CN113215001B - 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法 - Google Patents

一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113215001B
CN113215001B CN202110491079.2A CN202110491079A CN113215001B CN 113215001 B CN113215001 B CN 113215001B CN 202110491079 A CN202110491079 A CN 202110491079A CN 113215001 B CN113215001 B CN 113215001B
Authority
CN
China
Prior art keywords
laccase
ganoderma
culture
strain
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110491079.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113215001A (zh
Inventor
刘铁平
孙勇
孙怡凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Hexiang Health Technology Development Co ltd
Original Assignee
Shanghai Hexiang Health Technology Development Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Hexiang Health Technology Development Co ltd filed Critical Shanghai Hexiang Health Technology Development Co ltd
Priority to CN202110491079.2A priority Critical patent/CN113215001B/zh
Publication of CN113215001A publication Critical patent/CN113215001A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113215001B publication Critical patent/CN113215001B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03002—Laccase (1.10.3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法。本发明所述菌种包括四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号；所述藏灵芝二号的保藏编号CGMCC NO.21936。本发明利用藏灵芝二号生产灵芝漆酶，从而得到酶活力极高的灵芝漆酶，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍。

Description

一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，特别是涉及一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法。
背景技术
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种多酚氧化酶，属于蓝色氧化酶家族，是重要的木质纤维(ligno-cellulose)降解酶之一，最初发现于漆树漆液中，随后发现某些高等真菌也能分泌该酶。漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。而灵芝是一种食用菌，无任何毒副作用，灵芝漆酶的应用前景更为广阔，具有巨大的社会效益和经济效益。
目前，对于灵芝菌种生产灵芝漆酶的研究较少，且制备的灵芝漆酶酶活力较低，因此，亟需一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种。本发明的菌种得到的灵芝漆酶酶活力极高，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种，所述菌种包括四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号；所述藏灵芝二号的保藏编号为CGMCCNO.21936。
本发明还提供一种生产高酶活力灵芝漆酶的方法，包括以下步骤：
将上述菌种进行扩繁培养，得到发酵菌种；所述扩繁培养包括菌种活化、摇床培养、一级放大和二级放大；
将发酵菌种接种到发酵培养基上进行发酵培养，得到酶活力为20.581～21.23U/ml的灵芝漆酶的粗酶液；
所述菌种活化的培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨2～2.5份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾0.4～0.5份、磷酸氢二钾1.0～1.2份、七水硫酸镁0.5～0.6份、维生素B10.01～0.02份、琼脂18～20份和水1000份；所述摇床培养的培养基为不含琼脂的菌种活化培养基；
所述一级放大的培养基、二级放大的培养基和发酵培养基均包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉2％～3％、葡萄糖1.5％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、酵母粉0.2％～0.4％、豆油0.05％～0.1％和余量的水。
优选的，所述扩繁培养和发酵培养的温度均为26～28℃。
优选的，所述菌种活化的时间为20～30d。
优选的，所述摇床培养的时间为5～7d；所述摇床培养的振荡速度为100～200rpm。
优选的，所述发酵培养的条件包括：通气量为1～2V/V·min，搅拌速度为100～120rpm。
优选的，得所述粗酶液后，还包括提取和纯化处理；所述提取和纯化处理包括：压滤、硫酸铵沉淀、透析和层析；所述压滤的压力为50～60kg。
优选的，所述硫酸铵沉淀的方法包括：将压滤后得到的液体与40wt.％的硫酸铵混合，得到第一粗灵芝漆酶和上清液；
将上清液与80wt.％硫酸铵混合，得到第二粗灵芝漆酶和上清液；
将第一粗灵芝漆酶和第二粗灵芝漆酶混合，得到粗灵芝漆酶。
优选的，所述层析的装置包括葡聚糖G-100凝胶柱；所述层析的流速为0.5ml/min。
本发明还提供了利用上述方法生产得到的灵芝漆酶的冻干粉，所述冻干粉的酶活力为0.98～1.2U/mg。
有益效果：
本发明提供一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种，其特征在于，所述菌种包括四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号；所述藏灵芝二号的保藏编号为CGMCCNO.21936。本发明通过利用特定的藏灵芝二号来生产灵芝漆酶，从而得到酶活力极高的灵芝漆酶，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍。
生物保藏信息
四川灵芝藏灵芝二号，拉丁名为ganoderma sichuanense，于2021年03月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.21936。
具体实施方式
本发明提供一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种，所述菌种包括四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号；所述藏灵芝二号的保藏编号为CGMCC NO.21936。本发明通过利用特定的藏灵芝二号来生产灵芝漆酶，从而得到酶活力极高的灵芝漆酶，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍。
本发明还提供一种生产高酶活力灵芝漆酶的方法，包括以下步骤：将上述菌种进行扩繁培养，得到发酵菌种；所述扩繁培养包括菌种活化、摇床培养、一级放大和二级放大；将发酵菌种接种到发酵培养基上进行发酵培养，得到酶活力为20.581～21.23U/ml的灵芝漆酶的粗酶液；所述菌种活化的培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨2～2.5份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾0.4～0.5份、磷酸氢二钾1.0～1.2份、七水硫酸镁0.5～0.6份、维生素B10.01～0.02份、琼脂18～20份和水1000份；所述摇床培养的培养基为不含琼脂的菌种活化培养基；所述一级放大的培养基、二级放大的培养基和发酵培养基均包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉2％～3％、葡萄糖1.5％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、酵母粉0.2％～0.4％、豆油0.05％～0.1％和余量的水。
如无特殊说明，本发明对所述扩繁培养基和发酵培养的组分来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明将上述藏灵芝二号进行扩繁培养，得到发酵菌种。在本发明中，所述扩繁培养的温度优选为26～28℃。本发明通过在26～28℃温度下进行扩繁培养，结合后续发酵培养温度控制最大程度地保护了灵芝漆酶的酶活力。
本发明所述扩繁培养包括菌种活化、摇床培养、一级放大和二级放大，四个环节优选依次进行；所述菌种活化的培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨2～2.5份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾0.4～0.5份、磷酸氢二钾1.0～1.2份、七水硫酸镁0.5～0.6份、维生素B10.01～0.02份、琼脂18～20份和水1000份；优选包括以下重量份的组分：蛋白胨2.5份、葡萄糖25份、磷酸二氢钾0.5份、磷酸氢二钾1.2份、七水硫酸镁0.6份、维生素B10.02份、琼脂20份和水1000份；所述菌种活化的时间优选为20～30d，更优选为21～25d，最优选为22d。
在本发明中，所述摇床培养的培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨2～2.5份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾0.4～0.5份、磷酸氢二钾1.0～1.2份、七水硫酸镁0.5～0.6份、维生素B10.01～0.02份和水1000份；优选包括以下重量份的组分：蛋白胨2.5份、葡萄糖25份、磷酸二氢钾0.5份、磷酸氢二钾1.2份、七水硫酸镁0.6份、维生素B10.02份和水1000份；所述摇床培养的时间优选为5～7d，更优选为6d；所述摇床培养的振荡速度优选为100～200rpm，更优选为150rpm；所述摇床培养的接种量优选为5wt.％～12wt.％，更优选为8wt.％～11wt.％，最优选为10wt.％。本发明在适宜振荡速度的摇床上进行菌种的扩繁培养，降低了菌丝的凝结和自溶，从而促进了菌种的生长。
本发明所述一级放大的培养基和二级放大的培养基均包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉2％～3％、葡萄糖1.5％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、酵母粉0.2％～0.4％、豆油0.05％～0.1％和余量的水；优选包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉3％、葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.4％、豆油0.1％和余量的水；所述一级放大和二级放大的接种量优选均为10wt.％～25wt.％，更优选为18wt.％～22wt.％，最优选为20wt.％；所述一级放大培养的时间优选为3～4d；所述二级放大培养的时间优选为2～3d。
得到发酵菌种后，本发明将发酵菌种接种到发酵培养基上进行发酵培养，得到酶活力为20.581～21.23U/ml的灵芝漆酶的粗酶液；所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉2％～3％、葡萄糖1.5％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、酵母粉0.2％～0.4％、豆油0.05％～0.1％和余量的水；优选包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉3％、葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.4％、豆油0.1％和余量的水。本发明通过选择适宜的发酵培养基，进一步提高了灵芝漆酶的酶活力。
在本发明中，所述发酵培养的条件包括：通气量优选为1～2V/V·min，搅拌速度优选为100～120rpm，温度优选为26～28℃。本发明通过在26～28℃温度下进行发酵培养，进一步地保护了灵芝漆酶的酶活力。
在本发明中，发酵培养结束的判断方法优选包括：a、b和c中的一种或多种条件；其中：
a、菌丝上经1000倍显微镜观察无芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象发生；
b、菌丝湿重达到15％～21％；茵丝湿重的测定方法优选为：从发酵罐取样称重得到原始重量，在高速离心机中以8000rpm转速离心，最后得到菌丝真实重量，除以原始重量即为湿重；
c、发酵培养基的pH值为3.3～3.8。
得所述粗酶液后，本发明优选还包括提取和纯化处理。在本发明中，所述提取和纯化处理优选包括：压滤、硫酸铵沉淀、透析和层析；所述压滤的压力优选为50～60kg，更优选为55kg。
在本发明中，所述硫酸铵沉淀的方法优选包括：将压滤后得到的液体与40wt.％的硫酸铵混合，得到第一粗灵芝漆酶和上清液；
将上清液与80wt.％硫酸铵混合，得到第二粗灵芝漆酶和上清液；
将第一粗灵芝漆酶和第二粗灵芝漆酶混合，得到粗灵芝漆酶。
在本发明中，所述透析的装置优选包括透析袋。本发明对所述透析袋的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明及实施例方案中优选采用北京中科科尔仪器有限公司出售的Spectra6预湿型透析袋；所述透析袋的直径为22mm，平铺宽度为34mm。
在本发明中，所述层析的装置优选包括葡聚糖G-100凝胶柱；所述层析的流速优选为0.5ml/min。
在本发明中，层析处理后优选还包括将层析处理后得到的层析液冷冻干燥。本发明对冷冻干燥的操作方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。
本发明还提供了上述方法生产得到的酶活力为0.98～1.2U/mg的灵芝漆酶的冻干粉。
本发明通过利用特定的藏灵芝二号来生产灵芝漆酶，并在适宜的扩繁培养基和发酵培养基中扩繁培养后进行发酵培养，从而使生产得到的灵芝漆酶酶活力极高，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍。
同时，本发明通过特定的提取处理方法，提高了灵芝漆酶的纯度。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种高酶活力灵芝漆酶生产方法，由如下步骤组成：
1、灵芝菌种培养：培养温度为26～28℃，取四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号(保藏编号为CGMCC NO.21936)在菌种培养基中培养25d，所述菌种培养基的配方组成为：蛋白胨2g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、维生素B110mg、琼脂18g、水1000ml；
2、摇床种：保持温度在26～28℃，在3L三角瓶中装入2.4kg所述步骤1中不含琼脂的菌种培养基，并将240g步骤1中的菌种接种到三角瓶的菌种培养基中，然后置于振荡器上，振荡培养6d，控制振荡速度为150rpm；
3、一级放大：保持温度在26～28℃，将25kg步骤2中培养得到的菌种与250kg一级放大培养基混合后负压吸入一300L种子罐中，培养4d；
按质量百分数计，所述一级放大培养基的配方组成为：玉米淀粉2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水；
4、二级放大：保持温度在26～28℃，将250kg步骤3中培养得到的菌种与1000kg二级放大培养基混合后负压吸入1.5t的种子罐中，培养3d；所述二级放大培养基的配方组成与步骤3所述一级放大培养基的配方组成相同；
5、发酵培养：保持温度在26～28℃，将所述步骤4中培养后的培养基负压吸入7t的发酵罐中，并加入4350kg发酵培养基发酵，所述发酵培养基的配方组成与步骤3所述一级放大培养基的配方组成相同；
发酵结束时：
a、灵芝菌丝上经1000倍显微镜观察无芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象；
b、菌丝湿重达到15％；茵丝湿重的测定方法优选为：从发酵罐取样称重得到原始重量，在高速离心机中以8000rpm转速离心，最后得到菌丝真实重量，除以原始重量即为湿重；
c、培养基的pH值为3.4；
6、板框压滤：将所述步骤5发酵后的液体培养基取出，用50kg的压力压滤，压干，得到清澈发酵液；
7、硫酸铵沉淀：将所述步骤6得到的发酵液用40％硫酸铵一级沉淀得到粗灵芝漆酶，上清液再用80％硫酸铵二级沉淀得粗灵芝漆酶，两次粗灵芝漆酶合并。
8、柱层析提纯：将所述步骤7得到的粗灵芝漆酶先用透析袋透析，透析液上葡聚糖G-100凝胶柱进行分子筛层析，所用流速为0.5ml/min。收集目标柱层析液，冷冻干燥即得高纯度高酶活力灵芝漆酶。
实施例2
一种高酶活力灵芝漆酶生产方法，包括如下步骤：
1、灵芝菌种培养：培养温度为26～28℃，
取四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号(保藏编号为CGMCC NO.21936)在菌种培养基中培养20～30d，所述菌种培养基的配方组成为：蛋白胨2.5g、葡萄糖25g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾1.2g、七水硫酸镁0.6g、维生素B120mg、琼脂20g、水1000ml；
2、摇床种：保持温度在26～28℃，在3L三角瓶中装入2.4kg所述步骤1中不含琼脂的菌种培养基，并将240g步骤1中的菌种接种到三角瓶的菌种培养基中，然后置于振荡器上，振荡培养6d，控制振荡速度为150rpm；
3、一级放大：保持温度在26～28℃，将25kg步骤2中培养得到的菌种与250kg一级放大培养基混合后负压吸入一300L种子罐中，培养4d；
按质量百分数计，所述一级放大培养基的配方组成为：玉米淀粉3％、葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％、酵母粉0.4％、豆油0.1％、余量为水；
步骤4和5如同实施例1；
待达到以下标准时，发酵结束：
发酵结束时：
a、灵芝菌丝上经1000倍显微镜观察无芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象；
b、菌丝湿重达到21％；茵丝湿重的测定方法优选为：从发酵罐取样称重得到原始重量，在高速离心机中以8000rpm转速离心，最后得到菌丝真实重量，除以原始重量即为湿重；
c、培养基的pH值为3.3；
步骤6～8如同实施例1。
实施例3
一种高酶活力灵芝漆酶生产方法，包括如下步骤：
1、灵芝菌种培养：培养温度为26～28℃，
取四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号(保藏编号为CGMCC NO.21936)在菌种培养基中培养20～30d，所述菌种培养基的配方组成为：蛋白胨2.25g、葡萄糖22.5g、磷酸二氢钾0.45g、磷酸氢二钾1.1g、七水硫酸镁0.55g、维生素B115mg、琼脂19g、水1000ml；
2、摇床种：保持温度在26～28℃，在3L三角瓶中装入2.4kg所述步骤1中不含琼脂的菌种培养基，并将240g步骤1中的菌种接种到三角瓶的菌种培养基中，然后置于振荡器上，振荡培养6d，控制振荡速度为150rpm；
3、一级放大：保持温度在26～28℃，将25kg步骤2中培养得到的菌种与250kg一级放大培养基混合后负压吸入一300L种子罐中，培养4d；
按质量百分数计，所述一级放大培养基的配方组成为：玉米淀粉2.5％、葡萄糖2.25％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.075％、酵母粉0.3％、豆油0.075％、余量为水；
步骤4和5如同实施例1；
待达到以下标准时，发酵结束：
发酵结束时：
a、灵芝菌丝上经1000倍显微镜观察无芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象；
b、菌丝湿重达到18％；茵丝湿重的测定方法优选为：从发酵罐取样称重得到原始重量，在高速离心机中以8000rpm转速离心，最后得到菌丝真实重量，除以原始重量即为湿重；
c、培养基的pH值为3.8；
步骤6～8如同实施例1。
对比例1
一种与实施例2相似的生产方法，唯一区别在于，步骤1所述菌种为赤灵芝菌种。
对比例2
一种与实施例2相似的生产方法，唯一区别在于，步骤1所述菌种培养基为PDA培养基。
对比例3
一种与实施例2相似的生产方法，唯一区别在于，按质量百分数计，步骤5所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉1.5％、豆饼粉1％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母膏0.2％、豆油0.05％、余量为水。
应用例1
采用比色法测定实施例2～4和对比例1～3发酵液灵芝漆酶酶活力；具体方法为：分别取实施例2～4和对比例1～3步骤5发酵后的液体培养基1ml，1000rpm离心2min，取上清液，然后把粗酶液稀释5倍，再分别取0.5ml稀释酶液、1.5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH4.5)和1ml 0.5MmABTS溶液。混匀后，放入到分光光度计(波长420nm)中测定酶活。每隔30s记次数据，测大概3～4min。定义：1min内氧化1μmolABTS所需的酶量为1酶活单位(U)，测定结果见表1。检测仪器：岛津UV-3600i Plus紫外可见近红外分光光度计。
采用比色法测定实施例2～4和对比例1～3冻干粉灵芝漆酶以及和市售三种漆酶的酶活力，具体方法为：分别取实施例2～4和对比例1～3步骤8制备的灵芝漆酶冻干粉以及和市售三种漆酶1g，然后把冻干粉与水混合稀释5倍，再分别取0.5ml稀释酶液、1.5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH4.5)和1ml 0.5MmABTS溶液。混匀后，放入到分光光度计(波长420nm)中测定酶活。每隔30s记次数据，测大概3～4min。定义：1min内氧化1μmolABTS所需的酶量为1酶活单位(U)，测试结果见表2。
采用Bradford法分别测定实施例1～3、对比例1～3、漆酶标品和市售1～3漆酶冻干粉的纯度，测定原理为：考马斯亮蓝G250与漆酶结合后，颜色由红色变成蓝色，最大吸收波长由465nm变成595nm，且在此波长处的吸光度与漆酶浓度符合朗伯比尔定律；通过测定595nm处吸光度可知与其结合的漆酶质量；从测定前做的标准曲线线性关系可换算出样品漆酶含量。
Bradford法标准曲线的绘制
准确称取牛血清白蛋白10.0mg，用双蒸馏水准确稀释至1mg/ml；配制牛血清白蛋白标准溶液；依据牛血清白蛋白在280nm处的紫外消光系数计算牛血清白蛋白标准溶液蛋白质含量；分别梯度量取4μL、8μL、12μL、16μL、20μL标准蛋白质溶液，加入2.4mL双蒸馏水、0.6mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定吸光度，以2.4mL双蒸馏水及0.6mL蛋白试剂作为空白对照；以蛋白质质量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制不同质量的蛋白质标准曲线作为定量的依据。
检测过程
取20μL漆酶溶液样品，如是漆酶冻干粉则加5倍蒸馏水稀释配制漆酶溶液后取样，按Bradford法标准曲线绘制方法测得样品吸光度，换算出样品漆酶含量。
计算公式如下：
Figure GDA0003149236390000111
式中：
X为测定的漆酶质量，是通过将测定的样品吸光度值代入回归方程计算得出的(单位：μg)
A为样品稀释倍数
B为校正系数
C为稀释前的样品质量(以μg计算)
表1不同生产方法发酵液灵芝漆酶酶活力(U/ml)
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
20.581 23.1 21.23 5.082 8.387 8.342
表2不同冻干粉灵芝漆酶和市售漆酶酶活力和纯度
组别 酶活力(U/mg) 纯度
实施例1 0.98 98％
实施例2 1.2 98％
实施例3 1.08 98％
对比例1 0.24 98％
对比例2 0.44 98％
对比例3 0.42 98％
漆酶标品 0.5 99％
市售1 0.21 95％
市售2 0.48 95％
市售3 0.17 95％
注：表2中市售1为承德天丰生物工程有限公司出售的漆酶(食品级200U/G)；市售2为上海丹尼悦生物科技有限公司出售的漆酶(DENYKEM PAP-5P)；市售3为湖北康宝泰生物酶制剂有限公司出售的漆酶(食品级150)。
综上所述，本发明通过利用特定的四川灵芝(ganoderma sichuanense)藏灵芝二号来生产灵芝漆酶，并在适宜的扩繁培养基和发酵培养基中扩繁培养后进行发酵培养，从而使生产得到的灵芝漆酶酶活力极高，其酶活力是目前市售漆酶酶活力的50～100倍；另外，本发明通过特定的提取处理方法，提高了灵芝漆酶的纯度。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种，其特征在于，所述菌种为四川灵芝(ganodermasichuanense)藏灵芝二号；所述藏灵芝二号的保藏编号为CGMCC NO.21936。
2.一种生产高酶活力灵芝漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述菌种进行扩繁培养，得到发酵菌种；所述扩繁培养包括菌种活化、摇床培养、一级放大和二级放大；
将发酵菌种接种到发酵培养基上进行发酵培养，得到酶活力为20.581～21.23U/ml的灵芝漆酶的粗酶液；
所述菌种活化的培养基包括以下重量份的组分：蛋白胨2～2.5份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾0.4～0.5份、磷酸氢二钾1.0～1.2份、七水硫酸镁0.5～0.6份、维生素B10.01～0.02份、琼脂18～20份和水1000份；所述摇床培养的培养基为不含琼脂的菌种活化培养基；
所述一级放大的培养基、二级放大的培养基和发酵培养基均包括以下重量百分含量的组分：玉米淀粉2％～3％、葡萄糖1.5％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、酵母粉0.2％～0.4％、豆油0.05％～0.1％和余量的水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩繁培养和发酵培养的温度均为26～28℃。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述菌种活化的时间为20～30d。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述摇床培养的时间为5～7d；所述摇床培养的振荡速度为100～200rpm。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：通气量为1～2V/V·min，搅拌速度为100～120rpm。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，得所述粗酶液后，还包括提取和纯化处理；所述提取和纯化处理包括：压滤、硫酸铵沉淀、透析和层析；所述压滤的压力为50～60kg。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀的方法包括：将压滤后得到的液体与40wt.％的硫酸铵混合，得到第一粗灵芝漆酶和上清液；
将上清液与80wt.％硫酸铵混合，得到第二粗灵芝漆酶和上清液；
将第一粗灵芝漆酶和第二粗灵芝漆酶混合，得到粗灵芝漆酶。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述层析的装置包括葡聚糖G-100凝胶柱；所述层析的流速为0.5ml/min。
CN202110491079.2A 2021-05-06 2021-05-06 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法 Active CN113215001B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110491079.2A CN113215001B (zh) 2021-05-06 2021-05-06 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110491079.2A CN113215001B (zh) 2021-05-06 2021-05-06 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113215001A CN113215001A (zh) 2021-08-06
CN113215001B true CN113215001B (zh) 2022-07-12

Family

ID=77090979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110491079.2A Active CN113215001B (zh) 2021-05-06 2021-05-06 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113215001B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101008005A (zh) * 2006-01-24 2007-08-01 安徽大学 一种灵芝漆酶制剂及其生产方法
CN101638621A (zh) * 2008-09-23 2010-02-03 广州大学 一种产漆酶的灵芝菌株
CN109207371A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 上海禾向健康科技发展有限公司 一种生产灵芝的分段发酵方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101008005A (zh) * 2006-01-24 2007-08-01 安徽大学 一种灵芝漆酶制剂及其生产方法
CN101638621A (zh) * 2008-09-23 2010-02-03 广州大学 一种产漆酶的灵芝菌株
CN109207371A (zh) * 2018-09-10 2019-01-15 上海禾向健康科技发展有限公司 一种生产灵芝的分段发酵方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质;何国斌等;《生物加工过程》;20120331;第10卷(第2期);第2.1.1节，表1 *
灵芝属不同菌种漆酶活性的比较;刘禹等;《中药材》;20160831;第39卷(第8期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113215001A (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023104005A1 (zh) 一株产酯酵母菌株及其应用
CN108676730B (zh) 一种蝙蝠蛾拟青霉Cs-4的发酵生产工艺
CN110093285B (zh) 一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
CN110317734B (zh) 一种高产糖化酶、酯化酶和蛋白酶的红曲霉及其分离培养方法和应用
CN106754507B (zh) 一种复合风味菌剂及其制备方法和在酱油增香中的直投式应用
CN113999799B (zh) 解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109504725B (zh) 一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基
CN113293105B (zh) 一株米曲霉za173及其应用
CN113215001B (zh) 一种生产高酶活力灵芝漆酶的菌种和生产方法
CN111172043B (zh) 一种提高紫红曲霉中红曲色素合成的发酵方法
CN116769611A (zh) 一种产糖化酶的曲霉属菌株、糟醅发酵方法及其应用
CN112625914B (zh) 一种利用气升式发酵罐重复分批发酵灵芝的方法
CN113528350B (zh) 根霉菌株、酒曲和米酒以及该酒曲的生产方法
JPH01291793A (ja) キチナーゼの製造方法
CN114621880B (zh) 一株产酯的异常威克汉姆酵母及其在白酒大曲中的应用
KR100592129B1 (ko) 차가버섯(Ｉｎｏｎｏｔｕｓ Ｏｂｌｉｑｕｕｓ)균사체의 대량생산을 위한 액체배양법
CN116478827B (zh) 一种混菌发酵改善绿茶风味的发酵茶及其制备方法
CN116731874B (zh) 一株蜂蜜曲霉adm01及其应用
CN112251361B (zh) 毛霉菌株及其应用、毛霉制剂、南乳及其制备方法
CN115287193B (zh) 米曲霉及其在高sod活性酱油酿造中的应用
CN110846300B (zh) 一种生产胰蛋白酶的方法
CN109777847B (zh) 体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法
CN117987311A (zh) 一种产纤维素酶、果胶酶、单宁酶及植酸酶的副干酪乳杆菌yys-en2及其应用
CN117165442A (zh) 一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法
CN114907994A (zh) 一种耐高温、高产酸性蛋白酶的白曲霉及其在固态发酵中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant