CN104232709A - 一种发酵生产安普霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵生产安普霉素的方法,该方法包括斜面培养、种子液培养、发酵培养的过程,操作简单,在发酵培养的过程中补加了玉米浆,从而大幅提高了安普霉素的发酵单位。所述方法制备安普霉素的发酵单位能达到8400U/mL。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种发酵生产安普霉素的方法。
背景技术
安普霉素是一种氨基糖苷类抗生素,较为特别的是,其化学结构中含有辛二糖结构。安普霉素具有抗菌谱广、作用强、残留少、毒性低、不易产生耐药性等特点,广泛应用于大肠杆菌、沙门氏菌和支原体引起的感染。作为药物型饲料添加剂,安普霉素能明显促进增重和提高饲料转化率,在畜禽养殖领域得到了广泛的应用。
安普霉素由黑暗链霉菌发酵产生,目前对微生物发酵法生产安普霉素的研究主要是菌种的诱变处理、发酵培养基的优化,或者发酵工艺的优化,并没有取得很好的效果。2002年田威在《安普霉素产生菌的研究》中利用诱变处理、发酵工艺优化,在4m3发酵罐上发酵最高效价达到5390U/mL。1997年熊宗贵在《尼拉霉素单组份安普霉素高产菌株的研究》中利用均匀设计方法优化使得摇瓶效价达到6800μg/mL。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产安普霉素的方法,该方法能大幅提高安普霉素的发酵单位,发酵生产安普霉素的发酵单位最高能达到8400U/mL。
为了实现本发明所述目的,发明人提供了以下技术方案。
一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,每支斜面的砂土孢子接种量为0.003-0.005g,在温度37.0±1℃、湿度30-60%的条件下培养120-144h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为1-4cm2,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度30-60%、转速180-200rpm的条件下培养20-24h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵培养基体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度30-60%、转速200-220rpm的条件下培养40-48h,随后加入玉米浆继续培养80-96h,即得到含有安普霉素的发酵液。
所述步骤a中,斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0%-2.5%、硝酸钾0.1%-0.2%、硫酸镁0.025%-0.05%、氯化钠0.04%-0.06%、磷酸二氢钾0.04%-0.06%、酵母粉0.1%-0.2%、碳酸钙0.1%-0.3%、琼脂2.0%-2.5%。砂土孢子在斜面培养基上培养后,斜面上的孢子丰满,颜色均匀一致,孢子层厚。
所述步骤a中,湿度为40-50%,培养的时间为140h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的斜面培养基的好处。
所述步骤b中,种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%-2.5%、玉米淀粉1.5%-2.0%、低温黄豆饼粉2.0%-3.0%、碳酸钙0.2%-0.4%、硫酸镁0.05%-0.1%、酵母粉0.1%-0.3%、硫酸铵0.1%-0.15%、玉米浆1%-2%。斜面孢子接种于种瓶培养基中,培养完成后镜检菌丝粗壮、交织成网状,达到优良种子液标准。
所述步骤b中,湿度为40-50%,转速为180rpm,培养的时间为22h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的种瓶培养基的好处。
所述步骤c中,发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0%-4.0%、玉米淀粉5.0%-7.0%、碳酸钙0.4%-0.5%、磷酸二氢钾0.1%-0.2%、氯化铵0.6%-0.7%、硫酸锌0.02%-0.03%、硫酸镁0.05%-0.1%、淀粉酶0.1%-0.15%。发酵培养基的好处需要和玉米浆的添加的好处结合一起考虑,玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分,是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。
所述步骤c中,湿度为40-50%,转速为220rpm,培养45h后,加入玉米浆后继续培养90h。
所述步骤c中,玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5%-1.0%。
所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7%。
本发明所述发酵生产安普霉素的方法,通过在发酵摇瓶培养过程中加入玉米浆,使得安普霉素发酵单位大幅度提高。有文献报道在发酵过程中添加氨基酸能够促进安普霉素的产量,玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分,是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。此发明在发酵过程中添加玉米浆,使发酵单位显著提高。具体是在发酵培养45h,加入玉米浆后继续培养90h,培养完成后最高发酵效价达到8400U/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
实施例1
斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.3%、硝酸钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.05%、酵母粉0.2%、碳酸钙0.3%、琼脂2.5%。
种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉2.5%、碳酸钙0.3%、硫酸镁0.1%、酵母粉0.2%、硫酸铵0.15%、玉米浆2%。
发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉6.0%、碳酸钙0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化铵0.6%、硫酸锌0.03%、硫酸镁0.1%、淀粉酶0.15%。
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,砂土孢子的接种量为0.005g,在温度37.0±1℃、湿度50%的条件下培养140h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为3cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度50%、转速180rpm的条件下培养22h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵培养基体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度50%、转速220rpm的条件下培养45h后,随后加入玉米浆,加入玉米浆的量为发酵液体积的0.7%(v/v%),然后继续培养90h,即得到含有安普霉素的发酵液。
将制备得到的安普霉素发酵液进行检测,测得安普霉素的发酵单位为8400U/mL。
将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液,洗脱液经过浓缩、脱色,真空干燥最终得到安普霉素。
实施例2
斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0%、硝酸钾0.1%、硫酸镁0.025%、氯化钠0.04%、磷酸二氢钾0.04%、酵母粉0.1%、碳酸钙0.1%、琼脂2.0%。
种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%、玉米淀粉1.5%、低温黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.2%、硫酸镁0.05%、酵母粉0.1%、硫酸铵0.1%、玉米浆1%。
发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0%、玉米淀粉5.0%、碳酸钙0.4%、磷酸二氢钾0.1%、氯化铵0.6%、硫酸锌0.02%、硫酸镁0.05%、淀粉酶0.1%。
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,砂土孢子的接种量为0.003g,在温度37.0±1℃、湿度50%的条件下培养144h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为1cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度50%、转速200rpm的条件下培养24h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵液体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度50%、转速200rpm的条件下培养48h,随后加入玉米浆,加入玉米浆的量为发酵液体积的0.5%(v/v%),然后继续培养80h,即得到含有安普霉素的发酵液。
将制备得到的安普霉素发酵液进行检测,测得安普霉素的发酵单位为8200U/mL。
将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液,洗脱液经过浓缩、脱色,真空干燥最终得到安普霉素。
实施例3
斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.5%、硝酸钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.06%、磷酸二氢钾0.06%、酵母粉0.2%、碳酸钙0.3%、琼脂2.5%。
种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉3.0%、碳酸钙0.4%、硫酸镁0.1%、酵母粉0.3%、硫酸铵0.15%、玉米浆2%。
发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉7.0%、碳酸钙0.5%、磷酸二氢钾0.2%、氯化铵0.7%、硫酸锌0.03%、硫酸镁0.1%、淀粉酶0.15%。
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,砂土孢子的接种量为0.004g,在温度37.0±1℃、湿度60%的条件下培养120h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为4cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度60%、转速200rpm的条件下培养20h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵液体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度60%、转速220rpm的条件下培养40h,随后加入玉米浆,加入玉米浆的量为发酵液体积的1.0%(v/v%),然后继续培养96h,即得到含有安普霉素的发酵液。
将制备得到的安普霉素发酵液进行检测,测得安普霉素的发酵单位为8000U/mL。
将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液,洗脱液经过浓缩、脱色,真空干燥最终得到安普霉素。
实施例4
斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0%、硝酸钾0.2%、硫酸镁0.025%、氯化钠0.06%、磷酸二氢钾0.04%、酵母粉0.2%、碳酸钙0.1%、琼脂2.0%。
种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.2%、硫酸镁0.1%、酵母粉0.1%、硫酸铵0.15%、玉米浆1.5%。
发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉5.0%、碳酸钙0.5%、磷酸二氢钾0.1%、氯化铵0.7%、硫酸锌0.02%、硫酸镁0.1%、淀粉酶0.1%。
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,砂土孢子的接种量为0.004g,在温度37.0±1℃、湿度40%的条件下培养130h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为3cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度40%、转速180rpm的条件下培养22h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵液体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度50%、转速220rpm的条件下培养42h,随后加入玉米浆,加入玉米浆的量为发酵液体积的0.9%(v/v%),然后继续培养85h,即得到含有安普霉素的发酵液。
将制备得到的安普霉素发酵液进行检测,测得安普霉素的发酵单位为8100U/mL。
将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液,洗脱液经过浓缩、脱色,真空干燥最终得到安普霉素。
Claims (9)
1.一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中,每支斜面的砂土孢子接种量为0.003-0.005g,在温度37.0±1℃、湿度30-60%的条件下培养120-144h,得到斜面孢子;
b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中,斜面孢子的接种量为1-4cm2,种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1℃、湿度30-60%、转速180-200rpm的条件下培养20-24h,得到种子液;
c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中,种子液的接种量为发酵培养基体积的5%,在温度37.0±1℃、湿度30-60%、转速200-220rpm的条件下培养40-48h,随后加入玉米浆继续培养80-96h,即得到含有安普霉素的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤a中,斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0%-2.5%、硝酸钾0.1%-0.2%、硫酸镁0.025%-0.05%、氯化钠0.04%-0.06%、磷酸二氢钾0.04%-0.06%、酵母粉0.1%-0.2%、碳酸钙0.1%-0.3%、琼脂2.0%-2.5%。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤a中,湿度为40-50%,培养的时间为140h。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤b中,种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%-2.5%、玉米淀粉1.5%-2.0%、低温黄豆饼粉2.0%-3.0%、碳酸钙0.2%-0.4%、硫酸镁0.05%-0.1%、酵母粉0.1%-0.3%、硫酸铵0.1%-0.15%、玉米浆1%-2%。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤b中,湿度为40-50%,转速为180rpm,培养的时间为22h。
6.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤c中,发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0%-4.0%、玉米淀粉5.0%-7.0%、碳酸钙0.4%-0.5%、磷酸二氢钾0.1%-0.2%、氯化铵0.6%-0.7%、硫酸锌0.02%-0.03%、硫酸镁0.05%-0.1%、淀粉酶0.1%-0.15%。
7.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤c中,湿度为40-50%,转速为220rpm,培养45h后,加入玉米浆后继续培养90h。
8.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述步骤c中,玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5%-1.0%。
9.根据权利要求8所述的一种发酵生产安普霉素的方法,其特征在于,所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7%。
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