CN103444431B - 一种革耳菌菌株及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种革耳菌菌株及其应用方法。从天然竹林中的腐朽竹材中筛选得到一种能降解竹材木质素的真菌(Panus rudis)FG-35。该菌株在愈创木酚-PDA和苯胺蓝-PDA培养基上可产生变色圈。该菌株接种于液体培养基，30℃条件下摇床培养7天（装液量1/5,160r/min),过滤获得菌丝球。试验表明，粗竹原纤维接种该革耳菌后，30℃条件下培养15天，纤维素、木质素的降解率分别为9.45%和26.34%。本发明利用微生物液体发酵方法降解竹材木质素，使其为生物酶法制备精细竹原纤维奠定一定基础，该法环保、效率高，具有广阔的应用前景。
Description
发明领域
本发明属于竹材木质素降解技术领域，具体涉及一株高效选择性降解木质素的菌种及其应用方法。
背景技术
竹子是理想的再生纤维素纤维生产原料，其品种主要有毛竹、慈竹、桂竹、青竹、斑竹等。竹纤维是我国自主研发，具有优秀的吸放湿性能，还具有天然的抗菌功能和抗紫外线功能材料。被称为继棉、麻、丝、毛之后的“第五大类天然纤维”，竹纤维面料被誉为“21世纪最具有发展前景的健康面料”。
竹原纤维的主要组成为纤维素，此外还有较多的半纤维素、果胶和木质素等非纤维物质包裹在竹纤维表面。这些胶质，特别是木质素等非纤维素物质胶结在纤维外面，使得原竹呈坚固的片条状。所以，竹材在纺纱过程中须通过一道脱胶过程去除木质素等胶质，以满足纺纱要求。目前，竹纺行业常用的蒸煮方法主要是化学方法，即利用强酸强碱对粗竹原纤维进行处理。然而化学处理工艺能耗大，设备损耗大、且排放的废水无法循环利用，污染问题严重，如何开发出高效、节能、环保的处理粗竹原纤维降解木质素的方法是目前急待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效选择性降解竹材木质素的真菌菌株及其应用的方法；解决竹纤维降解木质素领域存在的难处理、效率低、能耗大、设备损耗大、不环保的问题。
一种革耳菌(Panus rudis)FG-35，该菌株保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
所述的革耳菌(Panus rudis)FG-35的应用方法，用于降解竹材木质素。
本发明提供的高活性的降解竹材木质素的革耳菌菌种(Panus rudis)FG-35，生长繁殖迅速，对木质素降解能力强而对纤维素降解能力很弱，特别有针对性，该菌株接种于液体培养基，30℃条件下摇床培养7天（装液量1/5,160r/min),过滤得到大小均匀的菌丝球，将菌丝球接入到粗竹原纤维中。试验表明，粗竹原纤维接种该革耳菌后，30℃条件下培养15天，纤维素、木质素的降解率分别为9.45%和26.34%。本发明利用微生物液体发酵方法降解竹材木质素，使其为生物酶法制备精细竹原纤维奠定一定基础，该法环保、效率高，具有广阔的应用前景。
本发明菌株命名为革耳FG-35(Panus rudis FG-35)，2013年3月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
附图说明
图1为本发明革耳菌菌株(Panus rudis)FG-35菌落形态图；
图2为本发明革耳菌菌株(Panus rudis)FG-35菌丝形态图；
图3为本发明革耳菌(Panus rudis)FG-35降解粗竹原纤维图；
图4是7株所筛选出的菌株产漆酶的能力。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：菌株分离与纯化
（1）培养基的配置
马铃薯培养基（PDA）：去皮马铃薯200g,切成小块煮沸,然后用4层纱布过滤，滤液中再加葡萄糖20g,琼脂18g,补水至1000mL。120℃灭菌20min。
PDA-愈创木酚培养基：于1L PDA培养基中加入0.4g愈创木酚；
PDA-苯胺蓝培养基：于1L PDA培养基中加入0.1g苯胺蓝；
（2）将取材于湖南黄丰桥林场的天然竹林中的腐朽竹材按1g:20ml的比例置于无菌水中，室温浸泡2天得富集液，然后取0.1ml富集液涂布于分离培养基（PDA-愈创木酚培养基）中，28℃培养2～4天，选取不同位置的菌落划线传代，获得野生型降解木质素的单克隆菌株。
实施例2：获得野生型降解木质素的单克隆菌株的菌丝圈直径、变色圈直径及比值如下：
表1：菌株的菌丝圈直径、变色圈直径及比值
上述野生型降解木质素的单克隆菌株接种在含有愈创木酚的PDA培养基中，愈创木酚是具有木质素特征性苯环结构的类似物，在PDA培养基中加入0.04%的愈创木酚，接种后其产生的颜色反应主要和木质素所分泌的木质素酶活力有关，是筛选木质素降解菌的有效手段。变色圈在菌丝外圈形成（Myce/Col<1）或变色圈在菌丝内圈形成（Myce/Col>1）。Ander Paul等试验表明Myce/Col的比值可以作为选择是否具有木质素降解菌的依据，如果其比值小于1，则选择性降解木质素；如果其比值大于1，纤维素先被降解。
彩绒革盖菌（Coriolus versicolor）别名：云芝、杂色云芝、瓦菌。形态特征：子实体无柄或平伏而反卷，覆瓦状叠生，基部往往贴于基质上，彼此互相连接。主要生于阔叶树的倒木或枯立木上，有时亦长在针叶树的倒木上，导致木材腐朽，具有较强的木素分解能力的白腐菌，也是目前研究最多的木质素降解白腐真菌，其降解木质素的能力主要取决于木素过氧化物酶、漆酶和多酚氧化酶活力的高低，依据其特性目前主要研究其活力和分泌情况对木质素的生物降解、生物制浆及环境保护均具有重要意义。
裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)又称白参、树花，隶属于真菌门，担子菌纲,伞菌目,裂褶菌科,裂褶菌属。特别是在热带、亚热带杂木林下常可找到它的踪迹。裂褶菌多生于夏、秋季初雨后栎、槠、栲等阔叶树的枯木树桩或倒木上,少数生长在针叶树的枯木上,亦能在活树上生长。该属已经发现的共有3个种,其中裂褶菌广布于世界各地。裂褶菌属木腐菌,具有较强的分解木质素、纤维素的能力。通常在含有萄葡糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素和木质素的基质上生长良好。
实施例3：菌种的进一步筛选
具体步骤：利用无菌接种环,将初筛中所纯化的菌株从保存的斜面上转接到PDA培养基中活化,28℃下培养7d后,接种于PDA-愈创木酚培养基上,28℃条件下恒温避光培养,记录菌落周围有无红褐色轮环产生及显色时间（愈创木酚是具有木质素苯环结构特征的木质素类似物，可在菌落周围较快地形成鲜艳而均匀的红棕色氧化圈,且显色时间和颜色的深浅可较好地反应出漆酶的活性,具有针对性强和明显的相关性等特点）。
表123个菌株的PDA-愈创木酚平板显色反应结果
注:-不显色;±开始显色;+、++、+++、++++显色圈逐渐增大。
图4主要是定量的说明7株所筛选出的菌株产漆酶的能力，漆酶也被认为是主要起降解木质素的过氧化物酶类。
实施例4：粗竹原纤维中实际测试菌种效能
培养基
1L含粗竹原纤维的培养基：粗竹原纤维5g,酒石酸铵0.2g，KH2PO41.0g,K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g,ZnSO4.7H2O0.006g，FeSO4.7H2O0.005g，CoCl2.6H2O0.001g，吐温-801g,0.1mol.L-1乙酸缓冲液（pH4.5），余量为水。
1L液态产酶培养基：葡萄糖5g，酒石酸铵0.2g，KH2PO41.0g,K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g,ZnSO4.7H2O0.006g，FeSO4.7H2O0.005g，CoCl2.6H2O0.001g吐温-801g,0.1mol.L-1乙酸缓冲液（pH4.5），余量为水。
将筛选出的7株菌，还有彩绒革盖菌和裂褶菌，分别接种一环经30℃、装液量1/5,160r/min条件下摇床培养7天得到菌丝球，使用的是液体产酶培养基；将大小均匀的菌丝球（每瓶加入3个菌丝球、菌丝球直径大小为0.5cm）接种到30ml含粗竹原纤维的培养基中30℃、装液量1/5,160r/min条件下摇床培养15天）。由表可以看出：9株菌经降解后木质素、纤维素的重量损失率各不相同，差异较大，重量损失也各不相同。在木质素降解方面革耳菌（FG-35号）降解率最高，降解率达26.34%。为了筛选具有降解木质素选择性优良的高产木质素降解酶的菌株。不但要有较强的降解木素能力并且对综纤维素的降解率要低，只有这样，筛选的菌株的选择系数才更大，而选择系数越大，在筛选的菌株在降解竹材木质素及木质素降解方面能力才更大，所以综合以上的指标分析，筛选出的FG-35(G革耳菌)为优良降解木质素菌株。
其测试结果如下表：
9菌株分别接种粗竹原纤维上对竹材降解率的影响
实施例5：本发明革耳菌菌种(Panus rudis)FG-35的鉴定
（1）肉眼观察
（2）菌落形态采用在PDA固体培养板上30℃培养7天，肉眼观察菌丝生长迅速，肉眼观察菌丝长满平板，相互交错连接，呈白色絮状，致密,从培养基背面观察菌落，菌落呈白色（或无色）；紧贴基质,气生菌丝多,菌丝透明无色,分枝繁茂,具横隔。在液体培养液中28℃，160rpm/min，培养四天时,形成白色的球形絮状物，表面具有放射状毛刺。
（3）光学显微镜下观察
使用美兰的单染色法对该菌染色，光学显微镜观察该菌菌丝构成，粗细均匀，有横隔，有分枝。呈放树枝状排列。
（4）分子鉴定
对分离培养的菌株进行DNA的提取及ITS测序，将得到的ITS序列分别于Genebank数据库中进行BLAST搜索，鉴定为革耳菌进一步验证了菌体形态及生理生化特征等形态学鉴定结果的准确性。
Claims (2)
1.一种革耳菌(Panus rudis)FG-35，其特征在于，该菌株保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
2.权利要求1所述的革耳菌(Panus rudis)FG-35的应用方法，其特征在于，用于降解竹材木质素。
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