CN100510064C

CN100510064C - 新漆酶和编码该酶的基因

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Publication number: CN100510064C
Application number: CNB018099149A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂纳·克鲁斯; 劳拉-莱纳·基斯基宁; 玛丽亚阿娜·雷特; 利萨·维卡里; 马尔库·萨洛黑莫
Original assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Current assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: FI20001240A; FI113879B; JP2003534795A; US20050089980A1; EP1294859B1; DE60128091D1; CA2409007A1; DE60128091T2; HK1054573A1; ES2284650T3; AU2001262389A1; MXPA02011572A; US7183090B2; ATE360684T1; BR0111040A; DK1294859T3; WO2001092498A1; EP1294859A1; CN1430668A; CA2409007C

Abstract

本发明涉及一种新的漆酶，其分离有Melanocarpus genus的菌株，特别是M.albomyces菌株。此酶的最适pH值是在5-8之间，且在30-80℃的温度下起作用。由等电聚焦测定此酶的等电点大约是在4.0，由SDS-PAGE测定其分子量约为80kDa。此酶尤其适于pH和温度条件都高的情况下的应用。本发明还涉及编码漆酶的基因以及通过重组技术生产的漆酶。

Description

新漆酶和编码该酶的基因

本发明涉及新的漆酶。本发明的目的具体是提供新的漆酶、酶制剂以及编码该酶的基因。本发明的另一目的是漆酶用于各种应用中。

漆酶(EC 1.10.3.2)属于蓝铜氧化酶。根据定义，漆酶是对二酚氧化酶。除联苯酚外，漆酶氧化许多其它底物，例如甲氧基取代的酚和二胺。关于它们的底物，漆酶是惊人的不确定。即由于它们广泛的底物特异性，且另一方面，由于它们氧化酚类化合物的能力，漆酶在工业应用中激起极大的兴趣。前途有望的漆酶应用领域包括，例如，森林工业中的脱木质化作用和纤维板黏结，纺织工业中的织物染色和染坊废水的解毒，也同样应用于不同的生物传感器中。在介质即中间分子的帮助下，漆酶也氧化那些它们否则将不能氧化的底物。这些介质是被漆酶氧化的小分子化合物。这些被氧化的介质反过来氧化那些真正的底物。

第一种漆酶是早于1883年在日本漆树(Rhus vernicifera)中发现的。漆酶在许多植物中被发现，例如桃树、西红柿、芒果和马铃薯；漆酶也在某些昆虫中被发现。然而，大部分已知的漆酶源自白色的霉菌。例如下列属产生漆酶：蘑菇属、曲霉属、齿毛菌属(Cerrena)、弯孢霉属、镰刀菌属、Lentinius，Monocillium，Myceliophtora，链孢菌属，青霉菌属，白腐菌属Phanerochaete、Phlebia、侧耳属真菌菇(Pleurotus)、Podospora、裂褶菌属、孢子丝菌属，壳多孢属(Stagonospora)和采绒革盖菌属(Trametes)。在自然界中，漆酶的作用涉及木质纤维素的分解、细胞壁的生物合成、水果和蔬菜的褐变反应以及在预防微生物对植物的攻击等。

许多真菌的漆酶已经被分离出来，编码它们的某些基因已被克隆。例如，Saloheimo等(1985)分离并鉴定Phlebia radiata的漆酶基因的特性，而Kojima等(1990)从白霉菌属中分离了Coriolus hirsutus的漆酶基因，以Berka等(1997)在WO 95/33836报道分离了Myceliophtora thermophila漆酶的基因。漆酶的天然生产水平经常是很低的。通过在外源生产宿主中表达漆酶基因来改善生产已作了很大的努力。例如，Saloheimo和Niku-Paavola(1991；WO92/01046)成功地在reesei木霉真菌中生产了Phlebia radiata漆酶。漆酶也已在米曲霉(Aspergillus oryzae)真菌(Yaver等，1996，Berka等，1997和WO95/33836)和毕赤酵母(Pichia pastoris yeast)(Jonsson等，1997)中异源地被生产出来。

源于鬼伞属的漆酶在曲霉属真菌类的表达描述在专利公布WO97/08325中。相类似，源于Polyporus pinsitus的种的漆酶和源于柱霉属的漆酶在曲霉属真菌中的表达在专利公布US5,770,418和US5,843,745中分别被描述。

分离自各种生物体的漆酶其温度和pH特性各有不同。它们也依赖于所应用的底物。由于大多数的漆酶已知在酸性pH和相当低的温度下功能最佳，它们的特性对于应用不是最佳的。某些热稳定或者中性的漆酶已有报道，但是通常，热稳定或者中性的漆酶或是热稳定的中是中性的，不会二者兼而有之。例如，Heinzkill等(1998)从鬼伞科属(Coprinaceae genus)的真菌中发现漆酶具有异常高的最适pH值。然而，60℃下60分钟后，发现所有漆酶的活性从开始水平降至30％以下。已申请一项专利(WO96/06930)将这些漆酶在漂白纺织的染料中，但是这项应用没有提及高温下这些漆酶的活性。此申请的实施例在30-35℃温度下进行。专利申请WO95/07988描述了源于立枯丝核菌属真菌的一种天然漆酶，但是该申请除了碱性条件外没有研究这种漆酶在高温下的适用性。另一方面，专利申请WO98/55628描述了一种源于采绒革盖菌(云芝)(Trametes versicolor)TV-1菌株的热稳定的漆酶，但是根据这项专利，该漆酶的活性在pH2时是最佳的。采绒革盖菌(云芝)(Trametes versicolor)TV-1漆酶也不是pH稳定的，在pH6下孵育60分钟后其残留活性大约是起初的60％。专利申请WO95/33836描述了中性的Myceliophtora thermophila漆酶，它在头发染色中于pH7下起作用，但是该申请实施例中的温度是30℃。Berka等(1997)出版报道了Myceliophtora thermophila漆酶在60℃下保留100％的活性达20分钟，且其最佳活性是在pH6.5下。

专利公布JP8070861和JP9056378详细描述了Trametes漆酶，它们曾被报道是耐热的以及它们的最适pH已报道是5.0。此外，Diamantidis等(2000)已鉴定了源于Azospirillum lipoferum细菌的细菌漆酶的特性。他们报道该漆酶在70℃下有10分钟是耐热的并且其最适pH是6.0。

Bharathi和Ramalingam(1993)的公布描述了一种蛤蜊的酚氧化酶，它的最高活性在pH6.8下并且当在60℃下孵化10分钟时仍保留50％以上的活性。专利公布EP-A1-0852260描述了源于漆斑菌属的种的多酚氧化酶，它们的最适pH值是8.5-9且最适温度是在60-70℃之间。众所周知，漆斑菌属的真菌产生毒素。

当对各种酶所指定的最适温度和pH值进行比较时，应注意到，所用的底物对值是有影响的。酚类底物，例如愈创木酚和syringaldazine，较非酚类底物如ABTS提供了更高的价值。

下述的专利公布提示漆酶在木材加工应用中的用途：WO9954545，US 5,691,193，DE 4137761，EP 408803和WO 9523232。

本发明的目的是消除涉及现有技术的缺点，并且提供一种相当新的含有漆酶活性的酶制剂。尤其是，该酶制剂能用于要求耐受高温和高pH的应用中。例如，在木材加工工业和其它加工工业中就有这些应用。

本发明介绍一种新的漆酶，相对于在要求中性或者碱性pH值和超过40℃的温度的应用中的已知漆酶，它同时具有较好的温度和pH特性，且特别是其耐热稳定性。

为了更加精确，本发明的目的是权利要求1中所指定的漆酶。

根据本发明该漆酶能从Melanocarpus属的菌株中分离出来。就我们所知，从Melanocarpus属菌株分离出的漆酶在此之前还没有被详细描述过。根据本发明所述的漆酶能优选地从M.albomyces种的菌株，尤其是从IMI 255989菌株中分离出来，其样品可从CABI生物科学英国中心CABI GRC菌种保藏处(Egham)(Bakeham Lane EghamSurrey DW20 9Ty，UK)免费获得。该菌株于1981年保藏在保藏中心。在1996年，该菌株也被保藏在VTT生物技术培养物保藏中心(芬兰VTT技术研究中心，地址：VTT Biotekniikka，PL1500，02044VTT，Espoo，Finland)，保藏编号为VTT-D-96490。此保藏样品也可免费获得。这个菌株在出版物Ravanko(1996)中描述，它研究了在各种各样的温度和PH值下该菌株培养液的漆酶活性。然而，该出版物没有描述此漆酶的分离和提纯。

根据本发明所述的漆酶大约在pH3-9在之间起作用，优选4-8之间，更优选5-8之间，甚至更优选6-8之间，最优选6.5-7.5之间。该漆酶活性在pH7-8最高，最高在约7.5。因此，此酶的最适pH值范围十分广，且范围在pH5-7.5之间；优选的最适pH是7.5。此酶的活性在30-80℃之间达最高，优选40-80℃之间，更优选50-80℃之间，甚至更优选60-80℃之间，最优选60-70℃之间。此酶的最佳活性出现在大约70℃的温度。根据本发明所述的漆酶在高温下可很好地保留其活性。在实施例3所述的条件下，其培养液中的该漆酶在60℃下孵育1小时后仍保留50％以上的活性。在70℃下孵育15分钟后，该酶保留约30％的活性，以及在70℃下孵育30分钟后，保留约10％的活性。80℃时，在实施例3所述的条件下该酶经得起孵育约5分钟。在某些应用中，例如，在森林工业中，即使一段短时间内的高温耐受也提供相当大的好处。当进一步研究纯酶的活性时，发现此酶的热稳定性是异常地好，且无疑地好于先前所描述的漆酶的热稳定性。在60℃下，此酶保留其活性基本上2小时无改变，正如实施例3和图7所显示。由Berka等(1997)鉴定特征的Myceliophtora漆酶的热稳定性在60℃下只保留20分钟。

此外，当pH值增加时，根据本发明所述的漆酶的pH稳定性有所改善。在pH4下孵育22小时后，其残留活性为65％，在pH5下的同等条件中其残留活性大约为80％，在pH6下其残留活性大约为85％，在pH7下其残留活性约为90％，以及在pH8时超过90％，约为92％。与最适pH值一起，此特性使得它有益于在高pH值下应用根据本发明所述的酶。

本发明所述的漆酶当等电聚焦测量时其等电点大约是4.0，由此精确度大约为±0.5。

当用SDS-PAGE来确定时，根据本发明所述的漆酶的分子量大约是80kDa。SDS-PAGE精确度在±5kDa范围内。

本发明的目的具体是漆酶，当它被提纯时，等电聚焦测量其等电点约为4.0，以及分子量约为80kDa。而当以提纯的酶来测量时此漆酶的最适pH约是7.5，以及最适温度约是70℃。此漆酶可分离自Melanocarpus属的菌株，优选分离自Melanocarpus albomyces属的菌株，最优选分离自M.albomyces IMI 25598菌株。本发明的另一目的是分离并纯化的漆酶。

本发明进一步目的是含有根据本发明所述的漆酶的酶制剂。此酶制剂中漆酶的含量优选高于Melanocarpus属的菌株尤其是Melanocarpus albomyces种的菌株中的含量，特别是由M.albomycesIMI 255989菌株在生长条件中其培养液里天然产生的酶含量，这些生长条件对于生产漆酶不是最优化的。此酶制剂中漆酶的含量优选高于10mg/l，更优选≥30mg/l，甚至更优选≥300mg/l，仍然甚至更优选≥500mg/l；最优选≥1g/l。

如上所述，根据本发明所述的漆酶可分离自Melanocarpus属的菌株，特别是分离自Melanocarpus albomyces种的菌株，尤其是分离自M.albomyces IMI 255989菌株，但是它也能通过分离编码根据本发明所述的漆酶的基因并将它们转移入合适的生产宿主以重组技术来进行生产。

根据本发明所述的漆酶可在其天然宿主或生产宿主的培养液中生产，从这些宿主中通过运用已知的蛋白化学方法它能被分离和提纯。如果此培养液含有足够高含量的漆酶，而且没有其它有害的蛋白质，则此培养液通过简单的分离细胞就可被如此使用。此培养液可能被浓缩。在不同的应用中，优选使用包含含量增加的漆酶的酶制剂。漆酶增加的含量通过在生产宿主的培养液中以重组技术方法能被制备。此增加的含量参考漆酶含量，其超过Melanocarpus属的菌株，特别是Melanocarpus albomyces属的菌株，尤其是IMI 255989菌株天然生产的漆酶含量。

本发明另外的目的是含有必需含量的根据本发明所述的漆酶的酶制剂。这意味着此漆酶是没有任何相当含量的其它酶的酶制剂的主要活性。本发明另外的目的物也是一种酶制剂，它含有可从Melanocarpus属的真菌中分离的漆酶，和各自应用所需的添加剂。这些添加剂能包含，例如，缓冲剂和稳定剂。

本发明的目的也是编码漆酶的核酸分子。此核酸分子选自：

一种核酸分子，其包含如SEQ ID NO：1或图15中所描述的核苷酸序列的编码区；

一种核酸分子，其编码含有如SEQ ID NO：2或图15中所描述的氨基酸序列的多肽；

-一种核酸分子，其包含由于遗传密码的简并性而区别于SEQ IDNO：1或图15中所描述的核苷酸序列的编码序列；

一种核酸分子，其与SEQ ID NO：1或图15的核苷酸序列杂交；

一种核酸分子，其编码多肽，所述多肽具有漆酶活性以及其氨基酸序列与SEQ ID NO：2或图15的氨基酸序列比较显示至少73％的同一性。

本发明也包括了编码多肽的核酸分子，其氨基酸序列与SEQ IDNO：2或者图15的氨基酸序列比较显示至少75％的同一性，优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，甚至更优选至少90％的同一性，最优选至少95％的同一性。如果根据本发明所述多肽的氨基酸序列与ID NO：2或图15的氨基酸序列比较显示至少99％的同一性，这是最优选的。如果相似性在同源氨基酸基础上被评估，本发明包括了核酸分子，其编码多肽，所述多肽的氨基酸序列至少83％同源于SEQID NO：2或者图15的氨基酸序列，优选至少85％同源，更优选至少90％同源，甚至更优选至少95％，最优选至少99％同源于SEQ ID NO：2或者图15的氨基酸序列。

此发明也包括了核酸分子，其在杂交条件下与序列SEQ ID NO：1杂交，其中杂交溶液含有6XSSC、5X Denhadt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性DNA，并且杂交在50-60℃下进行。另一选择方法是杂交溶液含有6XSSC、5X Denhadt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性DNA、50％甲酰胺，在此情况下，在25-35℃下实施杂交。此发明尤其包括了那些核酸分子，其在严格条件下与SEQ ID NO：1序列杂交，由此根据第一种选择方法进行杂交，否则在同等条件，但是在68℃下杂交，以及根据第二种选择方法，在42℃杂交。5X Denhadt是10g/l菲科尔、10g/l聚乙烯吡咯烷酮、10g/l牛血清白蛋白和SSC是0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠盐、pH7.0。

核酸分子涉及DNA、RNA或者例如cDNA。

本发明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定义的核酸分子所编码。本发明进一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式与SEQ IDNO：2或者图15的氨基酸序列是相同或者同源的。

本发明也涉及生产漆酶的方法，其包含以下步骤：

-将根据此发明所述的核酸分子或者载体转移到微生物宿主细胞中以表达核酸分子和任选地从宿主细胞中分泌所表达的肽；以及

-具有漆酶活性的多肽或从微生物宿主的细胞或从微生物宿主的培养液中回收。

根据本发明所述的漆酶格外适合于工业应用，在其中占优势的pH和温度条件是高的。这些应用包括森林工业，其影响木质素或者提取物(或直接地或通过介质)，从机械磨碎的含木质素的纤维中的制造纤维产品和木板，造纸机器运行性能的改善和其它应用，聚合物的氧化，例如木质素、纤维素和或者淀粉(或直接地或通过介质)，以及其它化学品的氧化，例如烯烃或者有色分子。在这些应用中，温度经常高于60℃，一般高至80℃，且pH值接近于中性或者稍高些。根据本发明所述的漆酶在pH值和温度都同时相当高的条件下作用极好。

以下，在附图和实施例的帮助下将详细描述本发明。

图1显示摇瓶培养中M.albomyces漆酶的生产。

图2显示在阴离子交换层析中各种馏分的漆酶活性和蛋白质含量。

图3显示在疏水作用层析中各种馏分的漆酶活性和蛋白质含量。

图4显示M.albomyces漆酶活性对温度的依赖性。

图5显示M.albomyces漆酶在各种pH值下的活性。

图6显示M.albomyces漆酶在各种温度下的残留活性。

图7显示纯的M.albomyces漆酶在各种温度下的残留活性。

图8显示M.albomyces漆酶在各种pH值下经22小时孵育后的残留活性。

图9显示40℃时在各种pH值下M.albomyces和T.hirsuta漆酶从2，6-二甲氧基酚中形成颜色的能力。漆酶含量是15nkat/mmol底物。

图10显示60℃时在各种pH值下M.albomyces和T.hirsuta漆酶从2，6-二氧基酚中形成颜色的能力。漆酶含量是30nkat/mmol底物。

图11显示在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下织物染色的脱色作用。

图12显示40℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下木质素标准物质的聚合作用。

图13显示于60℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下木质素标准物质的聚合作用。

图14显示于70℃在Melanocarpus和T.hirsuta漆酶的作用下源自木质素和提取物的可溶性化合物的聚合作用。

图15显示编码Melanocarpus albomyces漆酶的基因和对应的氨基酸序列。

用于此申请的术语“酶制剂”指的是包含漆酶活性的任何产品。酶制剂能是，例如，包含漆酶的培养液、分离的漆酶或者酶混合物，其中至少一种成分是漆酶。酶制剂也可包含各种添加剂，例如稳定剂或者缓冲剂。它们被挑选是为了适合于漆酶制剂的各自应用。酶制剂也能包含其它的酶活性，例如过氧化物酶活性，这取决于酶制剂的应用。

含有漆酶的酶制剂也能包含合适的介质，它被用于增强漆酶的作用。合适的介质包括，例如，Tempo(＝2，2，6，6-四甲基-1-呱啶基氧)、HBT(1-羟基苯并三唑)、ABTS＝2，2’-连氮基双-3-乙基苯基噻唑-6-磺酸酯、紫尿酸)、NHA(＝N-羟基-乙酰苯胺)。

生产漆酶的微生物的筛选

生产漆酶的微生物能从自然界中分离出来或者通过微生物学中熟知的筛选方法从已分离且鉴定的培养收集的菌株中筛选。由于漆酶属于酚氧化酶，那些适于筛选酚氧化酶的方法用于筛选中。或在平板培养的固体培养上或在液体培养基中通过测量酶活性研究酶的产生从而进行筛选。

在寻找较大多数已知的漆酶耐受更高的温度和pH的新漆酶时，从环境中筛选微生物是值得的，其中它们生活在温暖和/或碱性条件下。这样的环境被发现，例如，在堆肥、木屑堆或者热带地区。

通过在菌丝顶端添加酚氧化酶的底物，在平板中可对在筛选中所发现的阳性真菌酚氧化酶的生产进行研究。通过应用这些点滴测定，可发现平板上的阳性反应是否是酚氧化酶或漆酶引起的。合适的试剂包括ABTS、syringaldazine和愈创木酚，且在观察的过氧化物酶、过氧化氢。

将产生酚氧化酶且作为筛选结果而被发现的微生物在合适的培养基中培养，在培养液中酚氧化酶的形成由适于测量酚氧化酶活性的方法来观测。对真菌合适的培养基包括，例如，麦芽提取物和马铃薯葡萄糖培养基，以及用来测量活性的合适底物包括ABTS、愈创木酚和syringaldazine。对于许多真菌，酚氧化酶的产生要求诱导剂。这些诱导剂包括，例如，芳香族化合物、含有木质素的材料、表面活性剂、某些碳源和硫酸铜。漆酶活性能通过采用ABTS作为底物被测量，漆酶将它氧化为暗绿色。此测量可根据Niku-Paavola等(1988)的方法来实施。漆酶活性也可根据Paszczynnski等(1985)的方法通过使用愈创木酚来测定。

在足量的目的漆酶被生产出后，此酶被纯化且它的特性被鉴定出来。此酶的温度和pH值以及等电点能被确定。

漆酶生产者也能通过漆酶基因序列的同源性来筛选。如果是那样的话，基于漆酶基因氨基端的保守区域的核苷酸能作为引物用于PCR中，然后例如在各种真菌基因组中寻找基因序列，这些基因序列与已知漆酶同源。

漆酶活性在不同温度下的确定能通过ABTS方法来完成，如实施例1中所述。在不同的pH值下和合适的缓冲剂中此漆酶的最适pH值能通过愈创木酚方法来确定。当pH值超过7时，在活性分析中ABTS的作用变弱。

其热稳定性能通过在不同温度、确定的pH值和适宜的缓冲剂下孵育酶样品来确定。各温度下此酶残留活性能通过、例如、ABTS方法来解释。

在不同的pH值下和合适的缓冲剂中其pH稳定性能通过孵育酶样品来确定。其残留活性能通过例如ABTS方法来确定。

漆酶的分离和纯化

此酶能通过应用常规的酶化学方法来提纯，例如盐析、超滤、离子交换层析法和疏水作用层析法。提纯能通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测。可在不同温度和pH值下对纯化的酶活性进行测定；同样，可对分子量和等电点进行测定。

在本发明的实施例中，漆酶生产被描述成在丰富培养基上培养Melanocarpus albomyces菌株。在培养期间，根据Niku-Paavola等(1988)的ABTS方法基于在漆酶作用下从ABTS中生成暗绿色阳离子自由基对漆酶活性进行监控。然而，本发明不仅限于在这种培养基上产生的M.albomyces漆酶。

M.albomyces漆酶的纯化来自培养液，来自通过过滤或离心除去细胞的培养液。采用超滤使培养液进一步浓缩。阴离子交换层析法和疏水作用层析法被用于进一步提纯。超滤中的截留分子量值大约是30kDa。阴离子交换层析法在pH5乙酸盐缓冲液中完成，并用递增的线性梯度的硫酸钠从柱中将该漆酶洗脱出来。离子交换后最佳的馏分通过疏水作用层析在pH5乙酸盐缓冲液中进一步被提纯。样品在0.7M硫酸钠浓度下结合并用递减的线性梯度的硫酸钠洗脱。

然而，通过使用其它已知的提纯方法分离此酶也是可能的。

提纯的M.albomyces漆酶的分子大小、等电点以及pH和温度分布图被确定。

提纯的酶指的是酶制剂，其除漆酶带外没有其它的蛋白质，其可被观察，如通过SDS-PAGE和考马斯染色法所确定。在此申请中，酶通过超滤法、阴离子交换层析法和疏水作用层析法被提纯。基本上不含有其它蛋白质的所获得的漆酶纯度是≥90％。

提纯的M.albomyces漆酶的分子大小是80kDa，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确定。在采用Multiphor II电泳设备(Pharmacia LKB)的等电聚焦中，等电点确定为4.0。M.albomyces漆酶的活性在温度70℃时最高和其最适pH是7.5。经60℃下孵育两小时后，M.albomyces漆酶仍保留100％的活性。而且，当pH值增加时，它的pH稳定性有所改善。

漆酶的生产

根据本发明所述的漆酶能在其天然宿主或生产宿主的培养液里被生产出来，从该培养液中通过应用已知蛋白质化学方法可将它分离和提纯。如果培养液含有足够高含量的漆酶而不含其它的有害蛋白质，通过简单分离细胞就应用此培养液也是可能的。当需要如此时，可将培养液浓缩和/或提纯。在不同的应用中，利用含有含量增加的漆酶的酶制剂是更可取的。这样的酶制剂的制备方法是以基因技术的方法从生产宿主的培养液中生产含量增加的漆酶。此增加的含量指的是漆酶的含量，它超过了由M.albomyces菌株特别是菌株IMI 255989天然生产的漆酶含量。

根据本发明所述的漆酶也能采用重组技术通过分离编码根据本发明所述的漆酶的基因并将它们转移到合适的生产宿主中来进行生产。该编码漆酶的基因能从cDNA文库中以下列任何方式分离。此cDNA文库可在合适的酵母表达载体中构建并且转化到例如酿酒酵母中。生产漆酶的克隆例如根据通过应用包含ABTS底物的平板而测定的活性被鉴定。另一可能性是将cDNA文库连接到λZAP载体上并感染带有获得的生产库的大肠杆菌细胞。编码漆酶的克隆或在多克隆抗体或在DNA杂交的帮助下被确认。如果使用多克隆抗体，它们被生产以抗例如兔中提纯的漆酶蛋白。在杂交中，由PCR提供的漆酶基因片段作为一种探针应用。如果是那样的话，PCR引物序列或以漆酶基因中一般保守的区域(例如，与活性中心的氨基酸相对应的区域)为基础或以提纯的漆酶蛋白质或内肽的氨基末端的序列为基础。此外，与各信使RNA尾部的多腺嘌呤区域结合的oligodT区域能作为PCR引物而应用。

分离的漆酶cDNA被测序。分离的cDNA和分离的酶之间的关系通过氨基酸测序能被确定，该氨基酸序列是由酶形成的。漆酶基因的染色体拷贝或能通过PCR分离或能从λ载体中的基因组文库中被分离，且内含子的定位能通过测序被建立。

M.albomyces漆酶基因的分离

根据信使RNA和cDNA文库，M.albomyces漆酶基因的分离是不可能的。创建由代表性的cDNA文库不是成功的。令人惊奇地是由M.albomyces在培养晚期生产漆酶的事实引出问题，当许多细胞早已自溶，以及信使RNA部分降解时，则分离纯的RNA是困难的。因此，代替此cDNA文库，基因不得不从基因组基因库中分离。基因的分离在实施例9中有详细描述。

漆酶基因序列在图15和序列表(SEQ ID NO：1)中显示。基因的长度是2279bp，包括内含子。如图15所示，开始编码区的碱基数是286，其内含子位于第541-618、第698-770、第783-869、第1913-1999和第2069-2150。最终编码碱基是第2561。

该基因编码长度为623个氨基酸的多肽。当采用Blast方法(Altschul等，1990)将该氨基酸序列与在专利申请WO 9533836中公开的Myceliophtora的氨基酸序列进行比较时，发现氨基酸序列72％是完全一致的(同一性450/623，72％)，并且82％是同源的(阳性518/623，82％；阳性指的是同源性氨基酸)，(间隙＝4/623，0％)。

当对Podospora anserina漆酶进行相应比较时(Fernandez-Larrea和Stahl，1996)，发现其序列68％是完全一致的(一致性427/627，68％)，并且79％是同源的(阳性502/627，79％)(间隙＝12/627，1％)。

分离的漆酶基因被用在其它生物体中生产蛋白。这样的生产宿主包括上面所提及的曲霉生产系统，例如米曲霉(A.oryzae)或者黑曲霉(A.niger)(US 5,843,745，US 5,770,418，WO 9708325和WO9533386)、由木霉属真菌(EP244234)而发展的生产系统、或者由镰孢菌属真菌种而发展的生产系统，例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(Malardier等，1989)、由芽孢杆菌属细菌而发展的生产系统，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或者大肠杆菌、酵母属酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或者毕赤酵母、或者链霉菌放线菌或者某些其它微生物或者哺乳动物细胞。

优化漆酶生产

漆酶生产的提高方法是优化野生或重组菌株的培养条件和培养基。当优化培养基时，例如，氮源质量(其中，有机或无机氮源)和数量对漆酶生产的影响。当需要时，为了达到更高的产量氮源受到限制。同样，碳源的影响被确立。最适于酶生产的碳源被挑选。当需要时，碳源的量也能受到限制。碳/氮比例被优化到最适于酶生产。生长环境被优化到最可能适于正在讨论中的酶生产。微生物在最适于酶生产的pH和温度下生长。适当的混合和空气供给在发酵过程中保证最适通风。在发酵中，漆酶生产的诱导剂，例如3，4-二甲氧苯甲基乙醇、二甲苯酸或者木质素也能被应用。添加诱导剂的方法和时间以及它们的浓度被优化。

漆酶在各种应用中的用途

通常，根据本发明的漆酶是十分适宜于在应用领域中被使用，其中漆酶能被使用，例如凝胶形成、纤维黏结、栓处理脱色(尤其织物染色)、纤维染色、蛋白处理、去污剂、抗微生物应用、淀粉应用、化学品的氧化、生物膜的去除、木质素衍生物的制备、医学分析、减少羊毛缩水、烘烤、改善啤酒的保存性能、染料生产、油产品中氧的去除以及碘的生产。当需要如此时，根据本发明所述的漆酶也能因确定的目的而被固定。

根据本发明所述的漆酶尤其十分适宜于工业应用，其中占优势的pH和温度条件是高的。其中，这样的应用包括森林工业的应用、从机械磨碎的含有木质素的纤维中制造纤维产品和木板、造纸机器运转性能的改善和其他应用、聚合物的氧化和其它化学品例如染料分子的氧化。在这些应用中，温度经常超过60℃，通常达80℃，且pH值临近中性或者轻微碱性。

在所有应用中，足够的氧用于反应是必需的。氧是漆酶需要的还原底物。在某些情况下，尤其当底物浓度低时，反应混合物中如此能有足够的氧，但它也能或通过引入空气或通过引入氧或富含氧的空气被加到反应混合物中。

当需要时，介质在反应中被用作添加剂。

根据本发明所述的漆酶是十分适宜于例如着色剂的氧化。染料分子被引入在pH4-8下与漆酶接触，例如在pH4.5-7.5下，优选在pH6-8，更优选在pH7-8，其温度在25-80℃范围内，优选40-80℃，更优选50-80℃，最优选60-80℃。氧按需要被加进反应中。漆酶含量是每克着色剂的1-1000nkat，优选10-500nkat，最优选20-200nkat。此反应被允许发生5分钟-24小时，优选30分钟-2小时。

根据本发明所述的漆酶也十分适宜于聚合作用。有待聚合的挑选的化合物被引入在上述相同条件下与漆酶接触。在实验过程中，此反应混合物也能被通入空气。聚合作用能通过跟踪聚合化合物分子量的增加而被监测，例如通过GPC(凝胶渗透层析法)。

根据本发明所述的漆酶也能用于改善造纸机器的运转性能。通过源于木质素和提取物的化合物聚合和通过在造纸机器中有害微生物的生长降低，漆酶也能用于改善造纸机器的运转性能。通常，在造纸机器中的条件是pH约5-7和温度60-80℃。漆酶能被加进处理水或者造纸机器的头箱或者循环水系统中，而基本上无需改变在造纸机器中占优势的条件。pH能在5-8范围内以及温度在50-80℃范围内。漆酶含量能是每克干物质、纤维或每升循环水的1-1000nkat，优选10-500nkat。处理时间能是5分钟-24小时，优选30分钟-2小时。

根据本发明所述的漆酶也能用于纤维的氧化。含木质素的纤维能被引入在温度50-80℃、甚至高达50-100℃，优选在温度60-80℃，pH5-8，优选pH6-8下与漆酶接触，漆酶浓度以每克纤维的1-1000nkat，优选10-500nkat，反应时间是2分钟-24小时，优选10分钟-2小时。由于漆酶处理，纤维的强度特性改善，它能被利用例如在纤维木板如MDF木反的制造中，或者在纸产品或纸板产品中，这些产品是由机械磨碎的含木质素的纤维构成的。

除了上面所提及的申请实施例外，根据本发明所述的漆酶也能被用于纤维的脱木质化作用中。可将漆酶接触那些有待脱木质素的纤维，例如牛皮纸纤维，其卡帕值为20-30，优选大约25，密度为5-15，优选约10％，优选有介质存在，其量为纸浆的1-5％，优选为纸浆的3％，pH5-8范围内，优选pH6-8内，温度在50-80℃范围内，优选60-80℃范围内。反应时间能在5分钟-24小时之间，优选30分钟-2小时。漆酶含量在0.5Mpa的氧压下可为10-1000nkat/g，优选10-500nkat/g。

下面的实施例目的是对本发明的说明，且不应以任何方式解释为限制本发明。

实施例1

M.albomyces漆酶的生产

M.albomyces真菌被保留在燕麦-琼脂平板(Difco)上。接种物和生产培养基都含有

25g/l葡萄糖(AnalaR)

27.5g/l Bacto酵母提取物(Difco)

0.5mg/ml Indulin AT(Sigma)

0.041/1无机溶液包含：

1.0g/l CaCl_2·2H₂O (Riedel-de

)

1.0g/l FeSO_4·7H₂O (Riedel-de

)

0.1g/l ZnSO_4·7H₂O (Merck)

0.16g/l CuSO_4·5H₂O (Merck)

1.0g/l Na₂EDTA (Riedel-de

)

葡萄糖溶液单独灭菌。

首先，在100ml培养基中接种3-4块(约1cm²)切割自在麦片琼脂上生长良好的菌丝体。其培养温度是37℃且震荡速度是120rpm。经过2天的培养，菌丝体被均质，并在900ml的无菌培养物中接种100ml均质的种子培养物。生产培养的体积是1升；其培养温度是37℃，以及震荡速度是160rpm。培养继续14天。平行进行四种培养。

酶活性分析

M.albomyces培养溶液的漆酶活性通过采用ABTS测定。漆酶氧化ABTS为暗绿色阳离子基团。活性分析根据Niku-Paavola等(1988)开发的方法进行。将样品用pH4.5、0.025M琥珀酸盐缓冲液稀释。0.350ml的ABTS溶液(11g/l)被加进1.15ml的稀释液中，且此反应通过Perkin Elmer λ 20分光光度计在波长436nm下跟踪测定2分钟。

M.albomyces培养物的测定的漆酶活性在图1中显示。

实施例2

M.albomyces漆酶的提纯

蛋白含量的测定

蛋白含量通过Bio-Rad的DC蛋白分析试剂盒来测定，它是以Lowry等(1951)开发的方法为基础的。该分析通过应用此试剂盒的试剂来实施，因此形成的颜色反应强度通过日U-2000分光光度计在750nm波长下测量。每一次测量，标准曲线使用含有0.25-1.25g/l的牛血清白蛋白(BSA，Bio-Rad)的溶液也被定义。

提纯

将其中通过过滤细胞被除去的培养液通过Amicon 8400过滤装置采用PM30的膜(Millipore)超滤。在过滤中，溶液被浓缩并且加入蒸馏水，以便有可能通过离子交换层析将溶液的导电性降至要求的水平。其导电性通过应用EDV导电性仪器(铂电极Mettler Toledo)被测定。

超滤后，溶液通过阴离子交换层析(DEAE Sepharose Fast Flow，h＝10cm，V＝20ml，Pharmacia)被提纯。该树脂在室温下用pH5、0.01M乙酸盐缓冲液平衡。通过应用0-0.5M硫酸钠(Merck)的递增的线性梯度洗脱蛋白质。梯度总体积为90ml以及流速为2ml/分钟。在梯度洗脱过程中，收集4ml馏分。测定蛋白含量、漆酶活性和馏分的导电性。馏分的漆酶活性和蛋白含量在图2中显示。

阴离子交换的最佳漆酶馏分被合并，它们进一步通过疏水作用层析(HIC)被提纯(Phenyl Sepharose Fast Flow，h＝9cm，V＝18ml，Pharmacia)。蛋白的疏水性在层析前通过样品中加入硫酸钠而增加，以便盐含量成为0.7M。树脂用含有1M硫酸钠的pH5、0.02M柠檬酸盐缓冲液室温下平衡。样品用递减的线性盐梯度通过应用含有0.7-0M硫酸钠的柠檬酸缓冲液从柱中洗脱。梯度的总体积为90ml以及流速为2ml/分钟。经梯度洗脱后，树脂以平衡缓冲液冲洗，并最终用水冲洗。在梯度洗脱和随后的用缓冲液和水的冲洗涤过程中，收集3.5ml馏分，测定其中的漆酶活性、蛋白含量和盐含量(图3)。

大多数离子交换和HIC的目的馏分被分析，根据Laemmli(1970)的方法，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监测漆酶的纯度。在凝胶电泳中，使用Bio-Rad设备(Bio-Rad Ready Gel Cell)以及现成的聚丙烯酰胺凝胶(12％ Tris-HCl Ready Gel)。凝胶用考马斯亮蓝R350染色溶液(Pharmacia)染色。Prestained Protein Marker BroadRange #77708S(New England BioLabs)作为蛋白标准应用。

按SDS-PAGE测定，M.albomyces漆酶的分子量是80kDa。

实施例3

M.albomyces漆酶的特征鉴定

活性的温度依赖性

提纯的M.albomyces漆酶活性对温度的依赖性通过在温度25、40、50、60、70、80和90℃下用ABTS测量漆酶活性来解释。酶被稀释到经调节的pH4.5、0.025M琥珀酸缓冲液中。加酶后立即加入被调节的ABTS溶液。样品在所需温度下孵育2分钟，此后在436nm波长下测量吸光度。为了使添加的酶溶液不相当大地降低缓冲液的温度，在所有稀释液中加入缓冲液的酶体积低于总体积的7％。M.albomyces漆酶活性对温度的依赖性在图4中显示。

最适pH

提纯的M.albomyces漆酶的最适pH的确定是通过采用愈创木酚方法，在pH值分别为3、4、5、6、7和8的McIlvaine缓冲液中测量漆酶活性。由于当pH超过7时ABTS不起作用，因此选择愈创木酚。酶被稀释到缓冲液，并且加入酶后立即加入25μl的1％愈创木酚溶液。通过分光光度计在波长465nm下此反应被追踪达5分钟。M.albomyces漆酶活性对pH值的依赖性在图5中显示。

热稳定性

M.albomyces漆酶的热稳定性的确定是50、60、70和80℃下将该酶孵育在pH6、0.06M柠檬酸缓冲液中。在各温度下酶残留活性在孵育15、30、60和120分钟后通过ABTS方法被解释。热稳定性的测量结果在图6中显示。

提纯的M.albomyces漆酶的热稳定性在上述条件下被确定。其结果在图7中显示。该结果说明酶残留活性在60℃基本保持不变长达2小时。经4小时孵育后，仍然保留有60％的残留活性，而6小时后则保留40％。

pH稳定性

M.albomyces漆酶的pH稳定性的确定是在室温下和pH值为2、3、4、5、6、7和8的Mcllvaine缓冲液中孵育此酶。各pH下被孵育样品中酶的残留活性在孵育1、3、5和22小时后通过ABTS方法被解释。pH稳定性测量的结果在图8中显示。

等电点

M.albomyces漆酶的等电点通过等电聚焦而确定。0.5mm厚度的聚丙烯酰胺凝胶含有7.5％丙烯酰胺(Merck)、0.225％N，N′-双-亚甲基丙烯酰胺(Merck)、6％两性电解质(针对IEF的Pharmalyte 2.5-5，Pharmacia)、0.05％过硫酸铵(Merck)和0.05％N，N，N，N′-四亚甲基二胺(Merck)。等电聚焦采用Multiphor II电泳设备(Pharmacia LKB)。凝胶用活性染料染色，其中凝胶在稀释的ABTS溶液(1g/l)中浸泡约10秒钟。大约15分钟后，此漆酶带出现绿色。凝胶的pH分布通过应用pH表面电极(Mettler Toledo)被确定。根据等电聚焦，M.albomyces漆酶的等电点是4.0。

实施例4

M.albomyces漆酶在染料氧化中的用途

测试通过应用嗜热的M.albomyces漆酶实施，且其参考测试通过众所周知的漆酶进行，它分离自Trametes hirsuta真菌。传统底物2，6-二甲氧基酚用作其底物。底物浓度为1mmol/l，pH为4.5-7.5，以及温度为40或者60℃。漆酶含量为15nkat/g。在测试过程中反应混合物通入空气。在测试结束(30分钟)时，发现嗜热的M.albomyces漆酶在高温和高pH值时作用较好，此时从二甲氧基酚中颜色形成在波长468nm下被测量(图9和10)。

漆酶能用于从织物染色中脱色。漆酶氧化很多染料，这能以脱色而被观察。织物染色的脱色通过应用通常用于织物工业的染料黑钻PLC被测量。漆酶处理在pH7.5和温度40℃和60℃下实施2小时，漆酶的剂量是20nkat/mg染料。以最大吸光度(560nm)为基础，Melanocarpus漆酶在40℃除去34％的颜色以及在60℃则去除16％，而Trametes漆酶在40℃仅去除14％并在60℃仅去除为1％(图1)。

M.albomyces漆酶脱色的能力在pH5和8与T.hirsuta漆酶相比较。脱色能力采用常规用于织物工业的染料来研究。颜色溶液(50mg/l)以lnkat/ml50mM琥珀酸盐缓冲液(pH5)或磷酸盐缓冲液(pH8)，在40℃温度下漆酶剂量被氧化24小时。肉眼观察跟踪脱色。其结果在表1中显示。如结果所示，两种酶均氧化被测试的染料以致于它们在pH5下转变为无色。T.hirsuta漆酶在pH8是无效的，其不氧化被测试的染料，与M.albomyces漆酶不同，其即便在pH8也能氧化染料。该结果显示M.albomyces漆酶在染料氧化中的表现较传统的Trametes漆酶要广泛得多。

表1.在pH5和8下用T.hirsuta和M.albomyces漆酶对织物染色的去除。

(+＝颜色从溶液中去除，-＝无颜色从溶液中去除)

实施例5

M.albomyces漆酶在聚合中的用途

测试以嗜热的漆酶研究了标准化合物(木质素，Westvaco或者Indulin AT，Sigma)的聚合作用。木质素是典型的漆酶芳香族底物。参考测试是用分离自Trametes hirsuta的漆酶来实施。测试条件如下：底物浓度1％、pH7.5，以及温度40℃或者60℃。漆酶含量为200nkat/g。在测试过程中将反应混合物通入空气。聚合作用通过采用GPC(凝胶渗透层析)确定聚合的木质素分子量的增加而追踪。在反应结束(30分钟)时，发现嗜热M.albomyces漆酶在高温和高pH下较参考漆酶作用更加有效。图12举例说明一种情况，其中木质素的聚合在40℃下实施，以及相应地在60℃下实施显示于图13中。Melanocarpus漆酶导致分子大小的平均增加和小分子部分的降低，明显好于Trametes漆酶。

实施例6

M.albomyces漆酶在改善造纸机器运转性能中的用途

漆酶能被用于改善造纸机器运转性能，通过源于木质素和提取物的化合物聚合和通过造纸机器的微生物问题降低。通常，造纸机器的条件是：pH5-7以及温度60-80℃。处理测试用源于木质素和提取物、分离自造纸机器的可溶性化合物在造纸机器条件下利用嗜热和常规参考的漆酶来实施。底物浓度是0.5％干重、pH7及温度70℃。强烈震荡确保反应中有足够的氧含量。该反应通过凝胶过滤(GPC)作为芳香族和其它化合物的聚合作用而受到监测，这些化合物作为漆酶的底物而起作用，发现有嗜热的M.albomyces漆酶的反应较有参考漆酶的更加有效。

图14显示Melanocarpus漆酶和Trametes漆酶于70℃下在源于木质素和提取物的化合物的聚合作用中如何表现。图14中，Melanocarpus漆酶显然地降低了小分子的含量。

实施例7

M.albomyces漆酶在纤维氧化中的用途

将机械磨碎的无需化学脱木质化作用的含有木质素的纤维用M.albomyces漆酶处理以激活和聚合纤维表面上的木质素。该处理在以下条件下实施：温度是50℃和70℃、pH6，以及漆酶浓度为200nkat/g纤维。通过向反应混合物中吹氧使反应混合物通气。此参照为分离自Trametes hirsuta真菌的传统漆酶。手工层(hand sheet)从处理的纤维中制备，该层的物理特性被测量。其结果(表2)显示由用M.albomyces漆酶处理的纤维构成的层密度显然高于并且光散射少于参照层的密度。没有相应的变化在由用T.hirsuta漆酶处理的纤维构成的层中被观察到。其效果在增加的温度70℃下是十分明显的，其中由于其良好的热稳定性，M.albomyces漆酶分离自T.hirsuta真菌的参考漆酶表现有优势。以此结果为依据，能推断出在所用条件下应用M.albomyces漆酶来聚合木质素至纤维表面上是可能的。

表2.由用M.albomyces漆酶和T.hirsuta漆酶处理的纤维构成的层的密度和光散射

测试	T(℃)	密度(kg/m<sup>3</sup>)	光散射(m<sup>2</sup>/kg)
测试	T(℃)	密度(kg/m<sup>3</sup>)	光散射(m<sup>2</sup>/kg)	无酶	70	339	55.0
T.hirsuta漆酶	70	347	55.2	无酶	70	339	55.0
T.hirsuta漆酶	70	347	55.2	M.albomyces漆酶	70	367	53.6

实施例8

M.albomyces漆酶在纤维脱木质化作用中的用途

介质能用于扩大漆酶的底物范围，其中，在聚合物的脱木质化作用或者其它间接的氧化作用。羟基苯并三唑为被挑选介质。嗜热的漆酶在介质介导的氧化中被用于分解牛皮纸纤维的木质素。其反应条件如下：牛皮纸浆、卡帕数约为29、密度4％、介质含量为纸浆的1％、pH调节至7、以及温度70℃、反应时间为2小时、漆酶含量为500nkat/g，氧压0.SmPa。Trametes漆酶充当参考物质。处理后，将纸浆进行碱性提取、螯合作用和一步过氧化物漂白。碱性提取后木质素的分解通过在波长280nm下测量滤液的吸光度而被监测。手工层由纸浆和ISO亮度制备，并且测量卡帕数。如结果显示(表3)，M.albomyces漆酶在此测试条件下较参考漆酶作用更加有效；较参照漆酶它更加降低了层的卡帕值(木质素含量)并更加增加了滤液的吸光度280_nm。

表3.LM处理对具有LQ-E-P序列的牛皮纸浆(K29)的漂白率的影响

测试	滤液的A280	卡帕值
测试	滤液的A280	卡帕值	无酶	11.9	18.9
T.hirsuta漆酶	14.3	16.3	无酶	11.9	18.9
T.hirsuta漆酶	14.3	16.3	M.albomyces漆酶	32.7	15.4

实施例9

M.albomyces漆酶基因和其cDNA的分离

根据Raeder和Broda(1985)的方法，从细胞中分离总DNA。基因组文库的构建采用商业反应成套试剂(SuperCos I Cosmid VectorKit，Stratagene)，按照制造商的说明书进行。l00μg DNA用5单位的Sau3AI限制酶(New England Biolabs)通过在37℃孵育10分钟被部分切割。消化的DNA以20单位的CIAP(小牛肠碱性磷酸酶，Finnzymes)被脱磷酸化。不同长度的DNA分子的分离以15-30％蔗糖梯度在20℃下超速离心22小时以及转速为22000rpm(BeckmanSW41TI转子)而进行。12ml蔗糖梯度被分成300μl馏分，并且将每隔一个馏分的10μl通过电泳在0.5％琼脂糖凝胶上检测。根据凝胶电泳，将含有长度多于20千碱基对的DNA片段的馏分合并，并从中用乙醇沉淀DNA。将获得的DNA(约2μg)插入到SuperCos I粘粒载体(约1μg)中，该载体已用XbaI(New England Biolabs)消化，然后用CIAP脱磷酸化，最终用BamHI(Boehringer Mannheim)所消化。连接采用T4DNA连接酶(Promega)在4℃下孵育混合物过夜来完成。将连接混合物通过应用商业反应成套试剂(Gigapack III Gold包装提取物，Stratagene)根据制造商的说明书，装配到λ颗粒中，并将装配的噬菌体用于感染大肠杆菌宿主细胞(XLl-Blue MR菌株，Stratagene)。一次连接提供多于5 x 10⁶克隆，它可被认为是代表性的基因库。

用于基因库筛选的杂交探针从Podospora anserina真菌的lac2基因中获得。此基因被选为探针，这是因为M.albomyces漆酶的N-末端氨基酸序列和内肽同源于Podospora anserina漆酶的氨基酸序列。使Podospora anserina真菌生长在底物中，其在图1中描述。根据制造商的说明书采用商业反应成套试剂(Easy DNA Kit，Invitrogen)，将基因组DNA分离自菌丝体，它在生长三天后被收集并冻干。lac2基因通过PCR反应扩增，使用基于lac2基因公布的序列的引物：5′-TGCCACACTGCCGCCAACCGTGCT-3′(SEQ ID NO：3)(正向)和5′-GTTCTTGATATACCAATCAGGATG-3′(SEQ ID NO：4)(反向)。用于扩增的PCR程序包含26个循环，其中温度程序如下：在94℃DNA变性45秒，在55℃引物插入1分钟，在72℃以聚合酶延伸DNA链2.5分钟。最终，在72℃链被延伸5分钟。长度约1.9千碱基对的片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化获得。它作为探针的特性通过与用M.albomyces真菌的基因组DNA Southern杂交纯化获得而被检查如下：在两个不同的反应中，40μg的DNA用80单位的EcoRI和HindIII限制酶(NewEngland Biolabs)，在37℃下切割5小时。片段通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳来分离；将DNA变性并转移至Hybond N膜上(AmershamPharmacia Biotech)(此方法在Sambrook等，1989中描述)。P.anserina的lac2基因通过应用商业反应成套试剂(随机引发的DNA标记试剂盒，BoehringerMannheim)并根据制造商的说明书用α-³²p-dCTP标记，以及探针的结合在四种不同的杂交温度：48、50、55和60℃下被检测。杂交溶液含有6xSSC、lxDenhardt试剂(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml的鲱精子DNA(SSC含有0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠、pH7.0)。杂交包含约5 x 10⁵cpm/ml的标记探针。杂交后，把膜在含有0.1％SDS的2 x SSC中室温下洗涤两次，每次5分钟，此后，在相同温度下进行杂交30分钟。膜用薄膜密封在曝光的暗盒内，并且曝光的薄膜显示P.anserina lac2基因与DNA片段杂交，其长度约4.5千碱基对并用EcoRI酶切割。

来自获得的基因组基因库的约5 x 10⁵克隆被置于琼脂板上，并将已生长过夜的克隆被转移至硝酸纤维素膜(Protran，Schleicher和Schuell)上。将由克隆所得到的DNA变性(Sambrook等，1989)并通过在80℃加热2小时被附着到膜上。DNA附着后，细菌克隆的剩余通过在48℃用洗液(Sambrook等，1989)清洗，它们可从膜上洗去。将与膜结合的DNA在57℃下与用α-³²p-dCTP(杂交溶液，如上)标记的P.anserina lac2基因杂交过夜。根据获得的杂交信号，若干个克隆从原始平板中挑选出来，这些克隆已与P.anserina lac2基因杂交。把这些克隆与P.anserina lac2基因进一步杂交，并根据放射性信号，6个克隆被挑选为进一步检查。粘粒(质粒提纯方案，Tip-500，QIAGEN)从它们中分离。使从粘粒中分离漆酶基因成为可能的限制酶通过以19种不同的限制酶切割此粘粒而被寻找。获得的片段在57℃下应用P.anserina lac2基因如上所述进行Southern杂交。长度约为4.5千碱基对的EcolRI片段被再次与lac2基因杂交。粘粒用EcolRI切割，以及片段通过琼脂糖凝胶电泳提纯。将获得的片段插入到质粒pBluescriptSK-(Stratagene)中，并将质粒通过电穿孔转化进大肠杆菌宿主细胞(菌株DH5α，Gibco BRL)中。克隆从转化中获得，在pLLK1质粒中含有所需的EcolRI片段。应用合成的寡核苷酸引物，漆酶基因从该质粒被测序。测序反应根据制造商的说明书应用商业反应成套试剂(DNA测序试剂盒，若丹明终止子循环测序现成反应，PEBiosystems)来实施。

为了建立M.albomyces漆酶基因含有的内含子，根据制造商的说明书应用一种商业反应成套试剂(FirstChoiceTM RLM-RACE试剂盒，Ambion，Inc.)，将对应于M.albomyces漆酶的互补DNA(cDNA)通过RACE-PCR克隆。根据制造商的说明书通过应用一种商业反应成套试剂

试剂，Life Technologies)，将RNA从M.albomyces细胞中分离。将RNA脱磷酸化并且通过使用反转录酶翻译成DNA，随后根据制造商的说明书通过单独的PCR反应，将基因的5′和3′末端扩增。cDNA两末端的扩增应用不同引物通过两个连续的PCR反应来实施。在第一反应中，将漆酶cDNA的所需部分应用基因特异的引物扩增，以及通过应用另一基因特异的引物第二反应确保了漆酶cDNA的扩增。在各PCR反应中，DNA扩增所需的引物之一来自RLM-RACE试剂盒反应成套试剂，并且它结合与cDNA末端相连的接头区域。用于扩增的PCR程序包含35个循环，其中温度程序如下：在94℃ DNA变性30秒，在60-62℃引物插入30秒，在72℃ DNA链的延伸2分钟。在5′末端的扩增中，引物插入的温度是60℃，而在3′末端的扩增中则为62℃。最终，链的延伸在72℃进行7分钟。用于5′末端扩增的基因特异的引物如下：在第一个PCR反应中，5-GCCGGTGAGGATGTAGTCGATGAT-3′(SEQ ID NO：5)，和在第二个反应中，5′-AGGTGACGTTGAACCAGTAGTTGTC-3′(SEQ ID NO：6)。用于3′末端扩增的基因特异的引物如下：在第一个PCR反应中，5′-CTGGTGCACTTCACGCAGAACAA-3′(SEQ ID NO：7)，和在第二个反应中，5′-AGAACCACTTCCAGGTGTCGCT-3′(SEQ ID NO：8)。从RLM-RACE反应中，长度为1194碱基对的片段从5′末端获得，并且长度为1322碱基对的片段从3′末端获得。片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并根据制造商的说明书通过应用一种商业反应成套试剂(TOPOTA克隆试剂盒，Invitrogen)克隆到pCR2.1-TOPO^TM载体上。将质粒根据反应成套试剂说明书通过电穿孔方法转化到大肠杆菌宿主细胞(菌株TOP10F′，Invitrogen)中。把克隆的片段测序，并通过比较基因组序列与所得到的cDNA序列而建立M.albomyces漆酶基因中内含子的位置。

基因的基因组序列在图15中显示。内含子被下画线。

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序列表

<120>新漆酶和编码该酶的基因

(Novel laccese and the gens encoding the enzyme)

<130>SCT022555-09

<140>

<141>

<150>20001240

<151>2000-05-23

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>3116

<212>DNA

<213>Melanocarpus albomyces

<400>1

<210>2

<211>623

<212>PRT

<213>Melanocarpus albomyces

<400>2

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>5

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

Claims

1.一种漆酶，其特征在于分离自Melanocarpus albomyces的菌株，并且该酶的最适pH为5-8以及该酶在pH3-9和温度30-80℃起作用。

2.根据权利要求1所述的漆酶，其特征在于该酶的最适pH为6-8。

3.根据权利要求1所述的漆酶，其特征在于该酶在温度50-80℃下作用最佳。

4.根据权利要求1所述的漆酶，其特征在于该酶的最适pH是6.5-7.5，最适温度为60-80℃。

5.根据权利要求1所述的漆酶，其特征在于该酶的活性在60℃下2小时基本保持不变。

6.根据权利要求1所述的漆酶，其特征在于纯化的酶按等电聚焦所确定的等电点是4.0±0.5，并且其分子量按SDS-PAGE所确定的为80±5kDa。

7.一种酶制剂，其特征在于它包含前述任一项权利要求所述的漆酶作为主要活性。

8.一种酶制剂，其特征在于它包含比Melanocarpus属的菌株天然产生到其培养液中的更多的根据前述任一项权利要求所述的漆酶。

9.根据权利要求7或8所述的制剂，其特征在于该酶的最适pH为5-8并且该酶在pH3-9和温度30-80℃起作用。

10.根据权利要求7或8所述的制剂，其特征在于该酶按等电聚焦所确定的等电点是4.0±0.5，并且其分子量按SDS-PAGE所确定的为80±5kDa。

11.根据权利要求9所述的制剂，其特征在于该酶按等电聚焦所确定的等电点是4.0±0.5，并且其分子量按SDS-PAGE所确定的为80±5kDa。

12.编码具有漆酶活性的多肽的核酸分子，其特征在于该核酸分子选自：

a)一种核酸分子，其具有如SEQ ID NO：1或者图15中所示的核苷酸序列的编码区；

b)一种核酸分子，其编码具有如SEQ ID NO：2或者图中15所示氨基酸序列的多肽；或

c)一种核酸分子，其编码具有漆酶活性的多肽，并具有编码序列，所述编码序列由于遗传密码的简并性区别于SEQ ID NO：1或者图15的编码序列。

13.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于它是编码具有如SEQ ID NO：2或者图15中所示的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

14.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于它是具有如SEQ ID NO：1或者图15中所示的核苷酸序列的编码区的核酸分子。

15.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于它编码根据权利要求1-6任一项所述的酶。

16.一种载体，其特征在于它包含根据权利要求12-15任一项所述的核酸分子。

17.一种微生物宿主，其特征在于根据权利要求12-15任一项所述的核酸分子或根据权利要求16所述的载体已被转转移到其中。

18.根据权利要求17所述的宿主，其特征在于它是丝状真菌、酵母菌或细菌。

19.根据权利要求17或18所述的宿主，其特征在于它属于曲霉属、木霉属或镰孢霉属。

20.生产漆酶的方法，其特征在于

-将根据权利要求12-15任一项所述的核酸分子或根据权利要求16所述的载体转移到微生物宿主细胞中用于表达核酸分子，以及任选地用于从宿主细胞中分泌所表达的多肽；以及

-从细胞或从微生物宿主的培养液中回收具有漆酶活性的多肽。

21.一种多肽，其具有漆酶活性，其特征在于它被选自下列的核酸分子所编码：

a)一种核酸分子，其具有如SEQ ID NO：1或者图15所示的核苷酸序列的编码区；

b)一种核酸分子，其编码具有如SEQ ID NO：2或者图15中所示的氨基酸序列的多肽；或

c)一种核酸分子，其编码具有漆酶活性的多肽，并具有编码序列，所述编码序列由于遗传密码的简并性区别于SEQ ID NO：1或者图15的核苷酸序列的编码序列。

22.一种酶制剂，其特征在于它包含作为主要活性的根据权利要求21所述的多肽，所述多肽具有漆酶活性。

23.一种酶制剂，其特征在于它包含比Melanocarpus属菌株天然生产到其培养液中的更多的根据权利要求21所述的多肽，所述多肽具有漆酶活性。

24.根据权利要求7-8、22或23任一项所述的酶制剂，其特征在于它包含10mg/l以上的漆酶。

25.根据权利要求7-8、22或23任一项所述的酶制剂，其特征在于它包含≥30mg/l的漆酶。

26.根据权利要求7-8、22或23任一项所述的酶制剂，其特征在于它包含至少一种添加剂。

27.根据权利要求7-8、22或23任一项所述的酶制剂，其特征在于它包含至少一种稳定剂和/或缓冲剂。

28.根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶在氧化染色剂中的用途。

29.根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶在聚合化合物中的用途。

30.根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶在氧化纤维中的用途。

31.根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶在纤维去木质素中的用途。

32.根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶在改善造纸机器运转性能中的用途。

33.一种氧化染色剂的方法，其特征在于在存在足够量的氧、pH4-8和温度40-80℃下，按每克染色剂使用约1-1000nkat的漆酶，将染色剂与根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶接触5分钟-24小时。

34.一种聚合化合物的方法，其特征在于在存在足够量的氧、pH4-8和温度40-80℃下，按每克待聚合的物质使用约1-1000nkat的漆酶，将待聚合的化合物与根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶接触5分钟-24小时。

35.一种氧化纤维的方法，其特征在于在存在足够量的氧、pH5-8和温度50-80℃下，按每克干物质纤维使用约1-1000nkat的漆酶，将有待氧化的纤维与根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶接触5分钟-24小时。

36.一种去木质素纤维的方法，其特征在于在存在足够量的氧、pH

5-8和温度50-80℃下，按每克干物质纤维使用约1-1000nkat的漆酶，将有待去木质素的纤维与根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶接触5分钟-24小时。

37.一种改善造纸机器运转性能的方法，其特征在于将根据权利要求1-6任一项所述的漆酶、根据权利要求7-11或22-27任一项所述的酶制剂或根据权利要求21所述的多肽或根据权利要求20所述方法而获得的漆酶以每克干物质、纤维或每升循环水使用1-1000nkat漆酶的量加入到处理水中或加入到造纸机器的头箱中。

38.根据权利要求33-37任一项所述的方法，其特征在于将增强漆酶作用的介质用于所述方法中。