CN103409379B - 一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法。该方法步骤如下：（1）制备阿魏菇活化种子液；（2）制备胶红酵母活化种子液；（3）共发酵：将阿魏菇种子液按体积比3～5%的接种量接种至共发酵培养基，于24～26℃振荡培养1～4d，摇床转速150～200r/min；再按体积比2～6%的接种量接种上胶红酵母活化种子液，于相同条件下继续发酵培养3～6d，结束发酵，即得含漆酶的发酵液。本发明共培养液体发酵工艺可显著提高阿魏菇的产漆酶水平，所产漆酶酶活性高，符合产业化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及漆酶的微生物发酵生产方法，尤其涉及利用阿魏菇和胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，一般含有4个铜离子，属于铜蓝氧化酶蛋白家族。漆酶是单电子氧化还原酶，能够催化酚类物质发生氧化反应，同时伴随分子氧还原生成水，其催化底物包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物以及一些金属离子等。由于其作用底物广泛，漆酶在食品工业、制浆造纸、人工合成染料脱色、新型环保材料研制等领域具有巨大的价值。
在化学合成领域，漆酶可以催化合成高分子化合物，亦可参与降解稠环芳香化合物；漆酶可以催化氧化甲基、甲氧基、氯和硝基取代的4-(4’-磺酸基苯偶氮)苯酚等酚偶氮染料；在兰格缪尔槽中可以催化以4-四十烷氧基苯酚和六十烷基苯胺为单体的聚合反应来合成二维电光高分子网络。反应所利用的酶-水溶液-缓冲体系与传统的大量利用有机溶剂的高分子聚合体系相比，可以大大减少环境污染。
在造纸技术中，漆酶主要应用于生物制浆、生物漂白和造纸废水处理方面。木质原料中的纤维物质与木质素紧密结合交联在一起，需采用化学或物理方法来降解或去除木质素以达到分离的目的，漆酶具有良好的降解木质素的能力，且无化学法和物理法的能耗高、污染大等缺点，因此在造纸制浆领域具有广阔的应用前景，此外，用漆酶处理造纸废水，可以显著降低废水的COD浓度、色度和毒性。
在食品工业中，漆酶的应用是近20年发展起来的，主要包括饮料加工、食品成分测定等方面。漆酶能够氧化多酚类物质生成多酚氧化物，多酚氧化物自身再发生聚合形成可以被滤膜截留的大颗粒，改善了由于饮料中酚类化合物氧化反应引起的饮料后混浊、色泽加深及香味口感下降等现象，最终达到净化饮料的目的。
白腐真菌是目前自然界中漆酶的主要生产者，其中已经发现有多种具有产漆酶能力的侧耳类真菌，如糙皮侧耳（平菇）、刺芹侧耳（杏鲍菇）、环柄侧耳（凤尾菇）等。阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lenzi)又称阿魏菇，在我国是新疆特有的菇类，主要分布于新疆的伊犁、塔城、阿勒泰和木垒等地区，是寄生在药用植物“阿魏”腐败根茎上的一种重要食药用真菌。目前，有关阿魏菇发酵产漆酶的研究尚鲜见报道，申请号CN201210094741.1的专利“一种利用阿魏菇液体发酵产漆酶的方法”公开了一种利用阿魏菇液体发酵生产漆酶的工艺，但其产酶水平和漆酶酶活还有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法。本发明共培养液体发酵工艺可显著提高阿魏菇的产漆酶水平，所产漆酶酶活性高，符合产业化生产需求。
本发明的技术方案如下：
一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，是将阿魏菇种子液和胶红酵母的种子液先后接种至发酵培养基进行液体共发酵培养，得到含漆酶的发酵液。
其于具体步骤如下：
（1）制备阿魏菇种子液：取经组织分离得到的阿魏菇菌种接种至阿魏菇斜面培养基，于24～26℃培养至菌丝体长满斜面；将该斜面菌种接种至阿魏菇种子培养基，于24～26℃℃振荡培养6～8d，摇床转速150～200r/min，得阿魏菇活化种子液；
（2）制备胶红酵母种子液：取胶红酵母菌种接种至酵母斜面培养基，于30～32℃培养2～3d；将该斜面菌种接种至酵母种子培养基，于30～32℃振荡培养44～52h，摇床转速150～200r/min，得胶红酵母活化种子液；
（3）阿魏菇和酵母共发酵：将步骤（1）所得阿魏菇活化种子液按体积比3～5%的接种量接种至共发酵培养基，于24～26℃振荡培养1～4d，摇床转速150～200r/min；再按体积比2～6%的接种量接种上步骤（2）所得胶红酵母活化种子液，于相同条件下继续发酵培养3～6d，结束发酵，即得含漆酶的发酵液；所述共发酵培养基成分以g/L计为葡萄糖15～20，玉米粉10～20，麸皮10～15，KH2PO42～3，MgSO4·7H2O2～3，其余成分为水，起始pH8.0，121℃灭菌20min。
其进一步的技术方案为：
所述胶红酵母为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）JM401，保藏编号为CCTCC NO:M2013088。
步骤（1）所述阿魏菇斜面培养基为PDA培养基，所述阿魏菇种子培养基成分以g/L计为葡萄糖20，玉米粉10，麸皮10，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，其余成分为自来水，pH自然，121℃灭菌20min。
步骤（2）所述酵母斜面培养基为YEPD培养基，所述酵母种子培养基成分以g/L计为葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，其余成分为自来水，pH5.5，121℃灭菌20min。
本发明所涉及的胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）JM401，已于2013年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：CCTCC NO:M2013088，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：胶红酵母JM401CCTCC M2013088。
本发明的有益效果如下：
本发明首次将阿魏菇与胶红酵母（胶红酵母JM401CCTCC M2013088）共发酵技术运用于生产漆酶，证实在一定工艺条件下，胶红酵母可协同阿魏菇显著提高其原有的发酵产酶水平和漆酶酶活，经检测，本发明产漆酶酶活最高可达18015.1U/L，符合产业化生产需求，为微生物发酵产漆酶工业提供了新的思路和途径。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体说明。
如无特殊说明，以下实施例所涉及各原料和试剂均为国产或进口分析纯商品，涉及实验方法均为本领域常规方法。
实施例1胶红酵母JM401CCTCC M2013088的筛选、分离与鉴定
1.1胶红酵母JM401CCTCC M2013088的筛选分离
胶红酵母JM401CCTCC M2013088于2011年10月分离自四川泸州产烟梗；取5g烟梗置于含有10粒小玻璃珠的250ml灭菌三角瓶中，加入100ml无菌生理盐水，在30℃摇床上以150r/min振荡培养20min，静置2h；取上述菌悬液，将其稀释105、106、107倍，分别取100μl涂布在水溶苯胺蓝平板（水溶苯胺蓝平板组成以g/L计：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5，苯胺蓝2，琼脂15，其余成分为水，pH5.5，121℃灭菌15min），每个浓度重复三次，于32℃培养40h，挑选透明圈较大的单个菌落多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，于30℃培养48h后放于4℃冰箱保存待用。
将4℃冰箱保存待用的菌株接种到种子培养基中，于32℃培养20h后，取40ml活化种子液离心，收集全部菌体并将其转接入40ml脱色培养基中，测定培养过程中菌株对染料的降解脱色率，从中筛选出一株具有高效降解脱色能力的菌株，定名为JM401。
1.2胶红酵母JM401CCTCC M2013088的鉴定
（1）形态特征
在斜面培养基上培养40h后，显微镜观察：菌落直径约为2mm，呈椭圆形突起，边缘整齐，表面光滑，呈粘滞状，产类胡萝卜色素；在种子培养基中，菌株生长20h达到对数期；32℃下生长情况最好。
（2）ITS-5.8S rDNA序列分析
将目的菌株在斜面培养基上培养24h，利用PCR技术扩增该菌的ITS-5.8SrDNA序列，其寡核苷酸引物为：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(ITS1)和TCCTCCGCTTATTGATATGC(ITS4)，扩增产物交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。将测序结果与GeneBank中已知的ITS-5.8S rDNA序列进行同源性比较，发现与Rhodotorula mucilaginosastrain ATCC66034(EU853846.1)的同源性最高，为100%。
（3）生理生化特征
根据《酵母菌的特征与鉴定手册》（巴尼特等著，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991）和《酵母生产与应用手册》（于景芝等，中国轻工业出版社，2005）对菌株JM401进行生理生化鉴定，其主要生理生化特征参见表1。其生理生化特征与胶红酵母相吻合。
表1胶红酵母JM401CCTCC M2013088生理生化鉴定
| 特征 | JM401 | 特征 | JM401 |
| 细胞：直径3～5μm | + | 碳源利用：D-半乳糖 | - |
| 圆形或卵圆形 | + | 蔗糖 | + |
| 芽殖 | + | 麦芽糖 | + |
| 假菌丝 | - | 乳糖 | - |
| 掷孢子 | - | 棉子糖 | + |
| 菌落：椭圆形 | + | D-木糖 | + |
| 边缘整齐，表面光滑 | + | 松三糖 | + |
| 粘质状，略上凸 | + | 淀粉 | - |
| 产类胡萝卜色素 | + | 赤藓糖醇 | - |
| 生长：不添加生物素 | + | D-葡糖酸-1,5-内酯 | + |
| 30℃ | + | D-葡糖醛酸 | - |
| 加入0.1%放线菌素酮 | - | 甲醇 | - |
| 唯一氮源：硝酸盐 | - | 其他：淀粉形成 | - |
| 尸胺 | - | 尿素水解 | + |
注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。
结合上述形态特征、遗传学鉴定和生理生化鉴定，确定该菌株为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。
实施例2阿魏菇的组织分离
取采自新疆阿勒泰地区的野生阿魏菇新鲜未开伞的子实体，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75%乙醇进行子实体表面消毒后，移入超净工作台紫外灯照射20min;。用灭过菌冷却后的解剖刀将子实体一分为二，在菌柄内或菌柄中、菌柄与菌盖交界处、菌盖和菌褶处切割表皮内组织，将组织切成黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表皮组织；用无菌镊子接入试管斜面培养基（即PDA培养基），其组成（单位克/升）为：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌20min；每个组织部分各接种10支试管斜面，于25℃培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至7天时，用PDA培养基试管斜面转接。
阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶
以下实施例所述阿魏菇及胶红酵母活化种子液的制备工艺如下：
（1）阿魏菇种子液的制备：将实施例2分离得到的阿魏菇菌种接种至土豆培养基（PDA培养基，成分以g/L计为：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌20min），于25℃环境下培养7d，直至菌丝体长满斜面；将该斜面菌种接种至装有80ml阿魏菇种子培养基（成分以g/L计为葡萄糖20，玉米粉10，麸皮10，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌20min）的250ml三角瓶中，于25℃振荡培养7d，摇床转速150r/min，即得阿魏菇活化种子液。
（2）胶红酵母种子液的制备：将实施例1分离筛选到的胶红酵母JM401CCTCC M2013088接种至酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YEPD培养基，成分以g/L计为：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，琼脂20，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌20min），于30℃环境下培养2d；将该斜面菌种接种至装有80ml酵母种子培养基（成分以g/L计为葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，用自来水配制，pH5.5，121℃灭菌20min）的250ml三角瓶中，于30℃振荡，摇床转速150r/min，即得胶红酵母活化种子液。
所述漆酶酶活的具体测定方法如下：
取发酵液1ml，在8000r/min的条件下离心10min；取上清液，测定漆酶酶活；测定漆酶酶活力时以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）为底物，每分钟氧化1微摩尔ABTS底物所需要的酶量定义为1个酶活单位（U）。在1毫升反应体系中，底物ABTS终浓度为1mmol/L，其中含有100mmol/L pH4.5的乙酸钠缓冲液880μl，100μl ABTS和20μl发酵上清液，整个反应体系在30℃下反应5min，在420nm下测定其吸光度的变化。酶活力按以下公式计算：
其中A1为空白对照吸光值；
A2为反应后吸光值；
t为反应时间；
ε为底物ABTS的摩尔吸光系数，为3.6×104M-1cm-1。
实施例3
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分以g/L计为：葡萄糖18，玉米粉15，麸皮12，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，起始pH8.0，121℃灭菌20min）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养2d后，再将上述培养48h的胶红酵母种子液6ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为18015.1U/L。
实施例4
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分以g/L计为：葡萄糖17，玉米粉15，麸皮12，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，起始pH8.0，121℃灭菌20min）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养2d后，再将上述培养46h的胶红酵母种子液7ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为16892.3U/L。
实施例5
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分以g/L计为：葡萄糖18，玉米粉18，麸皮13，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，起始pH8.0，121℃灭菌20min）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养3d后，再将上述培养48h的胶红酵母种子液8ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为15421.0U/L。
实施例6
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分同实施例3）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养1d后，再将上述培养50h的胶红酵母种子液4ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为14634.4U/L。
实施例7
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分同实施例3）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养2d后，再将上述培养52h的胶红酵母种子液6ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为16089.3U/L。
实施例8
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分以g/L计为：葡萄糖15，玉米粉10，麸皮10，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，起始pH8.0，121℃灭菌20min）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养1d后，再将上述培养44h的胶红酵母种子液9ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为14082.4U/L。
实施例9
取阿魏菇活化种子液6ml接种至装有150ml共发酵培养基（成分以g/L计为：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮15，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，用自来水配制，起始pH8.0，121℃灭菌20min）的500ml三角瓶中，于25℃，150r/min振荡培养4d后，再将上述培养52h的胶红酵母种子液3ml接种至共发酵培养基，于相同条件下继续振荡培养，按阿魏菇接种时算起第7天结束发酵，即得阿魏菇与酵母共培养的发酵液。经检测，该发酵液中漆酶酶活力为13941.1U/L。
上述试验数据证明，本发明共培养液体发酵工艺可显著提高阿魏菇的产漆酶水平，所产漆酶酶活性高，符合产业化发展需求。
上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其它改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，其特征在于将阿魏菇种子液和胶红酵母种子液先后接种至发酵培养基进行液体共发酵培养，得到含漆酶的发酵液，所述胶红酵母为胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）JM401，保藏编号为CCTCCNO:M2013088；
所述阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法的具体步骤如下：
（1）制备阿魏菇种子液：取经组织分离得到的阿魏菇菌种接种至阿魏菇斜面培养基，于24～26℃培养至菌丝体长满斜面；将该斜面菌种接种至阿魏菇种子培养基，于24～26℃振荡培养6～8d，摇床转速150～200r/min，得阿魏菇活化种子液；
（2）制备胶红酵母种子液：取胶红酵母菌种接种至酵母斜面培养基，于30～32℃培养2～3d；将该斜面菌种接种至酵母种子培养基，于30～32℃振荡培养44～52h，摇床转速150～200r/min，得胶红酵母活化种子液；
（3）阿魏菇和酵母共发酵：将步骤（1）所得阿魏菇活化种子液按体积比3～5%的接种量接种至共发酵培养基，于24～26℃振荡培养1～4d，摇床转速150～200r/min；再按体积比2～6%的接种量接种上步骤（2）所得胶红酵母活化种子液，于相同条件下继续发酵培养3～6d，结束发酵，即得含漆酶的发酵液；所述共发酵培养基成分以g/L计为葡萄糖15～20，玉米粉10～20，麸皮10～15，KH2PO4 2～3，MgSO4·7H2O 2～3，其余成分为水，起始pH8.0。
2.根据权利要求1所述阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤（1）所述阿魏菇斜面培养基为PDA培养基，所述阿魏菇种子培养基成分以g/L计为葡萄糖20，玉米粉10，麸皮10，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 2，其余成分为水。
3.根据权利要求1所述阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤
（2）所述酵母斜面培养基为YEPD培养基，所述酵母种子培养基成分以g/L计为葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，其余成分为水。
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| CN102604902A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-07-25 | 江南大学 | 一种利用阿魏菇液体发酵产漆酶的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chaetoomium globosum 与Panus rudis共培养发酵合成漆酶;李静 等;《安徽大学学报(自然科学版)》;20111130;第35卷(第6期);93-97 * |
| 溶氧对几种真菌漆酶发酵的影响;王岁楼 等;《精细化工》;20060131;第23卷(第1期);32-34,49 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103409379A (zh) | 2013-11-27 |
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