CN117165442A - 一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法 - Google Patents

一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法 Download PDF

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CN117165442A CN202310734698.9A CN202310734698A CN117165442A CN 117165442 A CN117165442 A CN 117165442A CN 202310734698 A CN202310734698 A CN 202310734698A CN 117165442 A CN117165442 A CN 117165442A
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梁璋成
何志刚
林晓婕
李维新
林晓姿
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Abstract

本发明公开了一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法。所述方法包括以下步骤：（1）将米曲霉MJY2‑5接入红曲糟、麸皮、水制成的培养料中发酵得到成曲；（2）将成曲与盐水拌匀，曲水质量比为1:1，盐度3.5~4.5%，pH值为5.2~5.7、发酵温度为46~48℃，发酵5~7天，得到发酵液；（3）将发酵液与盐水拌匀，曲水质量比为1:1.5，盐度29~31%，pH值为5.2~5.7，发酵温度为35~37℃，发酵14~16天，得到调味液基料；（4）将调味液基料过滤、离心，收集上清液并杀菌、罐装。本发明以红曲糟为主要原料，以米曲霉为发酵剂，以酶解率及氨氮转化率为指标，筛选出蛋白利用率高、发酵液风味好的米曲霉MJY2‑5；然后基于米曲霉MJY2‑5，采用固稀态发酵技术研制红曲糟调味液，实现红曲黄酒副产物的高效利用。

Description

一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体涉及一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法。
背景技术
红曲黄酒是福建特产，它是以糯米和红曲米为主要原料，配以山泉精酿而成，具有醇香与红曲香的幽雅混合香，含有丰富的营养成分及莫纳可林K、洛伐他汀、红曲色素、γ-氨基丁酸(GABA)、麦角固醇等功能活性物质，符合当前国际酒类低度、营养、保健的消费趋势，具有广阔的市场前景。红曲糟是黄酒生产的主要副产物，它是黄酒醪经压榨、分离去酒液后留下的固形物。红曲黄酒在生产过程中能产生20～30％的红曲糟，以此推算，每年可产生2.5万吨以上的红曲糟。红曲糟除含有少量的酒精和水分外，还含有20-30％的蛋白质、20-30％的粗淀粉、10％左右的纤维素及少量的糖分、糊精、灰分等物质，其热能比较低，含有不溶性物质多，难以直接利用，一般酒厂只作为普通的饲料低价出售或作为垃圾直接丢弃，利用率很低。这不仅污染生态环境，也造成酒糟中大量的可利用资源成为废物。红曲糟具有特殊的风味，常用来做调味配料进行烹饪，因此，若将黄酒糟开发为优质的可食用产品或者其他添加剂，可极大的提高产品的附加值，具有很好的经济和社会效益。
目前，以酒糟蛋白为原料开发优质可食用蛋白或者其他添加剂已成为学者们的研究热点。国内外常用的降解蛋白生产氨基酸复合物的方法主要有酸法、碱法及酶法等。汪建国等人通过酸水解黄酒糟方式生产复合氨基酸。舒进使用碱法与酶法相结合的方法提取黄酒糟蛋白，并对其体外消化性进行了研究。谷海先等研究了应用复合风味蛋白酶及麦曲酸性蛋白酶、麦曲糖化酶水解黄酒糟生产特鲜酱油的技术。但采用酸法水解存在易产生含硫氨基酸使产品具有一股臭味、水解程度难控制、活性肽含量低等缺陷；碱法水解易引起蛋白质变性，精氨酸及部分赖氨酸被破坏，降低了蛋白质的营养价值；而用蛋白酶法水解具有条件温和、副反应少、水解程度容易控制、营养成分的保留较好等优点，但也存在不同蛋白酶制剂降解产物不固定，易生成含硫氨基酸破坏产品风味等缺陷。
目前，对黄酒糟的研究多集中于麦曲黄酒中，有关红曲糟的研究寥寥；尚未见有关采用微生物法酵解酒糟蛋白开发食品的研究报道。申请人团队前期研究了“一种红曲酒糟的红曲多肽调味液制备方法ZL201611186369.1”，采用纤维素酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等复合酶解制备红曲多肽调味液，但该方法成本较高；本团队也曾引进米曲霉3.042、RIB40、AS3.863等进行红曲糟酶解，但这些菌株不适合红曲糟的物性，酶解效率较低。因此，很有必要针对红曲糟的物性筛选高蛋白利用率米曲霉，并针对红曲糟物性研发米曲霉成曲培养及酶解发酵技术，开发成调味品或调味品基料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一株高蛋白利用率米曲霉，其分类命名为米曲霉MJY2-5，学名为Aspergillus oryzae MJY2-5，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 20221400，保藏日期为2022年09月09日。
红曲糟中蛋白主要为糯米源的谷蛋白及微生物源蛋白，蛋白质量高，充分利用酒糟的原料富含蛋白等特点，可开发成调味品或调味品基料，可极大的提高原料附加值，具有很好的经济和社会效益。
因此，本发明还提供了一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，包括以下步骤：
1)米曲霉的活化及孢子悬液制备
将米曲霉MJY2-5从甘油管接种至孟加拉红平板上，于31～33℃培养箱分离培养70～74h，在无菌操作条件下将单个孢子用接种铲接入斜面麦芽汁琼脂培养基，于31～33℃培养箱扩培70～74h，用接种铲将斜面孢子全部剥离，用无菌水洗下，摇匀，获得孢子悬液，冰箱4℃冷藏保存孢子悬液；
优选地，培养箱中培养温度为32℃，培养时间、扩培时间为72h；
2)接种
将孢子悬液接入种曲培养料中，按孢子接种量为1.0～5.0×106个/g接种；
所述种曲培养料中各组分及其质量比为：红曲糟:麸皮:水＝1:0.8:1.4，pH值为6.6±0.2；
3)发酵
将培养温度控制在32.0±0.5℃范围内，湿度保持在90.0±2.0％之间，发酵过程每天翻拌2次，发酵结束72h后获得种曲，将种曲于40℃烘箱中烘至水分含量为10.0-15.0％，打成粉末状保藏，种曲应符合《酿造酱油(GB 18186-2000)》中种曲制备的标准；
发酵过程，通过通风方式将培养料水分控制在40-50％之间；
4)成曲
将粉末状的种曲接入培养料中，按孢子接种量为1.0～5.0×106个/g接种，重复步骤2)、3)制备成曲，成曲应符合《酿造酱油(GB 18186-2000)》中成曲制备的标准；
所述培养料中各组分及其质量比为：红曲糟:麸皮:水＝1:0.8:1.4，pH值为6.6±0.2(优选为6.6)；
5)红曲糟调味液的制备
5-1)低盐固态发酵：将成曲与调配好的盐水拌匀，盐水须加热并过滤，成曲与盐水的质量比为1:1，盐水的盐度3.5～4.5％，盐水的pH值为5.2～5.7、发酵温度为46～48℃，发酵5～7天，得到发酵液；
优选地，盐水的盐度4.0％，pH值为5.5、发酵温度为47℃，发酵时间为6天；
5-2)高盐稀态发酵：将低盐固态发酵结束时的发酵液与调配好的盐水按拌匀，盐水须加热并过滤，成曲与盐水的质量比为1:1.5，盐水的盐度为30～31％，pH值为5.2～5.7、发酵温度为35～37℃，发酵14～16天，得到调味液基料；
优选地，盐水的盐度为30.6％(平衡盐度20.0％)，pH值为5.5、发酵温度为36℃，发酵时间为15天；
5-3)杀菌：将调味液基料过滤、离心，收集上清液并进行杀菌处理，杀菌条件为95℃、40min，杀菌后调味液的pH值为6.5；
5-4)罐装：将杀菌后的调味液基料进行罐装、封口，密封保存。
本发明以红曲糟为主要原料，以自有及引进的米曲霉为发酵剂，以酶解率及氨氮转化率为指标，筛选出蛋白利用率高、发酵液风味好的米曲霉MJY2-5，然后基于米曲霉MJY2-5研制红曲糟调味液。所制备的红曲糟调味液中氨基酸含量较高，主要为谷氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸等呈味氨基酸，占比超过40％。
本发明首先通过单因素试验及正交试验优化，选定成曲生长条件为：温度为32℃，时间为72h，pH值为6.6，在此条件下制备的成曲的孢子量、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和谷氨酰胺酶分别可达10.12±0.01lg(个/g)、1981.79±4.33U/g、499.89±5.20U/g和19.68±0.30U/g；然后通过正交优化工艺得到米曲霉产蛋白酶酶解大米蛋白的解最佳参数：初始pH值为5.5，酶解温度为47℃，酶解时间为5h；最后采用前期低盐固态发酵、后期高盐稀态发酵的固稀态酶解法，得到红曲糟调味液的最佳制备工艺为前期低盐固态酶解参数为曲料比1:1，盐度4.0％，温度47℃，发酵时间6天；后期高盐稀态酶解参数为曲料比1:1.5，盐度30.6％，温度36℃，发酵时间15天，其氨基酸态氮，氨氮转化率，酶解率分别为0.69±0.01g/100mL，42.71±1.85％，49.73±1.49％。本发明最大限度的提高了原料利用率，并且增加了调味液的风味。
附图说明
图1是不同米曲霉产谷氨酰胺酶活力测定结果。
图2是不同米曲霉产蛋白酶活力的影响。
图3是不同米曲霉产糖化酶活力测定。
图4是不同米曲霉产纤维素酶活力测定。
图5是不同成曲的酶解效果的影响。
图6是不同成曲对酶解液的氨氮转化率的影响。
图7是不同成曲对酶解液的氨基酸态氮的影响。
图8是菌株形态学和AFPA培养特征。
图9是基于邻位连接法构建的试验菌株MJY2-5与相关种的ITS rDNA序列系统发育树。
图10是基于邻位连接法构建的试验菌株MJY2-5与相关种的β-BenA基因序列系统发育树。
图11是产毒素基因PCR扩增产物。
图12为酶解时间对氨基酸态氮的影响。
图13为红曲糟调味液基料感官评分结果。
具体实施方式
以下实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
米曲霉MJY2-5的分离、纯化、筛选及鉴定
以发酵风味优良的酱胚为选育菌源，梯度稀释并涂布于虎红培养基平板上，经多次划线分离和镜检，得到较纯的菌株。对所有分离纯化的菌株划线平板培养后观察培养特征，挑选出具有典型米曲霉菌落特征的菌株4株，编号为MDQ2-1、MDQ2-2、MDQ2-3、MJY2-5，得到的菌株分别接种于麦芽汁斜面培养基上，28℃培养3d，4℃冰箱保藏，备用。
为了提高酶解率及氨氮转化率，筛选红曲糟发酵优良的米曲霉。本实施例以自主选育的米曲霉MDQ2-1、MDQ2-2、MDQ2-3、MJY2-5、引进收集的米曲霉3.042、RIB40、AS3.863、CICC2022、7801、ACCC30467等为菌种，以红曲糟为培养料，以成曲孢子量、产谷氨酰胺酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶及糖化酶活力、蛋白酶解率及氨氮转化率为指标，旨在筛选高酶解率及氨氮转化率米曲霉菌株。
1.材料与方法
1.1原料
1.1.1米曲霉：米曲霉MDQ2-1、MDQ2-2、MDQ2-3、MJY2-5均由本实验室分离并保藏，米曲霉3.042(上海酿造一厂酱油曲精)、RIB40(艾礼生物科技(上海)有限公司)、AS3.863(艾礼生物科技(上海)有限公司)、CICC2022(上海工业实验所)、7801(山东和众康源生物科技(山东)有限公司)、ACCC30467(上海保藏生物技术中心)分别购于上海酿造一厂酱油曲精、艾礼生物科技(上海)有限公司、上海工业实验所、山东和众康源生物科技(山东)有限公司、上海保藏生物技术中心。
1.1.2红曲糟：古田蓝溪红酒业有限公司提供的以红曲米酿造红曲酒的酒糟，经造粒、沸腾炉热风干制，粉碎过筛80目，备用。含水量为11.13％，粗蛋白(干基)36.42g/100g，酸溶性蛋白2.06g/100g。
1.1.3麸皮：市购。含水量为13.05％，麸皮粗蛋白17.39g/100g。
1.2培养基
1.2.1孟加拉红培养基：购于海博生物技术有限公司，用于米曲霉活化与孢子计数。121℃，20min灭菌，待用。
1.2.2麦芽汁琼脂培养基：购于海博生物技术有限公司，用于培养米曲霉扩大培养。121℃，20min灭菌，待用。
1.2.3红曲糟培养料：按前期优化的配料比，即红曲糟：麸皮：水为1:0.8:1.4配比、混料，121℃，20min灭菌，待用。
1.3米曲霉孢子液制备
将各米曲霉菌种接种至孟加拉红平板上，于30℃培养箱培养3d，在无菌操作条件下将孢子铲接入斜面麦芽汁琼脂培养基，于30℃培养箱培养3d，用接种环将斜面孢子全部剥离用无菌水洗下，摇匀，获得孢子悬液，取样计数，4℃冷藏保存孢子液。
1.4成曲制备
分别取一定量的红曲糟培养料，按孢子接种量为1.0×106个/g接入1.3制备好的各米曲霉孢子液，于30℃、湿度90％发酵培养72h。检测成曲孢子数、酸性蛋白酶、中性蛋白酶，谷氨酰胺酶、糖化酶、纤维素酶等指标。
1.5成曲的发酵酶解工艺
取一定量的1.4制备好的成曲，按固液比1:6的比例接入12％食盐水，置于500mL的锥形瓶中，在45℃下进行酶解。酶解过程每天称重补水并检测可溶性固形物的变化，发酵10天，可溶性固形物已不再变化。检测发酵液酶解率及氨氮转化率，感观评定等指标。
1.6感官评分
由12名接受过相关培训的食品专业师生组成感官评价小组，按照感官评分标准分别从色泽、典型性、滋味及风味4个方面对原油的感官品质进行感官评分，总分为100分，具体评分标准如表1所示。
表1发酵液的感官评分标准
2.结果与分析
2.1不同米曲霉成曲质量
根据SB/T10313-1999固稀发酵法酱油酿造工艺规程中成曲制备的标准，成曲孢子量须达6×109个/g，孢子发芽率须达90％以上。由表2可知，以红曲糟培养料制备的成曲，不同米曲霉的发芽率均达90％以上，成曲pH值在6.4-7.0之间，水分含量24％-32％；除米曲霉AS3.863、米曲霉CICC2022的成曲孢子数未达到标准要求，其他米曲霉成曲孢子数达成曲制备的标准要求，其中以米曲霉MJY2-5孢子数最高，孢子数对数值达10.13±0.23/lg(个/g)，但其与米曲霉3.042、MDQ2-2、MDQ2-3、RIB40、7801、ACCC30467间的差异均未达显著水平。
表2不同米曲霉产孢子量及质量分析
2.2不同米曲霉成曲产谷氨酰胺酶活力的差异分析
由图1知，不同成曲产谷氨酰胺酶的能力不同，MJY2-5产谷氨酰胺酶活力最高，达到15.67±0.43U/g，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)；其次为米曲霉RIB40，谷氨酰胺酶酶活为12.98±0.31U/g，而ACCC30467及7801产谷氨酰胺酶的能力较低，其它各处理的酶活为9.66±0.30U/g～10.55±0.30U/g，差异不显著。
2.3不同米曲霉成曲产酸性、中性蛋白酶活力差异分析
由图2知，以红曲糟培养料制备的成曲，各米曲霉成曲的中性蛋白酶活均达1000U以上，符合成曲的酶活质量要求，不同米曲霉存在差异。其中，以ACCC30467中性蛋白酶活力最高，可以达到2831.56±22.89U/g，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)，其次为米曲霉7801、MDQ2-2，米曲霉MJY2-5及CICC2022较弱，但仍达1250.90±12.05U/g及1119.25±41.68U/g。以AS3.863酸性蛋白酶活力最高，可以达到1377.53±24.89U/g，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)，而ACCC30467及7801的较低，MJY2-5的酸性蛋白酶活也处较高水平，可达782.07±5.75U/g。
2.4不同米曲霉成曲产糖化酶活力的差异分析
由图3知，不同成曲产糖化酶的能力不同，AS3.863产糖化酶酶活力最高，可以达到2273.41±6.31U/g，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)；其次为MJY2-5、MIDQ2-2、MIDQ2-3、7801及3.042，酶活为1784.96±8.67U/g--1976.50±10.23U/g，除MIDQ2-3外其它差异不显著(P>0.05)，米曲霉RIB40及CICC2022的酶活最低，差异达极显著水平。
2.5不同米曲霉成曲产纤维素酶活力的差异分析
由图4知，不同成曲产纤维素酶的能力不同，米曲霉7801、CICC2022、AS3.863、RIB40产纤维素酶活力最高，与3.042、MDQ2-3、ACCC30467处理组差异达显著水平(P<0.05)，与其他处理组差异达极显著水平(P<0.01)，MJY2-5及MDQ2-1产纤维素酶活较弱。
2.6不同米曲霉成曲在低盐稀态发酵的酶解率的差异分析
由图5知，不同米曲霉在红曲糟培养料下制成的成曲在低盐稀态酶解效果不同，MJY2-5及RIB40的酶解率最高，分别达79.68±0.15％与73.99±0.52％。与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)，分别比3.042高出29.68％与23.99％个百分点。
2.7不同米曲霉成曲在低盐稀态发酵的氨氮转化率的差异分析
以红曲糟培养料制成的不同米曲霉成曲，在低盐稀态发酵酶解10d，其氨氮转化率见图6。以MJY2-5的氨氮转化率最高，达51.33±0.83％，且与AS3.863、RIB40达显著水平(P<0.05)，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)。
2.8不同米曲霉成曲在低盐稀态发酵的氨基酸态氮的差异分析
以红曲糟培养料制成的不同米曲霉成曲，在低盐稀态发酵酶解10d，其氨基酸态氮见图7。以MJY2-5、AS3.963、RIB40氨基酸态氮最高，分别为0.27±0.02g/100g、0.25±0.01g/100g和0.25±0.01g/100g。且与MDQ2-2、MDQ2-3、ACCC30467达显著水平(P<0.05)，与其他处理差异达极显著水平(P<0.01)。
2.9感官评定
由表3知，不同米曲霉成曲在低盐稀态发酵酶解得到的调味液基料品质不同，综合各项品质得到综合感官评分最高的是MJY2-5、RIB40及ACCC30467发酵的调味液基料，综合分值分别为为91.68、91.07、90.16分且差异不显著(P>0.05)，其色泽红褐有光泽、酱香浓郁、且具有典型性酱油风格。其它各处理的综合分值也在84.02-87.75分之间。都具有不错的光泽，及典型性酱油风格。
表3调味液基料的感官评定
综上，本实施例以10种不同米曲霉为菌剂制备成曲，以MJY2-5酶解率及氨氮转化率水平最高，其成曲产孢子量为10.13±0.23lg/(个/g)、产酸性蛋白酶为782.07±5.75U/g、产中性蛋白酶为1250.90±12.05U/g、产谷氨酰胺酶为15.67±0.43U/g、产糖化酶为1800.20±4.06U/g、产纤维素酶为91.79±1.94U/g。利用该成曲发酵得到的调味液基料中酶解率和氨氮转化率分别为79.68±0.15％、51.33±0.83％，其色泽红褐有光泽、酱香浓郁、且具有典型性酱油风格。
3菌株MJY2-5的鉴定
(1)MJY2-5的形态学方法鉴定结果
菌株MJY2-5在CYA培养基及AFPA培养基上生长的菌落颜色及产孢结构电镜图见图8。菌株MJY2-5在CYA培养基25℃培养7d，菌落直径51-54mm，具有产孢结构黄绿色，边缘白色；质地丝绒状；菌落反面浅黄色；无渗出液产生；无可溶性色素产生等米曲霉典型的形态特征。AFPA培养基30℃培养48h，菌落反面为黄色。
微观形态：孢梗茎发生于基质，壁稍粗糙，透明；分生孢子头近球形或辐射状，直径为25-80μm；顶囊烧瓶形，长轴直径15-45μm，表面四分之三可育；产孢结构主要为单层，瓶梗5-15×3.5-5.5μm,偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊；分生孢子近球形或卵圆形，长轴直径4-7μm，壁平滑或稍粗糙。
(2)系统发育分析结果
试验菌株ITS rDNA、β-BenA基因序列与相关近缘菌种的系统发育树分别见图9和图10。系统发育结果显示，包括菌株MJY2-5在内的11株标准菌株聚为同一系统发育支，序列相似性大于97％。由系统发育结果可知，ITS rDNA序列分析可把MJY2-5鉴定为曲霉属黄绿组(Aspergillus section Flavi)，β-BenA基因序列分析结果可把MJY2-5鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。分子生物学鉴定没有办法完全区分黄曲霉及米曲霉。
(3)MJY2-5产毒基因检测结果
3个产毒基因PCR扩增的检测结果见图11，M代表DNAMarker(D2000)；1代表阳性对照菌株AS3.4408；2代表阴性对照菌株CICC2487；3代表检测样品“MJY2-5"；4代表PCR体系空白对照；ITS rDNA为基因组DNA提取和PCR反应的阳性参标；af1R为黄曲霉毒素合成的调控基因，黄曲霉毒素合成的关键基因之一；omt-1为柄曲霉素转甲氧基酶基因，黄曲霉毒素合成的关键基因之一；ver-1为杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1扩增结果，黄曲霉毒素合成的关键基因之一。af1R、omt-1、ver-1基因是在黄曲霉毒素合成通路中3个关键基因。同时具备3个基因，判定为黄曲霉；3个基因都不具备，判定为米曲霉；3个基因有缺失，需进一步根据产毒试验确认。由图11可知MJY2-5缺失af1R基因，所以需要进一步进行产毒试验确认。
依据SH-QO01-044-2022《黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2胶体金快速检测方法》，在豆粕培养基25℃培养10d，检测结果表明，MJY2-5不产黄曲霉毒素B1和B2(低于检测限5.0μg/kg)。
综合形态学、生理生化学、分子生物学及对菌种进行产毒基因检测等鉴定结果，将菌株MJY2-5鉴定为米曲霉MJY2-5(Aspergillus oryzae MJY2-5)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221400，保藏日期为2022年09月09日。
实施例2
米曲霉MJY2-5红曲糟成曲制备工艺的优化
米曲霉的活化及孢子液制备：将米曲酶MJY2-5从甘油管接种到孟加拉红平板上，长出孢子后，在无菌操作条件下使用接种铲接入斜面培养基中，待长出大量成熟孢子时，用接种环将斜面孢子全部剥离洗下，摇匀，获得孢子悬液，冰箱4℃冷藏保存孢子液。
成曲制备工艺优化：(1)红曲糟培养基料以红曲糟:麸皮:水为1:0.8:1.4。孢子接种量为1.0×106个/g，分装于5个培养皿中，在培养湿度90％下培养。培养温度分别为26℃、29℃、32℃、35℃、38℃；培养时间为48h、60h、72h、84h、96h，初始pH值为5.2、5.7、6.2、6.7、7.2。固定处理参数为培养温度为32℃，培养时间为72h，初始pH值为6.2。以成曲产孢子、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶能力考察不同温度，时间，pH值对成曲生长及产酶的影响。(2)在以上单因素试验结果基础上，以成曲产孢子、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶能力为考察指标，通过正交试验确定成曲培养工艺的最佳条件。
通过单因素试验及正交试验优化，结果表明产孢子、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶的最佳培养温度为32℃，时间为72h时；产谷氨酰胺酶、中性蛋白酶及产孢子的最佳pH为6.6，而产酸性蛋白酶的最佳pH为5.8。因为红曲糟中蛋白主要为谷蛋白，谷氨酸是调味液基料重要的的鲜味氨基酸，而中性蛋白酶活及谷氨酰胺酶活是影响红曲糟蛋白酶解率及氨转化率的重要指标，因此选定成曲生长条件为：温度为32℃，时间为72h，pH值为6.6。在此条件下制备的成曲的孢子量、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和谷氨酰胺酶分别可达10.12±0.01lg(个/g)、1981.79±4.33U/g、499.89±5.20U/g和19.68±0.30U/g。
实施例3
米曲霉MJY2-5产蛋白酶的酶解工艺优化
成曲的制备：将米曲霉从甘油管接种至孟加拉红平板上，于32℃培养箱培养72h，在无菌操作条件下将孢子铲接入斜面麦芽汁琼脂培养基，于32℃培养箱培养72h，用接种环将斜面孢子全部剥离用无菌水洗下，摇匀，获得孢子悬液。取一定量的红曲糟培养料，按孢子接种量为1.0×106个/g接种，按实施例2中得到的成曲最佳培养条件制备成曲。
粗酶液的制备：称取研细的成曲，加水混匀，在40℃水浴内，搅拌提取1h，过滤得到米曲霉MJY2-5的粗酶液，检测中性蛋白酶及谷氨酰胺酶活力。
MJY2-5产蛋白酶的酶解条件优化：(1)取一定量大米蛋白，以无菌水配5％(w/v)大米蛋白，分装于数个锥形瓶中。按酶解时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h；酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；谷氨酰胺酶酶浓度为8U/g、16U/g、24U/g、32U/g、40U/g，pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；NaCl浓度为0％、6％、12％、18％、24％(不同NaCl浓度用NaCl与无菌水加热混匀配置)。固定处理参数为时间5h，温度为45℃，酶浓度为24U/g，NaCl浓度0％，pH值为6.0，添加酶液后定容至200mL。以基料酶解率为指标，考察单因素对酶解效果的影响。(2)在以上单因素试验结果基础上，以酶解率及氨氮转化率为指标，以pH值、温度、时间为变量因子，以单因素谷氨酰胺酶酶浓度、NaCl浓度最佳处理为固定参数，通过正交试验，确定MJY2-5产蛋白酶其的酶解最佳条件。
正交优化工艺得到米曲霉产蛋白酶酶解大米蛋白的解最佳参数：初始pH值为5.5，酶解温度为47℃，酶解时间为5h，其氨氮转化率及酶解率分别为37.22±0.35％，61.40±1.55％。
实施例4
红曲糟调味液基料固稀态发酵工艺的优化
调味液基料是调味品中常见的基础原料，红曲糟为红曲黄酒的加工副产物，产量大而利用率低，发明人通过研究发现，红曲糟可以作为调味液基料的主要原料，米曲霉MJY2-5为适宜红曲糟培养料的的优势生产菌株，具有高产谷氨酰胺酶，高酶解率及氨氮转化率特性。由于NaCl会抑制酶的活性，抑制程度与反应体系中的NaCl浓度呈正相关，因此，为提高其酶解率，将采用前期低盐固态发酵、后期高盐稀态发酵的固稀态酶解法，研究调味液基料制备工艺，以最大限度的提高原料利用率及增加调味液基料的风味。
成曲的制备同实施例3
(1)低盐固态发酵
取制备好的成曲，按成曲与盐水质量比为1:1的比例，按酶解时间为3d、6d、9d、12d、15d，固定处理参数为温度为47℃，初始pH值为5.5，盐浓度为6％。以基料氨基酸态氮、铵盐为指标，选取适宜的低盐固态酶解时间。
酶解时间对氨基酸态氮的影响见图12；随着酶解时间的延长，氨基酸态氮呈先快速上升后趋于平缓的趋势，在47℃，含盐6％(w/v)的低盐固态发酵，氨基酸态氮含量(y)与时间(x)呈多项式函数关系，其方程为y＝0.0115x3-0.1766x2+0.8933x-0.5633R2＝0.9978。酶解9d后，氨基酸态氮达0.91±0.01g/100mL，与酶解12、15d时氨基酸态氮差异不显著(P>0.05)，而与酶解6d时的差异达显著(P＜0.05)。所有处理均符合相关标准中铵盐含量不得超过氨基酸态氮的30％要求，因考虑到节省时间成本，提高生产效率，选定低盐固态最佳酶解最佳时间为6d。
(2)固稀态发酵酶解
固稀态酶解发酵工艺是将低盐固态发酵与高盐稀态发酵相结合的方法，即前期低盐固态发酵、后期高盐稀态发酵。按成曲与盐水质量比为1:2.5的比例，分两次加入盐水，方案设计见表4。检测其氨基酸态氮，蛋白酶解率、氨氮转化率，铵盐指标。
表4固稀态发酵工艺试验方案
注：1.盐水经加热过滤，并温水加入。2.调整初始pH值为5.5。3.高盐稀态平衡盐度20％(w/v)。.4.盐水量大时，不能溶解部分直接加入，用无菌玻璃棒混至均匀)
由表5可知，比较各处理固稀态酶解发酵制备调味液基料，以处理1的氨基酸态氮及氨氮转化率的最高，可分别达0.69±0.01g/100mL、42.71±1.85％，与其他处理差异呈极显著(P＜0.01)。酶解率则与NaCL的浓度呈负相关，以处理1的酶解率最高，达49.73±1.49％、但与处理2间差异未达显著水平，与其他处理差异呈显著(P＜0.05)。各处理的铵盐占比均符合铵盐含量不得超过氨基酸态氮的30％要求。试验结果表明：红曲糟调味料固稀态发酵的最佳工艺为前期低盐固态酶解参数为曲料比1:1，盐度4.0％，温度47℃，发酵时间6天；后期高盐稀态酶解参数为曲料比1:1.5，盐度30.6％，温度36℃，发酵时间15天，其氨基酸态氮，氨氮转化率，酶解率分别为0.69±0.01g/100mL，42.71±1.85％，49.73±1.49％。
表5固稀态酶解发酵制备调味液基料主要理化指标
实施例5
一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，包括以下步骤：
1)米曲霉的活化及孢子悬液制备
将米曲霉MJY2-5从甘油管接种至孟加拉红平板上，于32℃培养箱分离培养72h，在无菌操作条件下将单个孢子用接种铲接入斜面麦芽汁琼脂培养基，于32℃培养箱扩培72h，用接种铲将斜面孢子全部剥离，用无菌水洗下，摇匀，获得孢子悬液，冰箱4℃冷藏保存孢子悬液；
2)接种
将孢子悬液接入种曲培养料中，按孢子接种量为1.0×106个/g接种；
所述种曲培养料中各组分及其质量比为：红曲糟:麸皮:水＝1:0.8:1.4，pH值为6.6±0.2；
3)发酵
将培养温度控制在32.0±0.5℃范围内，湿度保持在90.0±2.0％之间，发酵过程每天翻拌2次，发酵结束72h后获得种曲，将种曲于40℃烘箱中烘至水分含量为10.0-15.0％，打成粉末状保藏，种曲应符合《酿造酱油(GB 18186-2000)》中种曲制备的标准；
发酵过程，通过通风方式将培养料水分控制在40-50％之间；
4)成曲
将粉末状的种曲接入培养料中，按孢子接种量为1.0×106个/g接种，重复步骤2)、3)制备成曲，成曲应符合《酿造酱油(GB 18186-2000)》中成曲制备的标准；
所述培养料中各组分及其质量比为：红曲糟:麸皮:水＝1:0.8:1.4，pH值为6.6±0.2；
5)红曲糟调味液的制备
5-1)低盐固态发酵：将成曲与调配好的盐水拌匀，盐水须加热并过滤，成曲与盐水的质量比为1:1，盐水的盐度4.0％，pH值为5.5、发酵温度47℃，发酵6天，得到发酵液；
5-2)高盐稀态发酵：将低盐固态发酵结束时的发酵液与调配好的盐水按拌匀，盐水须加热并过滤，成曲与盐水的质量比为1:1.5，盐水的盐度为30.6％(平衡盐度20.0％)，pH值为5.5、发酵温度36℃，发酵时间15天，得到调味液基料，其氨基酸态氮为0.69±0.01g/100mL；
5-3)杀菌：将调味液基料过滤、离心，收集上清液并进行杀菌处理，杀菌条件为95℃、40min，杀菌后调味液基料的pH值6.5；
5-4)罐装：将杀菌后的调味液基料进行罐装、封口，密封保存。
本实施例所制备的产品分析如下:
(1)红曲糟调味液基料指标分析
由表6可知，调味液基料氨基酸态氮为0.71±0.01g/100mL，符合GB/T2717—2018《食品安全国家标准酱油》的氨基酸态氮含量的标准。铵盐占比符合GB/T 2717—2018《食品安全国家标准酱油》标准中铵盐含量不得超过氨基酸态氮的30％要求。
表6固稀态酶解发酵制备调味液基料主要理化指标
(2)红曲糟调味液基料氨基酸检测
发酵调味液的氨基酸是调味液品质好坏的重要因素，由表7得到，调味液基料中氨基酸含量较高，其中谷氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸为呈味氨基酸，其呈味氨基酸占比较高，达到42.54±0.07％。
表7固稀态酶解发酵制备调味液基料主要理化指标
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(3)红曲糟调味液基料感官评定
由12名接受过相关培训的食品专业师生组成感官评价小组，按照感官评分标准分别从色泽、典型性、滋味及风味4个方面对调味液基料的感官品质进行感官评分，总分为100分，具体评分标准如表8所示。
表8调味液基料的感官评分标准
红曲糟调味液基料感官评分如图13所示，得出综合感官评分90.8分，其香气十足、色泽红褐有光泽。

Claims (10)

1.一株高蛋白利用率米曲霉，其特征在于，其分类命名为米曲霉MJY2-5，学名为Aspergillus oryzae MJY2-5，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 20221400，保藏日期为2022年09月09日。
2. 一种基于权利要求1所述米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备成曲
将米曲霉MJY2-5接入红曲糟、麸皮、水按照质量比为1:0.8:1.4制成的 pH值为6.6±0.2的培养料中发酵70-74h，得到成曲；
2）红曲糟调味液的制备
2-1）低盐固态发酵：将成曲与盐水拌匀，成曲与盐水的质量比为1:1，盐水的盐度3.5~4.5%，盐水pH值为5.2~5.7、发酵温度为46~48℃，发酵5~7天，得到发酵液；
2-2）高盐稀态发酵：将上述发酵液与盐水按拌匀，成曲与盐水的质量比为1:1.5，盐水的盐度为29~31%，pH值为5.2~5.7、发酵温度为35~37℃，发酵14~16天，得到调味液基料；
2-3）杀菌、罐装：将调味液基料过滤、离心，收集上清液并进行杀菌处理，然后罐装保存。
3. 根据权利要求2所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤1）所述成曲的制备方法如下：
1-1）米曲霉的活化及孢子悬液制备
将米曲霉MJY2-5从甘油管接种至孟加拉红平板上，于31~33℃培养箱分离培养70~74h，在无菌操作条件下将单个孢子用接种铲接入斜面麦芽汁琼脂培养基，于31~33℃培养箱扩培70~74h，用接种铲将斜面孢子全部剥离，用无菌水洗下，摇匀，获得孢子悬液， 4℃冷藏保存；
1-2）接种
将孢子悬液接入培养料中；
1-3）发酵
接种后进行发酵，将培养温度控制在32.0±0.5℃范围内，湿度保持在90.0±2.0%之间，发酵过程每天翻拌2次，发酵72±2h后获得种曲，将种曲烘干后打成粉末状；
1-4）成曲
将粉末状的种曲接入培养料中，按孢子接种量为（1.0~5.0）×106个/g接种，重复步骤1-2）、1-3）制备得到成曲。
4.根据权利要求3所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤1-2）中，孢子接种量为（1.0~5.0）×106个/g。
5.根据权利要求3所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤1-2）和步骤1-4）中，所述培养料是由红曲糟、麸皮、水按照质量比为1:0.8:1.4制备而成，pH值为6.6±0.2。
6.根据权利要求3所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤1-3）中，发酵过程通过通风方式将培养料水分控制在40-50%之间，发酵70-74h。
7.根据权利要求2所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤2-1）中，水的盐度4.0%，pH值为5.5、发酵温度为47℃，发酵时间为6天。
8.根据权利要求2所述的一种基于米曲霉固稀态发酵的红曲糟调味液的制备方法，其特征在于，步骤2-2）中，盐水的盐度为30.6%，pH值为5.5、发酵温度为36℃，发酵时间为15天。
9.根据权利要求1至8任一项所述的制备方法得到的红曲糟调味液。
10.根据权利要求9所述的红曲糟调味液,其特征在于,所述红曲糟调味液中呈味氨基酸含量超过40%，包括谷氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸。
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