CN102115724B - 解淀粉芽孢杆菌ls01漆酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌LS01(CGMCC No.4260)芽孢漆酶的制备方法，催化性质和在染料脱色中的应用。本发明还涉及编码该芽孢漆酶的核苷酸序列。解淀粉芽孢杆菌LS01在固态产孢培养基上37℃发酵5天后，用去离子水将芽孢冲洗下来，再通过溶菌酶处理等一系列措施获得具有漆酶活性的芽孢悬液。该芽孢漆酶在碱性和高温条件下具有较好的催化活性，在介体作用下对不同结构的合成染料具有较好的脱色效果，可用于工业染料废水的处理。

Description

解淀粉芽孢杆菌LS01漆酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种细菌漆酶，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌LS01的芽孢漆酶的制备方法和催化性质，以及编码该芽孢漆酶的核酸片段。此外，本发明还涉及到该芽孢漆酶使合成染料脱色的方法，属于应用微生物领域。 

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛，因此漆酶酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。 

漆酶催化氧化底物一般包括两种作用方式，第一种是底物分子直接与漆酶铜簇反应氧化成相应的激发态分子。然而有些底物不能由漆酶直接氧化，原因在于它们分子太大而不能渗透进入酶的活性部位，或者由于其氧化还原电位较高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二种方式是通过一些小分子的介体物质为媒介，漆酶先将小分子介体氧化成激发态，然后这些激发态的介体再与大分子的或氧化还原电位较高的底物反应，该方式也被称为漆酶-介体系统(LMS)。漆酶-介体系统的应用有助于进一步扩大漆酶的底物范围，提高漆酶的工业应用范围。 

在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具 有更好的稳定性。由于工业造纸废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性差的限制，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。 

漆酶在细菌中的存在主要有三种形式，即：细胞外漆酶、细胞内漆酶和细胞组成漆酶。得到的这三种形式的酶，酶的活性及稳定性不同。由于胞内酶需破壁获得，此形式的漆酶在破胞过程中酶活性降低较明显，且随着细胞的破碎各种细胞组份与漆酶混合，对酶的纯化也会带来困难；与之相比，另外的两种形式漆酶则优势显而易见，尤其是细胞组成漆酶，通常是芽孢菌属的细菌，由于细菌芽孢对高温、高压、极端pH以及高盐等多种不利因素具有较强的抗逆性，该种类漆酶会因芽孢这一特殊构造的特性而表现出更好的温度稳定性和pH稳定性。 

随着分子生物学技术的不断发展，众多的漆酶基因已经得到了克隆和深入分析。研究漆酶编码基因的表达调控机制，有助于阐明不同基因在发育进程中所起的作用，此外，还可以通过定点诱变等技术对漆酶基因进行改造，提高漆酶工业应用性能。 

染料被广泛应用于纺织、印染、皮革等行业，全球每年生产染料万种之余，至少有10-15％的染料通过废水排放到自然环境中，对水体的生态环境造成严重破坏。工业使用的合成染料多是芳香族化合物，结构复杂，难降解。目前染料废水的处理方法主要有物理化学法和生物处理法，物化处理技术费用高，存在二次污染，生物法因其经济环保而成为较好的治理方法。其中漆酶由于具有广泛的底物作用范围，可催化降解多种结构的染料，在工业染料废水处理上具有较好的应用前景。已有很多关于应用白腐菌或其它真菌来源的漆酶脱色染料的研究，但关于细菌漆酶以及细菌漆酶-介体系统在染料脱色方面的研究报道较少。通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的工业应用。

发明内容

本发明目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LS01，同时本发明的目的还在于提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LS01产芽孢漆酶的制备方法，以及提供一种利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LS01产的芽孢漆酶脱色合成染料的方法。 

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LS01已于2010年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.4260。 

上述解淀粉芽孢杆菌菌株是从中国黑龙江省伊春市凉水国家自然保护区的森林表层土壤分离获得。解淀粉芽孢杆菌LS01菌株革兰氏染色阳性，芽孢中生，有鞭毛。在固体Luria-Bertani(LB)培养基上，37℃培养24h，菌落微黄色、隆起呈圆形，菌落表面干燥、褶皱，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。菌株的最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.0，可耐受1％-11％的NaCl。 

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌LS01产芽孢漆酶的产孢培养培养基配方及芽孢漆酶的制备方法。 

上述产孢培养基配方(g/L)为：营养肉汤8；KCl 1；MgSO₄·7H₂O 0.25；MnCl₂·4H₂O 0.002；琼脂17；调pH7.0后高温高压灭菌，加入过滤除菌的0.5mmol/LCaCl₂及0.001mmol/L FeSO₄。 

上述芽孢漆酶的制备方法为： 

1)解淀粉芽孢杆菌LS01划线接种于固体产孢培养基上，37℃倒置培养5d后。 

2)用无菌去离子水将固体培养基上的芽孢冲洗下来。 

3)加入终浓度0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min。 

4)依次用含有10mmol/L EDTA和0.3mg/mL PMSF的1mol/L NaCl，0.14mol/L NaCl和0.1％(w/v)SDS清洗一遍。 

5)用无菌去离子水清洗一遍。 

6)80℃水浴热击10min后用无菌去离子水清洗三遍。 

7)取一定量悬液后，将其余悬液装入灭菌后的三角瓶中，4℃避光保存。 

8)将取出的悬液置于80℃烘箱内烘至恒重，计算出芽孢悬液浓度(mg/ml)，并记录。 

本发明解淀粉芽孢杆菌LS01产生的芽孢漆酶可在pH值2.2-10.0范围内发挥作用，催化不同底物的最适pH值有所不同：以ABTS为底物时，在pH4.6时酶活最高；以丁香醛连氮为底物时，在pH6.8时酶活最高；以2，6-二甲氧基苯酚为底物时，在pH7.4时酶活最高。本发明解淀粉芽孢杆菌LS01产生的芽孢漆酶在碱性条件下具有较好的稳定性，在pH10.0的条件下30℃保温5天活性剩余45.39％，10天后仍可保留初始酶活的17.1％。多数真菌漆酶在此碱性条件下会丧失酶活，由于造纸工业很多采用碱法制浆，使造纸废水碱性较高，该芽孢漆酶在碱性条件下极好的稳定性有利于其在造纸废水等处理中发挥有效作用。 

本发明解淀粉芽孢杆菌LS01产生的芽孢漆酶的酶促反应温度范围较广，其最适温度为60℃，在50-90℃间可保持较高的活性，90℃时为最高酶活的58.89％，即使在100℃的高温下仍可保持最高酶活的38.25％，真菌漆酶在此温度下基本完全丧失活性。同时，这种芽孢漆酶具有较好的热稳定性，在50℃、60℃和70℃下保温10h后，其酶活分别为初始活性的115.51％、75.29％和92.99％，在80℃保温4h后残余酶活为59.99％。这种芽孢漆酶在高温下良好的稳定性在工业 上具有很大的实际应用价值。金属阳离子对所述漆酶的活性有较大的影响，如K⁺Q、Li⁺、Mg²⁺和Cu²⁺对其活性有激活作用，而Ag⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Al³⁺和Hg²⁺对酶活有抑制作用，其中Ag⁺、Mn²⁺和Hg²⁺可使本发明所述的芽孢漆酶完全失活。本发明解淀粉芽孢杆菌LS01产生的芽孢漆酶在不同浓度的NaCl下活性变化较大，0.01mol/L以下的NaCl对所述芽孢漆酶的活性有促进作用，随着NaCl浓度的增加活性逐渐下降，在浓度高达1mol/L的NaCl存在时仍可保持原始活性的41.82％。 

本发明解淀粉芽孢杆菌LS01所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。在介体乙酰丁香酮的参与下，在pH6.6时对RBBR(Remazol Brilliant Blue R，雷玛素艳蓝R，CAS No：2580-78-1)、活性黑KN-B(CAS No：17095-24-8)、靛红(CAS No：860-22-0)和结晶紫(CASNo：548-62-9)6h后的脱色率分别为63.02％、76.14％、81.55％和79.02％。在pH9.0时对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫6h后的脱色率分别为73.39％、89.43％、93.58％和79.04％，说明该芽孢漆酶在碱性环境下对各种染料仍保持了较高的脱色能力。该芽孢漆酶对不同结构的合成染料包括雷玛素艳蓝R，活性黑KN-B，结晶紫和靛红进行脱色，脱色条件为：40℃，pH6.8或9.0，芽孢漆酶悬液的终浓度是1mg/mL，染料终浓度分别为雷玛素艳蓝R 100mg/L，活性黑KN-B 40mg/L，靛红25mg/L，结晶紫5mg/L，加入终浓度是0.1mmol/L的漆酶介体乙酰丁香酮。 

本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌漆酶基因，来自于解淀粉芽孢杆菌LS01，CGMCC No.4260，是下列核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸； 

3)与序列表SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 

本发明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定义的核酸分于所编码。本发明进一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式与SEQ ID No：2的氨基酸序列是相同的或同源的。 

本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LS01经 发酵培养，可制备具有漆酶活性的芽孢悬液，该制备方法操作简单，成本较低。所制备的芽孢漆酶具有广泛的pH和温度催化范围，在碱性和高温条件下具有较好的稳定性，比真菌来源的漆酶具有更优越的适用性。在介体物质乙酰丁香酮的参与下，该芽孢漆酶能对不同化学结构的合成染料有效脱色，在碱性条件下仍保持了较好的脱色效果，因此本发明提供的芽孢漆酶在工业染料废水的处理上具有较好的应用前景。 

附图说明

图1是以ABTS为底物时pH对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶活性的影响； 

图2是以丁香醛连氮为底物时pH对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶活性的影响； 

图3是以2，6-二甲氧基苯酚为底物时pH对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶活性的影响； 

图4是解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶在pH10.0下酶活随时间变化的曲线图； 

图5是不同温度对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶活性的影响； 

图6是解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶在50-80℃时活性的稳定性； 

图7是不同浓度的NaCl对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶活性的影响； 

图8是pH6.6时解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果 

图9是pH9.0时解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶以乙酰丁香酮为介体对RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫的脱色结果 

具体实施方式

以下的实施方式是为了更好地理解本发明。 

以下实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可购买到的生化试剂。其中细菌基因组提取试剂盒和胶回收试剂盒是Omega公司产品，T载体和其他工具酶等均为TaKaRa公司产品。 

以下实施方式中所说的酶液，均是按照芽孢漆酶制备方法制备出的解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶。 

酶活测定方法是指用分光光度计检测漆酶与底物反应后吸光度，计算漆酶活性。所述的底物为丁香醛连氮，2，2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)或2，6-二甲氧基苯酚。 

酶的活性定义为每分钟氧化1μmol底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位。反应体系如下： 

(1)ABTS：反应体系含有1mmol/L ABTS，100μL芽孢悬液，及柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 3.0)，总体积3mL，30℃反应3min后在420nm处测定吸光值。 

(2)丁香醛连氮：反应体系含有0.1mmol/L丁香醛连氮，100μL芽孢悬液，及柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 7.0)，总体积3mL，30℃反应3min后在525nm处测定吸光值。 

(3)2，6-二甲氧基苯酚：应体系含有2mmol/L 2，6-二甲氧基苯酚，100μL芽孢悬液，及柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 7.0)，总体积3mL，30℃反应5min后在468nm处测定吸光值。 

实施例1解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶的性质 

1.pH值对芽孢漆酶活性和稳定性的影响 

pH对漆酶活性的影响采用pH2.2-7.8柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)、pH7.4-9.0Tris-HCl(0.05mol/L)缓冲液及pH8.6-10.0甘氨酸-氢氧化钠缓 冲液(0.05mol/L)测定，pH对漆酶稳定性的影响通过在30℃时将漆酶与pH3.0、8.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH9.0的Tris-HCl缓冲液及pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中混合放置1-10d后测定剩余活性。图1-3表明，本发明提供的芽孢漆酶催化范围广泛，在pH2.2-10.0的范围内均可催化底物反应，以ABTS，丁香醛连氮和2，6-二甲氧基苯酚为底物时测得的最适pH分别为4.6、6.8和7.4。图4表明，解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶在pH10.0的环境中具有较好稳定性，10d后仍可保持17％的活性。 

2.温度对芽孢漆酶活性和稳定性的影响 

温度对漆酶活性的影响在最适pH下在20-100℃范围内测定。漆酶的热稳定性测定在pH6.8的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中在50-80℃放置0-10h后测定剩余活性。图5表明，解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶的最适反应温度为60℃，从图6可看出，解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶即使在70℃高温下保温10h活性基本没有损失。 

3.金属离子对芽孢漆酶活性的影响 

在反应体系中分别加入常见的金属离子，使其终浓度为10mmol/L，在30℃保温5min，以不加金属离子的反应体系为空白，然后按常规方法以丁香醛连氮为底物测酶活性。 

4.NaCl对芽孢漆酶活性的影响 

将解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶与不同浓度的NaCl溶液均匀混合，在30℃温育5min后以丁香醛连氮为底物测定剩余活性。图7结果表明，0.01mol/L以下的NaCl对解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶酶活性有促进作用，当浓度增加时活性逐渐下降。当NaCl浓度上升到1mol/L时，活性仍可保留42％左右。 

实施例2解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶对合成染料的脱色 

1.脱色实验的反应体系及脱色率的计算 

实验反应体系为6mL，在体系中依次加入pH6.8柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)、染料(种类及终浓度见表1)、解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶(终浓度为1mg/mL)和乙酰丁香酮(终浓度为0.1mmol/L)。同时以不加入解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶的反应体系为空白对照。定时取样，12000rpm，离心2min后测各染料最大吸收波长(见表1)下的吸光值。所有测量均重复三次取平均值。之后计算染料脱色率。染料的脱色率计算公式为(A₀-A)/A₀×100％，其中A₀为初始染料吸光值，A为定期取样测的吸光值。 

表1染料类型、终浓度及最大吸收波长 

结果表明，解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶显示出较强的脱色染料的能力。在介体乙酰丁香酮的参与下，经过6h脱色后四种不同结构的合成染料的脱色率均在63％以上，其中对靛红的脱色率高达81.55％(图8)。 

2.碱性条件下染料的脱色实验 

由于细菌漆酶的优势在于碱性条件下具有比真菌漆酶更高的催化活性，为了进一步考察细菌漆酶在碱性环境中对染料的脱色能力，选用pH9.0的条件研究解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶对四种合成染料的脱色。经过6h后，RBBR、活性黑KN-B、靛红和结晶紫的脱色率分别为73.39％、89.43％、93.58％和79.04％，这一结果高于pH6.8下各种染料的脱色率，表明该芽孢漆酶在碱性环境下对各种染料仍保持了较高的脱色能力，在处理不同pH值的染料废水时具有较好的适用性。 

实施例3解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶基因的克隆 

1.菌株漆酶基因的克隆 

将上述菌株挑至5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养过夜。参照Omega公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取上述菌株的基因组DNA，并经1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

采用基因组DNA为模板，以上游引物“CGGGAATTCGGCACTGGAAAAATTTGCAGATG”(酶切位点EcoR I)和下游引物“CCGCTCGAGTTACTGCTTATCCGTGACGTCC”(酶切位点XhoI)扩增菌株解淀粉芽孢杆菌LS01芽孢漆酶基因。 

在200μL PCR管中加入下列试剂：ddH₂O 13.75μL，10×Ex Taq Buffer2μL，10mmol/L dNTP mixture 1μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，DNA模板1μL，Ex Taq酶0.25μL，总体积20μL。同时设置阴性对照。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃45s，53℃45s，72℃2min，30个循环，72℃10min延伸。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

通过PCR扩增出足量的目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切下目的条带，用Omega公司胶回收试剂盒参照说明书回收目的片段。回收的目的片段的纯度用1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

2.连接T载体及转化 

1)按下列步骤加好反应液：pMD18-T vector1μL，胶回收产物3μL，ddH₂O 1μL，Solution I 5μL，总体积10μL，16℃连接反应1h。 

2)将E.coli JM109感受态细胞在冰中融化。 

3)将10μL连接反应液加入到100μL感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30min，42℃保温60s，冰浴5min。 

4)加入890μL LB液体培养基，200rpm，37℃培养1h。同时设置阴性对照。 

5)取适量上述培养液均匀涂在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上，37℃培养过夜。 

3.重组T载体的筛选和鉴定 

1)通过蓝白斑筛选白色的阳性转化子，将白色菌落挑至5mLLB/Amp液体培养基中，37℃，200rpm，培养过夜。 

2)用质粒提取试剂盒参照说明书从过夜培养的菌液中提取质粒。 

3)PCR鉴定。 

依次加入下列试剂：ddH₂O 13.75μL，10×Taq Buffer 2μL，10mmol/LdNTP mixture 1μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，质粒模板1μL，Taq酶0.25μL，总体积20μL。同时设置阴性对照。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃45s，53℃45s，72℃2min，，30个循环，72℃10min延伸。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

4)酶切鉴定。 

依次加入下列试剂：10×H Buffer 2μL，EcoR I 1μL，Xho I 1μL，质粒3μL，ddH₂O 13μL，总体积20μL。37℃反应3h。1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。 

4.漆酶基因的测序及序列分析 

将PCR和酶切检测正确的阳性克隆送往上海英骏生物技术公司测序，测序结果见序列表SEQ ID No：1。 

Claims (7)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LS01，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.4260。

2.一种芽孢漆酶，该漆酶由权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.4260产生的，该芽孢漆酶的基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

3.权利要求2所述的芽孢漆酶，其特征在于，该酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

4.根据权利要求2或3所述的芽孢漆酶，其特征在于，该芽孢漆酶在pH 2.2-10.0发挥作用，在30℃时催化底物ABTS的最适pH值为4.6，催化底物丁香醛连氮的最适pH值为6.8，催化底物2，6-二甲氧基苯酚的最适pH值为7.4。

5.根据权利要求2或3所述的芽孢漆酶，其特征在于，该芽孢漆酶在20-100℃发挥功能，在pH 6.8以丁香醛连氮为底物时最适反应温度为60℃。

6.根据权利要求2或3所述的芽孢漆酶，其特征在于，该芽孢漆酶对不同结构的合成染料包括雷玛素艳蓝R，活性黑KN-B，结晶紫和靛红进行脱色，脱色条件为：40℃，pH 6.8或9.0，芽孢漆酶悬液的终浓度是1mg/mL，染料终浓度分别为雷玛素艳蓝R 100mg/L，活性黑KN-B 40mg/L，靛红25mg/L，结晶紫5mg/L，加入终浓度是0.1mmol/L的漆酶介体乙酰丁香酮。

7.根据权利要求2或3所述的芽孢漆酶的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：

a.解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.4260划线接种于固体产孢培养基上，37℃倒置培养5d后，所述的产孢培养基组份为：营养肉汤8g/L；KCl 1g/L；MgSO₄·7H₂O 0.25g/L；MnCl₂·4H₂O0.002g/L；琼脂17g/L；调pH7.0后高温高压灭菌，加入过滤除菌的0.5mmol/L CaCl₂及0.001mmol/L FeSO₄；

b.用无菌去离子水将固体培养基上的芽孢冲洗下来；

c.加入终浓度0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min；

d.依次用含有10mmol/L EDTA和0.3mg/mL PMSF的1mol/LNaCl、0.14mol/L NaCl、0.1％w/v SDS和无菌去离子水清洗一遍；

e.80℃热击10min后用无菌去离子水清洗三遍后，装入灭菌后的三角瓶中4℃避光保存。

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