CN101563500B

CN101563500B - 漆酶介质及使用方法

Info

Publication number: CN101563500B
Application number: CN2007800469050A
Authority: CN
Inventors: J·C·麦考利夫; 王华明
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2027-12-12
Also published as: CN101568640B; CN101568640A; CN101563500A

Abstract

新的漆酶介质，包括2，6-二甲氧基苯酚的甲酰氨基和氰基衍生物，其表现出改进的水解稳定性和良好的漂白性能。可将新的漆酶与本发明的2，6-二甲氧基苯酚衍生物组合使用以提供用于漂洗粗斜纹布织物的改进的方法。

Description

漆酶介质及使用方法

与相关申请的交互引用

本申请要求2006年12月18日提交的，标题为“新漆酶、组合物和使用方法”的美国临时专利申请顺序号60/875,518和2006年12月18日提交的，标题为“漆酶介质和使用方法”的美国临时专利申请顺序号60/875,454的优先权。

发明领域

本发明涉及水解稳定的漆酶介质，以及涉及用于漂白材料的酶学方法。

发明背景

漆酶是含铜的酶，公知其在氧的存在下是良好的氧化剂。发现漆酶存在于微生物、真菌和高等生物中。漆酶可用于许多的应用，包括纸浆和纺织品的漂白、处理纸浆废水、脱墨、工业颜色移除、漂白洗衣粉、口腔护理牙齿增白剂、以及用作聚合作用及氧化反应的催化剂或促进剂。

漆酶在许多工业中可以具有广泛的应用，包括洗涤剂工业、纸和纸浆工业、纺织工业和食品工业。在一种应用中，在洗涤剂洗净过程中，将酚氧化酶用作从衣物移除染色(诸如食物沾污)的助剂。

多数漆酶在酸性pH范围内展现出pH最适条件，而在中性或碱性pH中是失活的。

已知可通过多种真菌产生漆酶，包括曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、柄孢壳属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytis)、侧耳属(Pleurotus)、层孔菌属(Fornes)、射脉菌属(Phlebia)、栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、丝核菌属(Rhizoctonia)、双极蠕孢属(Bipolaris)、弯孢霉属(Curvularia)、壳单孢属(Amerosporium) 和香茹属(Lentinus)的物种。然而，在各种应用中仍然需要具有不同表现特性的漆酶。

对于许多应用，可通过应用介质(也称为增强剂)改进漆酶的氧化效率。在本领域中将包括漆酶和介质的系统称为漆酶-介质系统(LMS)。相同的化合物还可用于活化或启始漆酶的作用。

有若干种用于漆酶-介质系统的已知介质。它们包括HBT(1-羟基苯并三唑)、ABTS [2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-亚磺酸)]、NHA(N-羟基乙酰苯胺)、NEIAA(N-乙酰基-N-苯基羟胺)、HBTO(3-羟基1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)和VIO(紫尿酸)。此外，有若干种已发现可用作介质的含有NH-OH或N-O的化合物。

官能团和取代基对介质的效率具有很大的影响。甚至在同类化合物中，取代基可能改变漆酶对底物的特异性，由此极大地升高或降低介质效率。此外，介质能对一种具体应用有效但不适于另一应用。当前介质的另一缺点是它们在使用期间聚合的倾向。因此，有需要发现用于特定应用的有效介质。一种此类应用是漂洗纺织品，其中该介质不太昂贵或不太危险也是重要的。下面给出了漆酶-介质系统的其它应用。

因此，有需要鉴定活化漆酶和/或增强表现出漆酶活性的酶活性的其它介质。

发明概述

本发明描述了新的漆酶介质，包括2，6-二甲氧基苯酚的4-甲酰氨基和4-氰基衍生物，其表现出改进的稳定性和良好的漂白表现。

在一个实施方案中，将新的漆酶与本发明的4-取代的2，6-二甲氧基苯酚衍生物联用，以提供用于漂白粗斜纹布织物的改进的方法。

附图简述

图1是在实施例1中使用的芽孢杆菌表达质粒(p2JMagk103lnk2E-漆酶)的示意图，用于表达与编码BCE103的基因融合的密码子优化的漆酶D 基因。

图2是显示使用来自梭孢壳属中的种(Thielavia sp.)的漆酶和50及500μM浓度的多种介质漂白可溶靛蓝的结果的柱状图。

图3是显示在pH5使用来自梭孢壳属、毁丝霉属(Myceliophthora)和下皮黑孔菌属中的种(Cerrena sp.)的漆酶和多种介质漂白可溶靛蓝的结果的柱状图。

图4是显示在pH7使用来自梭孢壳属、毁丝霉属和下皮黑孔菌属中的种的漆酶以及多种介质漂白可溶靛蓝的结果的柱状图。

图5是显示用单色下皮黑孔菌(C.unicolor)漆酶(20ppm)和不同浓度的3种介质处理的粗斜纹布样品(正面)总色差(E)的柱状图。

图6是显示用单色下皮黑孔菌漆酶(20ppm)和不同浓度的3种介质处理的粗斜纹布样品(背面)总色差(E)的柱状图。

图7是作为使用来自单色下皮黑孔菌的漆酶D的漆酶/介质联合的函数显示的漂白的粗斜纹布圆片(正面)总色差的柱状图。

图8是作为使用来自单色下皮黑孔菌的漆酶D的漆酶/介质联合的函数显示的漂白的粗斜纹布圆片(背面)总色差的柱状图。

图9是于60℃和pH6作为介质浓度和酶浓度的函数显示的重组漆酶D和丁香酰胺介质的总色差图。

图10是于60℃和pH6作为介质浓度和酶浓度的函数显示的重组漆酶D和丁香腈介质的总色差图。

发明详述

除非在本文中以其它方式定义，否则本文中所使用的技术和科学术语均具有和本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第二版，John Wiley和Sons，纽约(1994)；以及Hale&Marham，生物学HARPER COLLINS词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)，Harper Perennial，纽约(1991)给本领域技术人员提供了本发明所使用的许多术语的一般词典。尽管可以应用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法及材料来实施或测试本发明，但本发明描述了优选的方法和材料。数值范围包括定义该范围的数值。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。

本文提供的标题不是对本发明各方面或实施方案的限制，其可通过作为整体来参考本说明书而获得。因此，通过作为整体参考本说明书能更完整地定义下面定义的术语。

本文所有引用的出版物均通过引用明确地并入本文，用于描述和公开可能与本发明关联使用的组合物和方法。

I.漆酶和漆酶相关酶

在本发明上下文中，漆酶和漆酶相关酶包括由酶分类(EC 1.10.3.2)包含的任何漆酶。已知漆酶来自微生物和植物来源。微生物漆酶可以源自细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，并且合适的实例包括可从以下菌株衍生的漆酶：曲霉属(Aspergillus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；柄孢壳属(Podospora)；葡萄孢属(Botrytis)；金钱菌属(Collybia)；下皮黑孔菌属；葡萄穗霉属(Stachybotrys)；革耳属(Panus)，例如野生革耳(Panus rudis)；梭孢壳属(Theilava)；层孔菌属；香茹属；侧耳属；栓菌属，例如绒毛栓菌(T.villosa)和变色栓菌(T.versicolor)；丝核菌属，例如立枯丝核菌(R.solani)；鬼伞属(Coprinus)，例如褶纹鬼伞(C.plicatilis)和灰盖鬼伞(C.cinereus)；小脆柄菇属(Psatyrella)；毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉(M.thermonhila)；柱顶孢属(Schytalidium)；射脉菌属，例如射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)；或革盖菌属(Coriolus)，例如，毛革盖菌(C.hirsutus)(JP2-238885)；棉皮孔菌属(Spongipellis sp.)；多孔菌属(Polyporus)；虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)；粗皮灵芝(Ganoderma tsunodae)和木霉属(Trichoderma)。

还可通过以下方法生产漆酶或漆酶相关酶：所述方法包括在允许漆酶表达的条件下在培养基中培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收漆酶，其中所述重组DNA载体携带有编码所述漆酶的DNA序列以及允许编码漆酶的DNA序列表达的DNA序列。

可将表达载体转化至合适的宿主细胞，诸如真菌细胞，其优选的实例是曲霉属(Aspergillus)的物种，最优选米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)；以及镰孢菌属(Fusarium)的物种，最优选有毒镰孢(Fusarium venenatum)。可通过涉及原生质体形成、以及转化原生质体并随后用本身已知的方法再生细胞壁的方法转化真菌细胞。曲霉属作为宿主微生物的用途描述于EP 238,023。镰孢菌属作为宿主微生物的用途描述于WO 96/00787和WO 97/08325。

备选地，宿主生物可以是细菌，特别是芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)或大肠杆菌(E.coli)的菌株。可根据常规方法进行细菌细胞的转化，例如，如描述于T.Maniatis等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor，1982。合适DNA序列的筛选和载体的构建也可通过标准方法进行，参见前面引用的T.Maniatis等。

用于培养经转化的宿主细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞的任何常规培养基。可使所表达的酶方便地分泌至培养基中，并且可通过公知的方法从培养基回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，通过盐诸如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质组分，随后是层析过程，诸如离子交换层析、亲和层析等。

在一个实施方案中，表达宿主可以是具有在CHB1启动子和终止子控制之下的漆酶编码区的里氏木霉(Trichoderma reesei)。(例如，参见美国专利5,861,271号)。表达载体可以是如在2005年10月7日提交的美国专利申请11/245,628号中公开的pTrex3g(代理人案号GC886)。

以这种方式，制备了以下新的基因和漆酶：

A.来自CBS154.29菌株的下皮黑孔菌属漆酶D1基因(SEQ ID No.13)，

GATTCTAATA GACCAGGCAT ACCAAGAGAT CTACAGGTTG ACAGACCATT 50

CTTCTAGGCG GCATTTATGC TGTAGCGTCA GAAATTATCT CTCCATTTGT 100

ATCCCACAGG TCCTGTAATA ACACGGAGAC AGTCCAAACT GGGATGCCTT 150

TTTTCTCAAC TATGGGCGCA CATAGTCTGG ACGATGGTAT ATAAGACGAT 200

GGTATGAGAC CCATGAAGTC AGAACACTTT TGCTCTCTGA CATTTCATGG 250

TTCACACTCT CGAGATGGGA TTGAACTCGG CTATTACATC GCTTGCTATC 300

TTAGCTCTGT CAGTCGGAAG CTATGCTGCA ATTGGGCCCG TGGCCGACAT 350

ACACATTGTC AACAAAGACC TTGCTCCAGA TGGCGTACAA CGTCCAACCG 400

TGCTTGCCGG AGGCACTTTT CCTGGGACGT TGATCACCGG TCAGAAAGTA 450

AGGGATATTA GTTTGCGTCA AAGAGCCAAC CAAAACTAAC CGTCCCGTAC 500

TATAGGGTGA CAACTTCCAG CTCAATGTCA TCGATGATCT TACCGACGAT 550

CGGATGTTGA CGCCAACTTC CATTGTGAGC CTATTATTGT ATGATTTATC 600

CGAATAGTTT CGCAGTCTGA TCATTGGATC TCTATCGCTA GCATTGGCAC 650

GGTTTCTTCC AGAAGGGAAC CGCTTGGGCC GACGGTCCCG CCTTCGTAAC 700

TCAGTGCCCT ATAATAGCAG ATAACTCTTT TCTGTATGAC TTCGACGTCC 750

CAGACCAAGC TGGTACTTTC TGGTATCATA GTCATCTATC CACTCAGTAC 800

TGTGACGGTT TACGTGGTGC CTTCGTTGTG TACGATCCTA ACGATCCTCA 850

CAAAGACCTA TACGATGTTG ATGACGGTGG GTTCCAAATA TTTGTTCTGC 900

AGACATTGTA TTGACGGTGT TCATTATAAT TTCAGAGAGC ACCGTGATTA 950

CCCTTGCGGA TTGGTACCAT GTTCTCGCCC AGACCGTTGT CGGCGCTGCG 1000

TGAGTAACAC ATACACGCGC TCCGGCACAC TGATACTAAT TTTTTTTTAT 1050

TGTAGCACTC CTGATTCTAC CTTGATCAAC GGGTTAGGCC GTTCACAGAC 1100

CGGACCCGCT GATGCTGAGC TGGCTGTTAT CAGCGTTGAA CATAACAAAC 1150

GGTATGTCAT CTCTACCCAG TATCTTCTCT CCTGCTCTAA TTCGCTGTTT 1200

CACCATAGAT ACCGTTTCCG TTTGGTTTCG ATTTCGTGCG ACCCCAACTT 1250

TACCTTCTCC GTTGATGGTC ATAATATGAC TGTCATCGAA GTCGATGGTG 1300

TCAACACACG ACCCCTGACC GTTGACTCTA TTCAAATCTT CGCCGGACAG 1350

AGGTATTCCT TTGTCGTAAG TTAATCGATA TATTCTCCTT ATTACCCCTG 1400

TGTAATTGAT GTCAATAGCT CAATGCTAAC CAACCCGAAG ACAATTACTG 1450

GATCCGTGCT ATGCCAAACA TCGGTAGAAA TACAACAACA CTGGACGGAA 1500

AGAATGCCGC TATCCTTCGA TACAAGAATG CTTCTGTAGA AGAGCCCAAG 1550

ACCGTTGGGG GCCCCGCTCA ATCCCCGTTG AATGAAGCGG ACCTGCGTCC 1600

ACTCGTACCT GCTCCTGTGG TATGTCTTGT CGCGCTGTTC CATCGCTATT 1650

TCATATTAAC GTTTTGTTTT TGTCAAGCCT GGAAACGCTG TTCCAGGTGG 1700

CGCAGACATC AATCACAGGC TTAACTTAAC TTTCGTACGT ACACCTGGTT 1750

GAAACATTAT ATTTCCAGTC TAACCTCTCT TGTAGAGTAA CGGCCTCTTC 1800

AGCATCAACA ACGCCTCCTT CACTaATCCT TCGGTCCCCG CCTTATTACA 1850

AATTCTGAGC GGTGCTCAGA ACGCTCAAGA TTTACTTCCA ACGGGTAGTT 1900

ACATTGGCCT TGAACTAGGC AAGGTTGTGG AGCTCGTTAT ACCTCCTCTG 1950

GCAGTTGGAG GACCGCACCC TTTCCATCTT CATGGCGTAA GCATACCACA 2000

CTCCCGCAGC CAGAATGACG CAAACTAATC ATGATATGCA GCACAATTTC 2050

TGGGTCGTCC GTAGTGCAGG TAGCGATGAG TATAACTTTG ACGATGCTAT 2100

CCTCAGGGAC GTCGTRAGCA TTGGAGCGGG GACTGATGAA GTCACAATCC 2150

GTTTCGTGGT ATGTCTCACC CCTCGCATTT TGAGACGCAA GAGCTGATAT 2200

ATTTTAACAT AGACCGACAA TCCGGGCCCG TGGTTCCTCC ATTGCCATAT 2250

TGATTGGCAT TTGGAGGCAG GCCTTGCCAT CGTCTTCGCT GAGGGCATCA 2300

ATCAGACCGC TGCAGCCAAC CCAACACCCC GTACGTGACA CTGAGGGTTT 2350

CTTTATAGTG CTGGATTACT GAATCGAGAT TTCTCCACAG AAGCATGGGA 2400

TGAGCTTTGC CCCAAATATA ACGGGTTGAG TGCGAGCCAG AAGGTCAAGC 2450

CTAAGAAAGG AACTGCTATT TAAACGTGGT CCTAGACTAC GGGCATATAA 2500

GTATTCGGGT AGCGCGTGTG AGCAATGTTC CGATACACGT AGATTCATCA 2550

CCGGACACGC TGGGACAATT TGTGTATAAT GGCTAGTAAC GTATCTGAGT 2600

TCTGGTGTGT AGTTCAAAGA GACAGCCCTT CCTGAGACAG CCCTTCCTGA 2650

GACAGCCCTT CCTGAGACGT GACCTCCGTA GTCTGCACAC GATACTYCTA 2700

AATACGTATG GCAAGATGAC AAAGAGGAGG ATGTGAGTTA CTACGAACAG 2750

AAATAGTGCC CGGCCTCGGA GAGATGTTCT TGAATATGGG ACTGGGACCA 2800

ACATCCGGA 2809

其编码酶漆酶D1，所述漆酶D1具有以下翻译的蛋白质序列(SEQ IDNo.14)。

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50

TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100

AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFVVYDP 150

NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200

PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VIEVDGVNTR 250

PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPEDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300

LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350

NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400

VVELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWVVRSA GSDEYNFDDA ILRDVVSIGA 450

GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500

AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526

B.来自CBS155.075菌株的下皮黑孔菌属漆酶D2基因(SEQ ID No.15)，

GATCTGGACG ATGGTATATA AGACGATGGT ATGAGACCCA TGAAGTCTGA 50

ACACTTTTGC TCTCTGACAT TTCATGGTTC ATACTCTCGA GATGGGATTG 100

AACTCGGCTA TTACATCGCT TGCTATCTTA GCTCTGTCAG TCGGAAGCTA 150

TGCTGCAATT GGGCCCGTGG CCGACATACA CATTGTCAAC AAAGACCTTG 200

CTCCAGATGG TGTACAACGT CCAACCGTGC TCGCCGGAGG CACTTTTCCT 250

GGGACGTTGA TCACCGGTCA GAAAGTAAGG AATATTAGTT TGCGTCAAAG 300

AGCCAACCAA AATTAACCGT CCCGTCCCAT AGGGTGACAA CTTCCAGCTC 350

AATGTCATTG ATGATCTTAC CGACGATCGG ATGTTGACAC CAACTTCCAT 400

TGTGAGCCTA TTATTGTATG ATTTATCCGT ATAGTTTCTC AGTCTGATCA 450

TTGGCTCTCT ATCGCTAGCA TTGGCACGGT TTCTTCCAGA AGGGAACCGC 500

TTGGGCCGAC GGTCCCGCCT TCGTAACTCA GTGCCCTATA ATAGCAGATA 550

ACTCTTTTCT GTATGACTTC GACGTCCCCG ACCAAGCTGG TACTTTCTGG 600

TATCATAGTC ATCTATCCAC TCAGTACTGT GACGGTTTAC GTGGTGCCTT 650

CGTTGTGTAC GATCCTAACG ATCCTCACAA AGACCTATAC GATGTTGATG 700

ACGGTGGGTT CCAAATACTT GACCAAGAAA CATTATATTG ATAGTATCCA 750

CTCTGATTTT CAGAGAGCAC CGTGATTACC CTTGCGGATT GGTACCATGT 800

TCTCGCCCAG ACCGTTGTCG GCGCTGCGTG AGTAACACAT ACACGCGCTC 850

CGGCACACTG ATACTAATTT TTTATTGTAG CACTCCTGAT TCTACCTTGA 900

TCAACGGGTT AGGCCGTTCA CAGACCGGAC CCGCTGATGC TGAGCTGGCT 950

GTTATCAGCG TTGAACATAA CAAACGGTAT GTCATCTCTA CCCATTATCT 1000

TCTCTCCTGC TTTAATTCGC TGTTTCACCA TAGATACCGA TTCCGTTTGG 1050

TTTCGATTTC GTGCGACCCC AACTTTACCT TCTCCGTTGA TGGTCATAAT 1100

ATGACTGTCA TCGAAGTCGA CGGTGTCAAC ACACGACCCC TGACCGTTGA 1150

CTCTATTCAA ATCTTCGCCG GACAGAGGTA TTCCTTTGTC GTAAGTTAAT 1200

CGATATATTC TCCCTATTAC CCCTGTGTAA TTGATGTCAA CAGCTCAATG 1250

CTAACCAACC CGACGACAAT TACTGGATCC GTGCTATGCC AAACATCGGT 1300

AGAAATACAA CAACACTGGA CGGAAAGAAT GCCGCTATCC TTCGATACAA 1350

GAATGCTTCT GTAGAAGAGC CCAAGACCGT TGGGGGCCCC GCTCAATCCC 1400

CGTTGAATGA AGCGGACCTG CGTCCACTCG TACCTGCTCC TGTGGTATGT 1450

CTTGTCGTGC TGTTCCATCG CTATTTCATA TTAACGTTTT GTTTTTGTCA 1500

AGCCTGGAAA CGCTGTTCCA GGTGGCGCAG ACATCAATCA CAGGCTTAAC 1550

TTAACTTTCG TACGTACACC TGGTTGAAAC ATTATATTTC CAGTCTAACC 1600

TCTTGTAGAG TAACGGCCTT TTCAGCATCA ACAACGCCTC CTTCACTAAT 1650

CCTTCGGTCC CCGCCTTATT ACAAATTCTG AGCGGTGCTC AGAACGCTCA 1700

AGATTTACTT CCAACGGGTA GTTACATTGG CCTTGAACTA GGCAAGGTTG 1750

TGGAGCTCGT TATACCTCCT CTGGCAGTTG GAGGACCGCA CCCTTTCCAT 1800

CTTCATGGCG TAAGCATACC ACACTCCCGC AGCCAGAATG ACGCAAACTA 1850

ATCATGATAT GCAGCACAAT TTCTGGGTCG TCCGTAGTGC AGGTAGCGAT 1900

GAGTATAACT TTGACGATGC TATCCTCAGG GACGTCGTGA GCATTGGAGC 1950

GGGGACTGAT GAAGTCACAA TCCGTTTCGT GGTATGTCTC ACCCCTCGCA 2000

TTTTGAGACG CAAGAGCTGA TATATTTTAA CATAGACCGA CAATCCGGGC 2050

CCGTGGTTCC TCCATTGCCA TATTGATTGG CATTTGGAGG CAGGCCTTGC 2100

CATCGTCTTC GCTGAGGGCA TCAATCAGAC CGCTGCAGCC AACCCAACAC 2150

CCCGTACGTG ACACTGAGGG TTTCTTTATA GTGCTGGATT ACTGAATCGA 2200

GATTTCTCCA CAGAAGCATG GGATGAGCTT TGCCCCAAAT ATAACGGGTT 2250

GAGTGCGAGC CAGAAGGTCA AGCCTAAGAA AGGAACTGCT ATTTAAACG 2299

其编码漆酶D2，所述漆酶D2具有以下翻译的蛋白质序列(SEQ ID No.16)

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50

TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100

AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFVVYDP 150

NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200

PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VIEVDGVNTR 250

PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPDDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300

LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350

NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400

VVELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWVVRSA GSDEYNFDDA ILRDVVSIGA 450

GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500

AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526

本文的术语“％同一性”是指当应用序列比对程序进行比对时，编码本文描述的漆酶的核酸序列之间或漆酶氨基酸序列之间核苷酸或氨基酸序列同一性的水平。

例如，如在本文所使用的那样，通过算法确定80％序列同一性，并且因此给定序列的同源序列在所述给定序列的长度上具有超过80％序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于80、85、90、95、98％或更高的与给定序列的序列同一性，所述给定序列例如是如本文所描述的漆酶编码序列。

可以用于确定两个序列间同一性的示范性计算机程序包括但不限于，BLAST程序组，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，公众可在互联网上于www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST获得。也参见Altschul等，1990和Altschul等，1997。

当相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评估给定的核酸序列时，一般应用BLASTN程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于针对GenBank蛋白序列和其它公共数据库中的氨基酸序列检索已以所有读码框方式翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX都应用缺省参数运行，所述缺省参数为11.0的空缺口罚分，以及1.0的延伸缺口罚分，并且应用BLOSUM-62矩阵(例如，参见Altschul等，1997)。

为确定两个或更多个序列间“％同一性”的所选序列的比对可以例如应用MacVector版本6.5中的CLUSTAL-W程序进行，用缺省参数操作，包括10.0的空缺口罚分，以及0.1的延伸缺口罚分，以及BLOSUM 30相似性矩阵。

II.介质

在一个实施方案中，酶氧化系统还包含一种或多种增强漆酶活性的化学介质。在本文中将术语“化学介质”(或可在本文互换使用的“介质”)定义为这样的化学化合物，即其作为氧化还原介质起作用，以有效地在表现出氧化酶活性的酶和染料之间穿梭传递电子。在本领域中化学介质也已知称为增强剂和促进剂。

化学介质可以是酚化合物，例如，丁香酸甲酯和相关化合物，如WO95/01426和96/12845所描述的那样。化学介质还可以是N-羟基化合物、N-肟化合物或N-氧化化合物，例如，N-羟基苯并三唑、紫尿酸或N-羟基乙酰苯胺。化学介质还可以是酚噁嗪/吩噻嗪化合物，例如吩噻嗪-10-丙酸酯。化学介质还可以是2，2’-连氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-亚磺酸)(ABTS)。其它化学介质是本领域公知的。例如，已知WO 95/01426中公开的化合物增强漆酶的活性。在具体的实施方案中，介质可以是乙酰丁香酮、丁香酸甲酯、丁香酸乙酯、丁香酸丙酯、丁香酸丁酯、丁香酸己酯或丁香酸辛酯。

介质优选为4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚，或其N-取代的衍生物，例如，诸如，4-(N-甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚、4-[N-(二羟乙基)甲酰氨基]-2，6-二甲氧基苯酚或4-(N，N-二甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚。

可通过下式描述在本发明中应用的介质：

式中，A是诸如-R、-D、-CH＝CH-D、-CH＝CH-CH＝CH-D、-CH＝N-D、-N＝N-D或-N＝CH-D的基团，其中D选自-CO-E、-SO₂-E、-CN、-NXY和-N⁺XYZ，其中E可以是-H、-OH、-R、-OR或-NXY，并且X和Y和Z可以是相同或不同的，并且选自-H、-OH、-OR和-R；R是C₁-C₁₆烷基，优选C₁-C₈烷基，所述烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的并且任选地被羧基、磺基或氨基取代；并且B和C可以是相同或不同的，并且选自C_m H_2m+1，1≤m≤5。

在一个实施方案中，上述式中的A是-CN或-CO-E，其中E可以是-H、-OH、-R、-OR或-NXY，其中X和Y可以是相同或不同的，并且选自-H、-OH、-OR和-R；R是C₁-C₁₆烷基，优选C₁-C₈烷基，所述烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的并且任选地被羧基、磺基或氨基取代；并且B和C可以是相同或不同的，并且选自C_m H_2m+1，1≤m≤5。

在上式中，可将A置于羟基的间位，而不是如所示的置于对位。

在一个实施方案中，介质是

4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚

在一个实施方案中，介质是

4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚。

在一个实施方案中，介质是

4-(N-甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚。

在一个实施方案中，介质是

4-(N，N-二甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚。

在具体的实施方案中，介质可以是乙酰丁香酮、丁香酸甲酯、丁香酸乙酯、丁香酸丙酯、丁香酸丁酯、丁香酸己酯或丁香酸辛酯。介质优选为4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚，或其N-取代的衍生物，诸如，4-(N-甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚、4-[N-(二羟乙基)甲酰氨基]-2，6-二甲氧基苯酚或4-(N，N-二甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚或其组合。

本发明的介质可以以每g粗斜纹布0.005-1000μmole的浓度存在，优选每g粗斜纹布0.05-500μmole的浓度存在，更优选每g粗斜纹布0.5-100μmole的浓度存在。

可通过本领域技术人员公知的方法制备介质，诸如描述于WO97/11217、WO 96/12845和US 5752980中的那些方法。

III.效用

漆酶的工业应用包括纸浆和纸的漂白以及纺织品漂白，例如漂白靛蓝染色的粗斜纹布织物。还发现漆酶可用于染发(例如，参见WO 95/33836和WO 95/33837)。欧洲专利0504005号公开了漆酶可以用于染色羊毛。

本文描述的漆酶可用于染色和漂白纺织品、纤维、纱等。还发现漆酶可用于废水处理、纸浆的去木质作用、高分子量聚合物的解聚、脱墨废纸、芳香族化合物的聚合、化学基团介导的聚合和交联反应(例如，涂料、涂层、生物材料)、以及染料的活化和偶联有机物。漆酶可用在清洁组合物或其组分中，或用在洗涤剂中。

如本文所述，漆酶能够应用氧作为电子受体氧化多种具有不同化学结构的有色化合物。因此，本文展现的漆酶可用于这样的应用，即在这种应用中期望更改与有色化合物相关的颜色，诸如在清洗中，例如，用于移除织物上的食物沾污。在某些情况下，可应用介质或增强剂以获得期望的效果。

本文展现的漆酶可用于纺织业领域。例如，本文所描述的漆酶可用于纤维或其它织物或制造物品的处理、加工、精加工、完善或生产。本文的酶例如可用于粗斜纹布处理(漂白污迹处理)；用于脱色靛蓝废物；用于织物染色；用于纺织品漂白处理；用于纤维改性；用于达到增强的纤维或织物特性，等等。

本文描述的漆酶可用于皮革工业。例如，漆酶可用于动物生皮的处理，包括但不限于生皮的脱毛、灰浸、软化和/或鞣制。

本文还公开了用于从含有木素纤维素的材料中移除木素、漂白含有木素纤维素的材料(即，回收纸的酶脱墨)和/或处理产生自造纸或造纤维素的废水的方法。该方法应用从下皮黑孔菌属中的种获得的漆酶，同时加入或计量非芳族氧化还原剂及酚类和/或非酚类芳族氧化还原化合物，木素的酚单元和非酚单元被这些酚类和/或非酚类芳族化合物的作用直接氧化，或者该木素被由这些化合物的氧化作用产生的其它酚类和/或非酚类化合物氧化。

本文描述的漆酶可用于纸浆和纸领域。例如，漆酶可用于从原材料诸如木头、竹子和谷类作物稻秸制造纸浆和绒毛浆(fluff pulp)；用于制造用于印刷和书写、包装、卫生和其它技术应用的纸及板材；用于回收纤维素纤维以制造纸和板材；以及用于处理由纸浆或纸磨碎机或其它专用于制造纸、纸浆或绒毛浆的设备产生并处理的废产品。本文展现的酶例如可用于木头加工、用于纸浆漂白、用于木纤维改性、用于MDF生产的生物胶(木素活化)、用于增强纸特性、用于墨移除、用于纸染色、用于胶粘(例如，用于颗粒或纤维板材的基于木素的胶粘)，等等。

本文描述的漆酶可用于饲料领域。例如，本文展现的漆酶可单独用作饲料添加剂或作为饲料添加剂的一部分，以增加任意种类动物的饲料的营养值，所述动物诸如鸡、牛、猪、鱼和宠物；和/或用作加工助剂以加工植物材料和食物工业副产品，以生产适合作为饲料原材料的材料/产品。

本文描述的漆酶可用于隐形眼镜清洁领域。例如，漆酶可用于隐形眼镜的清洁、储存、消毒和/或防腐。

本文描述的漆酶可用于淀粉领域。例如，漆酶可用于加工包括淀粉和/或谷物在内的底物至右旋糖(dextrose)糖浆、果糖糖浆或任何其它糖浆、醇(饮料或燃料)或糖。此类淀粉加工可以包括诸如底物的液化、糖化、异构化和去支链化的加工步骤。

本文描述的漆酶可用于食品领域。例如，漆酶可用于制备、加工、或作为食物中的活性组分，所述食物诸如用于人类消费的黄油、基于茶的饮料、烹饪产品、烘烤食品以及冷冻食品。漆酶例如可用作食品保存中的面包改进剂，用作除氧剂，等。

本文描述的漆酶可用于个人护理领域。例如，漆酶可用于人类的个人产品的制备，诸如芳香剂，以及人类皮肤护理、头发护理、口腔保健、个人清洗和除臭和/或止汗的产品。本文展现的酶可用于例如染发和/或漂白头发、指甲染色和/或漂白、皮肤染色和/或漂白、表面改性(例如，作为偶联剂)、作为抗微生物剂、用于除去气味、牙齿洁白，等等。

本文描述的漆酶可用于清洗领域。例如，漆酶可用于清洗、处理或护理洗衣物品，诸如衣物或织物；用于清洗家用硬表面；用于盘护理，包括机械洗盘应用；以及用于皂条和皂液和/或合成的表面活性剂条和液。本文展现的酶例如可用于染料移除/脱色，和/或用于移除气味，和/或用于卫生处理，等等。

本文描述的漆酶可用于废水处理领域。例如，漆酶可用于有色化合物的脱色；用于酚组分的脱毒；用于抗微生物活性(例如，在水回收中)；用于生物矫正，等等。

本文描述的漆酶可用于生物材料领域。例如，漆酶可用作多种有机反应的生物催化剂；和/或用于与生物聚合物连接；用于与包装材料连接；用于与胶粘剂连接；用于表面改性(活化和偶联剂)；用于伯醇的生产；用于与生物传感器连接和/或有机合成，等等。

本文描述的漆酶可用于抗微生物领域。例如，漆酶可用作清洁组合物中的抗微生物剂，或用于减少或消除多种食物(例如，肉)或饲料中的微生物载量。

漆酶介质可用作卫生处理和抗微生物剂(例如，木材保护，洗涤剂)。该介质可独立于酶使用，或与酶组合使用。

本文所使用的“清洁组合物”和“清洁制剂”是指能用于从待清洁的物件诸如织物等中移除不期望的化合物的组合物。该术语包含任何选择用于所期望的特定类型清洁组合物和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)的任何材料/化合物，只要该组合物与漆酶和该组合物中使用的其它酶相容。通过考虑待清洁的表面、物件或织物，以及在使用期间对于清洁条件而言期望的组合物形式，能很容易地作出清洁组合物材料的具体选择。

该术语还涉及适于清洁和/或漂白任何物品和/或表面的任何组合物。预期该术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液态和/或固态洗衣洗涤剂和细薄织物洗涤剂；硬表面清洁制剂，诸如用于玻璃、木头、陶瓷和金属柜台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶净洗剂；以及纺织品和洗衣预除污剂，以及盘洗涤剂)。

实际上，除非另外说明，本文的术语“清洁组合物”包括颗粒状或粉末形式的通用或重型清洁剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的通用清洗剂，尤其是所谓的重型液体(HDL)型；细薄织物液体洗涤剂；手洗盘剂或轻型洗盘剂，尤其是高泡类型的那些；机械洗盘剂，包括各种用于家用和公共使用的片状、粒状、液体或助清洗型；液体清洁和消毒剂、车或地毯洗洁剂、浴室清洁剂；洗发剂和染发液；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洗剂；以及清洁辅助剂诸如漂白添加剂和“染色棒(stain-stick)”或预处理型。

本文所使用的术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指预期用于洗涤介质的混合物，用于清洁污染物品。在一些实施方案中，该术语在洗织物和/或服装时使用(例如，“洗衣洗涤剂”)。在备选的实施方案中，该术语是指其它洗涤剂，诸如用于清洁盘子、餐具等的那些(例如，“洗盘洗涤剂”)。不期望将目前考虑的组合物限定至任何具体的洗涤剂制剂或组合物。实际上，除了漆酶外，预期该术语还包含含有表面活性剂、转移酶、水解酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂的洗涤剂。

本文所使用的术语“硬表面清洁组合物”是指用于清洁硬表面诸如地板、墙壁、瓷砖、不锈钢容器(例如，发酵罐)、浴室和厨房设备等的洗涤剂组合物。以任一形式，包括但不限于固态、液体、乳剂等形式提供此类组合物。

实施例

实施例1.使用经密码子优化的合成基因在芽孢杆菌属中表达漆酶D 基因为BCE103融合物。

DNA(SEQ ID NO：71)：

GGATCCTGAA GCTATCGGTC CGGTTGCAGA TTTACACATC GTAAACAAAG 50

ATCTTGCACC TGACGGCGTT CAACGTCCAA CTGTACTTGC TGGTGGAACA 100

TTCCCTGGTA CACTTATTAC TGGTCAAAAA GGTGACAACT TCCAATTAAA 150

CGTAATTGAC GATCTTACAG ATGACCGTAT GCTTACACCG ACTTCAATTC 200

ACTGGCACGG TTTCTTTCAA AAAGGAACAG CATGGGCTGA TGGTCCTGCA 250

TTCGTTACAC AATGTCCAAT CATTGCTGAT AACTCTTTCC TTTACGATTT 300

TGACGTTCCT GATCAAGCTG GTACATTCTG GTATCACTCA CACTTATCCA 350

CACAATACTG CGATGGACTT CGCGGAGCTT TCGTAGTTTA CGACCCAAAC 400

GATCCTCATA AAGACCTTTA CGATGTAGAT GATGGTGGAA CAGTTATCAC 450

ATTAGCTGAT TGGTACCATG TACTTGCTCA AACAGTTGTA GGTGCAGCTA 500

CACCAGATTC AACACTTATC AATGGATTAG GACGTTCTCA AACTGGTCCT 550

GCTGACGCAG AACTTGCTGT AATCTCTGTT GAACATAACA AACGTTACAG 600

ATTCCGTCTT GTTAGCATTT CTTGCGATCC AAACTTCACA TTTTCAGTTG 650

ACGGACATAA CATGACAGTT ATCGAAGTAG ATGGTGTAAA CACACGTCCA 700

CTTACTGTAG ACTCTATCCA AATCTTCGCA GGACAACGTT ACTCATTCGT 750

ATTAAACGCA AATCAACCAG AAGATAACTA CTGGATTCGT GCAATGCCAA 800

ACATCGGACG TAACACTACA ACTCTTGACG GCAAAAACGC AGCTATTCTT 850

CGTTACAAAA ACGCTTCTGT TGAAGAACCT AAAACAGTTG GTGGACCAGC 900

ACAATCACCA CTTAACGAAG CTGACTTACG TCCACTGGTT CCAGCACCTG 950

TACCTGGAAA CGCTGTACCA GGAGGTGCTG ATATTAATCA TAGACTTAAC 100

CTTACTTTCT CTAACGGTCT GTTCTCAATC AACAACGCTT CATTCACAAA 1050

TCCTTCAGTT CCAGCACTTT TACAAATTCT TAGCGGTGCA CAAAATGCTC 1100

AGGATCTTTT ACCAACTGGA TCTTACATTG GTCTTGAACT GGGTAAAGTA 1150

GTTGAATTAG TAATTCCTCC GCTTGCTGTA GGTGGACCAC ATCCTTTCCA 1200

TCTTCACGGT CATAACTTCT GGGTTGTACG TTCTGCTGGT TCAGATGAAT 1250

ACAACTTCGA TGACGCAATT CTTCGTGATG TTGTATCTAT TGGTGCTGGA 1300

ACAGATGAAG TAACTATTCG TTTCGTAACA GATAACCCTG GTCCTTGGTT 1350

CTTACATTGT CATATCGATT GGCATCTTGA AGCTGGACTT GCTATTGTTT 1400

TCGCTGAAGG AATCAATCAA ACAGCTGCAG CTAACCCAAC ACCTCAAGCA 1450

TGGGACGAAT TATGTCCAAA ATACAACGCA CTTTCTCCAG GAGATACTTA 1500

AAAGCTT 1507

其编码漆酶D基因，并由DNA2.0Inc.(1455Adams Drive，Menlo Park，CA94025)合成。用限制性酶BamHI和HindIII消化合成的质粒DNA，并且从凝胶中分离1.5kb的DNA片段，并将其连接至用相同的两个限制性酶消化的p2JMagk103lnk2载体(参见US20050202535A1)中，以产生表达质粒p2JMagk103lnk2E-漆酶(图1)。将该质粒转化至枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株中(degUHy32、oppA、DspoIIE、DaprE、DnprE、Depr、DispA、Dbpr、Dvpr、DwprA、Dmpr-ybfJ、DnprB、amyE::xylRPxylAcomK-ermC)(参见US20050202535A1)。在具有5mg/ml氯霉素的LB琼脂板上选择两个转化子，并且随后选择具有较高基因拷贝数的克隆，将克隆在具有25mg/ml氯霉素的LB琼脂板上连续画线，直到获得快速的克隆生长。将扩增的转化子接种至30ml含有0.5mM铜的MBD培养基(参见 US20050202535A1)中。在37℃培养该培养物60小时。离心培养物肉汤并且将上清液用于ABTS测试。

实施例2.用不同的漆酶漂白溶解的靛蓝

如下那样在96孔微量滴定板中进行通过漆酶/介质组合来漂白溶解的靛蓝测试法。

通过在室温于NMP(10ml)中搅拌靛蓝(30mg)5小时制备靛蓝的N-甲基吡咯烷酮(NMP)饱和溶液。将NMP溶液在水缓冲溶液中稀释10倍，得到蓝色溶液。例如，稀释至pH 5的50mM醋酸钠缓冲液中，或pH 7的50mM磷酸钠缓冲液中。在使用前即刻充分振荡溶液。

在96-孔微量滴定板中进行漂白溶解的靛蓝底物的测试法，其中每孔接受在pH 5的50mM醋酸钠缓冲液中的可溶靛蓝溶液(180μL)、漆酶(10ppm酶)和介质溶液(来自甲醇中的20mM储液)。用去离子水将每孔的总体积调节至200μL。一式两份地运行仅含有漆酶的对照。将板密封，并在加热的搅拌器(Thermomixer，Eppendorf)上以800转/分钟在50℃温育2小时。在该时期之后，解封该板，并且将抗坏血酸溶液(20μL 10％水溶液)加入到每一孔中，以还原氧化形式的介质。然后通过应用微量滴定板读数器确定每一孔在600nm处的吸光度从而评估靛蓝漂白的程度。吸光度读数越低，则靛蓝漂白的程度越高。

图2显示了来自梭孢壳属中的种的漆酶(Ecostone LCCl0，AB enzymes，Darmstadt，德国)的结果。使用的介质是2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-亚磺酸)(ABTS)、丁香酸、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)、丁香酸甲酯(MS)、4-(N-甲基甲酰氨基)-2，6-二甲氧基苯酚(MSA)、10-(羧基丙基)-吩噻嗪(PTP)和丁香醛。表1中列出了在600nm处相对于对照的吸光度改变，其中吸光度的最大改变对应于最大程度的靛蓝漂白。

在500μM浓度的介质时，对于靛蓝漂白最有效的介质是ABTS，随后是N-甲基酰胺(MSA)和未取代的酰胺、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)。在50μM的较低介质浓度时，ABTS仍然是最有效的介质，其余的介质或多或少是等价的。例外的介质是丁香酸，其漂白可溶靛蓝的效率不比对照条件高。

表1.用来自梭孢壳属中的种的漆酶和500及50μM浓度的多种介质漂白可溶靛蓝后，在600nm处吸光度的改变(n＝2)

Figure DEST_PATH_G54878779150138000D000011

实施例3.在两种pH值下用不同漆酶进行的可溶靛蓝漂白测试法

对源自毁丝霉属中的种的漆酶(

II(

II)，Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)、梭孢壳属中的种的漆酶(Ecostone LCC10，AB enzymes，Darmstadt，德国)和下皮黑孔菌属中的种的漆酶进行评估，评估它们在两种pH值下与低分子量介质联合漂白溶解的靛蓝的能力。

如实施例1描述的那样进行在96孔微量滴定板中的溶解靛蓝的漂白，在5和7的pH值下应用3种不同的漆酶。所应用的介质是芥子酸、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)、4-乙酰丁香酸甲酯(AMS)、丁香酸甲酯(MS)和2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-亚磺酸)(ABTS)。图3和4显示了应用分别源自毁丝霉属、梭孢壳属和下皮黑孔菌属中的种的三种漆酶在5和7的pH值下漂白可溶靛蓝的结果。这些数据如表2和3所示。

表2.于250μM的介质浓度，在pH5使用来自梭孢壳属、毁丝霉属和下皮黑孔菌属中的种的漆酶漂白可溶靛蓝后，相对于对照在600nm处吸光度的改变

表3.于250μM的介质浓度，在pH7使用来自梭孢壳属、毁丝霉属和下皮黑孔菌属中的种的漆酶漂白可溶靛蓝后，相对于对照在600nm处吸光度的改变

实施例4.用单色下皮黑孔菌漆酶漂白粗斜纹布样品

在50lb实验室标准翻滚洗涤机中以每升1克的剂量用

2XL预处理粗斜纹布腿部(denim legs)(由来自Cone Mill，型号1662P的硫底/靛蓝染色的粗斜纹布制得)。浴比(liquor ratio)是6比1(30升水中5kg底物)并且于pH4.5在55℃处理1小时。在纤维素酶处理后，进行温漂洗，随后在翻滚干燥器中干燥该织物。应用冲床从

2XL预处理的粗斜纹布腿部切得5/8英寸粗斜纹布圆片。用Minolta比色计CR-200预读每一粗斜纹布圆片，以确定该织物圆片正面和背面的CIE L^＊a^＊b^＊值。

将一片粗斜纹布圆片置于一式两份的两个12孔微量滴定板的每一孔中。每一孔接受单色下皮黑孔菌漆酶(20μL的1/20稀释，约20ppm)、介质(200、100、50或20μL的在甲醇中的20mM储液)和50mM，pH6的磷酸钾缓冲液，总体积是2mL/孔。介质是丁香酸甲酯(MS)、4-氰基-2，6- 二甲氧基苯酚(SN)和3，4，5-三甲氧基苯酚(TMP)。密封板并在标准保温箱中在150转/分钟在50℃温育2小时。在这一时期后，从板中移出样品，并且将其小心放置于布氏漏斗中的滤纸上，并且用大量的水洗涤，随后在高真空下过夜干燥残留的水。然后用比色计再读该样品，以确定漂白后该圆片的正面和背面的CIE L^＊a^＊b^＊值。根据下式从最初和最后的CIEL^＊a^＊b^＊值的不同计算总色差(ΔE)

ΔE＝(ΔL²+Δa²+Δb²)^1/2

在图5和6中绘制了作为介质浓度函数的总色差(ΔE)。最有效的介质是4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚(SN)，随后是丁香酸甲酯(MS)。对该两种化合物都观察到了剂量/反应关系，其中较低浓度的介质给出较少的漂白。在这些条件下，第三种介质，即3，4，5-三甲氧基苯酚(TMP)不是有效的介质。这些数据如表4所示。

表4.用单色下皮黑孔菌漆酶(20ppm)和不同浓度的3种介质处理的粗斜纹布样品正面和背面L、a、b和总色差(E)的变化。

¹MS-丁香酸甲酯、SN＝4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、TMP＝3，4，5-三甲氧基苯酚

²通过从最终读数减去初始读数确定L、a、和b的差异

实施例5.用重组单色下皮黑孔菌漆酶D漂白粗斜纹布样品

在这一实施例中，应用重组形式的衍生自单色下皮黑孔菌的漆酶D蛋白，如在实施例16描述的那样进行粗斜纹布样品漂白测试法。

将粗斜纹布圆片上样至两个重复的12孔板中。漆酶D储液(每mL 5.5ABTS单位)的剂量是每孔25或50μL。所应用的介质是丁香酸甲酯(MS)、4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚(SN)、4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)，并且以0.5或1mM的浓度使用。结果如图7和8所示。表5列出了L、a、b值的变化和相应的总色差(ΔE)。该结果表明在这些条件下，4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚(SN)对于粗斜纹布样品漂白是最有效的介质。

表5.作为使用来自单色下皮黑孔菌的漆酶D的漆酶/介质组合的函数的经漂白粗斜纹布圆片的总色差

¹MS＝丁香酸甲酯、SN＝4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚、SA＝4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚

²漆酶储液是针对ABTS的5.5U/mL活性的浓缩物。

实施例6.在单色下皮黑孔菌漆酶的存在下介质的稳定性

在实施例5描述的粗斜纹布圆片漂白方案后，通过LC/MS分析上清液的等分试样，以确定在2小时的温育期后，上清液中介质的终浓度。

通过将甲醇中的储液(20mM)稀释至去离子水中制备介质的标准溶液，从而使得对于三种介质丁香酸甲酯(MS)、4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚(SN)和4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)每一种的终浓度分别是1mM。应用以阳性电喷射离子化模式操作的Thermo Finnegan Quantum TSQ LC/MS系统(Thermo Finnegan，San Jose，CA)分析样本。液相色谱条件如下：

柱：Agilent Zorbax SB-Aq，2.1mmx100mm，3.5μM二氧化硅；

溶剂A：20mM甲酸铵，pH 5.0；

溶剂B：90％甲醇+10％溶剂A

流速：250μL/分钟

注射体积：5μL；

洗脱程序：0至1分钟70％溶剂A，第3至4分钟30％溶剂A，在4.5分钟回至70％A，维持在70％A直到总共8分钟。

质谱法条件如下：

在全扫描模式中的阳性模式电喷射离子化(+ve ESI)，在0.5秒中从175Da扫描至240Da。

喷射电压为4200V、管状屏极气流速41mL/分钟、辅助气流速15mL/分钟。

管透镜电压为109V，并且毛细管温度为270℃。

该实验的结果显示于表6。

表6.通过用于漂白粗斜纹布圆片的上清液中的初始浓度和终浓度确定的介质稳定性

介质	初始峰面积	最终峰面积	％残留
				MS	133x10⁷	40.2x10⁷	30.2％
SN	35.6x10⁷	35.2x10⁷	98.9％
				SA	122x10⁷	0.94x10⁷	7.8％

结果表明，在与漆酶和底物在50℃、2小时的标准温育条件下接触后，介质的稳定性有很大不同。在该实施例中，4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚(SN)是最稳定的化合物，其浓度基本上没有改变(98.9％残留)，其后是丁香酸甲酯(30.2％残留)。最不稳定的介质化合物是4-甲酰氨基-2，6-二甲氧基苯酚(SA)，在实验终点，其只剩下7.8％。

实施例7.纯化和比活性的确定

在14升发酵罐中应用描述于共同待决申请US 60/984,430(代理人案号GC993P，标题为“用于改进宿主细胞中异源蛋白质产量的信号序列和共表达的伴侣分子，2007年11月1日提交)中的表达系统表达漆酶D优化的基因(参见共同待决的申请代理人案号GC942和60/875,518中的SEQ ID NO：70)。在184小时收集发酵肉汤并通过超滤(UFC 20070245)浓缩。将该浓缩物透析过滤至25mM醋酸钠、pH4.0缓冲液中。然后将500mL透析过滤的UFC样本上样至用25mM醋酸钠、pH4.0缓冲液平衡的含有Poros HS-20树脂的离子交换柱(Applied Biosystems，20X275mm柱)上。用10倍柱体积的25mM醋酸钠、pH4.0缓冲液洗涤该柱。应用在25mM醋酸钠、pH4.0缓冲液中40mM至80mM的氯化钠盐梯度(12倍柱体积)从柱上洗脱漆酶D蛋白。收集含有漆酶活性的级分并用具有10K膜的Amicon 400mL搅拌式超滤装置进一步浓缩。通过SDS蛋白质凝胶应用BSA作为标准品测量总蛋白为4mg/ml(＞90％纯度)。用水将该漆酶样品稀释10,000倍，并且在室温储存18小时，以及在4℃储存超过24小时。测得ABTS活性为8570单位/ml。然后通过将8570单位/ml除以4mg/ml计算重组漆酶D的比活性，得到2140单位/mg蛋白，其比葡萄穗霉属漆酶(16u/mg)的活性高100多倍，参见Mander等，Appl.Environ.Microbiol.(2006)72：5020-5026)。因此，通过高比活性的优点，该酶导致了比其它漆酶(例如葡萄穗霉属漆酶)更低的排放至环境的铜排放量。

实施例8.粗斜纹布漂白的方法

介质

4-羟基-2，6-二甲氧基苯甲酰胺(丁香酰胺，SA)购自Punjab Chemicals&Crop Protection Limited(Mumbai，印度)。4-羟基-3，5-二甲氧基苄腈(丁香腈，SN)获自StereoChemical，Inc.，(Newark，DE)或Punjab Chemicals&Crop Protection Limited(Mumbai，印度)。

酶

在本实验中使用了源自单色下皮黑孔菌的漆酶(实施例7，8570U/ml， 4mg蛋白/ml)。

方法

在pH、温度、酶浓度和介质浓度的不同条件下，在ATLAS LP 2Launder-O-meter中进行酶温育。

在含有100ml液体的500ml不锈钢反应容器中进行反应。往每一容器中加入5块(7x7cm)经石洗的(stonewashed)粗斜纹布样品(ACG粗斜纹布型80270)和6个6mm直径的钢球。关闭反应容器，并使其进入预加热至期望温度的Launder-O-Meter中。使温育进行30分钟，随后用“流动”自来水洗涤样本，在AEG IPX4离心机中旋转干燥，并在程序棉(programcotton)下用Elna Press Electronic烙铁干燥，并进行评估。

粗斜纹布的石洗

在以下条件下在Unimac UF 50洗涤器中使粗斜纹布退浆，所述粗斜纹布12块腿部重约3kg：

●以10∶1的浴比、50℃，用0.5g/l(15g)Optisize 160淀粉酶(Genencor)和0.5g/l(15g)非离子表面活性剂(例如，Rucogen BFA(Rudolf Chemie)或Ultravon GPN(Huntsman))退浆15分钟。

●以30∶1浴比冷漂洗5分钟两次。

退浆后，按以下条件在Unimac UF 50洗涤器中石洗粗斜纹布：

●以10∶1浴比冷漂洗5分钟

●以10∶1浴比，在55℃，用1kg浮石、柠檬酸盐缓冲液(30g二水柠檬酸三钠和30g一水柠檬酸)和35g IndiAge 2XL纤维素酶(Genencor)石洗60分钟。

●以30∶1浴比冷漂洗5分钟两次。

在Miele Novotronic T494C家用织物干燥器中干燥粗斜纹布。从该粗斜纹布腿部中切出7x7cm的样品。

粗斜纹布样品的评估

在具有D 65光源的CIE Lab彩色空间中用Minolta比色计CR 310测量5个粗斜纹布样品的颜色。在漆酶处理前和处理后进行测量，并且将5 个样品的结果取平均值。计算总色差(TCD)。可以用以下公式计算总色差：

TCD＝√(ΔL)²+(Δa)²+(Δb)²。

粗斜纹布腿部的评估

在具有D 65光源的CIE Lab彩色空间中用Minolta比色计CR 310评估粗斜纹布腿部。只在漆酶处理后进行测量。对于每一粗斜纹布腿部，取得8次测量，并对12块腿部(96次测量)的结果取平均值。

实施例9.温度对重组漆酶D漂白性能的影响(Unimac)

经石洗的粗斜纹布的漆酶漂白：如实施例8所描述的那样退浆并石洗粗斜纹布，所述粗斜纹布的12个腿部约为3kg。在石洗后，根据如下方法在Unimac UF 50洗涤器中进行漆酶处理。

●在10∶1浴比下30分钟

●pH 6(21g磷酸一钠和5g己二酸，重组漆酶D)或pH 4.8(8.6g磷酸一钠和16.8g己二酸，Novoprime Base 268漆酶)

●漆酶(重组漆酶D或Novoprime Base 268)

●介质(丁香酰胺(SA)和丁香腈(SN))

●在漆酶处理后，在30∶1的浴比下在冷水中漂洗该粗斜纹布5分钟，漂洗两次。

进行了漆酶实验并且结果如表7和8所示

表7

单色下皮黑孔菌漆酶浓度	介质	介质浓度	温度 (℃)	漂白水平 (CIE L)
					0.05g/l/0.4U/ml	SA	0.33mM	60	35.6
0.05g/l/0.4U/ml	SN	0.47mM	60	35.9
					0.05g/l/0.4U/ml	SA	0.33mM	40	35.6
0.05g/l/0.4U/ml	SN	0.47mM	40	35.7

表8

Novoprime base 268 浓度	介质浓度	温度 (℃)	漂白水平(CIE L)
				0.05g/l	0.023g/l	60	35.9
0.05g/l	0.023g/l	40	33.7

[0339] 重组漆酶D在较低温度下具有比当前可商业获得的漆酶更好的性能。该漆酶(在介质的存在下)在低于60℃，优选40℃至60℃的温度间提供漂白效果。因此，该漆酶可以给织物处理器提供能量益处。

实施例10.重组漆酶D酶和介质浓度对漂白性能的影响(Launder-O-meter)

在pH 6(用氢氧化钠4N溶液调节pH的50mM磷酸一钠缓冲液)和于60℃的温度运行下表的实验，评估漆酶和介质浓度的影响。

用丁香酰胺(SA)和丁香腈(SN)介质进行该实验。

往具有5个7x7cm样品的烧杯中加入100ml缓冲液。总重量为12g(粗斜纹布∶浴比＝1∶8)。如下表应用漆酶和介质浓度。

表9

漆酶浓度 (μl/l)	活性对应 (漆酶单位/g粗斜纹布)
		10	0.67
33	2.17
		55	3.67
78	5.17
		100	6.67

表10

介质浓度(mM)
	0.10
0.33
	0.55
0.78
	1.00

将下表所标明的丁香酰胺或丁香腈介质的量作为在98％甲醇中的275mM SA或SN储液的稀释物加入到每一烧杯中。如下表所标明的那样，将漆酶作为400单位/ml漆酶储液的稀释物加入到每一烧杯中。封闭烧杯并如实施例8所描述的那样在60℃进行处理。如在实施例8那样评估样品。

表11

TCD＝总色差

表12

TCD＝总色差

上表和图9及10显示需要酶和介质两者以得到漂白。其还显示在达到某个漂白水平时，酶/介质比例存在一些可变性。

实施例11.重组漆酶D对漂白性能的剂量反应影响(Unimac)

经石洗的粗斜纹布的漆酶漂白：如实施例8所描述的那样退浆并石洗粗斜纹布，所述粗斜纹布的12个腿部约为3kg。石洗后，根据如下方法进行漆酶处理：在10∶1浴比、pH 6(21g磷酸一钠和5g己二酸)、60℃、漆酶和介质中30分钟。在酶处理后，在30∶1的浴比下在冷水中漂洗该粗斜纹布5分钟，进行两次。

进行了以下实验：

丁香酰胺0.33mM：

单色下皮黑孔菌漆酶浓度(g/l)	漂白水平(CIE L)
		0.010	34.6
0.05	36.2
		0.25	36.2

丁香腈0.39mM：

单色下皮黑孔菌漆酶浓度(g/l)	漂白水平(CIE L)
		0.25	37.7
0.4	39.5
		0.53	38.8

结果如上表所示。这些结果显示用重组漆酶D和酰胺介质，漂白水平很快即进入平台。在0.05和0.25的酶浓度下，得到了相同的漂白结果。对于重组漆酶D和腈介质，直至0.4g/l，漂白水平是升高的，在0.4g/l时显然是最佳值。

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅是用于阐述目的，根据它们的各种变形或改变对于本领域技术人员是很容易想到的，并且包括在本申请的原理和范围以及所附权利要求的范围之内的。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均在此全文引入作为参考。

Claims

1.用于在染色织物表面的色密度中提供漂白外观的方法，该方法包括在水介质中使染色织物与酚氧化酶系统和下式的增强剂接触：

式中，A是-CN；并且B和C可以是相同的或不同的，并且选自C_m H2_m+1，1≤m≤5。

2.根据权利要求1的方法，其中用还原染料染色该织物。

3.根据权利要求1的方法，其中该织物是纤维素织物或纤维素纤维的混合物或纤维素纤维和合成纤维的混合物。

4.根据权利要求1的方法，其中该织物是粗斜纹布。

5.根据权利要求1的方法，其中所述的酚氧化酶系统是过氧化物酶和过氧化氢源。

6.根据权利要求5的方法，其中该过氧化物酶是辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶或源自鬼伞属(Coprinus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、粘球菌属(Myxococcus)的过氧化物酶。

7.根据权利要求5的方法，其中所述的过氧化氢源是过氧化氢或过氧化氢前体，或产生过氧化氢的酶系统，或过氧羧酸或其盐。

8.根据权利要求1的方法，其中所述的水介质含有H₂O₂或H₂O₂的前体，其浓度为对应于0.001-25mM H₂O₂。

9.根据权利要求1的方法，其中所述的酚氧化酶系统是与氧一起的漆酶或漆酶相关酶。

10.根据权利要求9的方法，其中所述漆酶源自：曲霉属(Aspergillus)；脉孢菌属(Neurospora)；柄孢壳属(Podospora)；葡萄孢属(Botrytis)；金钱菌属(Collybia)；下皮黑孔菌属(Cerrena)；葡萄穗霉属(Stachybotrys)；革耳属(Panus)；梭孢壳属(Theilava)；层孔菌属(Fornes)；香茹属(Lentinus)；侧耳属(Pleurotus)；栓菌属(Trametes)；丝核菌属(Rhizoctonia)；鬼伞属(Coprinus)；小脆柄菇属(Psatyrella)；毁丝霉属(Myceliophthora)；柱顶孢属(Schytalidium)；射脉菌属(Phlebia)；或革盖菌属(Coriolus)；棉皮孔菌属(Spongipellis)；多孔菌属(Polyporus)；拟蜡菌属(Ceriporiopsis)；灵芝属(Ganoderma)或木霉属(Trichoderma)。

11.根据权利要求1的方法，其中所述织物是粗斜纹布，并且所述酚氧化酶的浓度对应于每g粗斜纹布0.001-10000μg酶蛋白。

12.根据权利要求1的方法，其中所述增强剂是4-氰基-2，6-二甲氧基苯酚。

13.根据权利要求1的方法，其中所述织物是粗斜纹布，并且水介质中的增强剂以每g粗斜纹布0.005至1000微摩尔的浓度存在。

14.根据权利要求10的方法，其中所述漆酶源自下皮黑孔菌属中的种(Cerrena spp.)。

15.根据权利要求14的方法，其中所述漆酶源自单色下皮黑孔菌(Cerrena unicolor)。

16.根据权利要求15的方法，其中所述漆酶是单色下皮黑孔菌漆酶D。

17.根据权利要求6的方法，其中所述过氧化物酶是源自灰盖鬼伞(C.cinereus)、长根鬼伞(C.macrorhizus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、或变绿粘球菌(M.virescens)的过氧化物酶。

18.根据权利要求7的方法，其中所述的过氧化氢前体是过硼酸盐或过碳酸盐，所述的产生过氧化氢的酶系统是氧化酶及其底物。

19.根据权利要求10的方法，其中所述漆酶源自：粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、野生革耳(Panus rudis)、绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、褶纹鬼伞(Coprinus plicatilis)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermonhila)、射脉菌(Phlebia radita)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、粗皮灵芝(Ganodermatsunodae)。

20.根据权利要求2的方法，其中所述还原染料是靛蓝或硫靛。

21.根据权利要求4的方法，其中所述织物是用靛蓝或硫靛染色的粗斜纹布。