CN103756980B - 一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法。所述的培养基配方为：可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4 0.50g/L、KH2PO4 0.50g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCl2 0.08g/L、VB1 0.1g/L、吐温-40 0.4%，藜芦醇0.05g/L培养基的初始pH=6.8。将发酵种子液接种于该培养基在31℃，转速160r/min下培养产漆酶。本发明提供的用于革耳发酵生产漆酶的培养基，具有产漆酶率高，漆酶活力高等优点，而且培养方法周期短、条件温和。

Description

一种革耳菌发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法
技术领域
本发明属于真菌培养产漆酶的技术领域，具体涉及一株产漆酶的真菌发酵培养基及工艺。更具体的说地，本发明涉及一种革耳发酵产生漆酶的培养基及方法。
背景技术
漆酶（Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，能够氧化多种酚类和芳胺类化合物，并同时将氧分子还原为水。漆酶能够直接作用于木质素，氧化降解酚型木质素结构单元，在某些能够传递电子的小分子介体存在条件下，可以对非酚型的木质素结构单元起到氧化降解的作用。因此漆酶在纸浆生物漂白、工业废水处理、有机染料脱色和高分子催化合成等方面，表现出了很大的研究价值和应用潜力，漆酶被认为是制浆造纸工业中最具有发展前景的酶。
目前,虽然人们对真菌产酶机制有较多了解，但与实际需要相比，多数试验菌株在人工和天然培养基上生长时合成漆酶产量偏低。且真菌培养时培养周期长，极易被污染，有的需要有毒的芳香类化合物的诱导，产酶活力不稳定且相对都比较低，这就导致漆酶的工业化生产很难实现。因此筛选得到高漆酶的菌株，对于开发漆酶的工业化生产具有很重要的促进作用。
野生革耳(Panus rudis)是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌，该菌属于担子菌纲（Basidiomycetes）、同担子亚纲（Homobasidiomycetes）、伞菌目（Agaricales）、侧耳科（Pleurotaceae）、革耳属（Panus），同时该菌产生的漆酶具有较好的热稳定性，是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种革耳菌(Panus rudis)FG-35发酵生产漆酶的培养基及方法，该培养基及配套的方法能够高效产漆酶，应用前景广阔。
一种革耳菌发酵产漆酶的培养基配方：可溶性淀粉5-15g/L、蛋白胨0.2-0.5g/L、K2HPO4 0.5-1.0g/L、KH2PO4 0.5-1.0g/L、ZnSO4·7H2O 0.005-0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01-0.07g/L、FeSO4·7H2O 0.005-0.010g/L、MnSO4 0.005-0.2g/L、CaCl2 0.002-0.4g/L、VB1 0.05-0.4g/L、吐温-40 0.2-1.0%，藜芦醇0.05-0.5g/L，培养基的pH=6.8-7.0；所述的革耳菌(Panus rudis)FG-35，保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
所述培养基配方优选：可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO40.50g/L、KH2PO4 0.50g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·7H2O0.01g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl2 0.08g/L、VB1 0.1g/L、吐温-40 0.4%，藜芦醇0.05g/L，培养基的pH=6.8。
一种革耳菌发酵生产漆酶的方法，包含以下步骤：
（a）将保藏号为CCTCC NO：M2013106的革耳菌(Panus rudis)FG-35接种于种子培养基，制得发酵种子液；
(b)将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的培养基中，300mL的三角瓶装液量为50-90mL,接入2×106-5×106个菌种孢子，于28-32℃，转速160-180r/min下培养4-6d。
所述的种子培养基配方：按1L培养基的重量计算，含有15%土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然；种子在28-32℃、160r/min恒温震荡培养4d得发酵种子液。
本发明菌株命名为革耳FG-35(Panus rudis FG-35)，2013年3月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
采用本发明优化后的培养基，菌龄5d，发酵周期6d,发酵产生结果革耳产漆酶为263.31U/mL以上。
本发明的有益效果：本发明的发酵周期短；条件温和；提供的用于革耳发酵生产漆酶的培养基，具有产漆酶时间短，漆酶活力高等优点。
附图说明
图1为不同碳源对产漆酶活性的影响；
图2为不同氮源对产漆酶活性的影响；
图3为不同无机盐对产漆酶活性的影响；
图4为不同表面活性剂对产漆酶活性的影响；
图5为不同诱导物对产漆酶活性的影响；
图6为各因素影响效果的排列图；
图7为可溶性淀粉与CaCl2交互影响酶活力的响应面图及等高线；
图8为可溶性为淀粉与吐温-40交互影响酶活力的响应面图及等高线；
图9为CaCl2与吐温-40交互影响酶活力的响应面图及等高线。
具体实施方式
本发明用下列实例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于下列实施例。
实施例1单因素实验确定最优培养基组分
（1）种子培养基和基础培养基配制
(a)种子培养基：按1L培养基重量计，含15%的土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然。1.01MPa，高压蒸汽灭菌20min。
(b)基础培养基：按1L培养基重量计，含15%的土豆汁、葡萄糖1%，酒石酸铵0.2%，pH自然。1.01MPa，高压蒸汽灭菌20min。
（c）马铃薯琼脂培养基：PDA基础培养基
（2）发酵种子的制作：将革耳菌FG-35(Panus rudis FG-35，保藏号为：CCTCCNO：M2013106)接种于马铃薯琼脂培养基上，于31℃下培养5d，待其产生孢子，即活化；用接种针将活化后的菌株孢子接种至种子培养基，31℃，转速160r/min下培养96h，即为发酵种子液。
（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下、4000r/min离心10min得上清液即为粗酶液待用。
（4）漆酶酶活测定：取100μL发酵上清液和2.7mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH=4.0)和0.4mL0.5mmol/L2,2'-连氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液，28℃水浴启动反应并连续测定反应前3min内反应液在420nm处吸光度的增加值△OD420。定义该条件下，每分钟催化1μmol ABTS氧化所需酶量为1个酶活力单位（U）。
式中ε为ABTS吸光系数36000（ε420=3.6×104mol/L.cm），V总代表漆酶酶活测定反应体系中的体积，V酶代表反应添加的酶液体积。
（5）不同单因素（碳源、氮源、无机离子、表面活性剂、诱导物）对产漆酶的影响。
（a）碳源对酶产量的影响,在基础培养基中分别添加1%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、羧甲基纤维素钠（CMC-Na)、淀粉和玉米粉，每组接入种子培养基培养4d得到的种子液，接入的菌种孢子数均为4×106个左右，在31℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
（b）氮源对产酶的影响，在基础培养基中分别添加0.2%的蛋白胨、酵母膏、牛肉粉、酒石酸铵、硫酸铵、氯化铵和尿素，每组接入种子培养基培养4d得到的种子液，接入的菌种孢子数均为4×106个左右，在31℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
（c）无机盐离子对产酶量的影响，在基础培养基中分别添加0.4mmol/L的无机盐离子（CuSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和CaCl2），每组接入种子培养基培养4d得到的种子液，接入的菌种孢子数均为4×106个左右，在31℃、160r/min的摇床中培养，以未加任何金属离子为对照组（CK），每天检测发酵液中漆酶活性。
（d）表面活性剂的对产酶量的影响，在基础培养基中分别加入0.2%的吐温-20（T-20）、吐温-40（T-40）、吐温-80（T-80），每组接入种子培养基培养4d得到的种子液，接入的菌种孢子数均为4×106个左右，在31℃、160r/min的摇床中培养，以没加任何表面表面活性剂为对照组（CK），每天检测发酵液中漆酶活性。
（e）诱导物对产酶量的影响，以没加任何诱导物为对照组（CK）,在基础培养基中分别加入0.05g/L愈创木酚、ABTS、藜芦醇、单宁酸、十二烷基磺酸钠（SDS），每组接入种子培养基培养4d得到的种子液，接入的菌种孢子数均为4×106个左右，在31℃、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
实验结果
碳源对酶产量的影响：如图1所示，添加可溶性淀粉的处理组明显提高了漆酶的酶活性。在接种后的第3天明显的比其他的出现的酶活高。添加淀粉、麦芽糖的处理，有助于提高产酶的水平，酶活性分别达到181.187U/mL、143.284U/mL、葡萄糖、麦芽糖和羧甲基纤维素钠（CMC-Na)与对照组酶活133.34U/mL相近，添加蔗糖、乳糖的处理都对供试菌产酶的不同程度的抑制作用。
氮源对酶产量的影响：如图2所示，在所添加的不同氮源中，添加蛋白胨、酵母膏、牛肉粉的处理有助于提高产酶水平，酶活性分别达到199.535U/mL、126.591U/mL、141.572U/mL，而添加酒石酸铵、硫酸铵、氯化铵和尿素的处理对其有强烈的抑制作用。据此，蛋白胨是革耳菌产漆酶的最佳氮源。
无机盐离子对酶产量的影响：如图3所示，在所添加的相同摩尔数不同无机盐离子中，添加Mn2+、Zn2+和Ca2+的处理均有助于提高该菌产漆酶能力，酶活性分别达到167.009U/mL、145.918U/mL和158.877U/mL，而添加Cu2+和Fe2+的处理较对照处理的酶活低，对供试菌产酶具有抑制作用。据此，Mn2+最能提高革耳菌产漆酶。
表面活性剂对产酶量的影响：如图4所示，在所添加的不同表面活性剂，与CK相比，T-40最有助于革耳菌提高产酶水平，所测得的酶活力为156.167U/mL，而添加T-20对产酶则有显著的抑制作用，测得酶活仅为120.93U/mL。据此，T-40最能提高革耳菌产漆酶的能力。
诱导物对对产酶量的影响：如图5所示，在添加诱导物的培养基中，5组不同的诱导物对漆酶的产生都有不同程度的促进作用，可以看出藜芦醇对于漆酶有很明显的促进作用，酶活相比CK增加了90.49U/mL，达到171.179U/mL；而愈创木酚、ABTS、单宁酸、SDS对漆酶的产生促进效果并不明显。
实施例2响应面确定最优发酵培养基
(1)实验确定最佳培养基
确定单因素实验培养基的基础上，确定最佳的各成分，改变各成分的浓度，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表1，将相同量的接种量（0.5%）种子液接种于300mL，装有50-90mL培养基的三角瓶中，接入的菌种孢子数均为2×106-5×106个左右，在28-32℃，转速160-180r/min下培养4-8d。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取Plackett-Burman和最陡爬坡实验最优结果和其产酶量最高的实验1、5、14三组实验，进行验证实验。
（2）Plackett-Burman筛选影响产漆酶因素
以淀粉、蛋白胨、CuSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O、CaCl2、吐温-40（T-40）及藜芦醇8个因素为作为产漆酶的考察因素进行实验，通过Minitab软件创建一个N=16的筛选实验设计表。
通过对表1进行数据整理分析，得到各因素对产漆酶的影响效应及重要性，实验结果见表2，同时利用Minitab软件制作影响因素效果图（见图6）。通过影响因素效果图可以直观地看出各因素影响产漆酶效应的重要性。该图可以清晰的显示一条在a=0.05水平下P值的标准化效应值为2.365的参考线，任何只要超过此参考线的影响因素都可能是显著的。由图6可以看出，CaCl2、淀粉和T-40对产漆酶的影响均较显著，可信度>95%，其他的因素对于漆酶不产生显著性影响。由表2可以看出，其中只有淀粉对菌株产漆酶具有显著正效应，而CaCl2和T-40对于菌株产漆酶有显著负效应。
表1筛选试验设计与结果
表2Plackett-Burman设计的因素与水平
（3）最陡爬坡实验结果
根据2.1PB实验所得的结果（见表2）来确定显著因素的效应决定各因素的爬坡方向和变化步长，淀粉效应系数为正，表明增大淀粉的量对产漆酶的效应为正；反之，CaCl2和Tween-40效应系数为负，表明减少CaCl2和Tween-40的量对产漆酶的效应为正，依据系数的变量确定实验的基本步长。而对于不显著因素，根据表现效应的正负来确定不显著因素的高水平和低水平。
表3最陡爬坡实验及结果
最陡爬坡实验结果如表3，由表可知4号处理组中漆酶活力最高，即当可溶性淀粉（11g/L）、CaCl2（0.08g/L）、T-40（0.4%）时，在最高产酶的最优点附近，因此，以第4组的水平选为中心点对革耳菌的产漆酶培养基进一步的优化。（4）响应面分析结果
利用Minitab软件设计一个以爬坡实验的处理4为中心点的3因素3水平Box-Benhnken实验，其中设3个中心实验点，12个分析点。设计影响漆酶响应面的各因素和水平见表4，实验结果见表5所示。同时利用软件Minitab16对表6实验数据进行二次多项式回归拟合分析，获得以漆酶酶活力为预测值的多元二次线性回归方程如下：
Y=-358.32+124.031A+3710.031B+554.312C-6.362A2-35586B2-654.685C2+127.325AB-16.475AC+1864.88BC
表4Box-Behnken实验设计因素与水平
表5Box-Behnken设计及试验结果
对上述结果进行方差分析（见表6）。从表6可以看出，在a=0.05的显著水平上，C、A2、B2、C2、BC的影响水平是显著的，其余项对于漆酶的影响不显著。通过表6可以看出，回归方程的P值=0.003，达到显著水平，说明回归模型是显著的，而失拟项的P值为0.876，说明失拟项不显著，表明其他因素对于漆酶实验的结果的干扰很小，所以说明方程与实际实验有很好的拟合，模型设计适合。而模型的决定系数R2=0.9481，直接说明培养基中的可溶性淀粉、CaCl2和T-40对革耳FG-35产漆酶有94.81%的拟合度。
通过Minitab16软件作出各因素交互作用对漆酶酶活影响的响应曲面和等高线图（图7-图9）。由图7和8的响应面图可以看出随着培养基中可溶性淀粉浓度的增加漆酶的产量逐渐增加，在可溶性淀粉浓度接近10.0404g/L左右，漆酶的产量达到最大，当浓度超过10.0404g/L后，漆酶的产量开始逐渐降低；而图9的响应面可以看出当CaCl2和T-40相互作用时，对于漆酶的产量有很显著的影响，当CaCl2和吐温-40的浓度在0.816g/L和0.428g/L时漆酶产量达到最高。
表6二次多项式方差分析
为了求得培养基最佳浓度，利用Minitab16软件获得非线性回归模型和响应面后，对回归方程的每个变量求一阶偏导数，得到Y的极大值在：A=10.0404g/L，B=0.816g/L，C=0.428g/L时，即得到最大产漆酶值，综合以上得到革耳菌产漆酶的最佳培养基为：可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4 0.50g/L、KH2PO4 0.50g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl2 0.08g/L、VB1 0.1g/L、吐温-40 0.4%、藜芦醇0.05g/L。
通过对最优培养基的模型进行验证，进行3次验证实验，结果实验的产酶量分别为259.811、262.489和266.129U/mL，平均值为263.31U/mL，有模型的预测值基本一致，因此可以说明该模型较能好的预测实际产酶情况。而未优化条件前测得的酶活力为127.194U/mL，因此优化后漆酶的活力比未优化的酶活力提高了1.07倍。
实施例3革耳菌产漆酶发酵方法
（1）种子的制备
（A）菌种及培养基
菌种：革耳菌FG-35
斜面培养基：PDA基础培养基
种子液体培养基成分：15%土豆汁（1L）、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%、pH自然。
（B）种子液的制备
将斜面上的革耳菌转接入装有50mL培养基的300mL三角瓶中，于31℃、160r/min的恒温震荡培养箱中培养96h，使菌液呈粘稠状，表明种子已生长好了。
（2）发酵培养
发酵培养基：根据响应面优化后的最优的培养基：含有可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4 0.50g/L、KH2PO4 0.50g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl2 0.08g/L、VB1 0.1g/L、吐温-40 0.4%、藜芦醇0.05g/L，培养基的pH=6.8。将上一步骤中制备的革耳菌的种子液，按最佳的培养条件得出的最佳条件，接种量为0.5mL(孢子数约为4×106个)，接种于300mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵液于31℃、转速160r/min，发酵时间为144h。经发酵后产生的漆酶平均为263.31U/mL，表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

Claims (4)

1.一种革耳菌发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基配方：可溶性淀粉5-15g/L、蛋白胨0.2-0.5g/L、K2HPO4 0.5-1.0g/L、KH2PO4 0.5-1.0g/L、ZnSO4·7H2O0.004-0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01-0.07g/L、FeSO4·7H2O0.005-0.010g/L、MnSO4 0.005-0.2g/L、CaCl2 0.002-0.4g/L、VB1 0.05-0.4g/L、吐温-40 0.2-1.0%，藜芦醇0.05-0.5g/L，培养基的pH=6.8-7.0；所述的革耳菌(Panusrudis)FG-35，保藏号为：CCTCC NO：M2013106。
2.根据权利要求1所述的革耳菌发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基配方：可溶性淀粉10.04g/L、蛋白胨0.2g/L、K2HPO4 0.50g/L、KH2PO40.50g/L、ZnSO4·7H2O 0.01g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·7H2O 0.01g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4 0.07g/L、CaCl2 0.08g/L、VB1 0.1g/L、吐温-40 0.4%，藜芦醇0.05g/L，培养基的pH=6.8。
3.一种革耳菌发酵生产漆酶的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（a）将保藏号为CCTCC NO：M2013106的革耳菌(Panus rudis)FG-35接种于种子培养基，制得发酵种子液；
（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的培养基中，300mL的三角瓶装液量为50-90mL,接入2×106-5×106个菌种孢子，于28-32℃，转速160-180r/min下培养4-8d。
4.根据权利要求3所述的革耳发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述的种子培养基配方：按1L培养基的重量计算，含有15%土豆汁、葡萄糖1%、酒石酸铵0.2%，pH自然；种子在28-32℃、160r/min恒温震荡培养4d得发酵种子液。
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