JP2003534795A

JP2003534795A - 新規ラッカーゼ酵素およびその酵素をコードする遺伝子

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Publication number: JP2003534795A
Application number: JP2002500690A
Authority: JP
Inventors: クルース，クリスティーナ; キイスキネン，ラウラ−レーナ; レット，マーヤーナ; ヴィイカリ，リイザ; サロヘイモ，マルック
Original assignee: ヴァルションテクニッリネントゥトキムスケスクス
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-11-25
Also published as: CA2409007C; CN1430668A; CN100510064C; DE60128091T2; EP1294859A1; FI113879B; WO2001092498A1; EP1294859B1; HK1054573A1; MXPA02011572A; ES2284650T3; CA2409007A1; US20050089980A1; ATE360684T1; PT1294859E; DK1294859T3; US7183090B2; DE60128091D1; AU2001262389A1; BR0111040A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株、特にＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ株から単離できる新規ラッカーゼ酵素に関する。酵素の最適ｐＨは５〜８の範囲であり、酵素は３０〜８０℃の温度で機能する。酵素の等電点は等電点電気泳動で測定して約４．０であり、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで規定して約８０ｋＤａである。酵素は特にｐＨおよび温度条件の高い用途に非常に適している。本発明はラッカーゼ酵素をコードする遺伝子、組換え技術で製造されたラッカーゼ酵素にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規ラッカーゼ酵素に関する。本発明の対象は、新規ラッカーゼ酵素
、酵素製品、および特に酵素をコードする遺伝子である。本発明の別の対象は、
種々の用途でのラッカーゼの使用である。

【０００２】ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２．）は、青銅オキシダーゼに属する。定義
によれば、ラッカーゼはｐ−ジフェノールオキシダーゼである。ジフェノールに
加えて、ラッカーゼは多くの他の基質、例えばメトキシ置換されたフェノールお
よびジアミンを酸化する。それらの基質に関して、ラッカーゼは意外にも非特異
性である。すなわちその広い基質特異性、および他方で、フェノール化合物を酸
化するそれらの能力の点から、ラッカーゼは、工業的使用に際して大いに関心が
高まっている。ラッカーゼの利用が見込まれる分野には、例えば林業における脱
リグニンおよびファイバーボードの接着、織物工業における織物の染色および染
色所からの排水の無毒化、ならびに種々のバイオセンサーへの使用が含まれる。
媒介物質、すなわち中間分子の助けにより、ラッカーゼはまた、そうでない場合
には酸化できない基質を酸化する。媒介物質は、ラッカーゼで酸化される低分子
化合物である。次いで、酸化された媒介物質は実際の基質を酸化する。

【０００３】最初に、ラッカーゼは日本のウルシノ木（Ｒｈｕｓｖｅｒｎｉｃｉｆｅｒａ
）で１８８３年頃に発見された。ラッカーゼは多くの植物、例えばモモ、トマト
、マンゴ、およびポテトで発見されている；ラッカーゼは数種の昆虫でも発見さ
れた。しかし、多くの公知のラッカーゼは白かび真菌類が源である。以下の属が
例えばラッカーゼを産生する：Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃ
ｅｒｒｅｎａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｌｅｎｔｉｎｉｕｓ
、Ｍｏｎｏｃｉｌｌｉｕｍ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｈｌｅｂｉａ、
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｐ
ｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、ＳｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａおよびＴｒａｍｅｔｅｓ。自
然状態では、ラッカーゼの機能は、リグノセルロースの分解、細胞壁の生合成、
果実および野菜の褐変、ならびに中でも植物への微生物の攻撃の防止に関する。

【０００４】多くの真菌性ラッカーゼが単離され、それをコードする数種の遺伝子がクロー
ン化されている。例えば、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ等（１９８５）は、Ｐｈｌｅｂｉ
ａｒａｄｉａｔａのラッカーゼ遺伝子を単離し、特徴付けを行っており、Ｋｏ
ｊｉｍａ等（１９９０）が白かび真菌からＣｏｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔｕｓ
からのラッカーゼ遺伝子を、そしてＢｅｒｋａ等（１９９７）、ＷＯ９５／３３
８３６がＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラッカーゼの遺
伝子を単離し特徴付けている。ラッカーゼの天然産生レベルは、多くの場合、非
常に低い。外来産生宿主中にラッカーゼ遺伝子を発現させて生産性を改善する努
力がなされた。例えば、ＳａｌｏｈｅｉｍｏおよびＮｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ（
１９９１；ＷＯ９２／０１０４６）は真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅ
ｉ中でＰｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔａラッカーゼを首尾よく生産した。ラッカ
ーゼはまた、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ真菌（Ｙａｖｅｒ等、１９
９６、Ｂｅｒｋａ等、１９９７およびＷＯ９５／３３８３６）およびＰｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母（Ｊｏｎｓｓｏｎ等、１９９７）で、異種的に製造さ
れた。

【０００５】Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属が起源のラッカーゼをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌中
で発現させることが、特許明細書ＷＯ９７／０８３２５に記載されている。同様
に、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓｐｉｎｓｉｔｕｓ種が起源のラッカーゼ、およびＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌のＳｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ属が起源のラッカーゼの
発現が特許明細書ＵＳ５，７７０，４１８およびＵＳ５，８４３，７４５にそれ
ぞれ記載されている。

【０００６】種々の有機体から単離されたラッカーゼの温度およびｐＨ特性はそれぞれで異
なっている。これは使用する基質にも左右される。公知のラッカーゼの大部分が
、酸性のｐＨおよび比較的低い温度で最も良く機能するので、その特性は様々な
用途に適しているわけではない。数種の熱に安定であるかまたは中性のラッカー
ゼが報告されているが、一般的に熱に安定であるかまたは中性のラッカーゼは熱
安定性であるか中性であるかのどちらかで、両方であることはない。例えば、Ｈ
ｅｉｎｚｋｉｌｌ等（１９９８）は、異常に高い最適ｐＨを有するＣｏｐｒｉｎ
ａｃｅａｅ属の真菌に由来するラッカーゼを見出した。しかし、６０分の間に、
発見された全てのラッカーゼの活性は、６０℃で、最初のレベルから３０％を下
回るまでに低下した。特許（ＷＯ９６／０６９３０）が、これらのラッカーゼの
織物染料の漂白への使用について出願されているが、この出願ではそれらのラッ
カーゼの高温での活性について言及していない。この出願の実施例は、温度３０
〜３５℃で実施されたものである。特許出願ＷＯ９５／０７９８８は、真菌Ｒｈ
ｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉからの中性ラッカーゼを記載しているが、こ
の出願はアルカリ条件に加えて高温でのこのラッカーゼの利用性について検討し
ていない。一方、特許出願ＷＯ９８／５５６２８は、Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒ
ｓｉｃｏｌｏｒＴＶ−１株由来の熱安定性ラッカーゼを記載しているが、該特
許によれば、このラッカーゼ活性はｐＨ２で最良である。Ｔｒａｍｅｔｅｓｖ
ｅｒｓｉｃｏｌｏｒＴＶ−１ラッカーゼはｐＨ安定性でもなく；６０分インキ
ュベートした後のｐＨ６での残留活性は最初の約６０％である。特許出願ＷＯ９
５／３３８３６は、髪染色にｐＨ７で作用する中性Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラッカーゼを記載しているが、この出願の実施例の温
度は３０℃であった。Ｂｅｒｋａ等（１９９７）の刊行物では、Ｍｙｃｅｌｉｏ
ｐｈｔｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラッカーゼが６０℃で２０分その活性を
１００％維持し、その最適活性がｐＨ６．５であることが報告されている。

【０００７】特許公報ＪＰ８０７０８６１およびＪＰ９０５６３７８には、Ｔｒａｍｅｔｅ
ｓラッカーゼが記載され、これは熱安定性であることが報告されており、その最
適ｐＨは５．０であるとされている。さらに、Ｄｉａｍａｎｔｉｄｉｓ等（２０
００）は、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｌｉｐｏｆｅｒｕｍバクテリアに由来す
るバクテリアラッカーゼを特徴付けている。そのラッカーゼは７０℃で１０分熱
安定性であり、かつ最適ｐＨが６．０であることが報告されている。

【０００８】刊行物ＢｈａｒａｔｈｉおよびＲａｍａｌｉｎｇａｍ（１９９３）は、ハマグ
リのフェノールオキシダーゼを記載し、その最大活性はｐＨ６．８であり、その
活性の５０％以上が、６０℃で１０分インキュベートした際に残留する。特許刊
行物ＥＰ−Ａ１−０８５２２６０は、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ属の種に由来する
ポリフェノールオキシダーゼを記載しており、その最適ｐＨは８．５〜９であり
、最適温度は６０〜７０℃である。Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ属の真菌が毒素を生
成することは公知である。

【０００９】種々の酵素に特定の最適温度および最適ｐＨ値を比較する際、使用する基質が
値に影響を及ぼすことに留意しなければならない。フェノール性基質、例えばグ
アイアコールおよびシリンガルダジンは、非−フェノール性基質、例えばＡＢＴ
Ｓよりも高い値を示す。

【００１０】以下の特許公報は、木材−加工用途でのラッカーゼ使用を提案している：ＷＯ
９９５４５４５、ＵＳ５，６９１，１９３、ＤＥ４１３７７６１、ＥＰ４０８８
０３およびＷＯ９５２３２３２。

【００１１】本発明の目的は、従来技術に関連する欠点を克服し、ラッカーゼ活性を示す全
く新しい種類の酵素製品を提供することである。特に、この酵素製品は高温およ
び高ｐＨの両方に抵抗性でなければならない用途に用いることができる。例えば
木材加工業および他の加工産業にそのような用途がある。

【００１２】本発明は、中性またはアルカリ性ｐＨであり４０℃を超える温度を要する用途
において、公知のラッカーゼより優れた温度およびｐＨ特性を有し、特に熱に安
定性である、新規のラッカーゼを提供する。より詳細には、本発明の対象は、請求項１に特定されるラッカーゼ酵素である
。

【００１３】本発明のラッカーゼ酵素はＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ（メカノカルプス）属の
株から単離できる。我々の知る限り、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株から単離
されたラッカーゼはこれまでに記載がない。本発明のラッカーゼは、Ｍ．ａｌｂ
ｏｍｙｃｅｓ（Ｍ．アルボマイセス）種の菌株から、特にＩＭＩ２５５９８９
株から好適に単離でき、そのサンプルはＣＡＢＩＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＵＫ
ｃｅｎｔｒｅＣＡＢＩＧＲＣ株保存機関（Ｅｇｈａｍ）（Ｂａｋｅｈａｍ
ＬａｎｅＥｇｈａｍＳｕｒｒｅｙＤＷ２０９Ｔｙ、ＵＫ）から自由に
入手できる。この株はその保存機関に１９８１年に寄託された。１９９６年にも
、株をＶＴＴＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの微生物株保存機関（Ｔｅｃｈｎｉ
ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅｏｆＦｉｎｌａｎｄＶＴＴ、住
所：ＶＴＴＢｉｏｔｅｋｎｉｉｋｋａ、ＰＬ１５００、０２０４４ＶＴＴ、
Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）に寄託し、ＶＴＴ−Ｄ−９６４９０の番号を得た
。この寄託物のサンプルも自由に入手できる。この株は刊行物Ｒａｖａｎｋｏ（
１９９６）に記載され、ここでは種々の温度およびｐＨ値での株の培養液のラッ
カーゼ活性が研究されている。しかし、この刊行物はラッカーゼの単離および精
製について記載していない。

【００１４】本発明のラッカーゼ酵素は、ｐＨ３〜９、好ましくは４〜８、より好ましくは
５〜８、さらにより好ましくは６〜８でさえも、最も好ましくは６．５〜７．５
の範囲で働く。ラッカーゼ活性は、ｐＨ７〜８の範囲で最も高く、約７．５で最
高になる。したがって、酵素の最適ｐＨはかなり広く、ｐＨ５〜７．５の範囲で
あり；好ましくは最適ｐＨは７．５である。酵素活性は３０〜８０℃、好ましく
は４０〜８０℃、より好ましくは５０〜８０℃、さらにより好ましくは６０〜８
０℃でさえも、最も好ましくは６０〜７０℃の範囲で最高となる。酵素の最高活
性は約７０℃の温度で現れる。

【００１５】本発明のラッカーゼは、高温でも高い活性を維持している。実施例３に記載さ
れる条件では、６０℃で１時間のインキュベート後に、培養液のラッカーゼ活性
の５０％以上が維持されている。７０℃で１５分のインキュベーション後に、酵
素活性の約３０％が残留し、７０℃で３０分のインキュベーション後には約１０
％が残留する。８０℃では、例３の条件で酵素は約５分間のインキュベーション
に耐える。ある用途、例えば林業では、高温で、短時間でも耐性であることが非
常な利点となる。純粋な酵素の活性についてさらに研究すると、酵素の熱安定性
が並はずれて良く、これまでに記載されたラッカーゼよりも明らかに優れている
ことが発見された。６０℃では、例３および図７に示されるように、酵素はその
活性を未変化の状態で２時間保持した。Ｂｅｒｋａ等（１９９７）によって特徴
付けられたＭｙｃｅｌｉｐｈｔｏｒａラッカーゼの熱安定性は、６０℃で２０分
しか保持されなかった。

【００１６】さらに、本発明のラッカーゼ酵素のｐＨ安定性は、ｐＨが増加すると改善され
る。ｐＨ４で２２時間インキュベートした後、残留活性は６５％であり、同一条
件でｐＨ５の場合に残留活性は約８０％であり、ｐＨ６で残留活性は約８５％で
あり、ｐＨ７で残留活性は約９０％であり、ｐＨ８で９０％を越え、約９２％で
ある。最適ｐＨを加味すると、この特性により、本発明の酵素の高いｐＨ値での
利用が有利になる。

【００１７】本発明のラッカーゼの等電点は等電点電気泳動により測定して約４．０であり
、この際、定義の精度は約±０．５である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して、本発明のラッカーゼの分子量は約８０ｋＤａで
ある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ定義の精度は、＋／−５ｋＤａのオーダーである。

【００１８】本発明の対象は、精製時に、特に等電点電気泳動で測定して等電点が約４．０
であり、分子量が約８０ｋＤａを示すラッカーゼである。精製酵素で測定して、
ラッカーゼの最適ｐＨは約７．５であり、最適温度は約７０℃である。ラッカー
ゼをＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株、好ましくはＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ
ａｌｂｏｍｙｃｅｓ（メカノカルプス・アルボマイセス）属、最も好ましくはＭ
．ａｌｂｏｍｙｃｅｓＩＭＩ２５５９８株から単離することができる。本発
明の別の課題は、単離しかつ精製したラッカーゼ酵素である。

【００１９】本発明のさらなる対象は、本発明のラッカーゼ酵素を含有する酵素製品である
。酵素製品中のラッカーゼ酵素量は、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属、特にＭｅｌ
ａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓ種の株の量、特にラッカーゼを産生す
るために最適化されていない増殖条件で培養液中にＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓＩ
ＭＩ２５５９８９株により天然に製造される酵素の量よりも多いのが好ましい
。酵素製品中のラッカーゼの量は、好ましくは１０ｍｇ／ｌであり、より好まし
くは≧３０ｍｇ／ｌであり、より好ましくは≧３００ｍｇ／ｌでさえあり、さら
により好ましくは≧５００ｍｇ／ｌであり；最も好ましくは≧１ｇ／ｌである。

【００２０】前記したように、本発明のラッカーゼをＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株、特
にＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓ種の株、特にＭ．ａｌｂｏｍ
ｙｃｅｓＩＭＩ２５５９８９株から単離できるが、本発明のラッカーゼをコ
ードする遺伝子を単離し、好適な産生宿主中に移入することによる組換え技術に
より製造することもできる。

【００２１】本発明のラッカーゼは、その天然宿主または産生宿主の培養液中で製造でき、
タンパク質化学の公知の方法を用いることによりそこからラッカーゼを単離精製
できる。培養液が十分に多い量のラッカーゼを含有するが、他の有害なタンパク
質を含有しないのであれば、培養液をそのまま使用する簡単に細胞を分離するこ
とによってできる。培養液は可能であれば濃縮してよい。別の用途では、より多
くのラッカーゼを含有する酵素製品を使用するのが好ましい。大量のラッカーゼ
は、組換え技術により産生宿主の培養液中でラッカーゼ酵素を製造することによ
り製造できる。増量は、ラッカーゼ酵素量に関するものであり、Ｍｅｌａｎｏｃ
ａｒｐｕｓ属、特にＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ株、特にＩＭＩ２５５９８９株に
より天然で製造されるラッカーゼ酵素の量を超えるラッカーゼ酵素の量を意味す
る。

【００２２】本発明のさらなる対象は、本発明のラッカーゼ酵素の必須量を含有する酵素製
品である。すなわち、他の酵素を無視できない量で含まず、ラッカーゼが酵素製
品の主要活性であることを意味する。本発明の対象はまた、Ｍｅｌａｎｏｃａｒ
ｐｕｓ属の真菌から単離できるラッカーゼ、および各用途に必要な添加物を含有
する酵素製品である。このような添加物には例えばバッファーおよび安定剤が含
まれる。

【００２３】本発明の対象はまた、ラッカーゼをコードする核酸分子である。核酸分子は、
以下の群から選択される： −ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢ（図１５Ｂは、図１５Ａに続
く配列を示す）に示されるヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子； −ＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードする核酸分子； −遺伝暗号の縮退により、ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢのヌ
クレオチド配列のコード配列と異なるコード配列を含有する核酸分子； −ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢのヌクレオチド配列とハイブ
リダイズする核酸分子；および −ラッカーゼ活性を有しかつアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２または図
１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列と少なくとも７３％同一であるポリペプチ
ドをコードする核酸分子。

【００２４】本発明はまた、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及びＢ
のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一であり、好ましくは少なくとも８０％
同一であり、より好ましくは少なくとも８５％同一であり、さらにより好ましく
は少なくとも９０％同一でさえあり；最も好ましくは少なくとも９５％同一であ
るポリペプチドをコードする核酸分子を具現する。本発明のポリペプチドのアミ
ノ酸配列が、ＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及びＢのアミノ酸配列と少なくとも
９９％同一である場合が、最も好ましい。相同アミノ酸をもとに類似性を推測す
る場合、本発明は、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及び
Ｂのアミノ酸配列と少なくとも８３％の相同性、好ましくは少なくとも８５％の
相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらにより好ましくは少な
くとも９５％の相同性を示し、最も好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：２または図
１５Ａ及びＢのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を示すポリペプチドを
コードする核酸分子を具現する。

【００２５】本発明はまた、ハイブリダイゼーション溶液が６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｄ
ｔ’ｓ試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性ＤＮＡを含有し、ハイブリ
ダイゼーションを５０〜６０℃で実施するハイブリダイズ条件で、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１とハイブリダイズする核酸分子を具現化する。別の場合には、ハイブ
リダイゼーション溶液が６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｄｔ’ｓ試薬、０．５％Ｓ
ＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ、５０％ホルムアミドを含有し、この際ハイ
ブリダイゼーションを２５〜３５℃で実施する。本発明は特に、厳しい条件でＳ
ＥＱＩＤＮＯ：１とハイブリダイズする核酸分子を具現化し、それによって
、ハイブリダイゼーションを最初の選択肢に沿って実施するかまたは同一条件で
、６８℃で実施するか、４２℃で第２の選択肢に沿って実施する。５０×Ｄｅｎ
ｈａｄｔは、１０ｇ／ｌＦｉｃｏｌｌ、１０ｇ／ｌポリビニルピロリドン、
１０ｇ／ｌウシの血清アルブミンであり、そしてＳＳＣは、０．１５ＭＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。核酸分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは例えばｃＤＮＡである。

【００２６】本発明はまた、ラッカーゼ活性を有し、前記核酸分子によりコードされるポリ
ペプチドに関する。本発明はさらに前記のように、ＳＥＱＩＤＮＯ：２また
は図１５Ａ及びＢのアミノ酸配列と同一かまたは相同のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドに関する。

【００２７】本発明はまた、ラッカーゼの製法に関し、該製法は以下のステップを含む： −本発明の核酸分子またはベクターを微生物宿主細胞に移入して核酸分子を発
現させ、場合により核酸分子を宿主から分泌させ；および −ラッカーゼ活性を有するポリペプチドを、細胞または微生物宿主の培養液か
ら回収する。

【００２８】本発明のラッカーゼは、有効なｐＨおよび温度条件が高い工業用途に非常に好
適である。このような用途には、リグニンまたは（直接または媒介物質による）
抽出物、機械的に破砕したリグニン−含有繊維に由来する繊維製品およびボード
の製造、ペーパー・マシンの稼働性の改善および他の用途に関連性を有する林業
、リグニン、セルロース、および／またはデンプン等のポリマーの（直接または
媒介物質による）酸化、ならびにアルケンまたは着色分子等の他の化学物質の酸
化が含まれる。これらの用途では、温度はしばしば６０℃以上、一般的に８０℃
程度に高く、ｐＨは中性に近いかまたはわずかに高い。本発明の酵素は、ｐＨお
よび温度が同時にかなり高い条件で非常に良く機能する。以下に、添付の図および例により本発明を詳細に説明する。

【００２９】本明細書で使用される用語「酵素製品」とは、ラッカーゼ酵素活性を含む任意
の製品を意味する。例えば酵素製品は、ラッカーゼ含有培養液、単離ラッカーゼ
または少なくとも成分の１つがラッカーゼである酵素混合物であってよい。酵素
製品はまた、種々の添加物、例えば安定剤またはバッファーを含有してよい。添
加物は、ラッカーゼ酵素製品の各用途に適するように選択される。酵素製品はま
た、酵素製品の用途に応じて他の酵素活性、例えばペルオキシダーゼ活性を有し
てもよい。

【００３０】ラッカーゼ含有酵素製品は、ラッカーゼの作用を強化するために使用される好
適な媒介物質を含有してもよい。好適な媒介物質には、例えばＴｅｍｐｏ（＝２
，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）、ＨＢＴ（＝１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール）、ＡＢＴＳ＝２，２’−アジノビス−３−エチルベ
ンズチアゾール−６−スルホネート、ビオルル酸、ＮＨＡ（＝Ｎ−ヒドロキシ−
アセトアニリド）が含まれる。

【００３１】ラッカーゼを産生する微生物のスクリーニングラッカーゼを産生する微生物は、天然から単離してもよく、または微生物学で
公知のスクリーニング法を使用することにより、すでに単離同定された保存機関
の株からスクリーニングしてもよい。ラッカーゼがフェノールオキシダーゼに属
するので、フェノールオキシダーゼのスクリーニングに好適な方法をスクリーニ
ングに使用する。スクリーニングは、プレート培養の固体培地または液体培地で
の酵素の製造を、酵素活性の測定により調査することで、実施される。

【００３２】公知の大半のラッカーゼのよりも高温および高いｐＨに抵抗性である新規ラッ
カーゼを探索する際、暖かくかつ／またはアルカリ条件で生息する微生物を環境
から選抜するのが重要である。このような環境は、例えば堆肥、ウッドチップの
パイルまたは熱帯地域で見出される。

【００３３】スクリーニングで見出された陽性の真菌によるフェノールオキシダーゼの製造
は、菌糸体の先にフェノールオキシダーゼの基質を添加することにより、プレー
ト上で調査することができる。これらの滴下試験により、プレート上での陽性反
応がペルオキシダーゼによるものであるのかラッカーゼによるものであるのかを
明確にすることができる。適当な試薬にはＡＢＴＳ、シリンガルダジンおよびグ
アイアコールが含まれ、ペルオキシダーゼの観察には過酸化水素が含まれる。

【００３４】フェノールオキシダーゼを産生するスクリーニングの結果により見出された微
生物を、好適な培地で培養し、培養液中でのフェノールオキシダーゼの生成を、
フェノールオキシダーゼ活性の測定に適した方法で観察する。真菌のための好適
な培地には、例えば麦芽エキスおよびジャガイモデキストロース培地が含まれ、
活性を測定するのに好適な基質にはＡＢＴＳ、グアイアコール、およびシリンガ
ルダジンが含まれる。多くの真菌のために、フェノールオキシダーゼの産生には
インデューサーが必要である。これには例えば、芳香族化合物、リグニン含有物
質、界面活性剤、一定の炭素源、および硫酸銅が含まれる。ラッカーゼ活性は基
質としてＡＢＴＳを使用することにより測定でき、ラッカーゼはそれを暗緑色に
酸化する。測定はＮｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ等（１９８８）の方法で実施できる
。ラッカーゼ活性はまた、Ｐａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ等（１９８５）のグアイアコ
ール法を使用して測定できる。

【００３５】目的のラッカーゼが十分量で産生された後、酵素を精製し、その特性を特徴付
ける。温度およびｐＨ挙動ならびに酵素の等電点を決定できる。ラッカーゼの生産起源も、ラッカーゼ遺伝子配列の相同性により篩い分けでき
る。この場合、ラッカーゼ遺伝子のアミノ末端の保存領域を基礎とするヌクレオ
チドをＰＣＲのプライマーとして使用し、公知のラッカーゼと相同な遺伝子配列
を例えば種々の真菌のゲノム中で探索する。

【００３６】種々の温度でのラッカーゼ活性の測定は、例１に記載されるようなＡＢＴＳ法
により実施できる。ラッカーゼの最適ｐＨを、異なるｐＨ値で、好適なバッファ
ーを用いたグアイアコール法により決定することができる。ｐＨが７以上である
と、活性分析でのＡＢＴＳの機能は弱化する。

【００３７】熱安定性は、一定のｐＨで好適なバッファーを用いて、種々の温度で酵素サン
プルをインキュベートすることにより測定できる。各温度での酵素の残留活性は
、例えばＡＢＴＳ法により定義できる。ｐＨ安定性は、好適なバッファーを用いて種々のｐＨで酵素サンプルをインキ
ュベートすることにより決定できる。残留活性を例えばＡＢＴＳ法により決定で
きる。

【００３８】ラッカーゼの単離精製酵素化学、例えば塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水
性相互作用クロマトグラフィーの常用法を用いて酵素を精製できる。精製は、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりモニターすることができる。精製酵
素の種々の温度およびｐＨ値での酵素活性が測定でき；同様に、分子量および等
電点を決定できる。

【００３９】本発明の実施例では、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓ株を肥
沃培地上で培養することにより、ラッカーゼを製造することが記載される。培養
中、ラッカーゼ活性を、ラッカーゼの影響下でのＡＢＴＳからの暗緑色カチオン
ラジカルの生成をベースとするＮｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ等（１９８８）のＡＢ
ＴＳ法に基づいてモニターする。しかし、本発明はこの培地上で産生されるＭ．
ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼのみに限定するものではない。

【００４０】Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼ培養液から精製し、その中から濾過または
遠心分離により細胞を除去した。培養液をさらに限外濾過により濃縮した。陰イ
オン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて
さらに精製した。限外濾過における分子量カットオフ値は約３０ｋＤａであった
。陰イオン交換クロマトグラフィーは酢酸バッファー中ｐＨ５で実施され、Ｎａ_２ＳＯ_４の増加直線勾配でラッカーゼをカラムから溶離した。陰イオン交換の最
良のフラクションをさらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、酢酸バッ
ファー中ｐＨ５で精製した。サンプルを０．７ＭＮａ_２ＳＯ_４濃度で結合させ
、Ｎａ_２ＳＯ_４の減少直線勾配で溶離した。

【００４１】しかし、他の公知の精製法を使用しても酵素を分離することができる。精製されたＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの分子の大きさ、等電点、およ
びｐＨおよび温度プロファイルを決定した。

【００４２】精製酵素とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染
色で確認されかつ観察できるラッカーゼのバンド以外の別のタンパク質のバンド
を有さない酵素製品を意味する。本明細書において、酵素は、限外濾過、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精
製される。得られるラッカーゼの純度は、≧９０％で他のタンパク質を実質的に
含有しないというものである。

【００４３】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定された、精製Ｍ．ａｌｂｏ
ｍｙｃｅｓラッカーゼの分子の大きさは８０ｋＤａであった。Ｍｕｌｔｉｐｈｏ
ｒＩＩ電気泳動装置（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ）による等電点電気泳動で
は、等電点として４．０が測定された。Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの活
性は７０℃の温度で最も高く、最適ｐＨは７．５であった。６０℃で２時間イン
キュベーション後、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼはその活性の１００％を
維持した。さらに、そのｐＨ安定性は高いｐＨで改善されている。

【００４４】ラッカーゼの製造本発明のラッカーゼは、その天然宿主または産生宿主の培養液中で製造でき、
そこから、タンパク質化学の公知の方法を用いて単離精製できる。培養液が十分
に多い量のラッカーゼを含有し、他の有害なタンパク質を含有しない場合、簡単
に細胞を分離することによってそのまま使用することができる。もし必要があれ
ば、培養液を濃縮しかつ／または精製してよい。種々の用途において、ラッカー
ゼの増加量を含有する酵素製品を使用するのが好ましい。このような酵素製品は
、遺伝子技術により産生宿主培養液中にラッカーゼ酵素の増加量を生成すること
により、製造することができる。増加量とは、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ株、特に
ＩＭＩ２５５９８９株により天然で製造できるラッカーゼ酵素の量を超えるラ
ッカーゼ酵素量を意味する。

【００４５】本発明のラッカーゼは、本発明のラッカーゼをコードする遺伝子を単離し、そ
れを好適な産生宿主に移入することによる組換え技術を用いて、製造することも
できる。ラッカーゼをコードする遺伝子は、以下のいずれかの方法でｃＤＮＡラ
イブラリーから単離できる。ｃＤＮＡライブラリーは、好適なイースト発現ベク
ター中に形成し、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅイ
ーストに形質転換できる。ラッカーゼを産生するクローンを、例えばＡＢＴＳ基
質を含有するプレートを用いて、活性に基づいて同定する。別の可能性は、ｃＤ
ＮＡライブラリーをλＺＡＰベクターと連結させ、得られた生成物バンクでＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞に感染させる。ラッカーゼをコードするクロ
ーンを、ポリクローナル抗体またはＤＮＡハイブリダイゼーションにより同定す
る。ポリクローナル抗体を使用する際、例えばウサギで、精製ラッカーゼタンパ
ク質に対して抗体を産生する。ハイブリダイゼーションでは、ＰＣＲで得られた
ラッカーゼ遺伝子フラグメントをプローブとして使用する。この場合、ＰＣＲプ
ライマーの配列は、ラッカーゼ遺伝子中で一般的に保存された領域（例えば活性
中心のアミノ酸に相当する領域）および／または精製ラッカーゼタンパク質のア
ミノ末端配列または内部ペプチドのアミノ酸末端をベースとしている。さらに、
各メッセンジャーＲＮＡのテール部のポリＡ領域に結合するオリゴｄＴ領域をＰ
ＣＲプライマーとして使用することができる。

【００４６】単離したラッカーゼｃＤＮＡを配列決定する。単離したｃＤＮＡと単離酵素の
間のつながりは、酵素を形成するアミノ酸配列によって確認することができる。
ラッカーゼ遺伝子の染色体コピーは、ＰＣＲで単離されるかまたはλベクター中
に形成されたゲノムライブラリーから単離でき、イントロンの位置をシークエン
スにより決定することができる。

【００４７】Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼ遺伝子の単離メッセンジャーＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーに基づいてＭ．ａｌｂｏｍ
ｙｃｅｓラッカーゼの遺伝子を単離することはできなかった。典型的なｃＤＮＡ
ライブラリーの作成は成功しなかった。意外にも問題は、多くの細胞がすでに自
家融解された時に、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓが末期の培養相でラッカーゼを産生
し、メッセンジャーＲＮＡが部分的に退化するという事実または純粋に単離する
ことが困難であるという事実によって生じた。したがって、ｃＤＮＡライブラリ
ーの代わりに、遺伝子をゲノム遺伝子ライブラリーから単離しなければならなか
った。遺伝子の単離は、実施例９に詳細に記載される。

【００４８】ラッカーゼ遺伝子の配列を図１５Ａ及びＢに示し、配列を列挙する（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１）。遺伝子の長さはイントロンを含んで２２７９ｂｐである。図
１５Ａ及びＢに示されるように、コード領域の開始する塩基番号は２８６であり
、イントロンは５４１〜６１８位、６９８〜７７０位、７８３〜８６９位、１９
１３〜１９９９位、２０６９〜２１５０位である。最後のコード塩基は２５６１
である。

【００４９】遺伝子は６２３アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。アミノ酸配列を
、特許出願ＷＯ９５３３８３６に開示されるＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａのアミ
ノ酸配列に関して、Ｂｌａｓｔ法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）を用いるこ
とにより比較すると、アミノ酸配列が７２％同一であり（同一性４５０／６２３
、７２％）、８２％が相同である（陽性５１８／６２３、８２％、陽性とは相同
アミノ酸を意味する）（ギャップ＝４／６２３、０％）ことが分かった。

【００５０】相当の比較をＰｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａラッカーゼ（Ｆｅｒｎａ
ｎｄｅｚ−ＬａｒｒｅａおよびＳｔａｈｌ、１９９６）で実施すると、配列が６
８％同一であり（同一性４２７／６２７、６８％）、７９％相同である（陽性５
０２／６２７、７９％）（ギャップ＝１２／６２７、１％）ことが分かった。

【００５１】単離ラッカーゼ遺伝子は、他の有機体中でたんぱく質製造に使用される。この
ような産生宿主には、前記のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ産生系、例えばＡ．ｏｒｙ
ｚａｅまたはＡ．ｎｉｇｅｒ（ＵＳ５，８４３，７４５、ＵＳ５，７７０，４１
８、ＷＯ９７０８３２５およびＷＯ９５３３３８６）、真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａに関して開発した産生系（ＥＰ２４４２３４）、またはＦｕｓａｒｉｕ
ｍの真菌種、例えばＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに関して開発した産生系（Ｍａｌａ
ｒｄｉｅｒ等、１９８９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓバクテリア、例えばＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓまたはＥ．ｃｏｌｉバクテリア、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、
またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅまたは他の微生物
または哺乳動物細胞に関して開発した産生系が含まれる。

【００５２】ラッカーゼ生成物の最適化ラッカーゼの生成は、野生または組換え株の培養条件および培地を最適化する
ことにより、改善することもできる。例えば、培地の最適化の際には、窒素源の
質（中でも、有機または無機窒素源）および量がラッカーゼ製造に影響を及ぼす
。必要であれば、より高い収量を達成するために窒素源を制限する。同様に、炭
素源の効果も確立される。酵素製造に最適な炭素源を選択する。必要であれば、
炭素源も制限できる。炭素／窒素割合を最適化して酵素の製造を最良にする。成
育条件を最適化して問題の酵素製造を最良にすることができる。酵素製造に最適
なｐＨおよび温度で微生物を増殖させる。

【００５３】適当な混合および空気供給により、発酵中に適当なエアレーションを保証する
。発酵中、ラッカーゼ製造のインデューサー、例えばベラトリルアルコール、キ
シリジン、またはリグニンを使用することもできる。インデューサーを添加する
方法および時間、ならびにその濃度を最適化する。

【００５４】種々の用途におけるラッカーゼの使用一般的に、本発明のラッカーゼはラッカーゼを使用する用途、例えばゲル生成
、繊維の接着、コルクの処理、染料の除去（特に繊維製品の染料）、繊維の染色
、たんぱく質処理、洗剤、抗菌用途、デンプン用途、化学物質の酸化、バイオフ
ィルムの除去、リグニン誘導体の製造、医薬品分析、ウールの縮みの減少、ベー
キング、ビールの保存性の改善、色素の製造、油製品からの酸素の除去、および
ヨウ素の製造に使用するのに非常に適している。所望により、本発明のラッカー
ゼを一定の目的のために固定することもできる。

【００５５】本発明のラッカーゼは、有効なｐＨおよび温度条件が高い工業用途に非常に適
している。このような用途は、中でも、林業用途、機械的な破砕物からの繊維製
品およびボードの製造、リグニン含有繊維、ペーパー・マシンの作動性の改善お
よび他の用途、ポリマーの酸化および他の化学物質、例えば染料分子の酸化を含
む。これらの用途では、温度はしばしば６０℃以上、一般的に８０℃程度であり
、ｐＨは中性に近いかまたはわずかにアルカリ性である。

【００５６】全ての用途において、十分な酸素を反応に供給することが必須である。酸素は
ラッカーゼが要する還元基質である。ある場合、特に基質濃度が低い場合には、
反応混合物自体の中に十分な酸素が存在するが、空気または酸素あるいは酸素強
化空気を反応混合物に添加することもできる。必要であれば、媒介物質を反応の添加物として使用する。

【００５７】本発明のラッカーゼは、例えば着色剤を酸化するのに非常に適している。染料
分子をｐＨ４〜８、例えばｐＨ４．５〜７．５、好ましくはｐＨ６〜８、より好
ましくはｐＨ７〜８で、２５〜８０℃の範囲の温度、好ましくは４０〜８０℃、
より好ましくは５０〜８０℃；最も好ましくは６０〜８０℃で、ラッカーゼと接
触させる。必要であれば酸素を反応系に添加する。ラッカーゼの量は着色剤１ｇ
に対して、１〜１０００ｎｋａｔ、好ましくは１０〜５００ｎｋａｔ、最も好ま
しくは２０〜２００ｎｋａｔである。反応は５分〜２４時間、好ましくは３０分
〜２時間実施する。

【００５８】本発明のラッカーゼは、重合にも非常に好適である。選択された被重合化合物
を前記したのと同一の条件で、ラッカーゼと接触させる。反応混合物を試験中エ
アレーションすることができる。重合化合物の分子量の増加を、例えばＧＰＣ（
ゲル透過クロマトグラフィー）で調べることにより、重合をモニターすることが
できる。

【００５９】本発明のラッカーゼは、ペーパー・マシンの作動性を改善するために使用する
こともできる。ラッカーゼは、リグニンと抽出物とに端を発する化合物を重合し
、ペーパー・マシン中での微生物の有害な増殖を抑制することにより、ペーパー
・マシンの作動性を改善するために使用できる。一般的に、ペーパー・マシンの
状件はｐＨ約５〜７であり、温度６０〜８０℃である。ラッカーゼをプロセス水
に添加するかまたは実質的にペーパー・マシンに有利な状件を変化させる必要な
しにヘッドボックスまたは循環水系に添加することができる。ｐＨは５〜８の範
囲、温度は５０〜８０℃の範囲である。ラッカーゼの量は乾燥状態の繊維１ｇま
たは循環水１ｌに対して、１〜１０００ｎｋａｔ、好ましくは１０〜５００ｎｋ
ａｔである。処理時間は５分〜２４時間、好ましくは３０分〜２時間である。

【００６０】本発明のラッカーゼは、繊維の酸化にも使用できる。リグニン含有繊維を、５
０〜８０℃の温度で、５０〜１００℃程度の高い温度で、好ましくは６０〜８０
℃の温度で、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜８で、ラッカーゼと接触させて、
このとき、ラッカーゼ濃度は繊維１ｇに対して１〜１０００ｎｋａｔ、好ましく
は繊維１ｇに対して１０〜５００ｎｋａｔであり、反応時間は２分〜２４時間、
好ましくは１０分〜２時間である。ラッカーゼ処理によって、例えば繊維ボード
、例えばＭＤＦボードの製造に使用できるかまたは機械的に破砕したリグニン含
有繊維からなる紙あるいはカードボード製品に使用される繊維の強度特性を改善
する。

【００６１】前記した用途例に加えて、本発明のラッカーゼは繊維の脱リグニンに使用する
こともできる。ラッカーゼを、クラフト繊維等の脱リグニンすべき繊維と、カッ
パー値２０〜３０、好ましくは約２５、調度５〜１５％、好ましくは約１０％で
、好ましくはパルプの１〜５％の量、好ましくはパルプの３％の量の媒介物質の
存在下に、ｐＨ５〜８、好ましくは６〜８で、温度５０〜８０℃、好ましくは６
０〜８０℃で接触させることができる。反応時間は５分〜２４時間、好ましくは
３０分〜２時間である。ラッカーゼの量は、０．５Ｍｐａの酸素圧力で、１０〜
１０００ｎｋａｔ／ｇ、好ましくは１０〜５００ｎｋａｔ／ｇである。以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明をどのようにも制限す
るものではない。

【００６２】実施例１Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの製造Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ真菌をオートアガープレート（Ｄｉｆｃｏ）上に保持
した。接種および製造培地の両方が、以下のものを含有した。２５ｇ／ｌグルコース（ＡｎａｌａＲ）２７．５ｇ／ｌＢａｃｔｏイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）０．５ｍｇ／ｍｌＩｎｄｕｌｉｎＡＴ（Ｓｉｇｍａ）０．０４１／ｌ以下のものを含有するミネラル溶液：１．０ｇ／ｌＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ）１．０ｇ／ｌＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ）０．１ｇ／ｌＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）０．１６ｇ／ｌＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）１．０ｇ／ｌＮａ_２ＥＤＴＡ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ）。グルコース溶液を個々に滅菌した。

【００６３】最初に、オートミールアガー上で良好に増殖した菌糸体から切り出した３〜４
片（約ａ１ｃｍ^２）を、培地１００ｍｌに接種した。培養温度は３７℃であり、
攪拌速度は１２０ｒｐｍであった。培養２日後に、菌糸体を均質化し、滅菌培地
９００ｍｌに均質化した接種材料１００ｍｌを接種した。生成培地の体積は１ｌ
であった；培養温度は３７℃であり、攪拌速度は１６０ｒｐｍであった。培養を
１４日間継続した。４個の類似した培養物が作成された。

【００６４】酵素活性アッセイＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ培養液のラッカーゼ活性を、ＡＢＴＳを使用して測定
した。ラッカーゼはＡＢＴＳを酸化して暗緑色のカチオンラジカルとする。活性
アッセイをＮｉｋｕ−Ｐａａｖｏｌａ等（１９８８）の開発した方法に沿って実
施した。サンプルを０．０２５Ｍコハク酸バッファー、ｐＨ４．５で希釈した
。ＡＢＴＳ溶液０．３５０ｍｌ（１１ｇ／ｌ）を希釈溶液１．１５ｍｌに添加し
、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬａｍｂｄａ２０分光光度計により、４３６ｎｍ
の波長で反応を２分実施した。Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ培養物について測定したラッカーゼ活性を図１に示す
。

【００６５】実施例２Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの精製タンパク質含量の測定タンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＤＣＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ
Ｋｉｔを用いて、Ｌｏｗｒｙ等（１９５１）の開発した方法に基づいて測定し
た。アッセイを、キットの試薬を用いて実施し、生じた着色反応の強度をＨｉｔ
ａｃｈｉＵ−２０００分光光度計を用いて波長７５０ｎｍで測定した。また、
測定毎に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）０．２５〜１．２５
ｇ／ｌを含む溶液を使用して、標準曲線を規定した。

【００６６】精製濾過により細胞を除去した培養液を、Ａｍｉｃｏｎ８４００濾過装置により
、ＰＭ３０メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて限外濾過した。濾過で溶
液を濃縮し、蒸留水を添加して溶液の伝導度をイオン交換クロマトグラフィーで
要求されるレベルまで低下させることができた。伝導度は、ＥＤＶＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ電気伝導測定装置（ｐｌａｔｉｎｕｍｅｌｅｃｔｒｏｄｅＭｅ
ｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ）を用いて測定した。

【００６７】限外濾過後、溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ｈ＝１０ｃｍ、Ｖ＝２０ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）により精製した。樹脂を室温で０．０１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５を用
いて平衡化した。０〜０．５Ｍ硫酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、増
加直線食塩勾配でタンパク質を溶離させた。勾配の総体積は９０ｍｌであり、流
速は２ｍｌ／分であった。勾配をかけている間、４ｍｌフラクションを回収した
。フラクションのタンパク質含量、ラッカーゼ活性、および電気伝導度をアッセ
イした。フラクションのラッカーゼ活性およびタンパク質含量を図２に示す。

【００６８】陰イオン交換の最も状態の良いラッカーゼ・フラクションを合わせ、さらに疎
水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ｈ＝９ｃｍ、Ｖ＝１８ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
より精製した。実験の前に、塩含量が０．７ＭとなるようにＮａ_２ＳＯ_４をサン
プルに添加して、タンパク質の疎水性を増加させた。樹脂を０．０２Ｍクエン
酸バッファー、ｐＨ５中の１ＭＮａ_２ＳＯ_４で、室温で平衡化した。クエン酸
バッファー中の０．７〜０ＭのＮａ_２ＳＯ_４を使用して減少直線食塩勾配で、
サンプルをカラムから溶離した。勾配の総体積は９０ｍｌであり、流速は２ｍｌ
／分であった。勾配をかけた後、樹脂を平衡バッファー、最後に水で洗浄した。
勾配をかけ、次にバッファーと水とで洗浄する間、３．５ｍｌフラクションを回
収し、そのラッカーゼ活性、タンパク質含量および塩含量を測定した（図３）。

【００６９】イオン交換およびＨＩＣの両方で最も興味深いフラクションをＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、Ｌａｅｍｍｌｉ（
１９７０）の方法に従ってラッカーゼの精製をモニターした。ゲル電気泳動にお
いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−ＲａｄＲｅａｄｙＧｅｌＣｅｌｌ）の装
置、および用意されたポリアクリルアミドゲル（１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＲ
ｅａｄｙＧｅｌ）を使用した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ３５０
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）色素溶液で染色した。ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔ
ｅｉｎＭａｒｋｅｒＢｒｏａｄＲａｎｇｅ＃７７０８Ｓ（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）をタンパク質標準として使用した。ＳＤＳＰＡＧＥで規定されたＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの分子量は
８０ｋＤａであった。

【００７０】実施例３Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの特徴付け活性の温度依存性精製したＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの活性の温度依存性を、２５、４
０、５０、６０、７０、８０および９０℃の温度でＡＢＴＳによりラッカーゼ活
性を測定することにより規定した。酵素を緩和０．０２５Ｍコハク酸バッファー
、ｐＨ４．５中で希釈した。酵素添加直後に、緩和ＡＢＴＳ溶液を添加した。サ
ンプルを所望の温度で２分インキュベートし、その後４３６ｎｍの波長で吸収を
測定した。添加した酵素溶液がバッファーの温度をそれほど低下させないように
するために、バッファーに添加される酵素の体積は、全ての希釈溶液で、総体積
の７％以下であった。Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの温度に対する依存性
を図４に示す。

【００７１】最適ｐＨ精製したＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの最適ｐＨを、３、４、５、６，
７および８のｐＨ値でＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファーにおいてグアイアコール法
に従って、ラッカーゼ活性を測定することにより決定した。ｐＨ７以上でＡＢＴ
Ｓが機能しないのでグアイアコールを選択した。酵素をバッファー中へ希釈し、
酵素添加直後に、１％グアイアコール２５μｌ溶液を添加した。反応を、４６５
ｎｍの波長で分光光度計を用いて５分間追跡した。Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッ
カーゼ活性のｐＨ依存性を図５に示す。

【００７２】熱安定性Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの熱安定性を、０．０６Ｍクエン酸バッ
ファー、ｐＨ６中で、５０、６０、７０および８０℃で酵素をインキュベートす
ることにより測定した。各温度での酵素の残留活性を、１５、３０、６０および
１２０分のインキュベーション後にＡＢＴＳ法により測定した。熱安定性測定の
結果を図６に示す。

【００７３】精製したＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓの熱安定性を前記した条件で測定した。結果
を図７に示す。結果は、酵素の残留活性が、６０℃で２時間程度、実質的に未変
化で維持されることを示している。４時間のインキュベーションの後、まだ６０
％の残留活性があり、６時間後では４０％であった。

【００７４】ｐＨ安定性Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼのｐＨ安定性を、２、３、４、５、６、７
および８のｐＨ値でＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中室温で酵素をインキュベー
トすることにより測定した。各ｐＨでインキュベートしたサンプル中の酵素の残
留活性を、ＡＢＴＳ法により、１、３、５および２２時間のインキュベーション
の後に測定した。ｐＨ安定性測定の結果を図８に示す。

【００７５】等電点Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの等電点を、等電点電気泳動により測定し
た。０．５ｍｍ厚のポリアクリルアミドゲルは、７．５％アクリルアミド（Ｍ
ｅｒｃｋ）、０．２２５％Ｎ，Ｎ’−ビス−メチレンアクリルアミド（Ｍｅｒｃ
ｋ）、６％両性電解質（ＩＥＦのためにＰｈａｒｍａｌｙｔｅ２．５〜５、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）、０．０５％過硫酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ）および０．０
５％Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（Ｍｅｒｃｋ）を含有した。等
電点電気泳動を、ＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ）を用いて実施した。ゲルを活性染料で染色し、この際、ゲルを希釈Ａ
ＢＴＳ溶液（１ｇ／ｌ）に約１０秒間浸漬した。約１５分後、ラッカーゼバンド
が緑色で出現した。ゲルのｐＨ分布を、ｐＨ表面電極（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌ
ｅｄｏ）を用いて測定した。等電点電気泳動法に基づいて、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃ
ｅｓラッカーゼの等電点は４．０であった。

【００７６】実施例４Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの染料（色素）酸化への使用好熱性Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼを使用して試験を実施し、Ｔｒａｍ
ｅｔｅｓｈｉｒｓｕｔａ真菌から単離された公知のラッカーゼにより対照試験
を実施した。常用の基質である２，６−ジメトキシフェノールを基質として使用
した。基質濃度は１ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ４．５〜７．５であり、温度は４０また
は６０℃であった。ラッカーゼの量は１５ｎｋａｔ／ｇであった。試験中、反応
混合物をエアレーションした。試験終了時点で（３０分）、ジメトキシフェノー
ル由来の色素の形成を４６８ｎｍの波長で測定する際に、好熱性Ｍ．ａｌｂｏｍ
ｙｃｅｓラッカーゼが高温および高ｐＨでより良好に機能することが見出された
（図９および１０）。

【００７７】ラッカーゼは繊維製品色素から色を除くために使用できる。ラッカーゼは多く
の染料（色素）を酸化し、これは色抜きとして観察できる。繊維製品染料の色抜
きは、繊維製品工業で一般的に使用される染料、ＤｉａｍｏｎｄＢｌａｃｋ
ＰＬＣ、を使用することにより測定された。ラッカーゼ処理を４０および６０℃
の温度で２時間、ｐＨ７．５で実施し、この際、ラッカーゼの量は染料１ｍｇに
対して２０ｎｋａｔであった。最大吸光（５６０ｎｍ）の測定値に基づいて、Ｍ
ｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓラッカーゼは４０℃で色の３４％を除き、６０℃で１６
％を除くが、これに対してＴｒａｍｅｔｅｓラッカーゼは４０℃でわずかに１４
％、６０℃で１％に過ぎない（図１）。

【００７８】Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの色抜き能力を、ｐＨ５および８で、Ｔ．
ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼと比較した。色抜き能力を、繊維製品工業で一般的に
使用される染料を用いて研究した。着色溶液（５０ｍｇ／ｌ）を、５０ｍＭコ
ハク酸バッファー（ｐＨ５）またはリン酸バッファー（ｐＨ８）中の１ｎｋａｔ
／ｍｌラッカーゼ量で、４０℃の温度で２４時間酸化した。色抜きを視覚的に追
跡した。結果を表１に示す。結果が示すように、両酵素ともｐＨ５で試験染料を
酸化して無色に変化させた。Ｔ．ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼはｐＨ８で効果が無
く、試験染料を酸化しなかったが、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼはこれと
異なり、ｐＨ８でさえも染料を酸化した。結果は、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッ
カーゼの染料酸化での挙動が、常用のＴｒａｍｅｔｅｓラッカーゼよりもかなり
広範囲であることを示している。

【００７９】表１Ｔ．ｈｉｒｓｕｔａおよびＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの、ｐＨ
５および８での繊維製品染料の除去（＋＝溶液から色が除かれる、−＝溶液から
色が除かれない）

【００８０】実施例５Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの重合への使用モデル化合物（リグニン、ＷｅｓｔｖａｃｏまたはＩｎｄｕｌｉｎＡＴ、Ｓ
ｉｇｍａ）の重合を、好熱性ラッカーゼで試験した。リグニンは典型的なラッカ
ーゼの芳香族基質である。対照試験は、Ｔｒａｍｅｔｅｓｈｉｒｓｕｔａから
単離されたラッカーゼを使用して実施した。試験条件は以下の通りであった：基
質濃度１％、ｐＨ７．５、および温度４０または６０℃。ラッカーゼの量は２０
０ｎｋａｔ／ｇであった。反応混合物を試験中にエアレーションした。ＧＰＣ（
ゲル濾過クロマトグラフィー）により重合したリグニンの分子量の増加を測定し
て、重合を追跡した。反応終了時（３０分）、好熱性Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラ
ッカーゼが高温および高ｐＨで対照ラッカーゼよりも効果的に機能することが見
出された。図１２は、状況を説明する図であり、ここでリグニンの重合は４０℃
で実施され、図１３の場合には同様にして６０℃で実施された。Ｍｅｌａｎｏｃ
ａｒｐｕｓラッカーゼは、Ｔｒａｍｅｔｅｓラッカーゼよりも明らかに優れ、分
子サイズの平均的な増加を誘導し、低分子の部分を減少させる。

【００８１】実施例６ペーパー・マシンの稼働性を改善させるためのＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカ
ーゼの使用ラッカーゼは、リグニンと抽出物とに端を発する化合物を重合し、ペーパー・
マシンの微生物による問題を減少させることにより、ペーパー・マシンの稼働性
を改善するために使用することができる。一般的に、ペーパー・マシンの条件は
：ｐＨ５〜７、温度６０〜８０℃である。処理試験を、リグニンとペーパー・マ
シンから単離された抽出物とに端を発する可溶性化合物を使用して、ペーパー・
マシン条件で、好熱性ラッカーゼおよび常用の対照ラッカーゼを用いて実施した
。基質濃度は０．５％乾燥質量であり、ｐＨ７および温度７０℃であった。激し
く攪拌することにより、十分な酸素含量が反応中に確保した。反応を、ラッカー
ゼ基質として機能する芳香族および他の化合物の重合として、ゲル濾過（ＧＰＣ
）を用いてモニターした。好熱性Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼによる反応
が対照ラッカーゼよりも効果的であることが見出された。

【００８２】図１４は、ＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓおよびＴｒａｍｅｔｅｓラッカーゼが、
リグニンと抽出物とに端を発する化合物の７０℃での重合において、いかに挙動
するかを示す図である。図１４から分かるように、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓラ
ッカーゼは低分子の量を明らかに低下させている。

【００８３】実施例７Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの繊維酸化への使用化学的な脱リグニンなしに機械的に破砕したリグニン−含有繊維を好熱性Ｍ．
ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼと処理して、繊維表面のリグニンを活性化し、重
合させた。処理は、以下の条件で実施された：温度５０および７０℃、ｐＨ６、
およびラッカーゼ濃度２００ｎｋａｔ／繊維１ｇ。酸素を反応混合物へ吹き込む
ことにより、反応混合物をエアレーションした。対照はＴｒａｍｅｔｅｓｈｉ
ｒｓｕｔａ真菌から単離した常用のラッカーゼであった。処理繊維からハンドシ
ートを製造した。シートの物理的特性を測定した。結果（表２）は、Ｍ．ａｌｂ
ｏｍｙｃｅｓラッカーゼで処理した繊維から作られたシートは、対照シートと比
べて明らかに密度が高く、光散乱が少なかった。Ｔ．ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼ
で処理した繊維から作られたシートでは相当の変化が認められなかった。効果は
特に７０℃の高温で明白であり、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼはその優れ
た熱安定性により、Ｔ．ｈｉｒｓｕｔａ真菌から単離された対照ラッカーゼより
も有利に作用した。この結果から、使用した条件において、繊維の表面でリグニ
ンを重合するためにＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼを使用できると結論付け
ることができる。

【００８４】表２Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓおよびＴ．ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼで処理し
た繊維から作られるシートの密度および光散乱

【００８５】実施例８Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの繊維の脱リグニンへの使用ラッカーゼの基質範囲を拡大するために、特に、脱リグニンまたは他の間接的
な重合体の酸化に媒介物質を使用することができる。ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールを媒介物質として選択した。好熱性ラッカーゼを使用して、媒介物質補助酸
化でクラフト繊維のリグニンを分解した。反応条件は以下の通りであった：クラ
フト・パルプ、カッパー値約２９、調度４％、媒介物質含量パルプの１％、ｐ
Ｈ７に調節、温度７０℃、反応時間２時間、ラッカーゼ量５００ｎｋａｔ／ｇ、
酸素圧力（０．５ｍＰａ）。Ｔｒａｍｅｔｅｓラッカーゼが対照材料であった。
処理後、パルプをアルカリ抽出、キレート化、および一工程での過酸化水素漂白
にかけた。アルカリ抽出後に、２８０ｎｍの波長における濾液の吸光を測定する
ことにより、リグニンの溶解をモニターした。パルプからハンドシートを製造し
、ＩＳＯ白色度、およびカッパー値を測定した。結果が示すように（表３）、Ｍ
．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼは試験条件で対照ラッカーゼよりも効果的に機
能する；Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼは対照ラッカーゼよりも、シートの
カッパー値を低下させ（リグニンの量）、濾液の吸光度（２８０ｎｍ）を上昇さ
せる。

【００８６】表３ＬＱ−Ｅ−Ｐシークエンスによるクラフト・パルプ（κ２９）の漂白能
に関するＬＭ処理の効果

【００８７】実施例９Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの遺伝子およびｃＤＮＡの単離全ＤＮＡをＲａｅｄｅｒおよびＢｒｏｄａ（１９８５）に従って細胞から単離
した。ゲノム・ライブラリーを、市販の反応パッケージを用い（ＳｕｐｅｒＣｏ
ｓＩＣｏｓｍｉｄＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、製造
者の指示に従って構築した。ＤＮＡ１００μｇを、３７℃で１０分インキュベー
トすることにより、Ｓａｕ３ＡＩ制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ）５Ｕで部分的に切断した。消化したＤＮＡをＣＩＡＰ（ＣａｌｆＩｎ
ｔｅｓｔｉｎａｌＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｆｉｎｎｚｙ
ｍｅｓ）２０Ｕで脱ホスホリル化した。異なる長さのＤＮＡ分子を、温度２０℃
および回転速度２２０００ｒｐｍで２２時間超遠心することにより（Ｂｅｃｋｍ
ａｎＳＷ４１ＴＩローター）、１５〜３０％スクロース勾配で分離した。
１２ｍｌスクロース勾配を３００μｌフラクションに分割し、各第２フラクショ
ン１０μｌを０．５％のアガロースゲル上で電気泳動により試験した。ゲル電気
泳動に基づいて２０キロベースペア以上の長さのＤＮＡフラグメントを含むフラ
クションを合わせ、ＤＮＡを、エタノールを用いてそこから沈澱させた。得られ
たＤＮＡ（約２μｇ）を、ＸｂａＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ
）で消化したＳｕｐｅｒＣｏｓＩコスミドベクター（約１μｇ）に挿入し、
その後ＣＩＡＰで脱ホスホリル化し、最後にＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
を用いて、混合物を４℃で一晩インキュベートすることにより、リゲーション（
結さつまたは連結反応）を行った。リゲーション混合物を、市販の反応パッケー
ジ（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃ
ｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、製造者の指示に従ってλ粒子へパックし、
パックされたファージを使用してＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に感染させた（ＸＬ１−
ＢｌｕｅＭＲ株、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。１回のリゲーションで５×１０^６を上回るクローンが得られ、これは典型的なジーン・バンクと見なすことができ
る。

【００８８】ジーン・バンクのスクリーニングのためのハイブリダイゼーション・プローブ
は、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａ真菌のｌａｃ２遺伝子から得られた
。Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼのＮ−末端アミノ酸配列および内部ペプチ
ドはＰ．ａｎｓｅｒｉｎａラッカーゼのアミノ酸配列と相同であったことから、
この遺伝子をプローブとして選択した。Ｐ．ａｎｓｅｒｉｎａ真菌を、図１に記
載した基質上で増殖させた。市販の反応パッケージ（ＥａｓｙＤＮＡＫｉｔ
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、増殖３日後に回収し
凍結乾燥させた菌糸体からゲノムＤＮＡを単離した。ｌａｃ２遺伝子を、ｌａｃ
２遺伝子の公表配列に基づくプライマー：５’−ＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＧＣ
ＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）（フォワード）および
５’−ＧＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：４）（リバース）を用いて、ＰＣＲ反応により増幅した。増幅に利用
したＰＣＲプログラムは２６サイクルを含み、温度プログラムは以下の通りであ
った：ＤＮＡの変性９４℃で４５秒、プライマーの挿入５５℃で１分、ＤＮ
Ａ鎖のポリメラーゼによる伸長７２℃で２．５分。最後に、鎖を７２℃で５分
伸長した。得られた約１．９キロベースペア長さのフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動により精製した。そのプローブとしての挙動をＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅ
ｓ真菌のゲノムＤＮＡを用いてサザン・ハイブリダイゼーションにより以下のよ
うに試験した：２種の異なる反応において、ＤＮＡ４０μｇをＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）８０Ｕ
により、３７℃で５時間切断した。フラグメントを０．８％アガロースゲル上で
の電気泳動により分離し；ＤＮＡを変性し、ＨｙｂｏｎｄＮメンブレイン（
ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）（方法はＳａｍｂｒ
ｏｏｋ等、１９８９に記載）上に移動した。Ｐ．ａｎｓｅｒｉｎａｌａｃ２遺
伝子をα^３２Ｐ−ｄＣＴＰにより、市販の反応パッケージを使用して（Ｒａｎｄ
ｏｍｐｒｉｍｅｄＤＮＡｌａｂｅｌｌｉｎｇｋｉｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、製造者の指示に従って標識し、プローブの結合を４
種の異なるハイブリダイゼーション温度で試験した：４８、５０、５５および６
０℃。ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ
ＨｅｒｒｉｎｇＳｐｅｒｍＤＮＡ（ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌおよ
び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ７．０である）を含有した。
ハイブリダイゼーションは、約５×１０^５ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを含有し
た。ハイブリダイゼーション後、メンブレインを、０．１％ＳＤＳを含有する２
×ＳＳＣ中で５分間室温で２回、その後、ハイブリダイゼーションと同一温度で
３０分間洗浄した。メンブレインを、フィルムを有する露光カセット中に入れる
と、露光されたフィルムは、Ｐ．ａｎｓｅｒｉｎａｌａｃ２遺伝子が、約４．
５キロベースペアの長さのＥｘｏＲＩ酵素で切断されたＤＮＡフラグメントとハ
イブリダイズしたことを示した。

【００８９】得られたゲノム・ジーン・バンクからの約５×１０^５のクローンをアガープレ
ート上に置き、一晩増殖させたクローンをニトロセルロースメンブレインへ移動
した（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）。コロニ
ーに含まれるＤＮＡを変性し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）、次いで８０℃
で２時間加熱してメンブレインに付着させた。ＤＮＡの付着後、バクテリアコロ
ニーの残留物を４８℃で、洗浄流（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）でゴシゴシ
洗浄することにより、メンブレインから洗い流した。メンブレインに結合したＤ
ＮＡを５７℃の温度で、α−^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したＰ．ａｎｓｅｒｉｎａ
ｌａｃ２遺伝子と一晩ハイブリダイズした（ハイブリダイゼーション溶液は、
前記と同様）。得られたハイブリダイゼーション・シグナルに基づいて、幾つか
のコロニーを最初のプレートから採取し、そのコロニーへＰ．ａｎｓｅｒｉｎａ
ｌａｃ２遺伝子をハイブリダイズさせた。これらのコロニーをさらにＰ．ａｎ
ｓｅｒｉｎａｌａｃ２遺伝子とハイブリダイズし、放射線シグナルに基づいて
、更なる試験用に６個のコロニーを選択した。コスミド（プラスミド精製プロト
コール、Ｔｉｐ−５００、ＱＩＡＧＥＮ）をそれらから単離した。このコスミド
からラッカーゼ遺伝子を単離することを可能にする制限酵素を、１９種の異なる
制限酵素でコスミドを切断することにより探索した。得られたフラグメントを、
Ｐ．ａｎｓｅｒｉｎａｌａｃ２遺伝子を用いて、前記のように５７℃の温度で
サザン・ハイブリダイゼーションにかけた。約４．５キロベースペアの長さのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを再度ｌａｃ２遺伝子でハイブリダイズした。コスミドを
ＥｃｏＲＩで切断し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製した。
得られたフラグメントをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁻（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）に挿入し、プラスミドをエレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌ
ｉ宿主細胞に形質転換した（株ＤＨ５α、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）。形質転換から
ｐＬＬＫ１プラスミド中に所望のＥｃｏＲＩフラグメントを含有するクローンを
得た。ラッカーゼ遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、こ
のプラスミドから配列決定した。配列決定反応は、市販の反応パッケージ（ＤＮ
ＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅＴｅｒｍｉｎａｔ
ｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ、Ｐ
ＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造者の指示に従って実施された。

【００９０】Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼ遺伝子に含まれるイントロンを定めるため
に、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼに対応する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、
市販の反応パッケージ（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（商標）ＲＬＭ−ＲＡＣＥ
Ｋｉｔ、ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．）を用い、製造者の指示に従って、ＲＡＣＥ−
ＰＣＲによりクローン化した。ＲＮＡを、市販の反応パッケージ（ＴＲＩＺＯＬ
（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、
製造者の指示に従って、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ細胞から単離した。ＲＮＡを脱
ホスホリル化し、逆転写酵素を用いてＤＮＡに転写し、その後遺伝子の５’およ
び３’末端を別個のＰＣＲ反応により、製造者の指示に従って増幅した。両ｃＤ
ＮＡ末端の増幅を、異なるプライマーを用いて二連のＰＣＲ反応により実施した
。最初の反応では、ラッカーゼｃＤＮＡの所望の部分を、遺伝子特異的プライマ
ーを用いて増幅し、第２の反応では別の遺伝子特異的プライマーを用いてラッカ
ーゼｃＤＮＡの増幅を保証した。各ＰＣＲ反応において、ＤＮＡの増幅に必要な
プライマーの１つはＲＬＭ−ＲＡＣＥＫｉｔ反応パッケージに由来し、それを
ｃＤＮＡの末端に連結したアダプター領域に結合した。増幅のために使用される
ＰＣＲプログラムは３５サイクルを含み、温度プログラムは以下の通りであった
：ＤＮＡの変性９４℃で３０秒、プライマーの挿入６０〜６２℃で３０秒、
ＤＮＡ鎖の伸長７２℃で２分。５’末端を増幅する際のプライマーの挿入温度
は６０℃であり、３’末端の場合は６２℃であった。最後に、鎖伸長を７２℃で
７分実施した。５’末端の増幅に使用する遺伝子特異的プライマーは以下の通り
であった：第１のＰＣＲ反応において、５’−ＧＣＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＡ
ＧＴＣＧＡＴＧＡＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、および第２反応におい
て、５’−ＡＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＣ−３’（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：６）であった。３’末端の増幅のために使用される遺伝子特異
的プライマーは以下の通りであった：第１ＰＣＲ反応において５’−ＣＴＧＧＴ
ＧＣＡＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、お
よび第２反応において、５’−ＡＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴ
−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）であった。ＲＬＭ−ＲＡＣＥ反応により、１
１９４ベースペア長さのフラグメントが５’末端から、１３２２ベースペア長さ
のフラグメントが３’末端から得られた。フラグメントをアガロースゲル電気泳
動により単離し、市販の反応パッケージ（ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫ
ｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、ｐＣＲ２．１−
ＴＯＰＯ（商標）ベクターにクローン化した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ宿主細
胞（株ＴＯＰ１０Ｆ’、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ、反応パッケージの指示に従
ってエレクトロポレーションにより形質転換した。クローン化フラグメントを配
列決定し、Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの遺伝子中のイントロンの位置を
、得られたｃＤＮＡをゲノム配列と比較することにより決定した。遺伝子のゲノム配列を、図１５Ａ及びＢに示す。イントロンには下線が引かれ
ている。

【図面の簡単な説明】

【図１】振とうフラスコ培養でのＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの製造を示す図で
ある。

【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーの種々のフラクションの、ラッカーゼ活性お
よびタンパク質含量を示す図である。

【図３】疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々のフラクションの、ラッカーゼ活性
およびタンパク質含量を示す図である。

【図４】Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼ活性の温度に対する依存性を示す図である
。

【図５】種々のｐＨ値におけるＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの活性を示す図であ
る。

【図６】種々の温度におけるＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの残留活性を示す図で
ある。

【図７】種々の温度における純粋なＭ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼの残留活性を示
す図である。

【図８】２２時間のインキュベーションの後の、種々のｐＨ値での、Ｍ．ａｌｂｏｍｙ
ｃｅｓラッカーゼの残留活性を示す図である。

【図９】４０℃および種々のｐＨ値で、２，６−ジメトキシフェノールからＭ．ａｌｂ
ｏｍｙｃｅｓおよびＴ．ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼが色彩を形成する能力を示す
図である。ラッカーゼの量は基質１ｍｍｏｌに対して１５ｎｋａｔであった。

【図１０】６０℃および種々のｐＨ値で、２，６−ジメトキシフェノールからＭ．ａｌｂ
ｏｍｙｃｅｓおよびＴ．ｈｉｒｓｕｔａラッカーゼが色を生成する能力を示す図
である。ラッカーゼの量は、基質１ｍｍｏｌに対して３０ｎｋａｔであった。

【図１１】ＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓおよびＴｒａｍｅｔｅｓラッカーゼの影響下での繊
維製品の脱色を示す図である。

【図１２】４０℃でのＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓおよびＴｒａｍｅｔｅｓの影響下でのリ
グニンモデル基質の重合を示す図である。

【図１３】６０℃でのＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓおよびＴｒａｍｅｔｅｓの影響下でのリ
グニンモデル基質の重合を示す図である。

【図１４】７０℃でのＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓおよびＴｒａｍｅｔｅｓラッカーゼの影
響下に、リグニンおよび抽出物中で発生する可溶性化合物の重合を示す図である
。

【図１５Ａ】Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼをコードする遺伝
子、および対応するアミノ酸配列を示す図である。

【図１５Ｂ】Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼをコードする遺伝
子、および対応するアミノ酸配列を示す図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｓ 11/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者レット，マーヤーナフィンランド，ＦＩＮ−01690 ヴァンター，スュィラキンクヤ９ (72)発明者ヴィイカリ，リイザフィンランド，ＦＩＮ−00200 ヘルシンキ，ロッキクヤ５Ｆ (72)発明者サロヘイモ，マルックフィンランド，ＦＩＮ−00390 ヘルシンキ，キュンテイェンティエ 18 ｂＦターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 CA09 CA20 DA06 DA11 DA12 EA04 EA06 GA14 HA03 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 DD03 EE01 FF05E FF09E FF11E HH02 LL05 LL10 4B065 AA26X AA58X AA58Y AA72X AB01 AC14 BA03 BB03 BB15 BB29 BB40 BC03 BC09 BD14 CA28 CA52 CA56 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】メカノカルプス（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）属の株から単
離でき、酵素の最適ｐＨが５〜８の範囲であり、酵素がｐＨ３〜９かつ温度３０
〜８０℃で機能することを特徴とするラッカーゼ酵素。
【請求項２】Ｍ．アルボマイセス（Ｍ．ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）株から単離
できることを特徴とする、請求項１に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項３】酵素の最適ｐＨが６〜８の範囲であることを特徴とする請求
項１または２に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項４】酵素が温度５０〜８０℃で最も良く機能することを特徴とす
る請求項１乃至３のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項５】酵素の最適ｐＨが約７．５であり、最適温度が約７０℃であ
ることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項６】酵素の活性が、実質的に６０℃で２時間変化せずに維持され
ることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項７】精製酵素の等電点が等電点電気泳動で測定して約４．０であ
り、その分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約８０ｋＤａであることを特徴と
する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のラッカーゼ酵素。
【請求項８】単離しかつ精製したＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓラッカーゼ酵
素、好ましくはメカノカルプス・アルボマイセス（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ
ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）ラッカーゼ酵素。
【請求項９】主活性としてＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓラッカーゼ、好まし
くはＭｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓａｌｂｏｍｙｃｅｓラッカーゼ酵素を含有する
ことを特徴とする、酵素製品。
【請求項１０】請求項１乃至９のいずれか１項に記載のラッカーゼを、Ｍ
ｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株がそれらの培養液中に天然に産生するラッカーゼ
よりも多量に含有することを特徴とする酵素製品。
【請求項１１】酵素の最適ｐＨが５〜８の範囲であり、酵素がｐＨ３〜９
かつ温度３０〜８０℃で機能することを特徴とする請求項９または１０に記載の
製品。
【請求項１２】酵素の等電点が等電点電気泳動で測定して約４．０であり
、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約８０ｋＤａであることを特徴とする請
求項９乃至１１のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１３】核酸分子が、以下の群：ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示されるヌクレオチド配
列のコード領域を含む核酸分子；ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードする核酸分子；ｃ）遺伝暗号の縮退によりＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示
されるコード配列とは異なるコード配列を含む核酸分子；ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示されるヌクレオチド配
列とハイブリダイズする核酸分子；およびｅ）ラッカーゼ活性を有しかつそのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２ま
たは図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列と少なくとも７３％同一であるポリ
ペプチドをコードする核酸分子；から選択されることを特徴とするラッカーゼ酵素活性を有するポリペプチドを
コードする核酸分子。
【請求項１４】ポリペプチドのアミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２
または図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるこ
とを特徴とするラッカーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
。
【請求項１５】核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及び
Ｂに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを特徴とする請
求項１３または１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及び
Ｂに示されるヌクレオチド配列のコード領域を含むことを特徴とする請求項１３
乃至１５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１７】核酸分子が請求項１乃至８のいずれか１項に記載の酵素を
コードすることを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の核酸分
子。
【請求項１８】請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の核酸分子を含
むことを特徴とするベクター。
【請求項１９】請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の核酸分子また
は請求項１８に記載のベクターが移入されたことを特徴とする微生物宿主。
【請求項２０】宿主が糸状菌、酵母またはバクテリアであることを特徴と
する、請求項１９に記載の宿主。
【請求項２１】宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリ
コデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属
に属することを特徴とする、請求項１９または２０に記載の宿主。
【請求項２２】請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の核酸分子また
は請求項１８に記載のベクターを微生物宿主細胞に移入し；核酸分子を発現し、場合により、宿主からそれを分泌させ；および微生物宿主の細胞または培養液からラッカーゼ活性を有するポリペプチドを回
収することを特徴とするラッカーゼの製法。
【請求項２３】ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示さ
れるヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードする核酸分子；ｃ）遺伝暗号の縮重によりＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示
されるヌクレオチド配列のコード配列とは異なるコード配列を含む核酸分子；ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１または図１５Ａ及びＢに示されるヌクレオチド配
列とハイブリダイズする核酸分子；およびｅ）ラッカーゼ活性を有しかつそのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２ま
たは図１５Ａ及びＢに示されるアミノ酸配列と少なくとも７３％同一であるポリ
ペプチドをコードする核酸分子からなる群より選択される核酸分子によってコードされることを特徴とするラ
ッカーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２４】ポリペプチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２または図１５Ａ
及びＢに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含
有することを特徴とする、ラッカーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２５】主活性として、ラッカーゼ活性を有する請求項２３または
２４に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする酵素製品。
【請求項２６】ラッカーゼ活性を有する請求項２２または２３に記載のポ
リペプチドを、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ属の株がその培養液中に天然に産生す
るポリペプチドよりも多量に含有することを特徴とする、酵素製品。
【請求項２７】ラッカーゼを１０ｍｇ／ｌより多く、好ましくは≧３０ｍ
ｇ／ｌ含有することを特徴とする請求項９乃至１２、２５または２６のいずれか
１項に記載の酵素製品。
【請求項２８】少なくとも１種の添加物、例えば安定剤および／またはバ
ッファーを含有することを特徴とする請求項９乃至１２、２５乃至２７のいずれ
か１項に記載の酵素製品。
【請求項２９】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されるラッカーゼの、着色剤を酸化するための使用。
【請求項３０】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されるラッカーゼの、化合物を重合するための使用。
【請求項３１】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されるラッカーゼの、繊維を酸化するための使用。
【請求項３２】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されるラッカーゼの、繊維を脱リグニンするための使用。
【請求項３３】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されるラッカーゼの、ペーパー・マシンの作動性を改善するための使用。
【請求項３４】十分量の酸素の存在で、着色剤を、請求項１乃至８のいず
れか１項に記載のラッカーゼ、請求項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか
１項に記載の酵素製品、または請求項２３または２４に記載のポリペプチド、ま
たは請求項２２に記載の製法により製造されたラッカーゼと、ｐＨ４〜８、温度
４０〜８０℃、５分〜２４時間で、着色剤１ｇに対して約１〜１０００ｎｋａｔ
のラッカーゼ量で接触させることを特徴とする着色剤の酸化法。
【請求項３５】十分量の酸素の存在で、重合すべき化合物を、請求項１乃
至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求項９乃至１２または２５乃至２８
のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求項２３または２４に記載のポリペ
プチド、または請求項２２に記載の製法により製造されたラッカーゼと、ｐＨ４
〜８、温度４０〜８０℃、５分〜２４時間で、重合すべき物質１ｇに対して約１
〜１０００ｎｋａｔのラッカーゼ量で接触させることを特徴とする化合物の重合
法。
【請求項３６】十分量の酸素の存在で、酸化すべき繊維を、請求項１乃至
８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求項９乃至１２または２５乃至２８の
いずれか１項に記載の酵素製品、または請求項２３または２４に記載のポリペプ
チド、または請求項２２に記載の製法により製造されたラッカーゼと、ｐＨ５〜
８、温度５０〜８０℃、５分〜２４時間で、乾燥状態の繊維１ｇに対して約１〜
１０００ｎｋａｔのラッカーゼ量で接触させることを特徴とする繊維の酸化法。
【請求項３７】十分量の酸素の存在で、脱リグニンすべき繊維を、請求項
１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求項９乃至１２または２５乃至
２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求項２３または２４に記載のポ
リペプチド、または請求項２２に記載の製法により製造されたラッカーゼと、ｐ
Ｈ５〜８、温度５０〜８０℃、５分〜２４時間で、乾燥状態の繊維１ｇに対して
約１〜１０００ｎｋａｔのラッカーゼ量で接触させることを特徴とする繊維の脱
リグニン法。
【請求項３８】請求項１乃至８のいずれか１項に記載のラッカーゼ、請求
項９乃至１２または２５乃至２８のいずれか１項に記載の酵素製品、または請求
項２３または２４に記載のポリペプチド、または請求項２２に記載の製法により
製造されたラッカーゼを、プロセス水またはペーパー・マシンのヘッドボックス
中へ、乾燥状態の繊維１ｇまたは循環水１リットルに対し１〜１０００ｎｋａｔ
で添加することを特徴とする、ペーパー・マシンの作動性を改善する方法。
【請求項３９】必要に応じて、媒介物質をその方法に使用することを特徴
とする請求項３４乃至３８のいずれか１項に記載の方法。