CN104593275B - 革耳氯烯酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

革耳氯烯酮类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

革耳氯烯酮类化合物及其制备方法和应用，涉及烯酮类化合物。所述革耳菌(Panus rudis)F01315，保藏编号：CGMCC No.8151。所述革耳氯烯酮类化合物包括革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B，所述革耳氯烯酮A的分子式为C22H25ClO6,分子量为420.13；所述革耳氯烯酮B的分子式为C23H27ClO6，分子量为434.15。制备方法：1)种子培养：(1)斜面种子培养；(2)平板种子培养；2)发酵培养；3)提取革耳氯烯酮类化合物；4)精制革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B。所述革耳氯烯酮类化合物可在制备抗肿瘤药物中应用。

Description

革耳氯烯酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及烯酮类化合物，尤其是涉及一种革耳氯烯酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是当前严重威胁人类生命和生活质量的重要疾病之一，是导致人类死亡的重要因素，寻找有效的抗肿瘤药物一直是全世界医学界的重大研究课题。天然产物是一类来源于自然界动物、植物、微生物等生物体的次生代谢产物。天然产物特有的化学结构的复杂性和生物活性的多样性使其在人类对抗疾病的历史中占有不可取代的重要地位，因此也一直是新型抗肿瘤药物的重要来源：从上世纪40年代到2006年的60多年间问世的175种抗肿瘤药物中，小分子药物占155种，其中113种来自于天然产物及其衍生物，占小分子药物的72.9％(Newman D.J.,Cragg G.M.Natural products as sources of new drugs overthe 30years from 1981 to 2010.J.Nat.Prod.2012,23,311-335)。
含卤素的化合物比相应的不含卤素的化合物有更高的药物有效性和生物利用度，所以引入卤素原子是先导化合物结构优化的一种常用手段。海洋生物，尤其是海洋微生物，是活性卤代化合物的主要产生者(王心，王佩，朱统汉，朱伟明.微生物生物活性卤代化合物的研究进展.中国海洋药物杂志.2011,30,40-51)。截止2011年从微生物中分离得到的具有生物活性的卤代天然产物仅163中，其中79个是来源于海洋微生物，仅有33个来源于陆地微生物，由此可见陆地微生物产生卤代化合物是很少见的。
大型真菌是菌物中具有大型子实体的一类特殊真菌，广义上指蘑菇类。大型真菌在长期的进化过程中因抵抗不良的生存环境而慢慢产生了特殊的代谢机制，可产生多种结构新颖且具有较好生物活性的次生代谢产物，是新药开发的重要源泉之一。目前从蘑菇类真菌中分离出的活性物质主要包括萜类、生物碱类、环肽类、多糖类等等。据统计地球上大约有14万种大型真菌，但目前人们研究的还不足其中的10％，所以大型真菌是丰富的天然产物的宝库，但从大型真菌中发现含卤素的活性天然产物还从未见报道(HawksworthD.L.Mushrooms:the extent of the unexploredpotential.Int.J.Med.Mushrooms.2001,3,82；Sekizawa R.,Ikeno S.,Nakamura H.,etal.Panepophenanthrin,from a mushroom strain,a novel inhibitor of theubiquitin-activating enzyme.J.Nat.Prod.2002,65,1491-1493)。
发明内容
本发明的第一目的是提供革耳菌(Panus rudis)F01315。
本发明的第二目的是提供一种革耳氯烯酮类化合物及其制备方法。
本发明的第三目的是提供一种革耳氯烯酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述革耳菌(Panus rudis)F01315，已于2013年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8151。
所述革耳氯烯酮类化合物包括革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B，所述革耳氯烯酮A的分子式为C22H25ClO6,分子量为420.13，手性碳的相对构型为4R、5R、6R、7R、8S、9S、11R、12S、15S，革耳氯烯酮A的结构式为：
所述革耳氯烯酮B的分子式为C23H27ClO6，分子量为434.15，手性碳的相对构型为4R、5R、6R、7R、8S、9S、11R、12S、15R，革耳氯烯酮B的结构式为：
以下给出革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B的结构确定参数：
革耳氯烯酮A：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 443.12179[M+Na]+，得到分子式C22H25ClO6；在600MHz核磁共振仪上以氘代甲醇为溶剂以TMS(三甲基硅烷)做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1；1H-NMR数据为：
表1革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B的1H-NMR和13C-NMR数据(data in ppm)
革耳氯烯酮B：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 457.13884[M+Na]+，得到分子式C23H27ClO6；在600M核磁共振仪上以氘代甲醇为溶剂以TMS做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1；1H-NMR数据为：
所述革耳氯烯酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)种子培养：
(1)斜面种子培养：
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基；再制成试管斜面，从保藏的甘油管中挑取菌种转接到试管斜面培养基上培养，得斜面菌种；
(2)平板种子培养：
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基；将马铃薯培养基倒平板，冷却后将第(1)部分培养的斜面菌种转接到种子培养基中培养，得种子平板；
2)发酵培养
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基作为发酵培养基，将发酵培养基倒平板，待冷却后将步骤1)第(2)部分得到的种子平板上的菌种转接到发酵培养基中发酵培养，得发酵物；
3)提取革耳氯烯酮类化合物
将步骤2)得到的发酵物切成小块，用混合有机溶剂浸提，合并提取液，减压浓缩至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓缩至干得浸膏，在浸膏中加入蒸馏水，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并加压浓缩得到含有革耳氯烯酮的粗提物；
4)精制革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B
将步骤3)得到的含有革耳氯烯酮的粗提物加到反相中压液相柱上，甲醇/水梯度洗脱得组分1和组分2，将组分1经过两次硅胶层析柱，得到革耳氯烯酮A；将组分2经过两次硅胶柱层析和一次凝胶层析，得到革耳氯烯酮B。
在步骤1)第(1)和(2)部分中，所述加水煮沸的时间可为20～40min；所述葡萄糖与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比可为1∶(15～20)；所述灭菌的条件可为121℃下灭菌20min；斜面培养基上培养和种子培养基中培养的条件均为23～30℃下培养3～7d。
在步骤2)中，所述加水煮沸的时间可为20～40min；所述葡萄糖与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比可为1∶(15～20)；所述灭菌的条件可为121℃下灭菌20min；所述发酵培养的条件可为23～30℃下培养10～18d。
在步骤3)中，所述混合有机溶剂可采用乙酸乙酯/甲醇/乙酸，乙酸乙酯、甲醇、甲酸的体积比可为80∶15∶5。
在步骤4)中，所述甲醇/水梯度洗脱的比例变化按体积比可为0/100到100/0；所述将组分1经过两次硅胶层析柱可分别采用反相硅胶和正相硅胶，正相硅胶柱层析使用的有机溶剂是石油醚/乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比可为3∶1；所述将组分2经过两次硅胶柱层析可分别采用正相硅胶和反相硅胶，正相硅胶柱层析使用的有机溶剂是石油醚/乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比可为3∶1，所述一次凝胶柱层析可采用LH-20，有机溶剂为甲醇。
所述革耳氯烯酮类化合物可在制备抗肿瘤药物中应用。所述革耳氯烯酮类化合物包括革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B。
所述肿瘤包括但不限于人胃癌细胞BGC823、人结肠癌细胞HCT116、血癌细胞HL-60和前列腺癌细胞LinCap。
采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝]]法，以顺铂做阳性对照，测定革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B的抗肿瘤细胞活性。革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B对人胃癌细胞BGC823、人结肠癌细胞HCT116、血癌细胞HL-60和前列腺癌细胞LinCap具有显著的活性，半数抑制浓度(IC50)值分别是9.81μmol/L、2.15μmol/L、6.15μmol/L、1.75μmol/L和10.31μmol/L、2.53μmol/L、8.08μmol/L、1.52μmol/L。由于革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B表现出较强的抗肿瘤活性，因此它们具有应用于制备抗肿瘤药物的潜力。
所述革耳菌(Panus rudis)F01315来源于陆生真菌革耳，具有较强抗肿瘤细胞株活性。
本发明从大型真菌革耳菌(Panus rudis)F01315中分离得到的两个结构新颖的氯烯酮化合物革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B，本发明涉及革耳菌F01315菌株的发酵过程，包括种子培养、发酵培养及化合物的纯化和精制过程。细胞水平的药理实验证实，革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B具有显著的抑制肿瘤细胞生长的活性，可在制备治疗抗肿瘤药物中应用。本发明还可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
1.培养基配方：斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的配方相同：取200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，20g琼脂，自来水定容至1000mL。
2.发酵工艺：斜面培养：按上述斜面培养基配方配置培养基，分装试管，121℃灭菌20min，制成斜面培养基。挑取甘油管保种的革耳菌(Panus rudis)F01315转接至斜面培养基上，28℃培养3d；按种子培养基的配方配置培养基，灭菌，将培养基倒Φ＝9cm平板，20mL/培养皿，冷却，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，培养后得到种子平板。发酵培养基按配方配置好后，将上述培养好的种子平板转接到发酵培养基上，28℃培养3d。
3.精制革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B：
革耳菌(Panus rudis)F01315的发酵产物粗提物用中压液相柱层析，甲醇/水从0/100到100/0(v/v)梯度变化。在甲醇/水比例为50/50时洗脱得到组分1，比例为70/30时得到组分2。组分1再经过一次甲醇/水反相硅胶层析和以石油醚/乙酸乙酯(3/1，v/v)做洗脱溶剂的正相硅胶，得到纯化的革耳氯烯酮A。组分2再经过一次甲醇/水的反相硅胶层析，以甲醇做溶剂的LH-20凝胶层析和以石油醚/乙酸乙酯(5/1,v/v)的正相硅胶层析，得到单一的革耳氯烯酮B。
4.革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B抗肿瘤活性的测试：
对数生长期的肿瘤细胞用胰酶消化后，用新鲜的培养基分散成106个/mL的细胞悬液，每孔80μL加到96孔板中，37℃、5％CO2培养过夜。第二天加入20μL用培养基稀释好的待测化合物(顺铂作为阳性对照药物)。继续培养72h，每孔加入10μL的5mg/mL MTT，37℃反应3h，每孔加入100μL 10％SDS-0.01mol/L HCl溶解，用酶标仪设定波长为595nm测定吸收值。另外设定无细胞只有培养基的3个孔作为空白对照孔，只有细胞无测试药物的3个孔为阴性对照孔。对肿瘤细胞的抑制率按下面公式计算：抑制率(％)＝(A阴性对照组-A实验组)/(A阴性对照组-A空白组)×100％。
IC50的测定同上述方法，待测化合物用一定浓度梯度作用于细胞72h，测定各抑制率后用计算软件Graphpad Prism计算得出IC50的值。本发明涉及的两个化合物对肿瘤细胞的IC50值如表2所示。
表2革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B对肿瘤细胞的IC50值(μmol/L)
结论：革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B对多种肿瘤细胞表现出不同程度的抑制作用，尤其是对结肠癌细胞HCT116和前列腺癌细胞LinCap，因此它们有作为抗肿瘤药物的潜力，用于制备抗肿瘤药物。

Claims (10)

1.革耳菌(Panus rudis)F01315，已于2013年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8151。
2.一种革耳氯烯酮类化合物，其特征在于包括革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B，所述革耳氯烯酮A的分子式为C22H25ClO6,分子量为420.13，手性碳的相对构型为4R、5R、6R、7R、8S、9S、11R、12S、15S，革耳氯烯酮A的结构式为：
所述革耳氯烯酮B的分子式为C23H27ClO6，分子量为434.15，手性碳的相对构型为4R、5R、6R、7R、8S、9S、11R、12S、15R，革耳氯烯酮B的结构式为：
3.如权利要求2所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)种子培养：
(1)斜面种子培养：
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基；再制成试管斜面，从保藏的甘油管中挑取菌种转接到试管斜面培养基上培养，得斜面菌种；
(2)平板种子培养：
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基；将马铃薯培养基倒平板，冷却后将第(1)部分培养的斜面菌种转接到种子培养基中培养，得种子平板；
2)发酵培养
马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，过滤得马铃薯滤液；在马铃薯滤液中加入葡萄糖和琼脂，自来水定容，灭菌，得马铃薯培养基作为发酵培养基，将发酵培养基倒平板，待冷却后将步骤1)第(2)部分得到的种子平板上的菌种转接到发酵培养基中发酵培养，得发酵物；
3)提取革耳氯烯酮类化合物
将步骤2)得到的发酵物切成小块，用混合有机溶剂浸提，合并提取液，减压浓缩至干，甲醇溶解过滤，滤液减压浓缩至干得浸膏，在浸膏中加入蒸馏水，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并加压浓缩得到含有革耳氯烯酮的粗提物；
4)精制革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B
将步骤3)得到的含有革耳氯烯酮的粗提物加到反相中压液相柱上，甲醇/水梯度洗脱得组分1和组分2，将组分1经过两次硅胶层析柱，得到革耳氯烯酮A；将组分2经过两次硅胶柱层析和一次凝胶层析，得到革耳氯烯酮B。
4.如权利要求3所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)第(1)和(2)部分中，所述加水煮沸的时间为20～40min；所述葡萄糖与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比为1∶(15～20)。
5.如权利要求3所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)第(1)和(2)部分中，所述灭菌的条件为121℃下灭菌20min；斜面培养基上培养和种子培养基中培养的条件均为23～30℃下培养3～7d。
6.如权利要求3所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述加水煮沸的时间为20～40min；所述葡萄糖与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯滤液中的马铃薯的质量比为1∶(15～20)；所述灭菌的条件为121℃下灭菌20min；所述发酵培养的条件为23～30℃下培养10～18d。
7.如权利要求3所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述混合有机溶剂采用乙酸乙酯/甲醇/乙酸，乙酸乙酯、甲醇、甲酸的体积比为80∶15∶5。
8.如权利要求3所述一种革耳氯烯酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述甲醇/水梯度洗脱的比例变化按体积比为0/100到100/0；所述将组分1经过两次硅胶层析柱分别采用反相硅胶和正相硅胶，正相硅胶柱层析使用的有机溶剂是石油醚/乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比为3∶1；所述将组分2经过两次硅胶柱层析分别采用正相硅胶和反相硅胶，正相硅胶柱层析使用的有机溶剂是石油醚/乙酸乙酯，石油醚与乙酸乙酯的体积比为3∶1，所述一次凝胶柱层析采用LH-20，有机溶剂为甲醇。
9.如权利要求2所述革耳氯烯酮类化合物在制备抗肿瘤药物中应用，所述革耳氯烯酮类化合物，包括革耳氯烯酮A和革耳氯烯酮B。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述肿瘤包括人胃癌细胞BGC823、人结肠癌细胞HCT116、血癌细胞HL-60和前列腺癌细胞LinCap。
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