CN101092601A - 低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，属于微生物诱变技术领域。该方法如下：在室温下，将灰色变异链霉菌的孢子悬浮液于无菌平皿内涂布均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用氮离子束注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释后涂布于含链霉素的高氏一号培养基平板中培养后，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，培养后选取遗传性状稳定的高产菌株。本发明采用的低能离子诱变技术操作比较简单、安全、方法易行，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，该方法诱变得到的灰色变异链霉菌，同原始菌株相比，发酵单位提高20％～90％。
Description
技术领域
本发明属于微生物诱变技术领域，特别涉及利用低能离子诱变手段诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产突变株的方法。
背景技术
植物病原菌对农用抗生素产生耐药性是全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗药菌的农用抗生素是解决这一问题的根本途径。
“灰色变异链霉菌”(拉丁文名称为“Streptomyces griseovariabilis”)是一种链霉菌属放线菌。其发酵产物可提取万隆霉素(英文名“Wanlongmycin”)，属于喹喔啉类抗生素(Quinoxaline antbiotics)家族的环状酯肽类抗生素，它是由10个氨基酸残基组成的环状酯(缩)肽，两个独特的喹喔啉发色团以酰胺键对称地结合在环状酯(缩)肽上。它对植物卵病菌病害有很好的防治效果。
万隆霉素产生菌是1996年从土壤样品中分离筛选出来的，经过10年的研究，已在万隆霉素的生物活性、理化特性、抑菌谱、分离纯化、分子结构、发酵工艺、菌株的鉴定、抑菌作用机理、定量构效关系等方面取得很大的进展。但至今还未有相关的商业产品，主要原因是万隆霉素产生菌原始菌株的产素水平比较低，产素品质较差，生产成本相对较高，从而阻碍了万隆霉素的工业化进程。应用高效简便的诱变选育技术是加快万隆霉素工业化进程的关键。
低能离子束注入用于微生物诱变育种较为广泛，它是一种集物理化学效应为一体的综合诱变技术，能引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅度提高变异的频率。低能离子束注入诱变技术表现出对生物体生理损伤小、突变谱广、突变频率高，并有一定的重复性和方向性的新特点。王付转等采用离子束处理利福霉素产生菌，从126株初筛菌株诱变出了产素能力较原始菌株高出42.7％的高产菌株。赵洪英等采用低能离子对庆大霉素产生菌的成熟孢子进行了诱变处理，选育到一株庆大霉素产量提高27.39％的高产菌株。而把低能离子束注入在生产万隆霉素菌株的选育，则还未有相关专利和文献报道。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，利用该方法可以有效提高万隆霉素的产量。
本发明所采用菌株是从土壤样品中分离的放线菌，菌株被命名为Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.GAAS2507(详见专利号为03140091.4的中国发明专利)，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC：M203059，保藏时间是2003年7月7日。菌株GAAS2507的形态特征为：菌株孢子丝为松散螺旋形，孢子表面光滑，在高氏一号培养基上，其气丝呈烟灰色，基丝无色至黄白色，不产色素。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，包括以下步骤：在室温下，将0.1～0.3mL灰色变异链霉菌的孢子悬浮液于无菌平皿内涂布均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为10～30Kev的氮离子束，剂量为7.8×1014～28.6×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用0.5～1.0mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释至103～106倍后涂布于含0.6～1.0μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，28～32℃培养7～10天，选取生长良好的单菌株接种于盛有100mL液体发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃，160～200rpm摇床中培养96～120h，获得诱变的遗传性状稳定的纯灰色变异链霉菌。所述灰色变异链霉菌为模式菌GAAS2507(详见专利号为03140091.4的中国发明专利)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC：M203059，保藏时间是2003年7月7日。
为了更好地实现本发明，所述孢子悬浮液是按下述方法配制而成：取灰色变异链霉菌的斜面孢子，用无菌水制成106～108个/mL的孢子悬浮液。
所述生长良好的单菌株为菌落直径大，产孢量大的单菌株。
所述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖6～10g，玉米浆10～15g，蛋白胨2～5g，NaCl2～5g，CaCO32～5g，(NH4)2SO42～5g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.2～7.4。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本发明采用氮离子束脉冲注入的方式进行对制备万隆霉素的菌株进行低能离子诱变的诱变方法，诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，在农用抗生素产生菌的菌株选育中有较大的推广价值。本发明通过利用氮离子束脉冲注入进行诱变，选育出高产抗生素万隆霉素链霉菌突变株，突变株正突变率6％～40％。发酵单位比原始菌株提高20％～90％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一
在室温25℃下，取菌株GAAS2507的斜面孢子用无菌水制成106个/mL的孢子悬浮液，将0.1mL孢子液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为20KeV的氮离子束，剂量为7.8×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用1.0mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释103倍后，涂布于含0.6μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株(菌落直径大，产孢量大的单菌株)接种于盛有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于28℃，160rpm摇床中培养120h，HPLC法检测发酵液中万隆霉素产量，挑选高产万隆霉素的遗传稳定突变株诱变的灰色变异链霉菌。突变株正变率10％～18％。发酵单位比原始菌株提高20％～35％。
上述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖6g，玉米浆10g，蛋白胨2g，NaCl2g，CaCO32g，(NH4)2SO42g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.2。
实施例二
在室温25℃下，取菌株GAAS2507的斜面孢子用无菌水制成107个/mL的孢子悬浮液，将0.2mL孢子液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为20KeV的氮离子束，剂量为13×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用0.5mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释105倍后，涂布于含0.8μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，30℃培养8天，选取生长良好的单菌株(菌落直径大，产孢量大的单菌株)接种于盛有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于30℃，180rpm摇床中培养112h，HPLC法检测发酵液中万隆霉素产量，挑选高产万隆霉素的遗传稳定突变株诱变的灰色变异链霉菌。突变株正变率6～11％。发酵单位比原始菌株提高27％～43％。
上述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖8g，玉米浆12g，蛋白胨4g，NaCl4g，CaCO34g，(NH4)2SO43g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.3。
实施例三
在室温25℃下，取菌株GAAS2507的斜面孢子用无菌水制成108个/mL的孢子悬浮液，将0.3mL孢子液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为20KeV的氮离子束，剂量为18.2×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用0.8mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释106倍后，涂布于含1μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，32℃培养7天，选取生长良好的单菌株(菌落直径大，产孢量大的单菌株)接种于盛有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于32℃，200rpm摇床中培养96h，HPLC法检测发酵液中万隆霉素产量，挑选高产万隆霉素的遗传稳定突变株诱变的灰色变异链霉菌。突变株正变率7％～9％。发酵单位比原始菌株提高32％～56％。
上述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖10g，玉米浆15g，蛋白胨5g，NaCl5g，CaCO35g，(NH4)2SO45g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.4。
实施例四
在室温25℃下，取菌株GAAS2507的斜面孢子用无菌水制成106个/mL的孢子悬浮液，将0.1mL孢子液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为20KeV的氮离子束，剂量为23.4×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用1.0mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释103倍后，涂布于含0.8μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株(菌落直径大，产孢量大的单菌株)接种于盛有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于30℃，180rpm摇床中培养112h，HPLC法检测发酵液中万隆霉素产量，挑选高产万隆霉素的遗传稳定突变株诱变的灰色变异链霉菌。突变株正变率31～40％。发酵单位比原始菌株提高65％～90％。
上述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖7g，玉米浆12g，蛋白胨4g，NaCl3g，CaCO33g，(NH4)2SO43g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.2。
实施例五
在室温25℃下，取菌株GAAS2507的斜面孢子用无菌水制成108个/mL的孢子悬浮液，将0.3mL孢子液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为20KeV的氮离子束，剂量为28.6×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用0.5mL无菌水洗下处理过的菌膜，稀释106倍后，涂布于含1μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，32℃培养7天，选取生长良好的单菌株(菌落直径大，产孢量大的单菌株)接种于盛有100mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于32℃，200rpm摇床中培养96h，HPLC法检测发酵液中万隆霉素产量，挑选高产万隆霉素的遗传稳定突变株诱变的灰色变异链霉菌。突变株正变率12％～15％。发酵单位比原始菌株提高45％～67％。
上述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖10g，玉米浆15g，蛋白胨5g，NaCl5g，CaCO35g，(NH4)2SO45g，溶解在1L蒸馏水中，初始7.4。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1、一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，其特征在于包括如下步骤：在室温下，将0.1～0.3mL灰色变异链霉菌的孢子悬浮液于无菌平皿内涂布均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为10～30Kev的氮离子束，剂量为7.8×1014～28.6×1014ions/cm2的条件下进行脉冲注入，然后用0.5～1.0mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释至103～106倍后涂布于含0.6～1.0μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，28～32℃培养7～10天，选取生长良好的单菌株接种于盛有100mL液体发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃，160～200rpm摇床中培养96～120h，获得诱变的遗传性状稳定的纯灰色变异链霉菌；所述灰色变异链霉菌为模式菌GAAS2507，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：M203059，保藏时间是2003年7月7日。
2、根据权利要求1所述的低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液是按下述方法配制而成：取灰色变异链霉菌的斜面孢子，用无菌水制成106～108个/mL的孢子悬浮液。
3、根据权利要求1所述的低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，其特征在于：所述生长良好的单菌株为菌落直径大，产孢量大的单菌株。
4、根据权利要求1所述的低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖6～10g，玉米浆10～15g，蛋白胨2～5g，NaCl 2～5g，CaCO3 2～5g，(NH4)2SO42～5g，溶解在1L蒸馏水中，初始pH7.2～7.4。
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