KR100592129B1

KR100592129B1 - 차가버섯(ＩｎｏｎｏｔｕｓＯｂｌｉｑｕｕｓ)균사체의 대량생산을 위한 액체배양법

Info

Publication number: KR100592129B1
Application number: KR1020040039112A
Authority: KR
Inventors: 김환철; 서승보; 최창하; 이찬복; 김진표; 김동희; 조수묵; 유창현; 유재국
Original assignee: 주식회사한국신약
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2006-06-23
Also published as: KR20050113949A

Abstract

본 발명은 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 액체배양법에 관한 것으로서, 구체적으로 뽕나무 추출물이 첨가된 한천배지를 이용하여 차가버섯 균사체를 초기 고체 종배양하고, 상기 고체 종배양한 균사체를 균질화하여 액체 종배양한 후, 이를 대량생산을 위하여 회분식 액체 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 차가버섯 균사체의 액체배양법은 기존의 자실체를 채집하거나 재배하는 방법을 이용할 때 따르는 자원고갈이나 생태계 파괴 등의 문제점을 해결하고, 재배기간을 단축시킬 수 있는 저비용의 고품질 다수확이 가능한 진보적인 배양방법으로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

차가버섯(Inonotus Obliquus)

Description

차가버섯(ＩｎｏｎｏｔｕｓＯｂｌｉｑｕｕｓ)균사체의 대량생산을 위한 액체배양법{The methods of liquid culture for the mass production of Inonotus Obliquus}

본 발명은 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 액체배양법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뽕나무 추출물이 첨가된 한천배지를 이용하여 차가버섯 균사체를 초기 고체 종배양하고, 상기 고체 종배양한 균사체를 균질화하여 액체 종배양한 후, 이를 대량생산을 위하여 회분식 액체 배양하는 방법에 관한 것이다.

차가버섯은 소나무 비늘버섯과(Hymenochaetaceae)에 속하는 담자균류의 일종으로 검은 자작나무류에 덩이 모양으로 대형의 균핵을 형성하기 때문에 검은 자작나무 버섯이라고도 하며, 자작나무류의 줄기에 기생해서 흰색 부후를 발생시키는 병원균의 균핵으로 자작나무 암종병균이라고도 한다. 차가버섯의 자실체는 수피밑에 얇고 넓게 퍼져 있으며 갓을 형성하지는 않는다. 또한, 균핵의 형태는 표면이 검고 종횡으로 균열이 많으며 내부는 황갈색으로 목질진흙버섯과 비슷하다. 균핵 의 직경은 10 내지 20 ㎝정도이며, 주로 약용으로 사용되는 부분이다.

상기의 차가 버섯이 속해 있는 담자균류는 오래 전부터 민간 전통요법으로 전래되어 오며 각종 질병에 대한 요법제로 이용되어 왔다. 특히, 담자균류가 생산하는 항암성 다당류들은 부작용이 적어 독성 면에서 매우 안전하면서도 인체 내 면역계의 기능을 강화시켜 탁월한 항암효과가 있는 것으로 널리 알려져 있다.

한편, 종래의 담자균류를 이용하는 방법으로는 크게 자실체를 채집하거나 재배하여 이용하는 방법과 자실체로부터 균사체를 분리하여 균사체를 이용하는 방법으로 나누어진다. 기존의 야생 자실체를 채집하거나 이용하는 방법은 자원의 고갈 및 생태계 파괴라는 문제가 뒤따를 뿐만 아니라 필요량의 확보가 불가능하며, 재배를 통한 자실체 수확 역시 재배기간에 오랜 시간이 소요되는 등의 많은 제약 조건이 있어 실제적인 이용방법으로서는 바람직하지 못하다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점들을 해결할 수 있으며, 차가버섯 균사체의 대량생산이 가능한 액체배양법을 개발하기 위하여, 차가버섯 균사체의 최적화 배지 및 최적 배양조건을 결정하고, 이를 이용하여 초기 고체 종배양과 액체 종배양을 거쳐 회분식 액체배양법의 단계를 포함하는 대량생산 방법을 확립하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 차가버섯 균사체의 빠른 성장과 저비용의 고품질 다수확을 위하여 최적화 배지를 이용한 초기 고체 종배양, 액체 종배양 및 회분식 액체배양의 단계로 이루어진 액체배양법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차가버섯 균사체의 최적화된 배지 및 배양조건을 제공한다.

또한, 본 발명은 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 액체배양법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 차가버섯 균사체의 최적화된 배지 및 배양조건을 제공한다.

본 발명자들은 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 액체배양법을 확립하기 위하여, 먼저 인공재배가 용이하지 않은 상기 균사체의 최적화된 배지 및 배양조건을 결정하였다.

배지, 온도 및 pH에 따른 차가버섯 균사체의 성장 속도 및 균사밀도를 측정한 결과, 본 발명의 차가버섯 균사체는 바람직하게는 YMG(Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ), No.31(Glucose 20 g, Malt extract 20 g, Peptone 1 g, Agar 20 g/ℓ), ME(Malt extract 20 g, Peptone 5 g, Agar 20 g/ℓ), Oatmeal(Oatmeal 60 g, Agar 20 g/ℓ), MYP(Malt extract 30 g, Yeast extract 2 g, Peptone 1 g, Agar 20 g/ℓ), SA(Glucose 40 g, Peptone 10 g, Agar 20 g/ℓ), MCM(Glucose 20 g, Yeast extract 2 g, Peptone 2 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, K₂HPO₄ 1 g, KH₂PO₄ 0.46 g, Agar 20 g/ℓ) 및 EYMG(Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ, 뽕나무 추출액 30%(v/v))배지에서 우수한 생장성을 보였으며, 가장 바람직하게는 MYP( Malt extract 30 g, Yeast extract 2 g, Peptone 1 g, Agar 20 g/ℓ)배지를 이용 25 내지 30℃ 및 pH 6의 조건에서 배양한 차가버섯 균사체가 가장 우수한 생장성을 보인다 (표 1, 2 및 3 참조).

본 발명자들은 상기에서 결정한 최적화된 배양조건을 바탕으로 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 단계별 액체배양법을 확립하였다.

본 발명의 액체배양법은 i) 한천배지에서 차가버섯 균사체를 초기 고체 종배양하는 단계; ii) 상기 고체 종배양한 균사체를 균질화하여 액체 종배양하는 단계; 및 iii) 플라스크 액체 종배양한 균사체를 대량으로 회분식 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 단계 i)의 초기 사용배지는 간편하면서도 신속하게 배양이 가능하도록 제조된 것으로, YMG 한천배지에 뽕나무 추출물을 바람직하게는 5 내지 100%, 가장 바람직하게는 30%(V/V) 첨가하여 제조한다. 또한, 상기단계 ii)의 플라스크 액체 종배양은 뽕나무 추출물 또는 상백피 추출물을 바람직하게는 5 내지 100%, 가장 바람직하게는 30%(V/V) 첨가하여 제조된 YMG(Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ) 또는 YGML(Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ, 대두유 0.03%(v/v))액체배지를 이용한다.

상기단계 iii)의 대량생산을 위한 액체 배지로는 2 내지 10%(W/V) 포도당, 0.5 내지 5%(W/V) 효모추출물 및 0.1 내지 3%(W/V) 펩톤류를 포함하는 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 탄소원으로 포도당뿐만 아니라 대두유, 자당, 맥아추출물 및 물엿 등을 사용할 수 있고, 질소원으로는 탈지대두분, 효모추출물, 분리대두단백, 콘스팁파우더, 파마메디아 및 CSL(corn steep liquor)를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 칼륨, 마그네슘 및 인산과 같은 무기염류를 첨가하여 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 P-1배지(2 내지 10%(W/V) 포도당, 0.5 내지 5%(W/V) 효모추출물 및 0.1 내지 3%(W/V) 펩톤류)를 사용하였다. 이외에도, 상기단계 iii)의 배양방법으로는 호기적 조건에서 진탕배양 또는 통기교반 배양을 하는 것이 바람직하며, 배양온도는 25 내지 30℃에서 배양하는 것이 가장 높은 생장성을 보인다. 본 발명의 상기단계 iii)에서 통기교반 배양을 이용하는 경우, 3 내지 10 일간의 짧은 배양기간으로도 대량생산이 가능하다.

상기한 액체배양법은 차가버섯뿐만 아니라 다른 담자균류의 배양방법으로도 이용 가능하다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 차가버섯 균사체의 최적배지 및 생장조건 결정

<1-1> 차가버섯 균사체의 배지에 따른 생장성 측정

먼저, 차가버섯 균사체의 생장성이 가장 우수한 배지를 결정하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 다양한 종류의 배지를 이용하여 균사생장과 밀도를 측정함으로써 최적의 생장배지를 결정하였다. 구체적으로 29±1℃로 고정된 배양기에서 각각의 다른 배지들을 사용하여 차가버섯의 균사체를 12 일간 배양하였고, 이에 따른 차가버섯 균사체의 지름 및 균사밀도를 측정함으로써 생장성을 측정하였다.

배지

PDA

YMG

P-1

No.31

YM

ME

Oatmeal

MYP

SA

MCM

Czapeck's

EYMG

지름/mm

49

50

41

57

46

56

60

62

52

53

38

58

균사밀도

***

**

***

*

***

균사밀도 *** : 우수 ** : 양호 * : 불량

PDA: Potato 200 g, Dextrose 20 g, Agar 20 g/ℓ

YMG: Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ

P1: Glucose 15 g, Yeast extract 10 g, Peptone 6 g, Malt extract 15 g, Agar 20 g/ℓ

NO.31: Glucose 20 g, Malt extract 20 g, Peptone 1 g, Agar 20 g/ℓ

YM: Yeast extract 3 g, Malt extract 3 g, Peptone 5 g, Dextrose 10 g, Agar 20 g/ℓ

ME: Malt extract 20 g, Peptone 5 g, Agar 20 g/ℓ

Oatmeal: Oatmeal 60 g, Agar 20 g/ℓ

MYP: Malt extract 30 g, Yeast extract 2 g, Peptone 1 g, Agar 20 g/ℓ

SA: Glucose 40 g, Peptone 10 g, Agar 20 g/ℓ

MCM: Glucose 20 g, Yeast extract 2 g, Peptone 2 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, K₂HPO₄ 1 g, KH₂PO₄ 0.46 g, Agar 20 g/ℓ

Czapek's: Sucrose 30 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, K₂HPO₄ 1 g, KCl 0.5 g, NaNO₃ 3 g, FeSO₄·7H₂O 0.01 g, Agar 20 g/ℓ

EYMG: Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, Agar 20 g/ℓ, 뽕나무 추출액 30%(v/v)

그 결과, 표 1 에서 보듯이 YMG, No.31, ME, Oatmeal, MYP, SA, MCM 및 EYMG 배지에서 대체적으로 우수한 생장성을 보였으며, 특히 MYP 배지를 사용하였을 때 균사의 생장성이 가장 우수함을 확인하였다.

<1-2> 차가버섯 균사체의 온도에 따른 생장성 측정

또한, 차가버섯 균사체의 온도에 따른 생장성 측정을 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 가장 우수한 성장성을 보인 MYP 배지를 사용하여 20℃, 25℃, 30℃, 37℃ 및 40℃로 배양온도를 설정한 후, 각 온도에 따른 균사체의 성장 속도 및 생장성을 측정하였다.

온도(℃)	20	25	30	37	40
지름(mm)	25	57	62	14	0
균사밀도	**	***	***	**	X

균사밀도 *** : 우수 ** : 양호 X : 불량

그 결과, 표 2 에서 보듯이, 25 내지 30℃ 사이에서 차가버섯 균사체의 성장 속도가 가장 빠름을 알 수 있었다.

<1-3> 차가버섯 균사체의 pH에 따른 생장성 측정

차가버섯 균사체의 pH에 따른 생장성 측정을 위하여, 본 발명자들은 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>의 결과를 토대로, MYP 액체배지를 사용하여 29±1℃에서 100 rpm의 교반속도로 차가버섯의 균사체를 7 일간 배양하는 방법으로 각 pH의 변화에 따른 균사생장과 밀도를 조사하였다. 초기 접종량은 배지의 10%(V/V)를 접종하여 배양하였다.

pH	3.0	4.0	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	8.0	9.0	10.0
DCW(g/100 ㎖)	0	0.28	0.59	0.64	0.77	0.72	0.68	0.43	0.12	0

DCW; Dry Cell Weight(균사체의 건조 후 무게)

그 결과, 표 3 에서 보듯이 특히 pH 6.0 에서 차가버섯 균사체의 성장이 가장 우수함을 알 수 있었다.

<실시예 2> 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 단계별 액체배양

<2-1> 차가버섯 균사체의 초기 고체 종배양

본 발명자들은 차가버섯 균사체의 신속하고 간편한 초기단계의 배양을 위하여 고체 종 배지를 선택하였다. 고체 종배지로는 뽕나무 추출물을 30%(V/V) 첨가한 YMG 한천배지(Yeast extract 4 g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ및 Agar 2%)를 121℃에서 15 분간 멸균한 뒤 페트리디쉬에 20 ㎖ 분주하여 사용하였다. 차가버섯의 균사체를 상기배지로 계대하여 25 내지 30℃에서 10 내지 20 일간 배양한 후, 차기단계의 액체 종배양을 위하여, 고체 종 배양배지상에서 균사체의 지름이 80 mm정도 자랐을 때 멸균수 120 ㎖을 첨가하여 배지를 파쇄하여 균질화시켰다.

<2-2> 차가버섯 균사체의 액체 종배양

대량 액체배양을 하기 위한 준비단계로서, 상기 고체 종배양한 차가버섯 균사체를 1차적으로 액체 종배양하였다. 액체배양의 종 배양배지로서는, 뽕나무 추출물 또는 상백피 추출물을 30%(V/V) 첨가한 YMG(Yeast extract 4g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ)배지 또는 YGML(Yeast extract 4 g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ, 대두유 0.03%)배지를 사용하였다. 상기배지 200 ㎖이 들어있는 1 ℓ플라스크를 121℃에서 15 분간 멸균한 후, <실시예 2-1>에서 멸균수를 첨가하여 파쇄한 고체 종배지 배양균주를 20 ㎖ 접종하여 진탕배양으로 3 내지 10 일간 액체 종 배양하였다.

<2-3> 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 회분식 배양

대량생산을 위한 회분식 배양에는 액체배양기를 이용한 대량 배양에서 가장 우수한 균사체의 성장성을 보이는 P-1 배지(Glucose 3 내지 10%(W/V), Yeast extract 1 내지 5%(W/V), Peptone 0.1 내지 3%(W/V))를 사용하였다. 구체적으로, 5 ℓ배양기에 상기 P-1 배지 3 ℓ가 들어있는 배양조를 121℃에서 20 분간 멸균하고, 여기에 액체 종배양액 3 내지 5%를 접종하여 25 내지 30℃에서 3 내지 10 일간 배양하였다.

상기 배양조건으로 통기량은 0.1 내지 1.0 vvm, 교반속도는 10 내지 500 rpm으로 하였으며, 용존산소량의 변화에 따라 산소량을 충족시킬 수 있도록 조절하여 배양하였다. 그 결과, 6 일 배양 후 21.6 g/ℓ의 높은 수득률로 건조균체를 얻는데 성공하였다.

본 발명의 액체배양법에 의한 차가버섯 균사체의 수득률은 종래의 배양방법으로는 얻을 수 없는 높은 수득률이며, 이는 차가버섯을 포함한 담자균류의 대량배양에 전기를 마련하는 중요한 의미를 지닌다.

본 발명은 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 고체 종배지에서의 초기 배양, 액체 종배양 및 회분식 대량 액체배양의 단계로 이루어진 액체배양법을 제공하며, 이는 종래의 자실체를 채집하거나 재배하는 방법을 이용할 때 따르는 자원의 고갈이나 생태계 파괴등의 문제를 해결하고, 재배기간을 단축시킬 수 있는 저비용의 고품질 다수확이 가능한 배양법으로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

ⅰ) YMG(Yeast extract, Malt extract, Glucose) 한천배지에서 차가버섯 균사체를 고체 종배양 하는 단계;

ⅱ) 상기 단계 1)의 고체 종배양한 균사체를 YMG(Yeast extract, Malt extract, Glucose) 액체배지 또는 YMGL(Yeast extract, Malt extract, Glucose, 대두유) 액체배지에서 액체 종배양 하는 단계; 및

ⅲ) 상기 단계 2)의 액체 종배양한 균사체를 대량으로 회분식 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 차가버섯 균사체의 대량생산을 위한 액체배양법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 ⅰ)의 배지는 뽕나무 추출물을 포함하는 YMG(Yeast extract 4g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ)한천배지인 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 1항에 있어서, 상기 YMG 한천배지는 뽕나무 추출물을 5 내지 100%(V/V)포함하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ⅱ)의 액체 종배양은 뽕나무 추출물 또는 상백피 추출물을 첨가한 YMG(Yeast extract 4 g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ) 또는 YGML(Yeast extract 4 g/ℓ, Malt extract 10 g/ℓ, Glucose 4 g/ℓ, 대두유 0.03%)배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 5항에 있어서, 상기 YMG 또는 YGML배지는 뽕나무 추출물 또는 상백피 추출물을 각각 5 내지 100%(V/V) 포함하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)의 회분식 배양은 통기량은 0.1 내지 1.0 vvm, 교반속도는 10 내지 500 rpm 및 배양온도는 25 내지 30℃로 배양하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)의 회분식 배양은 2 내지 10%(W/V) 포도당과 0.5 내지 5%(W/V)의 효모추출물 및 0.1 내지 3%(W/V)의 펩톤류를 포함하는 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.
제 8항에 있어서, 상기 배지는 P-1 배지(Glucose 3 내지 10%(W/V), Yeast extract 1 내지 5%(W/V), Peptone 0.1 내지 3%(W/V))를 사용하는 것을 특징으로 하는 액체배양법.