開された形式に従って調製されることができる（例えば、American Type Cultur e Collectionのカタログ中のもの）。得られた酵素は、その培地から、遠心分離又は濾過によるその培地からの細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによるその上清又は濾液のタンパク質成分の沈降、その後のさまざまなクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーその他による精製を含む慣用の手順により回収されることができる。好ましくは、単離されたタンパク質は、SDS-PAGEにより測定されるとき約90％の純度であり、その純度は、食品、ジュース又は洗剤用途において最も重要である。特に好ましい態様においては、ラッカーゼの発現は、真菌宿主細胞、例えばアスペルギルスにおいて達成される。以下の実施例中に詳細に記載するが、本ラッカーゼ遺伝子は、アスペルギルス・オリザエTAKA α−アミラーゼ・プロモーター、及びアスペルギルス・ニジュランスamd Ｓ選択マーカーを含むプラスミドにライゲートされる。あるいは、このamd Ｓは別々のプラスミド上にあることができ、そして同時形質転換において使用されることができる。プラスミド（単数又は複数）は、Yelton et al ．（PNAS USA 81：1470-1474，1984）中に記載された方法に従って、アスペルギルス種の宿主細胞、例えばA．oryzae又はA．nigenを形質転換するために使用される。当業者は、本発明が本明細書中、例えば図１と２に特に開示された核酸断片の使用に限定されないということを理解するであろう。本発明が、図１，２と３中に示すものと同一のアミノ酸配列をコードするが、その遺伝子コードの縮重のために特に示されたヌクレオチド配列と異なるようなヌクレオチド配列をも包含することは明らかであろう。さらに、本発明は他のヌクレオチド断片：及びそれによりコードされたタンパク質であって、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia s olani ）のものと実質的に同じ最適pHをもつラッカーゼ・タンパク質をコードし、そしてリゾクトニア・ソラニのアミノ酸配列とかなりのレベルの相同性を示すものをも包含する。例えば、本データは、１以上のリゾクトニア種が所望のpH特性をもつラッカーゼを生産することを示し；それ故、他のリゾクトニア種も類似のラッカーゼを生産し、そしてそれ故、本明細書中に記載した技術を使用して、請求に係る発明の範囲内で遺伝子の源として使用されることがでる。本実施例中にも示すように、必要な特徴をもつラッカーゼをコードする１以上のヌクレオチドとアミノ酸配列が存在するだけでなく、機能的な酵素を未だ生産しながらその配列内で耐えられるかなりの変更も存在する。それ故、本発明は、いずれかの変異体ヌクレオチド配列、及びそれによりコードされたタンパク質であって、図１，２と３に示すアミノ酸配列の中の１又は他のものと少なくとも約80％の相同性を保持し、そして本明細書中に記載する配列のラッカーゼと最適pH活性の両方を保持するものをも包含する。特に、リゾクトニア・ラッカーゼの高保存領域において高レベル（すなわち≧80％）の相同性を保持する変異体が企図される。このような領域は、RSLAC1内の残基458-469、及びRSLAC2 内の478-489；並びにRSLAC1内の残基131-144及びRSLAC2内の132-145として同定される。先に定められたカテゴリー内の有用な変異体は、例えばその内で保存的アミノ酸置換が行われ、その置換がそのタンパク質の活性に有意に影響を及ぼさないものを含む。保存的置換とは、同一クラスのアミノ酸がそのクラスのいずれかの他のものにより置換されることができるということを意味する。例えば、非極性脂肪族残基Hla，Val，Leu及びIleは互換性であり、同様に、塩基性残基LysとArg、又は酸性残基AspとGluもそうであることができる。同様に、SerとThrは互いに保存的置換であり、AsnとGluもそうである。このような置換がその分子の機能に決定的な領域の外で行われ、そして未だ活性な酵素をもたらすことができることは当業者に自明であろう。所望の活性の保持は、pH7.0における0.1Ｍリン酸ナトリウム中で標準的なABTS酸化法を行うことにより容易に測定されることができる。タンパク質は多数の工業的工程において使用されることができる；この酵素上、より低いpHにおいてある程度機能的であるけれども、R．solaniラッカーゼは中性又はアルカリ性pHにおいて通常行われる方法において最も有益に使用される。なぜなら、他のラッカーゼはこのpHレンジ内で活性ではないからである。これらの方法は、より高分子量のリグニンを作るために、溶液中での、リグニン、Kr aftとリグノスルフェートの両方の重合を含む。中性／アルカリ性ラッカーゼは、Kraftリグニンがより高いpHにおいてより安定性であるという点で特に有利である。このような方法は、例えば、Jin et al.，Holzforschung 45 （6）：467-468，1991；米国特許第4,432,921号；EP 0 275 544；PCT／DK93／00 217，1992中に記載されている。本発明に係るラッカーゼは、Kraftパルプ中のリグニンのその場の解重合、それによるより低いリグニン含量をもつパルプの製造のために使用されることもできる。ラッカーゼのこの使用は、製紙工場の環境的に不所望の副生成物である塩素化された芳香族化合物の生産を導くリグニンの解重合のための塩素の最近の使用についての改善である。このような使用は、例えば、Current opinion in Bio technology ３：261-266，1992，J．Biotechnol．25・333-339，1992；Hiroi e t al.，Svensk papperstidning ５：162-166，1976中に記載されている。製紙工場における環境は典型的にはアルカリ性であるので、本ラッカーゼは、酸性条件下で最良に働く他の公知のラッカーゼよりもこの目的により有用である。染料及び他の発色団化合物の酸化は、その化合物の変色を導く。布の間の染料の移りが不所望である状況、例えば繊維産業及び洗剤産業において特に有利であることができるラッカーゼが、上記目的のために使用されることができる。染料移り阻止及び染料酸化のための方法は、WO 92／01406，WO 92／18683，EP 04958 36とCalvo，Mededelingen van de Faculteit Landbouw-wetenschappen／Rijiksu niversitet Gent．56・1565-1567，1991中に見られることができる。本ラッカーゼは、リグニン中に存在するフェノール性化合物の重合のために使用されることもできる。このような用途の例は、ラッカーゼがそのジュース中に存在するフェノール性化合物の沈殿を加速し、それによりより安定性のジュースを作り出すであろうような、ジュース、例えばリンゴ・ジュースの処理である。このような用途は、Stutz，Fruit proce ssing７／93，248-252，1993；Maier et al.，Dt．Lebensmittel-rindschau 86 （5）：137-142,1990；Dietrich et al.，Fluss．Obst 57（2）：67-73，1990 中に記載されている。本発明を以下の非限定的実施例によりさらに説明する。実施例ポテト・デキストローズ寒天(Difco)上で培養したR．solaniの個々の単離物を、500ml振とうフラスコ中の100ml CFM（24.0ｇポテト・デキストロース・ブロス、3.0ｇ酵母エキス、1.0ml微量元素溶液〔0.80g KH₂PO₄，0.64g CuSO₄・5H₂O， 0.11ｇ FeSO₄・7H₂O，0.80ｇ MuCl₂・4H₂O，0.15ｇ ZnSO₄・7H₂O，1000mlまでの蒸留水〕、1000mlまでの蒸留水）に、活発に増殖するものを含む寒天小片を移すことにより、ラッカーゼ酵素発酵について調べる。インキュベーションを、軌道振とう機上200rpmにおいて室温において行った。サンプルを、50，74，122と170時間において収穫し、遠心分離し、そしてその透明上清を、そのABTS（ABTS＝2,2′−アジノビス（３エチルベンゾチアゾリン −６−スルホン酸）を用いてラッカーゼについて分析する。この分析を、0.1Ｍホスフェート・バッファーpH７中２mM ABTS 200μｌを添加し、そして室温（約 23−25℃）における30分間のインキュベーション後に418nmにおいて吸収における変化を観察することにより行う。この方法を、Puetter and Becker（Peroxida ses，In：Bergmeyer，H.U.Ced），Methods of Enzymatic Analysis，3rd ed.，V ol．III，pp-286-293，1983）により記載されたペルオキシダーゼ分析法から修飾する。 172時間目において収穫されたラッカーゼの各々を、電気泳動により分離し、そして発色団としてABTSを用いて染色する。いくつかの明確に区別できるパターンが現れる；株RS22は塩基性pIをもつラッカーゼを生産することが示され、そしてさらなる特徴付けのために選ばれる。ラッカーゼ活性は、シリンガルダジン（syringaldazine）法によっても測定されることができる。ラッカーゼは、黄色から紫色への色の変化を伴って、好気条件下、シリンガルダジンの、テトラメトキシ・アゾ・ビス−メチレン・キノンへの酸化を触媒する。pH5.5,30℃における（10mg／ｌの硫酸第２銅，5H₂Oを含む） 25mMアセテート・バッファー3000μｌを、１cmキュベット内で、225μｌ 0.28mM シリンガルダジン（５mgを25mlエタノール中で可溶化し、そして脱イオン水により50mlに調整したもの）と混合する。次にこの混合物を(吸光度（ΔOD）における増加が0.1〜0.6のレンジ内にあるようにアセテート・バッファー中で希釈された)100μｌのラッカーゼ希釈物と混合する。この反応混合物を30℃サーモスタット分光光度計内に置き、そしてその反応をラッカーゼの添加から10〜70秒間530n mにおいて追跡する。この酵素の活性を、△OD／分×0.677×希釈係数として計算し、そしてLACVとして表す。リゾクトニア・ラッカーゼの精製のために、2.1リッターの培養基であって0.1 9LACV／mlのLACV活性をもつものを10μｌフィルターを通して濾過し、そして10k Daのカットオフ値をもつFiltron Minisette OMEGA膜を使用した限外濾過により2 30mlに濃縮する。このサンプルのpHは5.3であり、その濃縮されたサンプルの活性は3.34LACV／mlと測定される。 pHを4.5に調整し、そして僅かな沈殿のための濾過の後、そのサンプルを、PH4.5における20mMアセテート・バッファー（バッファーＡ）により平衡化した40mlのS Sepharose Fast Flowカラムに適用する。このカラムをバッファーＡ中で洗浄し、そして１Ｍ NaClを含むバッファーＡにより溶出する。活性画分を集め、そしてプールする。この活性プールを濃縮し、そしてバッファーを、Diaflo YM10膜を備えたAmicon限外濾過ユニットを使用してバッファーＡに交換する。このサンプルを上記方法を使用して５ml S Sepharose High Performa nceカラム上で再びクロマトグラフィーにかける。但し、溶出を、バッファーＡから、0.5Ｍ NaClを含むバッファーＡへの30カラム容量にわたる線形グラジエントを用いて行う。最高活性を示すこの精製からの画分をプールする。約45mgのラッカーゼを、タンパク質濃度がA280nmにおいて１の吸収ユニットにより１mg／ mlと推定されるときに得る。このタンパク質は、SDS-PAGEにより判断されるとき＞90％の純度である。SDS-PAGEにより推定される分子量は約67kDaである。精製タンパク質の比活性は１ LACV／mgである。基質としてシリンガルダジンを使用して、精製されたタンパク質のpH特性を以下の表１に示す。このタンパク質の配列決定のために、ペプチドを、アクロモバクター（Achrom obacter ）からのリシン−特異的プロテアーゼ（Achromobacterプロテアーゼ１）又はバチルス・リケンホルミスからのグルタミン酸特異的プロテアーゼのいずれかを使用して作る。これらのペプチドを、0.1％水性TFA（溶媒Ａ）中に0.08％水性TFA（溶媒Ｂ）を含む80％スープロパノールの線形グラジエントを使用して逆相HPLCにより精製する。その無傷のタンパク質及び精製ペプチドのＮ−末端アミノ酸配列分析を、製造者の指示に従ってApplied Biosystems 473Ａタンパク質シーケンサー内で行う。単離されたタンパク質の最初の部分的配列決定は以下のＮ−末端配列をもたらす：このタンパク質を次に、リシン−又はグルタミン酸特異的プロテアーゼのいずれかにより消化し、そして以下の追加のペプチドを同定する。ペプチド１−４を、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）のラッカーゼにおける配列と並べられることができる：上記配列中Ｘは未同定の残基を示し、そしてＢはアスパラギン酸又はアスパラギンのいずれかである残基を表す。非−Rhizoctonia種から得られた真菌ラッカーゼの公知のアミノ酸配列（Choi et al.,前掲；German et al.，前掲；Saloheimo et al.，前掲；及びKojlma et al.,前掲）の研究を、それらの中のコンセンサス配列の存在を決定するために行う。高い同一性をもつ２つの領域、IHWHGFFQとTFWYHSHは、そのタンパク質のアミノ末端の１／３付近にある。これらのコンセンサス配列と対応 DNA配列に基づき、３つの縮重オリゴヌクレオチド、O-lac2〔TGG／AAAGACCATA／ GGTGTCG/AGTA／G〕、その相補物O-lac2r、及びO-lac3〔ATCCAT／CTGGCAT／CGGG ／CA／TTCTTCCAG／A〕を、Applied Biosystems 394 DNA／RNA合成装置を使用して合成する。この合成されたオリゴをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において使用して、ラッカーゼ遺伝子又はその断片についてリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solan i ）のゲノムDNAをスクリーンする。ゲノムDNAの増幅のために、0.5μｇのゲノム DNAを、〔10mM Tris-Cl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl,１mg／mlゼラチン；pH8.3〕中、１μＭの各プライマー、200μＭのdNTPs、及び１Ｖ taqポリメラーゼ(Boehrin ger Mannheim)とインキュベートする。これらの反応物を、95℃において１×５分間、30Ｘ〔95℃において１分間、50−60℃において１分間、72℃において１分間〕、そして72℃において１×５分間インキュベートする。このPCR反応は、220 ヌクレオチドのDNA断片を増幅する。このPCR生成物を、製造者の指示に従って、 TAクローニング・ベクター（InVitrogen Corp.）内にクローン化する。個々のクローンのDNA配列決定によるPCR生成物の特徴付けは、RSlac1とRSlac2と名付けられた２つの別個のラッカーゼ遺伝子を区別する。 R．solaniゲノム・ライブラリーを調製するために、R．solani DNAを、制限酵素Sau3Aにより部分消化し、そしてTris／アセテート／EDTAバッファー中0.8％ Sea Plaque Agarose（FMC Bioproducts）を通して電気泳動して、サイズ8.0と21kbの間のそれらのDNA断片を単離する。ゲル分画断片を製造者の指示に従ってBeta-Agarase(New England Biolabs)を用いてさらに精製し、そして次にBamHI末端をもつラムダ・ファージEMBL３アームにライゲートする。得られたファージを、GigapackIIパッケージング抽出物（Stratagene）を使用してインビトロにおいてパッケージングする。25mlのTB培地＋0.2％マルトースと10MgSO₄を、大腸菌（E．coli）K802(supＥ，hsdＲ，gal，metＢ）の一夜培養の50μｌアリコート内に接種し、そしてA600＝0.5まで振とうしながら37 ℃におていインキュベートする。パッケージングされたファージの１：10と１： 50希釈物25μｌを250μｌの上記K802細胞と混合し、そして37℃において20分間インキュベートする。各希釈物に、５μｌの、48℃において溶けた上部寒天を添加する。次にこの混合物を予熱したLBプレート上にプレートし、そして少なくとも12時間37℃においてインキュベートする。これらのファージから、大腸菌（E ．coli ）K802における170,000プラークのライブラリーを作り出し、そして将来の使用のために100倍に増幅する。このラッカーゼ遺伝子をスクリーニングするために、増幅されたゲノム・ライブラリーからの25,000プラークを慣用法を使用してプラーク・リフト（plaque l ifts）についてのNZY／アガロース・プレート上にプレートした。フィルターを、プローブとして５×10⁸Cpm／μｇにランダムに標識された220ヌクレオチドのP CR断片を使用してスクリーニングする。フィルターを50％ホルムアミド；６×SS C中で42℃において16時間ハイブリダイズし、そして0.5×SSC，0.1％ SDSにより 65℃において洗浄する。陽性クローンを慣用法を用いて拾い上げ、そして再スクリーニングする。同定された９つの陽性クローンは、DNA配列分析により２つの異なるラッカーゼ遺伝子、RSlac1 とRSlac2をコードすることが示される２つのクラスに分けられた。これらの遺伝子の各々の全体のヌクレオチド配列を、蛍光ヌクレオチド及びApplied Biosyste ms自動DNAシーケンサー(Model 363A，version 1．2．0)を使用して決定する。ヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を図１と２に示す。 RSlac3の単離のために、１mMアニシジン(anisidine)の存在中で増殖させたR． solani 菌糸体から精製されたポリＡ RNAを標準的なプロトコールを使用してcDNA の合成のための鋳型として使用する。このcDNAを0.8％アガロース・ゲルを通して電気泳動により分画し、そしてサイズ1.7と3.5kbの間のDNA断片を集める。次にライブラリーを、酵母発現ベクターpYES２内に上記サイズ分画されたcDNAをクローニングすることにより作る。このライブラリーからの3000の酵母形質転換体を２％グルコースを含むYNB（１リッター当り、アミノ酸を含まない1.7ｇ酵母ナイトロジェン・ベース、５ｇ(NH₄)₂SO₄）上に最初にプレートする。30℃において４日間増殖させた後、得られたコロニーを、0.1％グルコース、２％ガラクトース及び２mM ABTS〔2.2′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６ −スルホン酸）；Sigma # A-1888）〕を含むYNBにプレートする。30℃において2 4時間増殖させた後、単一コロニーは、段々に暗紫に変わる薄緑のハロー（halo ）をもつ。このコロニーからのプラスミドを単離し、そしてその挿入物を配列決定する。RSlac3遺伝子の翻訳された部分の配列とタンパク質を配列番号13と14、及び図４に示す。３．ラッカーゼ遺伝子の発現プラスミドpMWR-1は、上記TAKAアミラーゼ転写調節シグナルとTAKAアミラーゼ・シグナル配列を含むpVC誘導ベクターである。このプラスミドを、これらの２つの制限酵素が、フレーム内に、外来タンパク質を導入するために使用されることができるように、そのシグナル配列解裂部位におけるユニークSfiI部位、及び３′隣接NsiI部位を用いて遺伝子操作する。（上述のように行われるが鋳型として100μｇの適当な線状プラスミドDNAを用いた）PCR 反応及び突然変異源化したプライマーを使用して、SfiI部位を、そのタンパク質コーディング配列がそのTAKAシグナル配列と共にフレーム内にあるように、それぞれ、RSlac1とRSlac2のアミノ酸12とアミノ酸14において導入する。さらに、PC R増幅を、RSlac1の３′末端においてPstI部位（CTGCAG）を、そしてRSlac2の３ ′末端においてNsiI部位（ATGCAT）を導入するためにも使用する。形質転換体の調製のために、アスペルギルス・オリザエの細胞を16〜20時間10 〜120rpmを用いて34℃においてYPG（１ｇ／ｌ酵母エキス、0.25ｇ K₂PO₄，0.125 ｇ MgSO₄，3.75ｇグルコース）中で培養し、次にミラクロス(miracloth)による濾過により集める。細胞をMg溶液(0.6Ｍ MgSO₄・7H₂O)により洗浄し、次に２− ６ｇの細胞を10mlのMgP(1.2Ｍ MgSO₄・7H₂O，10mM NaH₂PO₄・2H₂O；pH5.8)中に溶かす。これに、１mlのNovozyme登録商標234(120mg／ml MgP)を添加し、そしてこのサンプルを５分間氷上に保つ。１mlのBSA（12mg／ml）を添加し、そしてそのサンプルを34−37℃において緩やかに振とうする。プロトプラストをミラクロスを通しての濾過により集め、そして５mlのST（0.6Ｍソルビトール、100mM Tri s；pH７）を重層する。サンプルを15分間2500rpmにおいて遠心し、そしてプロトプラストのバンドを集める。２容量のSTC(1.2Ｍソルビトール、10mMトリス、10m M CaCl₂・2H₂O；pH7.5)を添加し、そしてサンプルを５分間2500rpmにおいて遠心する。その沈殿物を５mlのSTCにより２回洗浄し、そしてそのプロトプラストを0 .5〜７mlのSTC中に懸濁する。この形質転換方法のために、プロトプラスト濃度を１−５×10⁷／mlに調整する。100μｌのプロトプラスト溶液に、10μｌのDNA溶液（５−10μｇのスーパーコイルDNA）と0.2mlのPEG(60％PEG 4000，10mM Tris，10mM CaCl₂ H₂O；pH7. 5)の混合物を添加し、そしてその組合せ物を十分に混合する。サンプルを室温において25分間保ち；次にそれに混合しながら最初に0.2ml PEGを、混合しながら0 .85ml PEGを添加する。この混合物を室温において20分間保ち、次に15分間4000r pmにおいて遠心する。この沈殿物を、10分間2500rpmにおける回転により２mlのS TCにより洗浄する。このプロトプラストを0.2−0.5mlのSTC中に再懸濁し、そして次にCOVEプレート上に拡げる。COVE培地（pH７）は、342.3ｇ／ｌのスクロース、25ｇ／ｌの寒天及び塩溶液であって26ｇ／ｌ KCl，26ｇ／ｌ MgSO₄・H₂O ，76ｇ／ｌ KH₂PO₄、及び50ml／ｌの微量金属を含んで成るものを含み；これらの微量金属は、40mg／ｌ NaB₄O₇・10H₂O，400mg／ｌ CuSO₄・5H₂O，1200mg／ｌ FeSO₄・7H₂O，700mg／ｌ MnSO₄・H₂O，800mg／ｌ Na₂MoO₂・2H₂O，10ｇ／ｌ ZnSO₄・7H₂Oである。オートクレーブ後、10ml／ｌの１Ｍ濾過アセトアミド及び５〜10mlの３Ｍ CsClをこの溶液に添加する。形質転換体を、炭素源としてアセトアミドを含むCOVE培地上での増殖細胞により選択する。サンプル中のラッカーゼ生産の確認を、pH５と7.3における、２mM ABTSを含むCOVE培地上での上述のようなABTS酸化法により決定する。RSlac1とRSlac2の両方がpH５とpH７においてラッカーゼ活性を発現し、これに反し、対照ラッカーゼは、pH7.3において実質的に全く活性を示さない。 RSlac1とRSlac2の各々の発現生成物を、基質としてシリンガルダジンを使用して各種pHにおいてオキシダーゼ活性についてテストする。検定を、４〜９のpHレンジにわたり、生来のタンパク質の検定について実質的に先に記載したように行う。図５と６に示すように、両ラッカーゼは、pH５を上廻るpHにおいて活性であり、そしてRSlac1は、６を上廻るpHにおいても特に良好な活性をもつ。活性のパターンは、一般的に、RS22から単離したRSlac3ラッカーゼについて観察されたものに匹敵し（上記表１参照）、RSlac1は、最も広いレンジの活性を示す。微生物材料の寄託以下の微生物材料を、Bakeham Lane，Egham，Surrey TW 20 GTYに在るthe Int ernational Mycological Institute，Genetic Resource Reference Collection に、ブダペスト条約の約定下に寄託し、そして以下の受託番号を得た。奇託物受託番号リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani） IMICC 358730RS22 以下の微生物材料を、the Agricultural Research Service Patent Culture C ollection，Northern Regional Research Center，1815 University Street，Pe oria，Illinois，61604に、ブダペスト条約の約定下に寄託し、そして以下の受託番号を得た。奇託物受託番号 α−アミラーゼ・シグナル配列に NRRL B-21141 融合されたRSlac1を含む大腸菌（E．coli）（EMCC 00844） SfiI部位挿入物をもつRSlac2 NRRL B-21142 を含む大腸菌（E．coli）（EMCC 00845） RSlac3を含む大腸菌（E．coli） NRRL B-21156 （EMCC 0088）

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月１６日【補正内容】請求の範囲１．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼをコードする核酸配列を含む核酸断片。２．リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ラッカーゼをコードする配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。３．配列番号：２に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。４．配列番号：４に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。５．配列番号：５，６，７，８，９，10，11、又は12に表すアミノ酸配列の中の１以上を含むタンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。６．配列番号：14に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。７．配列番号：１に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。８．配列番号：３に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。９．配列番号：13に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 10．NRRL B-21141内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 11．NRRL B-21142内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 12．RS 22により作られるラッカーゼをコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 13．NRRL B-21156内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 14．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働く実質的に純粋なリゾクトニア（Rh izoctonia ）ラッカーゼ酵素。 15．リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ラッカーゼである、請求項14に記載の酵素。 16．配列番号：２に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 17．配列番号：４に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 18．配列番号：５，６，７，８，９，10，11又は12に表すペプチド配列の中の１以上、又はこれらのペプチドの中の１以上に対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 19．配列番号：14に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 20．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア・ラッカーゼをコードする核酸配列を含む核酸断片を含んで成る組換えベクター。 21．断片がプロモーター配列に連結されている、請求項20に記載のベクター。 22．プロモーターが、真菌又は酵母プロモーターである、請求項21に記載のベクター。 23．プロモーターが、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のT AKAアミラーゼ・プロモーターである、請求項22に記載のベクター。 24．プロモーターが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）又はアスペルギルス・アワムシ（Aspergillus awamsii）のグルコアミラーゼ(glu A)プロモーターである、請求項22に記載のベクター。 25．選択マーカーを含んで成る、請求項21に記載のベクター。 26．選択マーカーが、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulan s ）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のamd Sマーカーである、請求項25に記載のベクター。 27．選択マーカーが、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulan s ）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamorii）、又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のpyr Gマーカーである、請求項25に記載のベクター。 28．アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のTAKAアミラーゼ・プロモーターと、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のamd S又はpyr Gマーカーの、両方を含んで成る、請求項21に記載のベクター。 29．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼをコードする核酸配列を含む異種核酸断片を含んで成る宿主細胞。 30．真菌細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。 31．アスペルギルス（Aspergillus）細胞である、請求項30に記載の宿主細胞。 32．断片が宿主細胞ゲノム内に組み込まれている、請求項29に記載の宿主細胞。 33．断片がベクター上に含まれる、請求項29に記載の宿主細胞。 34．配列番号：２に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 35．配列番号：４に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 36．配列番号：14に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 37．配列番号：５，６，７，８，９，10，11、又は12に表すアミノ酸配列の中の１以上をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 38．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くラッカーゼ酵素の獲得方法であって、その酵素の発現を誘導する条件下、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼ酵素をコードする核酸配列を含む核酸断片を含んで成る宿主細胞を培養し、そしてそのカルチャーからその酵素を回収することを含んで成る方法。 39．溶液中でリグニン（lignin）又はリグノスルフェート（lignosulfate）基質を解重合する方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとその基質を接触させることを含んで成る方法。 40．Kraftパルプにおけるその場の（in sita）解重合のための方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとそのパルプを接触させることを含んで成る方法。 41．染料を酸化する方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとその染料を接触させることを含んで成る方法。 42．フェノール性化合物を重合させる方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとそのフェノール性化合物を接触させることを含んで成る方法。 43．請求項38に記載の方法により、作られた、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働く組換えリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＤ２１Ｃ 9/10 7633−3ＢＤ２１Ｃ 9/10 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (31)優先権主張番号０８／１６２，８２７ (32)優先日 1993年12月３日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／１７２，３３１ (32)優先日 1993年12月22日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クリステンセン，ビョルンエッゲルトデンマーク国，デーコー―2840 ホルテ, ドロンニングガールズアー11 32 (72)発明者シュナイデル，パレデンマーク国，デーコー―2750 バレルップ，リュドトフテン 43

Claims

【特許請求の範囲】１．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼをコードする核酸配列を含む核酸断片。２．リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ラッカーゼをコードする配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。３．配列番号：２に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。４．配列番号：４に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。５．配列番号：５，６，７，８，９，10，11、又は12に表すアミノ酸配列の中の１以上を含むタンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。６．配列番号：14に表すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。７．配列番号：１に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。８．配列番号：３に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。９．配列番号：13に表す核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 10．NRRL B-21141内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 11．NRRL B-21142内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 12．RS 22により作られるラッカーゼをコードする核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 13．NRRL B-21156内に含まれる核酸配列を含んで成る、請求項１に記載の断片。 14．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働く実質的に純粋なリゾクトニア（Rh izoctonia ）ラッカーゼ酵素。 15．リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ラッカーゼである、請求項14に記載の酵素。 16．配列番号：２に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 17．配列番号：４に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 18．配列番号：５，６，７，８，９，10，11又は12に表すペプチド配列の中の１以上、又はこれらのペプチドの中の１以上に対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 19．配列番号：14に表す配列、又はそれに対する少なくとも80％の相同性をもつ配列を含んで成る、請求項14に記載の酵素。 20．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア・ラッカーゼをコードする核酸配列を含む核酸断片を含んで成る組換えベクター。 21．断片がプロモーター配列に連結されている、請求項20に記載のベクター。 22．プロモーターが、真菌又は酵母プロモーターである、請求項21に記載のベクター。 23．プロモーターが、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のT AKAアミラーゼ・プロモーターである、請求項22に記載のベクター。 24．プロモーターが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）又はアスペルギルス・アワムシ（Aspergillus awamsii）のグルコアミラーゼ(glu A)プロモーターである、請求項22に記載のベクター。 25．選択マーカーを含んで成る、請求項21に記載のベクター。 26．選択マーカーが、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulan s ）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のamd Sマーカーである、請求項25に記載のベクター。 27．選択マーカーが、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulan s ）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamorii）、又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のpyr Gマーカーである、請求項25に記載のベクター。 28．アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のTAKAアミラーゼ・プロモーターと、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のamd S又はpyr Gマーカーの、両方を含んで成る、請求項21に記載のベクター。 29．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼをコードする核酸配列を含む異種核酸断片を含んで成る宿主細胞。 30．真菌細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。 31．アスペルギルス（Aspergillus）細胞である、請求項30に記載の宿主細胞。 32．断片が宿主細胞ゲノム内に組み込まれている、請求項29に記載の宿主細胞。 33．断片がベクター上に含まれる、請求項29に記載の宿主細胞。 34．配列番号：２に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 35．配列番号：４に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 36．配列番号：14に表すアミノ酸配列をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 37．配列番号：５，６，７，８，９，10，11、又は12に表すアミノ酸配列の中の１以上をコードする配列を含む断片を含んで成る、請求項29に記載の宿主細胞。 38．約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くラッカーゼ酵素の獲得方法であって、その酵素の発現を誘導する条件下、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼ酵素をコードする核酸配列を含む核酸断片を含んで成る宿主細胞を培養し、そしてそのカルチャーからその酵素を回収することを含んで成る方法。 39．溶液中でリグニン（lignin）又はリグノスルフェート（lignosulfate）基質を解重合する方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとその基質を接触させることを含んで成る方法。 40．Kraftパルプにおけるその場の（in sita）解重合のための方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとそのパルプを接触させることを含んで成る方法。 41．染料を酸化する方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとその染料を接触させることを含んで成る方法。 42．フェノール性化合物を重合させる方法であって、約6.0と8.5の間のpHにおいて最適に働くリゾクトニア（Rhizoctonia）ラッカーゼとそのフェノール性化合物を接触させることを含んで成る方法。