CN112251361B - 毛霉菌株及其应用、毛霉制剂、南乳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛霉菌株及其应用、毛霉制剂、南乳及其制备方法。雅致放射毛霉菌株已于2019年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60792，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼，邮政编码510075。所述雅致放射毛霉菌株具有下述性质：(1)具有南乳高产挥发性醇类物质的能力；(2)具有南乳高产挥发性酯类物质的能力；(3)具有产非挥发性风味物质的能力；(4)具有较强的高产蛋白酶的能力。

Description

毛霉菌株及其应用、毛霉制剂、南乳及其制备方法

技术领域

本发明涉及南乳调味品加工技术领域，特别是涉及一种毛霉菌株及其应用、毛霉制剂与南乳。

背景技术

腐乳是中国传统的发酵大豆食品。腐乳在我国具有悠久的历史，被称为中国奶酪。腐乳分为很多类型，根据制作工艺外观色泽不同大致可以分为红方腐乳、白方腐乳、和青方腐乳这三种。红腐乳可称为红方，在后期发酵的汤料中加了红曲，赋予腐乳红色。在我国广东一带，称红方为南乳。

南乳是豆腐经过微生物发酵而成具有很高的营养价值和保健功能。毛霉常用作发酵豆腐乳。毛霉产生的蛋白酶具有很强的具有较强的分解蛋白质的能力，常用于制作豆腐乳和豆豉，可使腐乳产生芳香物质及蛋白质分解物，有些毛霉能产生柠檬酸、草酸、乳酸、甘油等，并能转化甾族化合物。

南乳滋味鲜美，气味浓郁，可即食，也可以炖煮时加入，以提高食品的滋味。南乳发酵过程分为前期和后期发酵过程。前期发酵是在豆腐块上喷洒毛霉，一段时间后，豆腐块表面被毛霉菌丝牢牢覆盖，形成坚硬的菌膜。后期发酵主要是添加辅料进行腌制，也是腐乳质地变硬的过程，在各种微生物所产生的酶的作用下，大分子蛋白质开始降解，生成氨基酸的过程中，同时产生有机酸、醇、酯、酮类等风味成分。

酯类、醇类、酮类物质在腐乳中占有特别重要的地位，酯类含量越高证明毛霉发酵豆腐块的能力越好。不同毛霉发酵后所赋予南乳的风味有所不同。现有技术中的毛霉发酵后的南乳在挥发性风味物质以及滋味物质都不具备优势。

发明内容

基于此，有必要提供一种雅致放射毛霉菌株。

一种雅致放射毛霉菌株，所述雅致放射毛霉菌株已于2019年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60792。

在其中一个实施例中，所述雅致放射毛霉菌株具有下述性质：

(1)具有高产挥发性醇类物质的能力；

(2)具有高产挥发性酯类物质的能力；

(3)具有产非挥发性风味物质的能力；

(4)具有高产蛋白酶的能力；

(5)具有快速生长的特性。

本发明还在于提供一种挥发性风味物质、滋味物质对比于标准雅致放射毛霉菌株CICC 3093都有明显优势的雅致放射毛霉制剂。

一种雅致放射毛霉制剂，所述雅致放射毛霉制剂由所述的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株加工而成。

本发明还在于提供一种使用所述的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株制备挥发性风味物质、滋味物质对比于CICC 3093标准雅致放射毛霉菌株都有明显优势的南乳的制备方法。

一种发酵南乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)制作豆腐；

(2)在步骤(1)制作的豆腐上接种权利要求1-2任意一项所述的雅致放射毛霉菌株的毛霉，发酵；

(3)盐腌形成南乳。

所述的雅致放射毛霉制剂在制备南乳中的应用。

一种使用所述的雅致放射毛霉菌株发酵得到的或者所述的发酵南乳的制备方法制得的南乳。

在其中一个实施例中，所述南乳中检测到的醇类物质不少于8种，所述南乳中醇类总含量为不少于2.5μg/g。

在其中一个实施例中，所述南乳中检测到的酯类物质有不少于33种，所述南乳中酯类总含量为不少于350μg/g。

在其中一个实施例中，所述南乳中检测到的非挥发性醇类物质有不少于4种，所述南乳中非挥发醇类总含量为不少于700μg/g。

在其中一个实施例中，所述雅致放射毛霉菌株发酵第二天的蛋白酶活力为不少于280U/g。

本发明提供了一种发酵生产南乳高产醇和酯类风味物质的雅致放射毛霉菌株，其发酵得到的南乳在挥发性风味物质、滋味物质对比于标准毛霉菌株都有明显优势。

对比标准菌株CICC 3093，本发明的雅致放射毛霉菌株能赋予成品南乳更多的醇类物质和酯类物质，本发明的雅致放射毛霉菌株南乳的成品酯类和醇类的含量相对于标准菌株有很大的提升。在本发明的雅致放射毛霉菌株南乳的成品中酯类相对含量为353.295μg/g，标准菌株南乳的成品中酯类的相对含量为177.093μg/g。其它醛类，酸类，酮类差异不明显。

对比滋味物质检测结果，本发明的雅致放射毛霉菌株发酵所得成品南乳中检测到的滋味成分中糖类、酸类、醇类，无论是在种类上还是在含量上对比标准菌株都有明显优势。对比酯类虽然在含量上标准菌株作为发酵菌种展现略微优势，但在种类上本发明的雅致放射毛霉菌株作为发酵菌种却有绝对优势。

综上对比，本发明的雅致放射毛霉菌株作为发酵菌种所制得的成品无论是在挥发性风味物质的检测，还是在滋味物质的检测对比于标准菌株都有明显优势。所以GDMCCNo.60792雅致放射毛霉菌株更能赋予南乳块更好的风味和口感。

附图说明

图1为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养1天形态图；

图2为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养2天形态图；

图3为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养3天形态图；

图4为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养4天形态图；

图5为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养1天显微镜观察结果图；

图6为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养2天显微镜观察结果图；

图7为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养3天显微镜观察结果图；

图8为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株(左)与标准菌株CICC 3093(右)菌落培养4天显微镜观察结果图；

图9为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株DNA测序比对图；

图10为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株与标准菌株CICC 3093两种不同的毛霉发酵得到的成品南乳部分差异挥发性风味物质质谱图；

图11为GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株与标准菌株CICC 3093两种不同的毛霉发酵得到的成品南乳中四种高含量酯类对比峰面积图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种雅致放射毛霉菌株，所述雅致放射毛霉菌株已于2019年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类名称为雅致放射毛霉菌Actinomucorelegans，保藏编号为GDMCC No.60792，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼，邮政编码510075。

所述毛霉菌株通过如下步骤筛选得到：

1、材料准备

(1)出发菌株：保藏于广州致美斋食品有限公司的菌种保藏中心，来源于南腐乳生产环境中分离纯化得到的菌种。

(2)扩培培养基配置：1000g大豆用5000mL水煮制5个小时后，过滤获得800mL豆汁，添加硫酸铵1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉30g，琼脂20g，调节pH值至6.40～6.80之间，121℃灭菌20min。

(3)酪素筛选培养基配置：干酪素4g，磷酸二氢钾0.3g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，琼脂20～25g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

2、毛霉菌株诱变与筛选

(1)孢子悬浮液的制备：取出发菌株培养2-3天的斜面，用生理盐水洗下孢子，将孢子打散、过滤，调节孢子数至10⁵个/mL，用无菌生理盐水10倍梯度稀释得到孢子悬浮液；

(2)紫外诱变：取孢子悬浮液10-20μL，置于紫外灯辐射下进行多组诱变处理，各组诱变时间分别为10s、20s、60s、80s、120s、150s、180s、200s，以诱变处理0s作为对照组，诱变处理结束后，稀释后取100-200μL涂覆于所述的扩培培养基的平板上，25-28℃培养箱中倒置培养2-3天；

(3)计算致死率：致死率＝(对照组平板菌落数-诱变处理组平板菌落数)/对照组平板菌落数×100％；

(4)菌株筛选：挑选经过紫外诱变处理后致死率在70％～90％的平板上的菌落点种于所述的酪素筛选培养基的平板上，25-28℃培养2-3天，观察记录透明圈和菌落大小，计算K值，选取菌落生长好、菌落直径大且K值大的菌落。

3、菌株保藏

将筛选获得的优良菌株菌落转接至扩培培养基斜面上，30℃恒温培养3天后成熟得到雅致放射毛霉菌，放入0-4℃冰柜保藏，所述毛霉菌株在扩培培养基上培养后的菌落形态如图1-图4所示，显微镜(20×40)观察结果图见图5-图8所示。

从图1-图4可知，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的菌落表现如下：

菌落颜色：GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的菌落在培养的前1天为白色，随着时间的延长逐渐变为枯黄色，直至发灰。而标准菌株CICC 3093培养前3天都呈白色，随着时间的延长逐渐变为淡黄色。

菌落形态：GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的菌落呈圆形，外观较干燥。而标准菌株则呈不规则形态，较小，外观较湿润。

菌落和培养基之间的连接：GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的联系较紧密，菌膜较薄，粘稠，不易挑取。标准菌株的菌落和培养基的联系较疏松，菌膜较厚，易挑取。

菌丝特征：GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的菌落菌丝稀疏且较长，质地疏松，呈绒毛状，标准菌株菌丝致密但相对较短，呈絮状。

从图5-图8可知，显微镜察结果显示：GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株的菌落菌丝均无横隔，培养第1天就有顶囊产生，而标准菌株培养2天后才有较少的孢子囊产生，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株培养第2天已经有较多的孢子囊产生；标准菌株培养3天后可观察到少量散落的孢子，随着培养时间的延长，散落的孢子数量逐渐增多。由此可见，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株生长成熟的速度要比标准菌株至少快1天。

本发明的雅致放射毛霉菌株于2019年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60792。

所述雅致放射毛霉菌在扩培培养基配置扩大培养后，提取DNA后测序，NCBI比对结果如图9所示。

所述雅致放射毛霉菌株至少具有下述性质之一：

(1)具有南乳高产挥发性醇类物质的能力；

(2)具有南乳高产挥发性酯类物质的能力；

(3)具有产非挥发性风味物质的能力；

(4)具有高产蛋白酶的能力；

(5)具有快速生长的特性，快速生长可以减少雅致放射毛霉菌株生长时杂菌的污染几率。

本发明提供了一种发酵生产南乳高产醇和酯类风味物质的雅致放射毛霉菌株，其发酵得到的南乳在挥发性风味物质、滋味物质对比于标准毛霉菌株都有明显优势。

实施例2

本实施例提供了一种雅致放射毛霉制剂，所述雅致放射毛霉制剂由所述的雅致放射毛霉菌株加工形成粉状、液状。

实施例3

本实施例提供了一种南乳，该南乳使用所述的雅致放射毛霉菌株发酵得到。

发酵南乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)制作豆腐；

(2)毛霉的接种：将步骤(1)制作的豆腐切块，喷洒所述的雅致放射毛霉菌株的毛霉，发酵；

(3)盐腌：撮毛，加盐腌制，形成南乳胚；

(4)调料腌制：将调料腌制步骤(3)得到的南乳胚，发酵预定时间，得到南乳。

经检测上述制得的南乳，所述雅致放射毛霉菌株性能如下：

(1)其具有南乳高产挥发性醇类物质的能力：本发明的雅致放射毛霉菌株发酵的南乳成品中检测到的醇类物质有不少于8种。本发明的雅致放射毛霉菌株发酵的南乳成品中醇类总含量为不少于2.5μg/g。

(2)其具有南乳高产挥发性酯类物质的能力：本发明的雅致放射毛霉菌株发酵的南乳成品中检测到的酯类物质不少于33种。本发明的雅致放射毛霉菌株发酵的南乳成品中酯类总含量不少于350μg/g。

(3)产非挥发性风味物质的能力较强：本发明的雅致放射毛霉菌株南乳成品中检测到的非挥发性醇类物质不少于4种。本发明的雅致放射毛霉菌株发酵的南乳成品中非挥发醇类总含量不少于750μg/g。

(4)其具有较强的高产蛋白酶的能力：本发明的雅致放射毛霉菌株南乳第二天的蛋白酶活力不少于280U/g。

雅致放射毛霉菌株南乳成品中的挥发性风味物质检测方法：采用顶空-固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)的方法研究挥发性风味物质。将南乳块和蒸馏水1:1混合研磨均匀，吸取5g样品放入顶空瓶中并加入转子，立即密封顶空瓶，放置在磁力搅拌器上，600r/min，80℃水浴平衡20min。平衡后，将装有50/30μm的DVB/CAR/PDMS萃取头的进样器插入瓶中，推出纤维头与样品液面保持1.0-1.5cm的距离，萃取温度为80℃，顶空萃取40min。将萃取头插入GC-MS的进样口，240℃解吸15min。

标准毛霉菌株CICC 3093与实施例1的雅致放射毛霉菌株两种不同的毛霉发酵得到的成品南乳部分差异挥发性风味物质质谱图见图10所示。

标准毛霉菌株CICC 3093与实施例1的雅致放射毛霉菌株两种不同的毛霉发酵得到的成品南乳挥发性风味物质检测结果，见表1所示。

表1两种毛霉菌株(CICC3093、GDMCC No.60792)发酵的成品南乳块挥发性风味物质峰谱图结果

由表1可知，气相色谱-质谱法(GC-MS)共鉴定出挥发性化合物60种，其中，GDMCCNo.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得到的成品南乳块中酯类含量为353.295μg/g，醇类含量为2.712μg/g，标准毛霉菌株中发酵所得的成品南乳块中酯类含量为177.093μg/g，醇类含量为0.663μg/g。酯类物质含量相差2倍，醇类物质相差4倍多。GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得的成品南乳醇类比标准菌株发酵所得多出5种。同时在雅致放射毛霉菌株中发酵所得成品中检测得到的酯类物质为33种，标准菌株发酵所得为21种。两者酯类的种类和含量相差很大，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得基本上是标准菌株发酵所得的2倍。图10中列出了只在GDMCC No.60792雅致放射毛霉检测出的典型风味物质，这些标准菌株均未检测到。图11四种高含量酯类，对比峰面积，能明显看到雅致放射毛霉检测到的面积大于标准菌株发酵所得。

其他风味物质在2种毛霉发酵的成品中总含量和种类差别不是很大。

雅致放射毛霉菌株南乳成品中的非挥发性物质的检测：

非挥发性风味物质检测方法：取0.6微克的南乳块样品置于1.5mL的离心管中；置于-80℃，真空冷冻干燥；加入300μL的N-N-二甲基甲酰胺，超声溶解30min，涡旋均匀，离心(12000,5min)；取50μL的上清液，置于1.5mL离心管，加入100μL的BSTFA，5μL的内标，涡旋均匀；取1μL于GC-MC进样分析。

标准毛霉菌株CICC3093与实施例1的雅致放射毛霉菌株GDMCC No.60792两种不同的毛霉发酵得到的成品南乳滋味物质检测结果如表2所示。

表2两种毛霉菌株(CICC3093、GDMCC No.60792)发酵的成品南乳块非挥发性风味物质峰谱图结果

由表2可知，1、对比糖类，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得成品南乳中检测到的糖类有12种，含量为5944.835μg/g。标准毛霉菌株CICC3093发酵所得成品中检测到糖类有9种，含量为4369.938μg/g。2、对比酸类，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得成品中检测到的酸类物质有7种，含量为1060.607μg/g，标准毛霉菌株CICC3093发酵所得到的酸的种类为3种，含量为863.269μg/g。3、对比酯类，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得成品中测得5种，含量为551.47μg/g，标准毛霉菌株CICC3093发酵所得成品中测得3种,含量为571.492μg/g，虽然标准毛霉菌株CICC3093发酵所得的酯类的含量稍微大于GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得，但是对比酯类的种类却是正好相反。4、对比醇类GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵所得成品测得醇的种类为4种，含量为72.310μg/g。标准毛霉菌株CICC3093作为发酵菌种测得的物质中醇的种类为2种,含量为375.163μg/g。综上，本发明的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株对比标准毛霉菌株CICC3093作为发酵菌种所制得的成品具有明显优势。

蛋白酶酶活力测定：

蛋白酶活的测定按照国标SB/T 10317-1999执行。接种GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株后，第2天测定蛋白酶活力，发现GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株发酵的豆腐块酶活力为289.5±22.8U/g，标准毛霉菌株CICC3093酶活力为195.4±15.4U/g，本发明的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株比标准毛霉菌株CICC3093酶活力高出48％。

对比标准菌株，本发明的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株能赋予成品南乳更多的醇类物质和酯类物质，GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株南乳的成品酯类和醇类的含量相对于标准毛霉来说有很大的提升。GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株在南乳中的酮类含量为0.099μg/g，而标准毛霉菌株酮类的含量为0.075μg/g，其它酸类，烃类和杂环类含量基本一致。

对比滋味物质检测结果，本发明的雅致放射毛霉菌株发酵所得成品南乳中检测到的滋味成分中糖类、酸类、醇类，无论是在种类上还是在含量上对比标准菌株都有明显优势。对比酯类虽然在含量上标准菌株作为发酵菌种展现略微优势，但在种类上对雅致放射毛霉菌株作为发酵菌种却有绝对优势。

综上对比，本发明的雅致放射毛霉菌株作为发酵菌种所制得的成品无论是在挥发性风味物质的检测，还是在滋味物质的检测对比于标准毛霉菌株都有明显优势。所以本发明的GDMCC No.60792雅致放射毛霉菌株更能赋予南乳块更好的风味和口感。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种雅致放射毛霉菌株，其特征在于，所述雅致放射毛霉菌株已于2019年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60792，拉丁名称为Actinomucor elegans。

2.根据权利要求1所述的雅致放射毛霉菌株，其特征在于，所述雅致放射毛霉菌株至少具有下述性质之一：

（1）具有高产挥发性醇类物质的能力；

（2）具有高产挥发性酯类物质的能力；

（3）具有产非挥发性风味物质的能力；

（4）具有高产蛋白酶的能力；

（5）具有快速生长的特性。

3.一种雅致放射毛霉制剂，其特征在于，所述雅致放射毛霉制剂由权利要求1或2所述的雅致放射毛霉菌株加工而成。

4.一种发酵南乳的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制作豆腐；

（2）在步骤（1）制作的豆腐上接种权利要求1-2任意一项所述的雅致放射毛霉菌株的毛霉，发酵；

（3）盐腌形成南乳。

5.权利要求1-2任意一项所述的雅致放射毛霉菌株在制备南乳中的应用。

6.一种使用权利要求1-2任意一项所述的雅致放射毛霉菌株发酵得到的或者权利要求4所述的发酵南乳的制备方法制得的南乳。

7.根据权利要求6所述的南乳，其特征在于，所述南乳中检测到的醇类物质不少于8种，所述南乳中醇类总含量为不少于2.5μg/g。

8.根据权利要求6所述的南乳，其特征在于，所述南乳中检测到的酯类物质有不少于33种，所述南乳中酯类总含量为不少于350μg/g。

9.根据权利要求6所述的南乳，其特征在于，所述南乳中检测到的非挥发性醇类物质有不少于4种，所述南乳中非挥发醇类总含量为不少于700μg/g。

10.根据权利要求6所述的南乳，其特征在于，所述雅致放射毛霉菌株南乳第二天的蛋白酶活力为不少于280U/g。

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