CN101638621B - 一种产漆酶的灵芝菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产漆酶的灵芝菌株，该灵芝菌是韦伯灵芝TZC1(Ganodermaweberianum TZC1)，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.2648。本发明韦伯灵芝TZC1在发酵过程中能产生漆酶，所得漆酶的活性可高达8620，830U/L，是现有技术中可达到最高酶活的253倍。本发明韦伯灵芝TZC1发酵所分泌的漆酶在较广的温度和pH值范围内保持较好的活性，能促进木质素的分解，对印染染料脱色具有显著的促进作用。

Description

一种产漆酶的灵芝菌株
技术领域
本发明涉及生化领域，具体涉及一种发酵漆酶的真菌菌株。
背景技术
漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，主要包括植物漆酶和真菌漆酶；前者主要催化底物的氧化聚合，与植物伤口保护等有关[雷福厚等(2003)中国生漆，2003(1)：4-7]；后者主要在木腐菌中发现，能促进木质素等底物的降解[Bajpai(1999)Biotech Prog，15：147-157；涂宁宇等(2006)造纸科学与技术，25：27-31]。真菌漆酶的用途十分广泛。在木材加工中，用漆酶处理促使表面胶合，可替代胶合剂；在造纸工业中，漆酶用于漂白纸张，降低纸浆硬度、降低化学品用量和降低能耗以及降低废液中有机氯含量；在食品业中，漆酶用于去除啤酒和果汁混浊；在纺织业中，漆酶用于脱色、漂白和去除木质素；在环境保护中，漆酶用于污染物脱毒、土壤修复以及有机磷农药分解等。因此，漆酶具有极大的应用潜力[Bourbonnais等(1997)Appl Environ Microbial，63：4627-4632；王国栋等(2003)植物学通报，20：469-475]。
尽管漆酶的用途广，但产量的不足极大地限制了其潜能的发挥。目前有关漆酶的研究多是围绕提高漆酶的产量而展开的，如筛选优良的产漆酶菌株或构建基因工程菌，探索最佳的产漆酶培养条件，以期能进行工业化生产。近十几年尤其是近五六年来，这方面的研究取得了一定的进展，然而仍存在着不少问题：多数试验菌株在人工和天然培养基上生长时的发酵周期长、不易操作，产酶能力弱，且往往需要有毒或昂贵的诱导剂，不环保，致使利用现有菌种生产成本高，限制了漆酶的产业化进程。
灵芝(Ganoderma)是一类寄生在树木上的真菌，能产生漆酶，将所寄生树木的木质素消化。关于灵芝的研究主要围绕着其药用价值和保健功能这两个方面展开，而关于灵芝漆酶的研究尚不多见。国家知识产权局于2007年3月28日公开了一项发明专利申请“一种灵芝漆酶的清洁高效生成方法”(申请号200610096638.5)，该申请涉及一种灵芝漆酶的生产方法，该方法利用树舌灵芝ST(CCTCC NO.M206100)在含有玉米粉、粮食麸皮和花生饼粉的培养基中发酵5天，获得酶活为9000U/L的灵芝漆酶。国外也有关于利用灵芝生产漆酶的研究，如Trevor M等人利用Ganoderma adspersum液体发酵14天，获得酶活达34000U/L(ABTS法)的漆酶[Songulashvili G etal(2006)Biotechnol Lett28：1425-1429]。虽然上述方法利用灵芝发酵漆酶的产量有较大的提高，但是离产业化生产仍有相当的距离。
发明内容
本发明的目的是提供一种产漆酶的灵芝菌菌株。
本发明所提供的灵芝菌菌株是韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)，已于2008年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2648。
本发明韦伯灵芝TZC1是从野生灵芝中分离出来的，经形态学和分子鉴定为韦伯灵芝Ganoderma weberianum(BRES&Henn.ex Sacc.)Steyarrt。依据《中国真菌志，第十八卷，灵芝科》(2000)、《中国药用真菌图鉴》(1987)和《中国灵芝图鉴》(2005)对本发明菌株进行形态学检验，其宏观特征和显微特征符合韦伯灵芝Ganoderma weberianum(BRES&Henn.exSacc.)Steyarrt种的特征范围。对从本发明菌株所产生的菌丝提取的DNA进行PCR扩增、测序和序列比对，结果表明韦伯灵芝TZC1的ITS序列(如SEQ NO.1所示)与韦伯灵芝的同源性达99.9％；但TZC1的Mn-SOD基因的部分序列(如SEQ NO.2所示)与韦伯灵芝的同源性仅为96％。
本发明所述的韦伯灵芝TZC1在液体产酶基础培养基中发酵，可获得酶活高达46,780U/L(ABTS法检测)的漆酶，比已经报道的最高的灵芝漆酶活性34,000U/L高出26.4％。所述的液体产酶基础培养基每升中含有马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B12mg，酵母膏5g和70mL微量元素溶液，余量为水，pH4.8；其中所述的微量元素溶液是指含有MgSO4·7H2O 3g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，NaCl 1g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CoCl20.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.1g/L，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01g/L的水溶液。
本发明所述的韦伯灵芝TZC1可以在上述培养基中发酵获得，也可以在下述专用培养基发酵获得：麸皮15～35g/L，葡萄糖5～25g/L，酵母粉1～10g/L，KH2PO4 1～5g/L，MgSO4 0.5～5g/L，VB1 1～5mg/L，Cu2+ 0.1～5μmol/L，Zn2+ 0.1～5μmol/L，Mn2+ 5～100μmol/L，其余为水。将本发明所述的韦伯灵芝TZC1菌丝按10％接种量接种于上述培养基中，在20～32℃、120～250r/min条件下振荡或搅拌培养6天，可获得酶活高达8620,830U/L(ABTS法检测)的漆酶。
本发明韦伯灵芝TZC1发酵所得的漆酶在pH值2.64～5.0范围内活性较为稳定，在pH值为4.2时酶活最高。本发明韦伯灵芝TZC1发酵所得漆酶的酶促反应温度范围较广，其最适温度为50～60℃，70℃时为最高酶活的81.7％，20℃、30℃及40℃均可达到最高酶活的88％以上，10℃为最高酶活的65％。同时，这种漆酶具有较好的热稳定性，在40、50、60、70和75℃、80℃下反应0.5h，其酶活分别为原酶活的99.1％、96.2％、93.7％、67.2％、6.5％和0；在60℃时，反应1、1.5、3.5和4h的残存酶活分别为69.1％、68.2％、47.1％和40.1％；在70℃时，反应1、1.5和2h残存酶分别为6.9％、3.4％和1.6％。金属阳离子对所述漆酶的活性有较大的影响，如Mg2+、Cu2+、K+和Hg+对其活性有激活作用，而Al3+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+则有抑制作用，尤其是Fe2+可使本发明所述的漆酶完全失活。
本发明TZC1发酵所分泌的漆酶能促进木质素的分解，对印染染料脱色具有显著的促进作用，对纸浆脱墨也具有一定的促进作用。
附图说明
图1是温度与本发明漆酶酶活的关系曲线图。
图2是反映本发明漆酶热稳定性的曲线图。
图3是本发明漆酶在60℃和70℃时反应其酶活随时间变化的曲线图，其中
Figure G200810198678XD00031
表示60℃，表示70℃。
图4是本发明漆酶在pH值为3-8的环境中pH值与酶活关系的曲线图。
图5是本发明漆酶在pH值为4-6的环境中pH值与酶活关系的曲线图。
图6是反映本发明漆酶的pH值稳定性的曲线图。
图7是本发明漆酶用于染料脱色的效果图。
具体实施方式
以下实施例检测酶活的方法均为ABTS法：
液体摇瓶培养物取样后以12,000r/min离心10min，上清液即为待测酶液。酶活测定以2，2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)为底物，反应体系包括1.5mL pH5.0醋酸缓冲液、0.5mL0.5mmol/LABTS(pH5.0醋酸缓冲液配制)及1mL适当稀释的酶液(以pH5.0醋酸缓冲液稀释)，室温下测定反应的前3min内反应液在波长420nm处OD值的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成1μmol反应物所需的酶量定义为一个酶活力单位，以酶液事先灭活后的反应混合液为对照。定义每分钟转化1μmol的底物所需的酶量为一个酶活力单位(U))其计算公式：
Figure G200810198678XD00033
其中，ε＝3.6×104mol.cm-1；Δt：3min；ΔOD：3min内吸光度OD的变化值；V总：酶反应中，反应液的总体积；V酶：酶反应中，酶液的体积。
例1韦伯灵芝TZC1在液体产酶基础培养基中的发酵
1、菌种分离：韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)子实体经采用组织分离法分离纯化，再转接于新鲜的综合PDA斜面培养基，于电热恒温培养箱28℃培养6天，挑取菌丝块以三点接种方法转接到平板上，28℃培养4d，用无菌打孔器将平板菌种制成直径10mm，厚2mm的菌种塞，备用。
2、种液培养：将菌种塞接种到装有50mL摇瓶种子培养基和10个直径5mm的玻璃珠的300ml三角锥形瓶中，每瓶接入3个菌塞，在28℃、160r/min条件下振荡培养4天。
3、摇瓶发酵培养：按10％接种量将摇瓶种子接入装有100mL液体产酶基础培养基的500mL三角瓶中，在28℃、160r/min条件下振荡培养。每天定时取样检测漆酶酶活(ABTS法)，发现摇瓶培养至第6天酶活最高，达到46,780U/L，比已经报道的最高的灵芝漆酶活性34,000U/L高出26.4％。
上述方法中所用到的培养基配方为：
综合PDA斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B11mg/L，琼脂15g/L。
摇瓶种子培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B12mg/L，酵母膏5g/L，pH4.8。
液体产酶基础培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B12mg/L，酵母膏5g/L，70mL/L微量元素溶液，pH4.8。其中所述的微量元素溶液为含有以下组分的水溶液：MgSO4·7H2O3g/L，MnSO4·H2O0.5g/L，NaCl1g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，CoCl20.1g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L，CuSO4·5H2O0.1g/L，KAl(SO4)2·12H2O0.01g/L，H3BO30.01g/L，Na2MoO4·2H2O0.01g/L。
例2韦伯灵芝TZC1在专用培养基培养基中的发酵
1、菌种分离：韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)子实体经采用组织分离法分离纯化，再转接于新鲜的综合PDA斜面培养基，于电热恒温培养箱28℃培养6天，挑取菌丝块以三点接种方法转接到平板上，28℃培养4d，用无菌打孔器将平板菌种制成直径10mm，厚2mm的菌种塞，备用。
2、种液培养：将菌种塞接种到装有50mL摇瓶种子培养基和10个直径5mm的玻璃珠的300ml三角锥形瓶中，每瓶接入3个菌塞，在28℃、160r/min条件下振荡培养4天。
3、摇瓶发酵培养：按10％接种量将摇瓶种子接入装有100mL本发明优化的发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、160r/min条件下振荡培养6天后，采用ABTS法测得酶活高达8620，830U/L，是产酶基础培养基上生产酶活的184倍(是利用Ganoderma adspersum液体发酵253倍)。将培养液离心，除去菌丝球即得到灵芝粗酶液，可以直接应用也可以纯化加工后再应用。
上述方法中所用到的培养基配方为：
综合PDA斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B11mg/L，琼脂15g/L。
摇瓶种子培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B12mg/L，酵母膏5g/L，pH4.8。
本发明优化的发酵培养基：麸皮25g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，KH2PO43g/L，MgSO41.5g/L，VB12mg/L，CuSO4·5H2O0.5μmol/L，ZnSO4·7H2O0.5μmol/L，MnSO4·H2O50μmol/L，其余为水。
例3韦伯灵芝TZC1在专用培养基培养基中的发酵
1、菌种分离：韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)子实体经采用组织分离法分离纯化，再转接于新鲜的综合PDA斜面培养基，于电热恒温培养箱28℃培养6天，挑取菌丝块以三点接种方法转接到平板上，28℃培养4d，用无菌打孔器将平板菌种制成直径10mm，厚2mm的菌种塞，备用。
2、种液培养：将菌种塞接种到装有50mL摇瓶种子培养基和10个直径5mm的玻璃珠的300ml三角锥形瓶中，每瓶接入3个菌塞，在28℃、160r/min条件下振荡培养4天。
3、摇瓶发酵培养：按10％接种量将摇瓶种子接入装有100mL本发明优化的发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、160r/min条件下振荡培养6天后，将培养液离心，除去菌丝球即得到灵芝粗酶液，可以直接应用也可以纯化加工后再应用。
上述方法中所用到的培养基配方为：
综合PDA斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B11mg/L，琼脂15g/L。
摇瓶种子培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B12mg/L，酵母膏5g/L，pH4.8。
本发明优化的发酵培养基：麸皮15g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，VB11mg/L，CuSO4·5H2O0.1μmol/L，ZnSO4·7H2O0.1μmol/L，MnSO4·H2O5μmol/L，其余为水。
例4韦伯灵芝TZC1在专用培养基中的发酵
1、菌种分离：灵韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)子实体经采用组织分离法分离纯化，再转接于新鲜的综合PDA斜面培养基，于电热恒温培养箱28℃培养6天，挑取菌丝块以三点接种方法转接到平板上，28℃培养4d，用无菌打孔器将平板菌种制成直径10mm，厚2mm的菌种塞，备用。
2、种液培养：将菌种塞接种到装有50mL摇瓶种子培养基和10个直径5mm的玻璃珠的300ml三角锥形瓶中，每瓶接入3个菌塞，在28℃、160r/min条件下振荡培养4天。
3、摇瓶发酵培养：按10％接种量将摇瓶种子接入装有100mL本发明优化的发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、160r/min条件下振荡培养6天后，将培养液离心，除去菌丝球即得到灵芝粗酶液，可以直接应用也可以纯化加工后再应用。
上述方法中所用到的培养基配方为：
综合PDA斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B11mg/L，琼脂15g/L。
摇瓶种子培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，维生素B12mg/L，酵母膏5g/L，pH4.8。
本发明优化的发酵培养基：麸皮35g/L，葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，KH2PO45g/L，MgSO45g/L，VB15mg/L，CuSO4·5H2O5μmol/L，ZnSO4·7H2O5μmol/L，MnSO4·H2O100μmol/L，其余为水。
例5韦伯灵芝TZC1发酵所得漆酶的性能研究
1、温度对本发明漆酶酶促反应的影响
(1)温度对漆酶活性的影响
让反应体系分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃温度下反应3min，测定酶活力，以酶活最高者为100％计算相对酶活力。由图1可知，本发明所生产的漆酶的酶促反应温度范围较广，其最适温度为50～60℃，70℃时为最高酶活的81.7％，20℃、30℃及40℃均可达到最高酶活的88％以上，10℃为最高酶活的65％。
(2)漆酶的热稳定性
将粗酶液分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、90℃水浴保温30min后，然后迅速冷至室温，测定酶活力，以未保温的酶液的酶活为100％，计算剩余酶活性，结果如图2所示。进一步，将酶液在60℃和70℃的水浴中分别保温1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h后迅速冷至室温，后按前述方法测定和计算剩余酶活，结果如图3所示。可见，本发明所产生的漆酶具有较好的热稳定性，不同温度处理30min，40、50、60、70、75和80℃的酶活分别为原酶活的99.1％、96.2％、93.7％、67.2％、6.5％和0(图2)。在60℃时，反应1、1.5、3.5和4h的残存酶活分别为69.1％、68.2％、47.1％和40.1％；在70℃时，反应1、1.5和2h残存酶分别为6.9％、3.4％和1.6％(图3)。
2、pH值对本发明漆酶稳定性的影响
(1)pH对漆酶活性的影响
分别采用pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的醋酸缓冲液配制底物和稀释酶液，使酶液处在不同pH的缓冲液中，测定酶活力，以酶活最高者为100％，计算剩余酶活性。结果表明，该酶的最合适pH值在5左右(图4)。进一步采用pH为4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、和6.0的醋酸缓冲液配制底物和稀释酶液，使酶液处在不同pH的缓冲液中，测定酶活力，以酶活最高者为100％，计算剩余酶活性。结果表明，该酶的最合适pH值为4.6(图5)。
(2)漆酶的pH稳定性
将粗酶液中加入pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的醋酸缓冲液，常温下维持1h后，测定酶活力，以没有经过处理的酶液的酶活为100％，计算剩余酶活性。结果表明，该酶在pH值为3～5.5时表现出较好的稳定性，pH值为6.0时残余酶活为39.4％，pH值为7.0残余酶活为18.1％。
3、本发明漆酶在染料脱色中的应用
(1)酶粗提液准备：按10％接种量将摇瓶种子接入装有100mL本发明优化的发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、160r/min条件下振荡培养6天后，将发酵酶液在12000rm/min的条件下离心2min，取上清，测酶活，备用。
(2)染料的配制：准确称取0.5g染料，用0.2mol/LpH5.0的醋酸缓冲液定容至25ml，浓度为20mg/ml。反应时的终浓度为200mg/L。染料包括分散蓝2BLN100％、阳离子蓝X-GRRL250％、直接湖蓝5B、活性黑HGRF、考马斯亮蓝R250、本胺蓝以及溴酚蓝。
(3)反应体系：各处理的反应总体积为3000μl，pH5.0，反应温度为28℃，反应24h后照相记录(图7)。CK：2970μl醋酸缓冲液(0.2mol/LpH5.0)+30μl染料；死酶体系：2960μl醋酸缓冲液(0.2mol/LpH5.0)+30μl染料+10μl死漆酶(10U/ml)；活酶体系：2960μl醋酸缓冲液(0.2mol/L pH5.0)+30μl染料+10μl活漆酶(10U/ml)；ABTS：2470μl醋酸缓冲液(0.2mol/L pH5.0)+30ul染料+0.5ml ABTS(0.5mmol/L)；活酶+ABTS：2460μl ml醋酸缓冲液(0.2mol/LpH5.0)+30μl染料+10μl活漆酶(10U/ml)+0.5mlABTS(0.5mmol/L)。
由图7可以看出，用韦伯灵芝TZC1漆酶处理所示染料，可以使分散蓝、直接湖蓝、活性黑、苯胺蓝以及溴酚蓝脱色，添加ABTS促进这些染料脱色，并使只有漆酶不脱色的阳离子蓝活性黑HGRF和考马斯亮蓝R250脱色。
SEQUENCE LISTING
<110>广州大学
<120>一种产漆酶的灵芝菌株
<160>2
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>728
<212>DNA
<213>Ganoderma weberianum TZC1
<400>1
Figure G200810198678XD00091
<210>2
<211>703
<212>DNA
<213>Ganoderma weberianum TZC1
<400>2
Figure G200810198678XD00092
Figure G200810198678XD00101

Claims (3)

1.韦伯灵芝TZC1，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.2648。
2.一种韦伯灵芝TZC1发酵漆酶的专用培养基，该培养基为水溶液，所述的水溶液的溶质由以下浓度的组分组成：麸皮15～35g/L，葡萄糖5～25g/L，酵母粉1～10g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO40.5～5g/L，VB11～5mg/L，Cu2+0.1～5μmol/L，Zn2+0.1～5μmol/L，Mn2+5～100μmol/L。
3.一种生产漆酶的方法，该方法是将韦伯灵芝TZC1菌丝按10％的接种量接种于权利要求3所述的专用培养基中，在20～32℃、120～250r/min条件下振荡或搅拌培养6天，然后将发酵液离心后取上清即可。
CN200810198678XA 2008-09-23 2008-09-23 一种产漆酶的灵芝菌株 Expired - Fee Related CN101638621B (zh)

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