KR100383078B1

KR100383078B1 - 상황버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR100383078B1
Application number: KR10-2000-0033132A
Authority: KR
Inventors: 이계관; 김종래; 권호균; 전계택; 김규중
Original assignee: 환인제약 주식회사
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2003-05-12
Also published as: KR20010113057A

Abstract

본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 유가식 배양(fed-batch culture)을 통한 대량 생산 방법에 관한 것으로 강력한 항암작용을 나타내는 단백다당체를 생산하는 상황버섯 균사체의 성장을 위한 최적 온도와 pH 및 초기 글루코스 농도를 결정하고, 배양중에 간헐적 또는 지속적으로 글루코스 또는 글루코스와 효모추출물을 공급하는 유가식 배양방법을 통하여 균사체의 생산성을 증가시키는 뛰어난 효과가 있다.

Description

상황버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량 생산 방법{Process for mass production of Phellinus linteus by fed-batch culture}

본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 유가식 배양(fed-batch culture)을 통한 대량 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상황버섯 균사체의 성장을 위한 최적 pH, 온도 및 초기 글루코스(Glucose)농도를 결정하고 탄소원인 글루코스와 질소원인 효모추출물(yeast extract)을 간헐적 또는 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 통한 대량생산방법에 관한 것이다.

노인기에 많이 나타나는 만성 퇴행성 질환으로는 면역기능 저하에 기인한 질환, 암, 간장질환, 관절염, 당뇨병, 혈관 및 뇌혈관 장애, 치매증, 골조송증 등이 있다. 면역증강제는 면역기능 저하에 사용되며, 또한 세포면역기능 장애의 개선과치료를 목적으로 사용되고 있으므로, 면역증강제의 응용영역은 매우 다양하다. 최근에는 빨리 증식하고 있는 세포를 죽이는 기전에 의한 직접적인 항암 효과 외에 면역체계를 활성화시킴으로서 간접적인 항암효과를 나타내는 면역학적 요법이 위암, 대장암, 직장암 등 소화기 관련 암 치료에 있어서 외과요법, 화학요법 및 방사선요법에 대한 보조치료요법으로 응용되고 있다.

버섯의 성분 중 면역증강작용을 나타내는 것은 다당체이다. 버섯 다당체는 일반적으로 β-1,3 글루칸(β-1,3 glucan)의 골격에 β-1,6의 가지 구조를 갖는 단일물질임에도 불구하고 생체기능에 다양한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 일본의 경우 기능성 식품으로 표고버섯 균사체 추출물이 이미 일반화 되어 있으며, 또한 1992년 아가리쿠스버섯 (흰들버섯) 자실체로부터 추출한 고분자 다당체가 암세포 증식 억제 뿐만 아니라 류머티스 관절염이나 만성기관지염, 위염처럼 면역기능 약화가 원인인 모든 질병에 효능이 있다고 알려지면서 그 활용방안에 대한 연구가 큰 진전을 보이고 있고, 최근 기능성 식품으로 상품화 되었다. 의약품의 경우 면역증강효과에 의한 암 치료(보조)제로 사용되고 있으며 구름(운지)버섯 배양 균사체에서 추출한 단백다당체 PSK가 항암성 면역증강제 크레스틴(Krestin)산제로, 치마버섯 균사체 배양의 배양여액에서 추출한 세포외 다당체 시조필란 (Shizophyllan)이 항암성 면역증강제 시조필란(Sizofilan)주사제로 그리고 표고버섯 자실체에서 추출한 단백다당체 렌티난(Lentinan)이 항암성 면역증강제 렌티난(Lentinan)주사제로 판매되고 있다. 이 다당체는 균사체의 생체성분으로서 균사체 생장에 비례하여 증가하는 특성을 가지고 있다. 본 연구에서 사용한 균주인상황 (Phellinus linteus) 버섯은 소나무비늘버섯과 (Hymenochaetaceae)의 진흙버섯속 (Phellinus)에 속하는 백색부후균으로, 자실체 추출물에서 96.7%의 매우 강력한 종양저지율을 나타냄이 알려져 왔다. 최근에 와서는 상황을 비롯한 이들 버섯 균사체 추출물의 항 종양작용, 면역조절 효과 및 임상실험에 의한 안정성이 입증되었으며, 따라서 각종의 산업적 응용연구가 활발히 진행되기에 이르렀다.

현재 국내에서는 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)를 대형 발효탱크에서 생산하고, 항암활성이 있는 균사체의 추출물을 항암제로 시판하고 있으나 상황버섯의 액체배양에 의한 대량 생산 방법은 보고된 바 없었다.

본 발명자들은 상황버섯 균사체의 액체배양을 위한 최적 온도, pH 및 초기 탄소원 농도조건을 확립하고, 배양중에 글루코스(Glucose)를 간헐적 또는 지속적으로 공급함으로써 고밀도의 세포배양이 가능한 유가식 배양 공정을 확립함으로써 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상황버섯 균사체의 액체배양을 위한 최적 온도, pH 및 초기 탄소원 농도조건을 확립함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 배양중에 글루코스를 공급함으로써 고밀도 세포배양을 위한 최적의 유가식 대량배양 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 배양중에 글루코스와 효모추출물을 혼합하여 공급함으로써 고밀도 세포배양을 위한 최적의 유가식 대량배양 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 상황버섯 균사체를 배양배지에 접종하여 온도, pH 및 초기 글루코스 농도를 달리하여 균체의 최적 성장 조건을 확립한 후, 상기 조건을 기초로 하여 글루코스(Glucose) 또는 글루코스와 효모추출물(Yeast extract)을 간헐적 및 지속적으로 공급하고 건조균사체의 수율과 균사체의 비성장속도(Specific growth rate)를 조사하여 최적의 유가식 발효공정을 확립함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다 .

도 1은 배지 중의 pH 변화에 따른 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 건조균체농도를 나타낸 그래프이다. 도 2는 상황버섯 균사체의 회분식 배양시 시간의 경과에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도, 글루코스농도를 나타낸 그래프이다. 도 3은 상황버섯 균사체의 각기 다른 초기 글루코스 농도로 회분 배양시 건조균체농도를 나타낸 그래프이다. 도 4는 상황버섯 균사체의 각기 다른 초기 글루코스 농도로 회분 배양시 비성장속도를 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 5는 간헐적 방법에 의해 글루코스를 공급하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양시 시간의 경과에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도 및 글루코스농도를 나타낸 그래프이다. 도 6은 지속적 방법에 의해 글루코스를 공급하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양시 시간의 경과에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도 및 글루코스농도를 나타낸 그래프이다.도 7은 간헐적 방법에 의해 글루코스와 효모추출물을 공급하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양시 시간의 경과에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도 및 글루코스농도를 나타낸 그래프이다. 도 8은 지속적 방법에 의해 글루코스와 효모추출물을 공급하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양시 시간의 경과에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도 및 글루코스농도를 나타낸 그래프이다. 도 9는 각기 다른 배양방법에 의해 상황버섯 균사체 배양시의 비성장속도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명은 발효기(생물반응기)에 글루코스(Glucose) 5∼100g/L, 펩톤(Peptone) 1∼20g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 1∼20g/L, MgSO₄·7H₂O 1∼10g/L, KH₂PO₄0.1∼1g/L 및 K₂HPO₄0.1∼1g/L를 함유하는 배지를 첨가하여, 온도는 25∼35℃로 유지하고 pH를 5∼7로 조절하면서 공기압축기를 통하여 0.1∼1.0L/min으로 공기를 공급하고 용존산소농도에 따라 교반속도를 변화시키면서, 배지중의 영양소가 고갈됨을 예측하여 배양중에 탄소원을 글루코스로 하고 그의 초기농도를 10g/L로 하여 배양하다가 추가로 10g/L의 글루코스를 24시간 간격으로 간헐적으로 공급하거나 또는 글루코스 농도가 10g/L로 일정하게 유지되도록 지속적으로 공급하면서 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)를 배양하는 것을 특징으로 하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양방법에 관한 것이다.본 발명은 성장 배지가 포함된 배플 플라스크(baffled flask)에 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)를 접종하고 진탕배양하여 본배양을 위한 종배양을 실시하는 단계; 상기 종배양액을 PDA(potato dextrose agar)고체배지와 PDB(potato dextrose broth)액체배지에 접종하고 배양온도를 달리하여 배양한 후 균사체 생산량을 조사함으로써 최적 온도조건을 결정하는 단계; 상기 균사체를 최적화된 생산 배지(이하 WIM 완전배지)에 접종하고 초기 pH를 달리하여 배양한 후 균사체 생산량을 조사함으로써 최적 pH조건을 결정하는 단계; 상기 균사체를 7L 발효기를 사용하여 온도를 28℃로 유지하고 pH를 5.5로 조절하여 임펠러로 교반하면서 WIM 완전배지내의 초기 글루코스 농도를 변화시켜 배양한 후 균사체 생산량을 조사함으로써 최적 초기 글루코스 농도 조건을 결정하는 단계; 상기 균사체를 초기 글루코스 농도가 1%인 WIM완전 배지에 배양하면서 탄소원 고갈에 따라 추가로 1% 농도의 글루코스를 간헐적 및 지속적 공급 방식에 의해 공급한 후 최종 균사체량과 균사체 비성장속도를 조사함으로써 유가식 배양조건을 확립하는 단계; 상기 단계의 결과를 토대로 글루코스와 함께 효모추출물을 간헐적 및 지속적 방식에 의해 공급한 후 최종 균사체량과 균사체의 비성장속도(specific growth rate)를 조사함으로써 회분식 배양(batch culture)공정보다 건조 균사체(dry cell weight) 수율이 향상된 유가식 배양(fed-batch culture)공정을 확립하는 단계로 구성된다.

상기 단계에서 사용한 상황버섯 균사체(Phellinus linteusWI-001)는 강원도 양양에서 채집한 자실체로부터 균사조직을 무균적으로 떼어 내어 고체배지상에 옮겨 순수 분리하였다. 표준 균주로 사용한 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)ATCC-26710는 American Type Culture Collection에서 구입하였다.

균주 보존은 4℃ 냉장실에서 20ml 시험관에 PDA(potato dextrose agar) 슬랜트(slant)로 보관하면서 필요할 때마다 PDA고체 배지에 이식한 후, 균사체 직경이 5cm이상 자랐을 때 균사체 가장자리에서 의료용 무균칼로 가로 5mm, 세로 5mm의 절편을 떼어 확대 배양하였다.

종배양을 위한 성장배지는 미국 Difco사에서 제조된 감자 덱스트로 아가(potato dextrose agar) 고체 배지 및 감자 덱스트로 브로스(potato dextrose broth) 액체 배지를 사용하였다. 본 배양을 위한 생산배지의 조성은 글루코스 (Glucose) 20g/L, 펩톤(Peptone) 6g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 4g/L, MgSO₄·7H₂O 1.5g/L, KH₂PO₄0.4g/L, K₂HPO₄0.2g/L였으며 pH는 5.5로 조절하였다. 배지의 열 멸균시 침전과 갈변현상을 방지하기 위하여 당과 무기 염류를 농축용액으로 만들어 멸균한 후 무균상태에서 나머지 배지용액과 혼합하여 사용하였다. 유가식 배양시 글루코스 또는 글루코스와 효모추출물의 공급은 페리스탈틱 펌프(peristalitic pump, Cole parmer CO., Masterplex L/S)를 이용하였다.

본 발명에 사용된 발효기는 7L 용량의 상부형 발효기(B. E. Marubishi Co., Ltd.)로서 자동 온도 조절기, 교반속도 조절기, 용존산소농도 센서(TOA Electronics Ltd., DY220) 및 pH 센서(TOA Electronics Ltd., D26)를 부착하고 있으며 제어지시기(B. E. Marubishi Co., Ltd., MDR-4CR)와 연결되어 자동으로 제어된다. 산소의 공급은 공기압축기를 이용하여 여과필터를 거쳐 발효기 안으로 투입되게 하였으며 유량은 0.1∼1.0 L/min 범위내에서 조절하였다.

균체농도의 분석은 매시간 마다 채취한 시료를 여과장치에서 와트만 페이퍼2(Whatman paper2)로 여과한 후 균사체를 증류수로 세척하고 다시 여과하였다. 이 과정을 2회 반복한 후에 수분측정기(Mettler toledo, HR73)에서 온도를 80℃로 조정한 후 수분이 완전히 증발되면 건조무게를 측정함으로써 분석하였다.

배양액중의 잔류 글루코스의 농도 분석은 매시간마다 채취한 시료를 여과장치에서 whatman paper 2로 여과한 후 균사체는 제거하고 여과액 50㎕를 Dinitrosalicylic acid(DNS)시약 150㎕와 혼합하고 5분간 끊는 물에서 중탕시킨 후 상온에서 냉각시켜 UV-Visible 분광광도계(HP 8453)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus )의 액체배양을 위한 조건결정

제1공정 : 상황버섯 균사체( Phellinus linteus )의 본배양을 위한 종배양

종균 배양기간 설정을 위해서 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 생장곡선 및 탄소원 소모도를 7L 발효기를 사용하여 배양함으로써 조사하였다. 실험결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 배양 6일째까지 균사성장이 왕성한 것으로 조사되었으며, 배지내 탄소원도 완전히 고갈되지 않은 상황이므로 균사체에 스트레스로 작용하지 않은 것으로 나타났다. 따라서 본배양을 위한 종균 배양일은 6일을 넘지 않은 종균을 사용하였다.

상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 1차 종배양은 100mL 성장배지를 넣은 500ml 배플 삼각플라스크(baffled flask)에 접종하여 25℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 120rpm으로 교반하면서 7일간 배양하였다. 1차 종배양 완료후 균사체 ball을 균질화시키고자 waring blender(Cole parmer Co.)로 5초간 균질화 시킨 후 2차 종배양으로 300ml 생산배지를 넣은 1L 배플 삼각플라스크(baffled flask)에 상기 배양액을 10%(v/v)로 접종한 후 25℃ 진탕배양기에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하였다.

제2공정: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus )의 최적 성장 온도의 결정

종균 및 본배양에서 균사체 배양을 위한 최적 성장온도를 조사하기 위하여P. linteusWI-001와P. linteusATCC 26710을 대상으로 PDA 고체배지상에서 23℃, 25℃, 28℃, 30℃ 및 32℃로 배양온도를 설정한 후 균사체 성장속도를 조사하였다. 실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 배양온도 28℃에서 배양한 균사체의 반지름이 22mm로서 성장속도가 가장 빠른 것으로 나타났으며, 배양온도 25℃ 이하 또는 30℃ 이상에서는 균사체 성장속도가 떨어지는 결과를 얻었다. 배양온도에 따른 PDB 액체배지상에서의 균사체 생산량을 조사한 결과에서도 28℃에서 균사체 생산량이 12g/L로서 고체배지상의 결과와 일치하였다.

상황버섯 균사체(Phellinus linteus)의 성장에 미치는 온도의 영향

온도 (℃)	P. linteusWI-001	P. linteusATCC 26710
온도 (℃)	균사체 반지름(mm)	균사체 생산량(g/L)	균사체 반지름(mm)	균사체 생산량(g/L)
23	15	7.2	14	7.1
25	18	10.4	18	9.2
28	22	12.0	19	11.4
30	21	10.8	17	10.3
32	17	7.8	13	6.9

제3공정: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus) 의 최적 성장 pH조건의 결정

WIM 완전배지에서 초기 pH에 따른 균사체 생산량을 플라스크 배양을 통해 조사하였다. 또한, WIM 완전배지에서 배양배지의 초기 pH를 5.5로 조절하고 탄소원인 글루코스 농도를 20g/L로 설정하여 배양하면서 균사체의 성장속도에 따른 pH의 변화를 조사하였다.

실험 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 초기 pH는 5.0에서 5.5사이가 적합한것으로 조사되었으며 배양중의 pH의 변화는 도 2에 나타낸 바와 같이 배양 3일째까지 pH가 6.5로 상승한 후 다시 배양 7일에 pH가 5.5로 떨어지는 경향을 나타냈으며 배양기간 동안 최적 pH 범위를 크게 벗어나지 않았다. 이러한 pH 변화 양상은 배양 초기 3일까지는 균사체가 배지성분의 질소원 구성성분인 아미노산을 왕성하게 이용하면서 배지중으로 방출된 암모니아가 배지중의 수소이온과 결합하여 배지의 pH가 상승하는 것으로 보인다.

제4공정: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus) 의 최적 성장 초기 글루코스 농도의 결정

7L 발효기에서 배양부피(working volume)를 5L로 하여 최적 성장온도인 28℃를 유지하면서 pH는 5.5로 조절하고, 터빈 타입 임펠러(turbin type impeller) 및 마이크로 홀 타입 스파거(micro-hole type sparger)를 고정시켜 용존산소농도에 따라 70∼150rpm으로 교반하면서 배양하였다. 이때 WIM 완전배지의 초기 탄소원 농도를 변화시켜 상황버섯 균사체(P. linteusWI-001)의 건조균체농도(dry cell weight)와 비성장속도(specific growth rate)를 조사하였다.

실험 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 초기 글루코스 농도를 10g/L로 조정한 배지에서의 균사체 건조균체농도는 약 10 g/L였으며, 20g/L 농도의 배지에서 균사체 건조균체농도는 약 15 g/L였고, 40g/L 농도의 배지에서는 균사체 건조균체농도가 24 g/L였다. 초기 탄소원 농도가 증가할수록 균사체 최종 생산량은 증가하는 양상을 보이지만, 균사체의 성장 속도는 초기 글루코스 농도가 낮을수록 빠른 양상을보였다. 상기 실험 결과를 토대로 도 4에 나타낸 바와 같이 초기 글루코스 농도변화에 따른 균사체의 비성장속도 (specific growth rate, μ)를 비교하여 보았다. 초기 글루코스 농도가 5g/L 및 10g/L일 경우 균사체 비성장속도 (specific growth rate, μ)는 각각 0.027 h^-1및 0.029 h^-1로 나타났으며, 초기 글루코스농도가 20g/L, 30g/L 및 40g/L일 경우 균사체 비성장속도 (specific growth rate, μ)는 0.016 h^-1, 0.015 h^-1및 0.013 h^-1으로 나타났다. 이 결과로 볼 때 상황버섯 균사체의 성장속도에 미치는 초기 글루코스 농도는 10g/L를 기준으로 큰 차이를 보이고 있었다. 따라서 균사체가 활력있게 성장하기 위해서 초기 글루코스농도를 10g/L 이하로 조절하면 균사체 비성장속도 (specific growth rate, μ)는 0.027 h^-1이상을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus) 의 대량 생산을 위한 탄소원 공급을 통한 유가식 배양

상기 실시예 1의 결과를 토대로 균사체 생산량 증가 및 배양기간 단축을 위한 유가식 배양 (fed-batch culture)을 시도하였다. 배지중의 초기 글루코스 농도는 균사체 비성장속도가 가장 우수한 10g/L로 첨가하여 배양하다가 탄소원 고갈에 따라 추가로 10g/L 농도의 글루코스를 간헐적 공급방식 (intermittent feeding) 및 지속적 공급방식 (continuous feeding)에 의해 공급하였다. 간헐적 공급방식을 사용한 유가식 배양에서는 도 5에 나타낸 바와 같이 글루코스의 추가 공급은 글루코스 소모도를 예측하여 400g/L 글루코스 스톡(stock)을 배양 3일째부터 배양 5일째까지 24시간 간격으로 간헐적 공급하여 균사체를 배양하였다. 지속적 공급방식을 사용한 유가식 배양에서는 도 6에 나타낸 바와 같이 배양 중 배양 3일째부터 배양 5일째까지 균사체 성장을 고려하여 글루코스농도가 10g/L로 유지되도록 지속적 공급방식에 의해 균사체를 배양하였다.

상기와 같은 유가식 배양 결과, 간헐적 공급방식에 의한 유가식 배양은 최종 균사체량이 18g/L였으며, 지속적 공급방식에 의한 유가식 배양은 최종 균사체량이 20g/L였다. 이는 초기 글루코스 농도를 20g/L로 하여 회분식 배양한 결과 획득된 건조 균사체량인 14g/L에 비해 간헐적 공급방식의 경우에는 28%, 지속적 공급방식의 경우에는 42%의 수율이 증가되었다. 균사체의 비성장속도(specific growth rate, μ)는 초기 글루코스 농도를 20g/L로 하여 회분식 배양한 경우 0.016h^-1이었으며, 글루코스의 간헐적 또는 지속적 공급에 의하여 유가식 배양한 경우에는 각각 0.027h^-1, 0.028h^-1이였다. 이는 회분식 배양에 비해 유가식 배양한 경우 균사체의 비성장속도가 약 60%이상 증가된 것이다.

실시예 3: 상황버섯 균사체( Phellinus linteus )의 대량 생산을 위한 탄소원과 질소원 공급을 통한 유가식 배양

상기 실시예 2의 결과를 토대로 상황버섯 균사체의 생산량 증가 및 배양기간 단축을 위하여 탄소원인 글루코스(Glucose)와 함께 질소원인 효모추출물(Yeastextract)을 간헐적 및 지속적 방식에 의해 공급하는 유가식 배양(fed-batch culture)을 실시하였다. 배지 중의 초기 글루코스 농도는 10g/L로 첨가하여 배양하다가 탄소원과 질소원의 고갈에 따라 추가로 10g/L의 글루코스와 5g/L의 효모추출물을 혼합하여 간헐적 및 지속적방식에 의해 공급하였다. 간헐적 공급방식(intermittent feeding)을 사용한 유가식 배양에서는 도 7에 나타낸 바와 같이 글루코스와 효모추출물을 배양 3일째부터 배양 5일째까지 24시간 간격으로 간헐적으로 공급하였다. 지속적 공급방식을 사용한 유가식 배양에서는 도 8에 나타낸 바와 같이 글루코스와 효모추출물을 배양 3일째부터 배양 5일째까지 균사체 성장을 고려하여 글루코스 농도가 10g/L로 유지되도록 공급하였다.

실험결과, 간헐적 공급방식에 의한 유가식 배양은 최종 건조균사체량이 20g/L였으며, 지속적 공급방식에 의한 유가식 배양은 최종 건조균사체량이 25g/L였다. 이는 초기 글루코스 농도를 20g/L로 하여 회분식 배양(batch-culture)을 통하여 획득된 건조 균사체량인 14g/L에 비해 간헐적 공급방식 및 지속적 공급방식에 의한 유가식 배양의 경우 수율이 각각 42%, 78%가 증가된 것이다. 균사체의 비성장속도(specific growth rate, μ)는 도 9에 나타낸 바와 같이 회분식 배양한 경우 0.016h^-1이었으며, 글루코스와 함께 효모추출물을 간헐적 및 지속적으로 공급하면서 유가식 배양한 경우에는 각각 0.028h^-1, 0.031h^-1이였다. 이는 회분식 배양한 경우보다 유가식 배양한 경우 균사체의 비성장 속도가 최대 93%이상 증가된 것이다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 강력한 항암 작용을 나타내는 단백다당체를 생산하는 상황버섯 균사체(Phellinus linteusWI-001)를 회분식 배양공정에 의해 생산하는 것에 비해 지속적 및 간헐적으로 탄소원 또는 탄소원과 질소원을 공급하는 유가식 배양공정을 사용하는 것이 균사체의 생산량 증가와 배양기간을 단축시킬 수 있는 효과가 있으며 단백다당체의 대량생산에 있어서 경제성을 확보하는 뛰어난 효과가 있으므로, 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

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발효기(생물반응기)에 글루코스(Glucose) 5∼100g/L, 펩톤(Peptone) 1∼20g/L, 효모 추출물(Yeast extract) 1∼20g/L, MgSO₄·7H₂O 1∼10g/L, KH₂PO₄0.1∼1g/L 및 K₂HPO₄0.1∼1g/L를 함유하는 배지를 첨가하여, 온도는 25∼35℃로 유지하고 pH를 5∼7로 조절하면서 공기압축기를 통하여 0.1∼1.0L/min으로 공기를 공급하고 용존산소농도에 따라 교반속도를 변화시키면서, 배지중의 영양소가 고갈됨을 예측하여 배양중에 탄소원을 글루코스로 하고 그의 초기농도를 10g/L로 하여 배양하다가 추가로 10g/L의 글루코스를 24시간 간격으로 간헐적으로 공급하거나 또는 글루코스 농도가 10g/L로 일정하게 유지되도록 지속적으로 공급하면서 상황버섯 균사체(Phellinus linteus)를 배양하는 것을 특징으로 하는 상황버섯 균사체의 유가식 배양방법.
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제 2항에 있어서, 상기 추가 공급은 글루코스 단독 또는 10g/L의 글루코스와 5g/L의 효모추출물(yeast extract)을 혼합하여 간헐적 또는 지속적으로 공급함을 특징으로 하는 상황버섯의 유가식 배양방법.