CN104388418A

CN104388418A - 利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法

Info

Publication number: CN104388418A
Application number: CN201410671197.1A
Authority: CN
Inventors: 张一折; 张书杰; 朱朝印; 马轩; 刘建华; 方业忠
Original assignee: Mengzhou Nongda Biochemical Products Co ltd; Zhengzhou University
Current assignee: Mengzhou Nongda Biochemical Products Co ltd; Zhengzhou University
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明公开了一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，首先取赤霉菌菌株用无菌水制成10⁸~10⁹个/mL的原生质体悬浮液；将原生质体悬浮液涂布到培养皿中风干；将氮离子束脉冲注入到风干后的原生质体内，诱发菌体变异；将诱变后的原生质体加入山梨醇溶液冰浴，悬浮后涂布于PDAS再生培养基平板中培养；将生长良好的单菌株接种于盛装液体发酵培养基的摇瓶中进行振荡培养，即可获得赤霉酸高产菌株。本发明的优点在于利用氮离子束脉冲注入的方式对赤霉菌进行诱变，可选育出高产的赤霉菌突变株，采用本发明方法，突变株正突变率可达10%~40%，发酵效价比出发菌株提高30~90%。

Description

利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法

技术领域

本发明涉及微生物诱变技术，尤其是涉及一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法。

背景技术

赤霉酸（gibberellic acid)是一种属于双萜类化合物的植物生长调节剂，具有促进种子发芽和植物生长、提早开花结果等作用，对农作物、蔬菜的产量和品质都有明显的促进作用，在农业生产和酿造业中有着广泛应用。随着农业技术的推广和蔬菜水果种植业的扩大，赤霉酸的需求量提高很快，生产量满足不了市场实际需求量。

赤霉酸主要依靠藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）发酵生产。赤霉酸的生产至今已半个世纪的历史，菌种的改良主要依靠UV 、X 射线、同位素⁶⁰Co 照射和化学法诱变等传统的育种方法，一般的诱变剂效果并不明显, 未能取得较满意的结果。另一方面，抗性筛选菌株因具有代谢定向特性而受到重视，但是存在着目标不明确，费时费力而且收效不明显的问题。如：李武军等对菌体原生质体进行诱变，原生质体融合重组选育；构建携带血红蛋白基因的藤仓赤霉菌工程株等；张金儿等应用氯霉素抗性筛选法，获得赤霉素产量高于出发菌20%的阳性氯霉素抗性突变株；王卫等采用制霉菌素抗性筛选获得产赤霉素能力提高16.8%的菌株等。目前国内外赤霉素的生产效价呈现出徘徊不前的状态，而且有的生产菌种出现退化。国内外大规模商业化的赤霉酸生产均通过赤霉菌经液态深层发酵后对发酵液的提取而获得，赤霉酸的发酵水平也参差不齐，约在1.2~2g/L之间。因此，提高赤霉酸的发酵效价，从现有菌种出发，通过诱变筛选出更加高产的菌株，进一步提高赤霉酸的发酵水平十分必要。

近些年来，离子束作为一种新的诱变源，在微生物诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展迅速。与传统诱变源相比，低能离子束注入是一种集物理与化学诱变特性为一体的综合诱变技术，它能够在低剂量注入的情况下，引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因或分子水平上发生改变或缺失，明显提高变异的频率，获得对生物体生理损伤小、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果。

离子注入技术被应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，已选育出一些在工业上具有较大应用前景的生物新品种，并取得了显著的经济和社会效益。而把低能离子束注入法用于赤霉酸生产菌株的选育，则还未见有相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，该方法可有效提高赤霉酸的产量。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，包括下述步骤：

第一步，原生质体的制备：

取赤霉菌菌株用无菌水制成10⁸~10⁹个/mL的原生质体悬浮液；

第二步，氮离子注入诱变：

将第一步得到的原生质体悬浮液涂布到培养皿中，无菌状态下风干；将能量10~20keV的氮离子束脉冲注入到风干后的原生质体内，诱发菌体变异；

第三步，高产菌株的筛选和获得：

将第二步诱变后的原生质体加入浓度1mol/L的山梨醇溶液冰浴，悬浮后涂布于PDAS再生培养基平板中培养；将培养出的生长良好、直径2~4mm的单菌株接种于盛装液体发酵培养基的摇瓶中进行振荡培养，即可获得发酵效价1.8~2.1g/L的赤霉酸高产菌株。

第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl,pH7.5；50mmol/L的CaCl₂。所用的PDAS固体再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3.5%~4.1%，琼脂1.5%~2%，pH6.0~6.5。

本发明的优点在于利用氮离子束脉冲注入的方式对赤霉菌进行诱变，可选育出高产的赤霉菌突变株，采用本发明方法，突变株正突变率可达10%~40%，发酵效价比出发菌株提高30~90%。与其他传统的物理化学诱变方法相比，本发明的优点体现在如下几点：

1、由于离子束注入诱变是一种集物理和化学诱变特征于一体的综合诱变，具有对生物细胞损伤小的特点，因此采用该方法诱变的菌株正突变率高，诱变效果好；

2、采用本发明方法选育出的高产赤霉酸菌株，具有高产性状稳定，不易丢失的优点，经过10代以上转接，效价仍能保持筛选后的水平，产赤霉酸量在1.9~2.3g/L之间。

3、采用本发明诱变筛选的高产赤霉酸菌株，经过3m³发酵罐试验，效价仍能保持较高水平，产赤霉酸量在1.8~2.1g/L。见下表1。证明本发明方法筛选出的菌株有利于大规模工业化生产。

表1 本发明选育的高产菌株与出发菌株的产量比较

。

附图说明

图1是实施例3的摇瓶发酵结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法做进一步详细的描述。

实施例1：

取赤霉菌菌株用无菌水制成10⁸个/mL的原生质体悬浮液；取0.1mL原生质体悬浮液均匀涂布到无菌平培养皿中，在无菌状态下吹干；采用能量10keV、剂量1.5×10¹⁴ions/cm²的氮离子束，脉冲注入到风干后的原生质体内，加入浓度1mol/L的山梨醇溶液10倍冰浴，所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl,pH7.5；50mmol/L的CaCl₂。悬浮后涂布于PDAS再生培养基平板中28℃培养5天，所用的PDAS再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3.5%~4.1%，琼脂1.5%~2%，pH6.0~6.5；选取培养出的白色浑圆、形态正常、长势旺盛、直径2~4mm的单菌株接种于盛装有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于28℃、220rpm摇床中培养180h。随机抽取40支诱变单菌株为考察对象，按照HPLC法检测发酵液中赤霉酸产量，发酵效价在1.8~2.1g/L的高产赤霉酸的赤霉菌突变株为16株，突变株正突变率达30%，发酵效价比出发菌株提高30~70%（与出发菌株相比, 摇瓶发酵效价高于5%的为正突变株, 反之为非正突变株；正突变菌株数量与总菌株数量的比率为正突变率）。

其中，液体发酵培养基的组成为：液化淀粉100g/L，花生饼粉15g/L，豆粕粉3g/L，硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH值5~6。

实施例2：

取赤霉菌菌株用无菌水制成10⁹个/mL的原生质体悬浮液；取0.3mL原生质体悬浮液均匀涂布到无菌平培养皿中，在无菌状态下吹干；采用能量20keV、剂量1.5×10¹⁵ions/cm²的氮离子束，脉冲注入到风干后的原生质体内，加入浓度1mol/L的山梨醇溶液10倍冰浴，所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl,pH7.5；50mmol/L的CaCl₂。悬浮后涂布于PDAS再生培养基平板中28℃培养5天，所用的PDAS再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3.5%~4.1%，琼脂1.5%~2%，pH6.0~6.5；选取培养出的白色浑圆、形态正常、长势旺盛、直径2~4mm的单菌株接种于盛装100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于28℃、220rpm摇床中培养180h。随机抽取40支诱变单菌株为考察对象，按照HPLC法检测发酵液中赤霉酸产量，发酵效价在1.8~2.1g/L的高产赤霉酸的赤霉菌突变株为18株，突变株正突变率达40%，发酵效价比出发菌株提高40~90%。

其中，液体发酵培养基的组成同实施例1。

实施例3：

将诱变得到的发酵效价在1.8~2.1g/L的高产赤霉酸的赤霉菌突变株在在PDA 斜面培养基（成分：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 15g，自来水 1000mL）上连续传代12次，每次传代后在发酵培养基（成分：液化淀粉100g/L，花生饼粉15g/L，豆粕粉3g/L，硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH值5~6）中培养、测定赤霉酸含量，摇瓶发酵结果见图1。以原菌株发酵所产赤霉酸含量为100%，其它各代与之相比较，结果传代10 次产赤霉酸量仍然稳定，维持在93%以上，表明该突变菌株遗传稳定性较好，可作为潜在的生产菌株。

Claims

1.一种利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，原生质体的制备：

第二步，氮离子注入诱变：

第三步，高产菌株的筛选和获得：

2.根据权利要求1所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，其特征在于：第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl,pH7.5；50mmol/L的CaCl₂。

3.根据权利要求1所述的利用低能离子诱变赤霉菌选育赤霉酸高产菌株的方法，其特征在于：第三步中所用的PDAS固体再生培养基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3.5%~4.1%，琼脂1.5%~2%，pH6.0~6.5。