DE60128091T2

DE60128091T2 - Laccase enzym und dafür kodierendes gen

Info

Publication number: DE60128091T2
Application number: DE60128091T
Authority: DE
Inventors: Kristiina Kruus; Laura-Leena Kiiskinen; Marjaana Rättö; Liisa Viikari; Markku Saloheimo
Original assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Current assignee: Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: AU2001262389A1; CN1430668A; CN100510064C; FI113879B; PT1294859E; BR0111040A; MXPA02011572A; DE60128091D1; US7183090B2; EP1294859B1; CA2409007C; ES2284650T3; EP1294859A1; JP2003534795A; HK1054573A1; ATE360684T1; CA2409007A1; WO2001092498A1; DK1294859T3; FI20001240A

Description

Die Erfindung betrifft neue Laccaseenzyme. Der Gegenstand der Erfindung ist ein neues Laccaseenzym, eine Enzymzubereitung und ein Gen, welches das entsprechende Enzym kodiert. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Laccase in verschiedenen Anwendungen.
Laccasen (EC 1.10.3.2) gehören zu den Blau-Kupfer-Oxidasen. Gemäß einer Definition sind Laccasen p-Diphenol-Oxidasen. Zusätzlich zu Diphenolen oxidieren Laccasen viele andere Substrate wie methoxysubstituierte Phenole und Diamine. In Bezug auf ihre Substrate sind Laccasen erstaunlich unspezifisch. Nämlich wegen ihrer breiten Substratspezifität und auf der anderen Seite aufgrund ihrer Fähigkeiten, phenolische Verbindungen zu oxidieren, haben Laccasen großes Interesse bei industriellen Anwendungen geweckt. Viel versprechende Gebiete zur Anwendung von Laccasen schließen zum Beispiel die Delignifizierung und das Kleben von Faserplatten der Holzindustrie, das Färben von Stoffen und das Entgiften von Färbeabwässern in der Textilindustrie, sowie die Verwendung in zahlreichen Biosensoren ein. Mit der Hilfe von Mediatoren, d. h. zwischengeschalteten Molekülen, können Laccasen auch Substrate oxidieren, die sie sonst nicht in der Lage wären zu oxidieren. Die Mediatoren sind Small Molecule Compounds, die durch Laccasen oxidiert werden. Der oxidierte Mediatoren oxidiert dann wiederum das tatsächliche Substrat.
Die erste Laccase wurde bereits 1883 im japanischen Lackbaum (Rhus vernicifera) gefunden. Laccasen fanden sich in vielen Pflanzen wie Pfirsich, Tomate, Mango und Kartoffel; Laccasen fanden sich auch in einigen Insekten. Die am bekanntesten gewordenen Laccasen stammen jedoch aus dem Weissfäulepilz. Die folgenden Arten produzieren z. B. Laccase: Agaricus, Aspergillus, Cerrena, Curvularia, Fusarium, Lentinius, Monocillium, Myceliophtora, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Schizophyllum, Sporotrichum, Stagonospora und Trametes. In der Natur steht die Arbeitsweise der Laccasen unter anderem mit der Dekompostierung von Lignozellulose, der Biosynthese von Zellwänden, dem Braunwerden von Früchten und Gemüsen, sowie der Vorbeugung gegen mikrobische Angriffe auf Pflanzen in Verbindung.
Zahlreiche Pilzlaccasen wurden isoliert und einige Gene, die diese kodieren, wurden geklont. Zum Beispiel isolierten und charakterisierten Saloheimo et al. (1985) das Laccasegen von Phlebia radiata, sowie Kojima et al. (1990) das Laccasegen des Coriolus hirsutus des Weissfäulepilzes und Berka et al. (1997), WO 95/33836 , das Gen der Myceliophtora thermophila Laccase. Die natürlichen Produktionsmengen der Laccasen sind oft sehr niedrig. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Produktion zu erhöhen, indem Laccasegene in fremden Produktionswirten exprimiert wurden. Zum Beispiel gelang es Saloheimo und Niku-Paavola (199; WO 92/01046 ), die Phlebia radiata Laccase in dem Pilz Trichoderma reesei erfolgreich zu produzieren. Laccasen wurden auch heterolog in Aspergillus oryzae Pilzen (Yaver et al., 1996, Berka et al., 1997 und WO 95/33836 ) und in Pichia Pastoris Hefen (Jönsson et al, 1997) hergestellt.
Die Expression einer Laccase, die aus der Coprinus Gattung und dem Pilz der Aspergillus Gattung stammt, wurde in der Patentveröffentlichung WO 97/08325 beschrieben. In ähnlicher Weise wurde die Expression der Laccase, die aus der Polyporus pinsitus Art stammt, und die Laccase, die aus der Scytalidium Gattung stammt, in dem Pilz der Aspergillus Gattung in der Patentveröffentlichung US 5,770,418 und US 5,843,745 beschrieben.
Die Temperatur- und pH-Eigenschaften der Laccasen, die aus verschiedenen Organismen isoliert wurden, unterscheiden sich erheblich voneinander. Sie sind ebenfalls abhängig von dem verwendeten Substrat. Da die Mehrheit der bekannten Laccasen am besten bei einem sauren pH und verhältnismäßig niederen Temperaturen funktionieren, sind deren Eigenschaften nicht optimal für die Anwendung. Es wurde von einigen thermostabilen oder neutralen Laccasen berichtet, jedoch sind die thermostabilen oder neutralen Laccasen üblicherweise entweder thermostabil oder neutral, nicht beides. Zum Beispiel fanden Heinzkill et al. (1998) Laccasen mit einem ungewöhnlich hohen pH-Optimum aus den Pilzen der Coprinaceae Familie. Die Aktivität all dieser gefundenen Laccasen verminderte sich jedoch in 60 Minuten auf unter 30 % des Anfangsniveaus bei 60 °Celsius. Es wurde ein Patent ( WO 96/06930 ) für die Verwendung dieser Laccasen beim Bleichen von Textilfarben angemeldet, jedoch erwähnt die Anmeldung keine Aktivität dieser Laccasen bei hohen Temperaturen. Die Beispiele der Anmeldung wurden bei Temperaturen von 30 bis 35 °C durchgeführt. Die Patentanmeldung WO 95/07988 beschreibt eine neutrale Laccase des Pilzes Rhizoctonia solani, jedoch untersucht die Anmeldung nicht die Aktivität dieser Laccase bei hohen Temperaturen und zusätzlich zu den alkalischen Bedingungen. Auf der anderen Seite beschreibt die Patentanmeldung WO 98/55628 eine thermostabile Laccase aus dem Trametes versicolor TV-1 Stamm, welche gemäß des Patentes die beste Aktivität bei pH 2 hat. Die Trametes versicolor TV-1 Laccase ist außerdem nicht pH-stabil; die Restaktivität bei pH 6 nach 60 Minuten Inkubationszeit beträgt etwa 60 % der ursprünglichen. Die Patentanmeldung WO 95/33836 beschreibt eine neutrale Myceliophtora thermophila Laccase, die beim Haarefärben bei pH 7 arbeitet, wobei jedoch die Anwendungstemperatur des Beispiels 30 °C war. Die Veröffentlichung von Berka et al. (1997) berichtet, dass die Myceliophtora thermophila Laccase 100 % ihrer Aktivität bei 60 °C für 20 Minuten behält und ihr Aktivitätsoptimum bei pH 6,5 hat.
Die Patentveröffentlichungen JP 8070861 und JP 9056378 beschreiben Trametes Laccasen, über die berichtet wurde, dass sie thermostabil sind und ihr pH-Optimum bei 5,0 haben. Zusätzlich haben Diamantidis et al. (2000) eine bakterielle Laccase aus Azospirillum lipoferum Bakterien charakterisiert. Sie berichteten, dass die Laccase für 10 Minuten bei 70 °C thermostabil war und das pH-Optimum bei 6,0 hatte.
Die Veröffentlichung von Bharathi und Ramalingam (1993) beschreibt die Phenoloxidaxe einer Muschel, deren maximale Aktivität bei pH 6,8 ist und bei der über 50 % ihrer Aktivität erhalten blieben, sofern sie für 10 Minuten bei 60 °C inkubiert wurde. Die Patentveröffentlichung EP-A1-0852260 beschreibt Polyphenoloxidasen aus Arten der Myrothecium Gattung, deren pH-Optimum bei 8,5 bis 9 ist und deren Temperaturoptimum bei 60 bis 70 °C liegt. Es ist bekannt, dass die Pilze der Myrothecium Gattung Toxine produzieren.
Wenn man die Temperatur und pH-Optima, die für verschiedene Enzyme bestimmt wurden, vergleicht, sollte erwähnt werden, dass das verwendete Substrat Auswirkungen auf die Werte hat. Phenolische Substrate wie Guaiacol und Syringaldazin liefern höhere Werte als nichtphenolische Substrate wie etwa ABTS.
Die folgenden Patentveröffentlichungen schlagen die Verwendung von Laccasen in holzverarbeitenden Anwendungen vor: WO 99/54545 , US 5,691,193 , DE 4137761 , EP 408803 und WO 95/23232 . WO 97/19999 offenbart eine Laccase mit verbesserten Färbeeigenschaften.
Es ist der Zweck dieser Erfindung, Nachteile des Standes der Technik auszuräumen und eine neue Art der Enzymzubereitung, die Laccaseaktivität enthält, bereitzustellen. Insbesondere kann die Enzymzubereitung in Anwendungen eingesetzt werden, welche sowohl hohe Temperaturen als auch einen hohen pH tolerieren müssen. Solche Anwendungen finden sich z. B. in der holzverarbeitenden Industrie und anderen verarbeitenden Industrien.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Laccase vor, die sowohl bessere Temperatur- wie bessere pH-Eigenschaften und insbesondere bessere thermische Stabilität in Anwendungen hat, die einen neutralen oder alkalischen pH und eine Temperatur von über 40 °C erfordern, als bekannte Laccasen.
Genauer ausgedrückt ist der Gegenstand der Erfindung das Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 1 und das Polypeptid gemäß Anspruch 15.
Das Laccaseenzym gemäß der Erfindung kann aus den Stämmen der Melanocarpus Gattung isoliert werden. Soweit es uns bekannt ist, wurde bislang keine Laccase, die aus den Stämmen der Melanocarpus Gattung isoliert wurde, früher schon beschrieben. Die erfindungsgemäße Laccase kann vorzugsweise aus dem Stamm der M. albomyces Spezies isoliert werden, insbesondere aus dem IMI 255989 Stamm, von welchem Proben bei CABI Bioscience UK Zentrum CABI GRC Stammsammlung (Egham) (Bakeham Lane Egham Surrey DW20 9Ty, UK) frei erhältlich sind. Der Stamm wurde in 1981 in der Sammlung hinterlegt. In 1996 wurde der Stamm auch in der Culture Collection der VTT Biotechnology (Technical Research Centre of Finnland VTT unter der Adresse: VTT Biotekniikka, PL 1500, 02044 VTT, Espoo, Finnland) hinterlegt und erhielt die Nummer VTT-D-96490. Proben dieser Hinterlegung sind ebenso frei erhältlich. Der Stamm wird in der Veröffentlichung von Ravanko (1996) beschrieben, welche die Laccaseaktivität der Kulturlösung des Stammes bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten untersuchte. Die Publikation beschreibt jedoch nicht die Isolation und Aufreinigung der Laccase.
Das Laccaseenzym gemäß der Erfindung arbeitet über einen pH-Bereich von 3-9, vorzugsweise 4-8, weiter vorzugsweise 5-8, noch weiter vorzugsweise 6-8, noch weiter vorzugsweise 6,5-7,5. Die Laccaseaktivität ist am höchsten über einem pH-Bereich von 7 bis 8, mit einem Höchstwert bei etwa 7,5. Der optimale pH-Bereich des Enzyms ist demnach ziemlich breit und reicht über einen pH von 5-7,5; vorzugsweise ist das pH-Optimum bei 7,5. Die Aktivität des Enzyms ist am höchsten zwischen 30-80 °C, vorzugsweise zwischen 40-80 °C, weiter vorzugsweise zwischen 50-80 °C, noch weiter vorzugsweise zwischen 60-80 °C, noch weiter vorzugsweise zwischen 60-70 °C. Die optimale Enzymaktivität stellt sich bei einer Temperatur von etwa 70 °C ein.
Die Laccase gemäß der Erfindung behält ihre Aktivität bei hohen Temperaturen gut bei. Bei den in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen bleiben mehr als 50 % der Laccaseaktivität der Kulturlösung nach einer Inkubation bei 60 °C für eine Stunde erhalten. Nach einer Inkubation bei 70 °C für 15 Minuten bleiben etwa 30 % der Enzymaktivität erhalten und nach einer Inkubation bei 70 °C für 30 Minuten etwa 10 %. Unter den Bedingungen, die in Beispiel 3 beschreiben sind, übersteht das Enzym eine Inkubation bei 80 °C für etwa 5 Minuten. In einigen Anwendungen, z. B. in der Forstindustrie, stellen auch Toleranzen für kurze Zeit bei hohen Temperaturen einen erheblichen Vorteil dar. Beim weiteren Studium der Aktivität des reinen Enzyms wurde festgestellt, dass die thermische Stabilität des Enzyms ausgesprochen gut war und deutlich besser als jene von bisher beschriebenen Laccasen. Bei 60 °C behielt das Enzym seine Aktivität im Wesentlichen unverändert für 2 Stunden bei, wie es in Beispiel 3 und 7 gezeigt ist. Die thermische Stabilität der Myceliophtora Laccase, die von Berka et al. (1997) charakterisiert wurde, bleibt bei 60 °C nur für 20 Minuten erhalten.
Darüber hinaus verbessert sich die pH-Stabilität des Laccaseenzyms gemäß der Erfindung, wenn der pH ansteigt. Nach einer 22-stündigen Inkubation bei pH 4 ist die Restaktivität 65 %, die Restaktivität unter denselben Bedingungen bei pH 5 ist etwa 80 %, die Restaktivität bei pH 6 ist etwa 85 %, die Restaktivität bei pH 7 ist etwa 90 % und bei pH 8 sogar über 90 %, etwa 92 %. Zusammen mit dem pH-Optimum sorgt diese Eigenschaft für einen vorteilhaften Einsatz des Enzyms gemäß der Erfindung bei hohen pH-Werten.
Der isoelektrische Punkt der Laccase gemäß der Erfindung ist etwa 4,0, wenn er durch isoelektrische Fokussierung gemessen wurde, wobei die definitionsgemäße Genauigkeit bei +/– 0,5 liegt.
Das Molekulargewicht der Laccase gemäß der Erfindung liegt bei 80 kDa, mittels SDS-PAGE bestimmt. Die definitionsgemäße Genauigkeit des SDS-PAGE ist in einer Größenordnung von +/– 5 kDa.
Die Laccase gemäß der Erfindung hat, sofern sie gereinigt ist, einen isoelektrischen Punkt bei etwa 4,0, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung und ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa. Das pH-Optimum der Laccase ist bei etwa 7,5 und das Temperaturoptimum bei etwa 70 °C, sofern es für ein gereinigtes Enzym gemessen wird. Die Laccase kann aus den Stämmen der Melanocarpus Gattung isoliert werden, vorzugsweise den Stämmen der Melanocarpus albomyces Art, weiter vorzugsweise aus dem Stamm M. albomyces IMI 25598. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes und gereinigtes Laccaseenzym.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Enzymzubereitung, welche das Laccaseenzym gemäß der Erfindung enthält. Die Menge des Laccaseenzyms in der Enzymzubereitung ist vorzugsweise höher als die der Stämme der Melanocarpus Gattung, insbesondere die der Stämme der Melanocarpus albomyces Arten und insbesondere höher als die Menge des Enzyms, welche natürlicherweise von M. albomyces IMI 255989 in Kulturlösung unter Wachstumsbedingungen produziert wird, die nicht für die Laccaseproduktion optimiert sind. Die Menge der Laccase in der Enzymzubereitung ist vorzugsweise über 10 mg/l, weiter vorzugsweise ≥ 30 mg/l, noch weiter vorzugsweise ≥ 300 mg/l, noch weiter vorzugsweise ≥ 500 mg/l; äußerst vorzugsweise ≥ 1 g/l.
Wie oben erwähnt, kann die Laccase gemäß der Erfindung aus den Stämmen der Melanocarpus Gattung, insbesondere den Stämmen der Melanocarpus albomyces Arten und insbesondere aus dem Stamm M. albomyces IMI 255989 isoliert werden. Sie kann jedoch auch mittels rekombinanter Techniken produziert werden, wobei die Gene, welche die Laccase gemäß der Erfindung kodieren, isoliert und in einen geeigneten Produktionswirt transferiert werden.
Die Laccase gemäß der Erfindung kann in Kulturlösung ihres natürlichen Wirtes oder eines Produktionswirtes hergestellt werden, aus welcher sie unter Verwendung von bekannten Verfahren der Proteinchemie isoliert und aufgereinigt werden kann. Sofern die Kulturlösung eine genügend hohe Menge der Laccase, jedoch keine anderen nachteiligen Proteine enthält, kann die Kulturlösung durch einfaches Abtrennen der Zellen als solches verwendet werden. Die Kulturlösung kann eventuell aufkonzentriert werden. In verschiedenen Anwendungen ist es vorzuziehen, eine Enzymzubereitung zu verwenden, die eine erhöhte Menge an Laccase enthält. Eine erhöhte Menge der Laccase kann durch die Produktion des Laccaseenzyms in Kulturlösung des Produktionswirtes mittels rekombinanter Technologie hergestellt werden. Die erhöhte Menge bezieht sich auf eine Menge an Laccaseenzym, welche die Menge des Laccaseenzyms, wie sie natürlicherweise durch die Stämme der Melanocarpus Art, insbesondere dem Stamm M. albomyces, insbesondere dem Stamm IMI 255989, hergestellt wird, übersteigt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Enzymzubereitung, die eine wesentliche Menge des Laccaseenzyms gemäß der Erfindung enthält. Dies bedeutet, dass die Laccase die Hauptaktivität der Enzymzubereitung darstellt, ohne jegliche beachtenswerte Mengen anderer Enzyme. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch eine Enzymzubereitung, die eine Laccase enthält, die aus den Pilzen der Melanocarpus Art isoliert werden kann und Zusätze enthält, die für die jeweilige Anwendung benötigt werden. Solche Additive können zum Beispiel Puffer und Stabilisatoren umfassen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Nukleinsäuremolekül, welches Laccase kodiert. Das Nukleinsäuremolekül wird aus der Gruppe ausgewählt, welche umfasst:

– ein Nukleinsäuremolekül, die kodierende Region der Nukleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO. 1 dargestellt ist, umfassend;
– ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO. 2 dargestellt ist, umfasst;
– ein Nukleinsäuremolekül, welches eine kodierende Sequenz umfasst, die von der kodierenden Sequenz der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO. 1 durch die Degeneration des genetischen Codes abweicht;
– ein Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Bedingungen an die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO. 1 hybridisiert;
– ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid kodiert, das Laccaseaktivität hat und dessen Aminosäuresequenz wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 aufweist.

Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuremoleküle ein, welche Polypeptide kodieren, deren Aminosäuresequenz wenigstens 85 % Identität, vorzugsweise wenigstens 90 % Identität, weiter vorzugsweise wenigstens 95 % Identität aufweisen. Es ist äußerst bevorzugt, wenn die Amino säuresequenz des Polypeptids gemäß der Erfindung wenigstens 99 % Identität mit SEQ ID NO. 2 oder der Aminosäuresequenz der 15 aufweist. Sofern die Ähnlichkeit auf der Basis von homologen Aminosäuren ermittelt wird, schließt die Erfindung Nukleinsäuremoleküle ein, welche für Polypeptide kodieren, deren Aminosäuresequenz wenigstens 83 % Homologie zu SEQ ID NO. 2 oder der Aminosäuresequenz der 15, vorzugsweise wenigstens 85 % Homologie, weiter vorzugsweise wenigstens 90 % Homologie, noch weiter vorzugsweise wenigstens 95 %, noch weiter vorzugsweise wenigstens 99 % Homologie zu SEQ ID NO. 2 oder der Aminosäuresequenz der 15 zeigt.
Die Erfindung schließt auch Nukleinsäuremoleküle ein, welche an die Sequenz SEQ ID NO. 1 unter Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, in denen die Hybridisierungslösung 6 × SSC, 5 × Denhardt's Reagenz, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierte DNA enthält und die Hybridisierung bei 50 bis 60 °C ausgeführt wird. Alternativ enthält die Hybridisierungslösung 6 × SSC, 5 × Denhardt's Reagenz, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierte DNA, 50 % Formamid und in diesem Fall wird die Hybridisierung bei 25-35 °C durchgeführt. Die Erfindung schließt solche Nukleinsäuremoleküle ein, die unter stringenten Bedingungen an die SEQ ID NO. 1 hybridisieren, wobei die Hybridisierung gemäß der ersten oben erwähnten Alternative ausgeführt wird oder mit den selben Bedingungen, jedoch bei 68 °C ausgeführt wird und gemäß der zweiten Alternative bei 42 °C. 50 × Denhardt enthält 10 g/l Ficoll, 10 g/l Polyvinylpyrrolidon, 10 g/l bovines Serum Albumin und das SSC enthält 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0.
Das Nukleinsäuremolekül bezieht sich auf DNA, RNA oder beispielsweise auf cDNA.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Polypeptide, die Laccaseaktivität haben und die durch ein wie oben definiertes Nukleinsäuremolekül kodiert werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, deren Aminosäuresequenz wie sie oben beschrieben ist, identisch oder homolog mit SEQ ID No. 2 oder der Aminosäuresequenz der 15 ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Laccase, welches die folgenden Schritte umfasst:

– ein Nukleinsäuremolekül oder ein Vektor gemäß der Erfindung wird in einen Wirtszellmikroorganismus transferiert, um das Nukleinsäuremolekül zu exprimieren und wahlweise um es aus der Wirtszelle zu sezernieren; und
– ein Polypeptid, welches Laccaseaktivität hat, zu gewinnen entweder aus den Zellen oder der Kulturlösung des Wirtsmikroorganismus.

Die Laccase gemäß der Erfindung ist außerordentlich gut geeignet für industrielle Anwendungen, bei welchen die vorherrschenden pH- und Temperaturbedingungen hoch sind. Solche Anwen dungen schließen jene der Forstindustrie ein, die Lignin oder andere Extrakte (entweder direkt oder über Mediatoren) angreifen, die Herstellung von Faserprodukten und Brettern aus mechanisch hergestelltem Lignin enthaltendem Holzschliff, die Verbesserung der Laufeigenschaften von Papiermaschinen und andere Anwendungen wie Oxidation von Polymeren, wie etwa Lignin, Zellulose und/oder Stärke (entweder direkt oder durch Mediatoren) sowie die Oxidation anderer Chemikalien wie Alkenen oder Farbmolekülen. Bei diesen Anwendungen ist die Temperatur häufig über 60 °C, normalerweise so hoch wie 80 °C und der pH ist nahezu neutral oder etwas höher. Das Enzym gemäß der Erfindung arbeitet außerordentlich gut unter Bedingungen, bei welchen der pH und die Temperatur gleichzeitig ziemlich hoch sind.
Im nachfolgenden wird die Erfindung im Detail unter zu Hilfenahme der angehängten Figuren und Beispiele beschrieben.
1 zeigt die Herstellung der M. albomyces Laccase in einer Schüttelflaschenkultur.
2 zeigt die Laccaseaktivität und den Proteingehalt von verschiedenen Fraktionen einer Anionenaustauschchromatographie.
3 zeigt die Laccaseaktivität und den Proteingehalt von verschiedenen Fraktionen einer hydrophoben Interaktionschromatographie.
4 zeigt die Abhängigkeit der M. albomyces Laccaseaktivität von der Temperatur.
5 zeigt die Aktivität der M. albomyces Laccase bei verschiedenen pH-Werten.
6 zeigt die Restaktivität der M. albomyces Laccase bei verschiedenen Temperaturen.
7 zeigt die Restaktivität einer reinen M. albomyces Laccase bei verschiedenen Temperaturen.
8 zeigt die Restaktivität der M. albomyces Laccase bei verschiedenen pH-Werten nach 22-stündiger Inkubation.
9 zeigt die Fähigkeit der M. albomyces und T. hirsuta Laccasen, Farbstoffe aus 2,6-Dimethoxyphenol bei 40 °C und verschiedenen pH-Werten zu bilden. Die Menge der Laccase betrug 15 nkat/mmol des Substrats.
10 zeigt die Fähigkeit der M. albomyces und T. hirsuta Laccasen, aus 2,6-Dimethoxyphenol bei 60° C und verschiedenen pH-Werten Farbstoffe zu bilden. Die Menge der Laccase betrug 30 nkat/mmol des Substrats.
11 zeigt die Entfärbung einer Textilfarbe unter Einwirkung von Melanocarpus und Trametes Laccasen.
12 zeigt die Polymerisierung einer Ligninmodellsubstanz unter Einwirkung der Melanocar pus und Trametes Laccasen bei 40 °C.
13 zeigt die Polymerisierung einer Ligninmodellsubstanz unter Einwirkung der Melanocarpus und Trametes Laccasen bei 60 °C.
14 zeigt die Polymerisierung von löslichen Verbindungen, die von Lignin und Extrakten abgeleitet sind unter Einwirkung der Melanocarpus und Trametes Laccasen bei 70 °C.
15 zeigt ein Gen, welches die Mekanocarpus albomyces Laccase kodiert und eine entsprechende Aminosäuresequenz.
Der Begriff „Enzymzubereitung", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf jedes Produkt, das Laccaseenzymaktivität enthält. Eine Enzymzubereitung kann z. B. eine Kulturlösung, die Laccase enthält, sein, eine isolierte Laccase oder eine Enzymmischung sein, von welcher wenigstens ein Bestandteil Laccase ist. Die Enzymzubereitung kann auch verschiedene Additive wie Stabilisatoren oder Puffer enthalten. Sie werden im Hinblick darauf ausgewählt, dass sie für die jeweilige Anwendung der Laccaseenzymzubereitung geeignet sind. Die Enzymzubereitung kann auch andere Enzymaktivitäten wie Peroxidaseaktivität in Abhängigkeit der Anwendung der Enzymzubereitung enthalten.
Die Enzymzubereitung, die Laccase enthält, kann auch einen geeigneten Mediator enthalten, der dazu eingesetzt wird, die Arbeitsweise der Laccase zu erhöhen. Geeignete Mediatoren schließen z. B. Tempo (= 2,2,6,6-Tetramethyl-1-Piperidinyloxy), HBT (= 1-Hydroxybenzotriazol), ABTS = 2,2'-Azinobis-3-Ethylbenzthiazol-6-Sulphonat, Violursäure, NHA (= N-Hydroxy-Acetanilid) mit ein.
Screening nach Mikroben, die Laccase produzieren
Mikroben, die Laccase produzieren, können aus der Natur isoliert werden oder sie können durch das Screenen unter Verwendung von Screening-Verfahren, die in der Mikrobiologie wohl bekannt sind, aus bereits isolierten und identifizierten Stämmen von Kultursammlungen aufgefunden werden. Da Laccasen zu den Phenoloxidasen gehören, werden Verfahren, die geeignet für das Screening von Phenoloxidasen sind, zum Screenen eingesetzt. Das Screenen kann durchgeführt werden, indem die Herstellung des Enzyms entweder an einer festen Kultur auf einer Kultivierungsplatte oder in einem flüssigen Kulturmedium durch das Messen der Enzymaktivität untersucht wird.
Wenn nach neuen Laccasen gesucht wird, die höhere Temperaturen und pH-Werte als die Mehrheit der bekannten Laccasen tolerieren, ist es lohnend, Mikroben aus einem Umfeld zu untersuchen, in welchem sie unter warmen und/oder alkalischen Bedingungen leben. Ein solches Umfeld kann zum Beispiel im Kompost, in Haufen aus Holzchips oder in tropischen Gebieten gefunden werden.
Die Produktion von Phenoloxidasen durch im Screening aufgefundene positive Pilze kann auf Platten, durch die Zugabe von Substraten der Phenoloxidasen auf das Mycel, untersucht werden. Durch diesen Tropftest kann herausgefunden werden, ob die positiven Reaktionen auf der Platte durch Peroxydasen oder Laccasen verursacht wurden. Geeignete Reagenzien schließen ABTS, Syringaldazin und Guaiacol ein und Wasserstoffperoxid bei der Beobachtung von Peroxidasen.
Der Mikroorganismus, der Peroxidasen produziert und der als Ergebnis des Screenings aufgefunden wurde, wird auf geeignetem Medium kultiviert und es wird die Bildung von Phenoloxidase in der Kulturlösung durch Verfahren, die geeignet sind, die Phenoloxidaseaktivität zu messen, beobachtet. Geeignete Kulturmedien für Pilze schließen z. B. Malzextrakt und Kartoffelstärkemedien ein. Geeignete Substrate zur Messung der Aktivität schließen ABTS, Guaiacol und Syringaldazin ein. Bei vielen Pilzen bedarf die Herstellung von Peroxidasen eines Induktors. Solche schließen z. B. aromatische Verbindungen, ligninhaltiges Material, oberflächenaktive Agenzien, gewisse Kohlenstoffquellen und Kupfersulfat ein. Die Laccaseaktivität kann unter Verwendung von ABTS als Substrat, welches Laccase dunkelgrün oxidiert, gemessen werden. Die Messung kann in Anlehnung an das Verfahren von Niku-Paavola et al. (1988) durchgeführt werden. Die Laccaseaktivität kann auch unter Verwendung eines Guaiacolverfahrens in Anlehnung an das Verfahren von Paszezynski et al. (1985) gemessen werden.
Nachdem eine ausreichende Menge einer interessierenden Laccase produziert wurde, wird das Enzym gereinigt und seine Eigenschaken werden charakterisiert. Es können das Temperatur- und pH-Verhalten sowie der isoelektrische Punkt des Enzyms bestimmt werden.
Laccaseproduzenten können auch über die Homologie von Sequenzen des Laccasegens gescreent werden. In diesem Fall können Nukleotide basierend auf der konservierten Region des Aminoendes des Laccasegens als PCR-Primer verwendet werden, um z. B. im Genom von verschiedenen Pilzen nach Gensequenzen, die homolog zu bekannten Laccasen sind, zu suchen.
Die Bestimmung der Laccaseaktivität bei verschiedenen Temperaturen kann mittels des ABTS-Verfahrens, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt werden. Das pH-Optimum der Laccase kann mittels des Guaiacolverfahrens in einem geeigneten Puffer bei verschiedenen pH-Werten bestimmt werden. Sobald der pH über 7 ist, zeigt die Arbeitsweise des ABTS in der Aktivitätsanalyse Schwächen.
Die thermische Stabilität kann durch das Inkubieren einer Enzymprobe bei verschiedenen Temperaturen in einem geeigneten Puffer bei einem bestimmten pH-Wert bestimmt werden. Die Restaktivität des Enzyms bei jeder Temperatur kann z. B. mittels des ABTS-Verfahrens definiert werden.
Die pH-Stabilität kann durch Inkubieren einer Enzymprobe bei verschiedenen pH-Werten in einem geeigneten Puffer bestimmt werden. Die Restaktivität kann z. B. mittels des ABTS-Verfahrens bestimmt werden.
Isolation und Aufreinigung der Laccase
Das Enzym kann unter Einsatz konventioneller Verfahren der Enzymchemie wie Salzfällung, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Aufreinigung kann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophoresen überwacht werden. Die Enzymaktivität des gereinigten Enzyms bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten kann bestimmt werden; in ähnlicher Weise können das Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt bestimmt werden.
In den Beispielen dieser Erfindung wird die Produktion der Laccase durch die Kultivierung des Stammes Melanocarpus albomyces in einem reichhaltigen Kulturmedium beschrieben. Während der Kultivierung wurde die Laccaseaktivität gemäß des ABTS-Verfahrens von Niku-Paavola et al. (1988), welche auf der Erzeugung von dunkelgrünen kationischen Radikalen des ABTS durch die Wirkung der Laccase beruht, überwacht werden. Die Erfindung ist jedoch nicht beschränkt auf die Produktion der M. albomyces Laccasen in nur diesem Medium.
Die M. albomyces Laccase wurde aus der Kulturlösung aufgereinigt, aus welcher die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt wurden. Die Kulturlösung wurde darüber hinaus unter Verwendung von Ultrafiltration konzentriert. Eine Anionenaustauschchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie wurden für die weitere Aufreinigung eingesetzt. Der Molekulargewichtsabgrenzungswert für die Ultrafiltration war bei etwa 30 kDa. Die Anionenaustauschchromatographie wurde bei pH 5 in einem Acetatpuffer durchgeführt und die Laccase wurde aus der Säule mit einem ansteigenden linearen Gradienten Na₂SO₄ ausgeschwemmt. Die besten Fraktionen des Innenaustausches wurden weiter aufgereinigt mittels hydrophober Interaktionschromatographie bei pH 5 in einem Acetatpuffer. Die Probe wurde bei 0,7 M Na₂SO₄ Konzentration gebunden und mit einem abnehmend linear Gradienten von Na₂SO₄ ausgeschwemmt.
Es ist jedoch auch möglich, das Enzym unter Verwendung anderer bekannter Aufreinigungsverfahren abzutrennen.
Die molekulare Größe, der isoelektrische Punkt sowie die pH- und die Temperaturprofile der gereinigten M. albomyces Laccase wurden bestimmt.
Das gereinigte Enzym bezieht sich auf deine Enzymzubereitung, welche zusätzlich zu der Laccasebande keine anderen Proteine enthält, die beobachtet werden können durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbungen. In dieser Anwendung wird das Enzym durch Ultrafiltration, Anionaustauschchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt. Die Reinheit der erhaltenen Laccase, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, ist ≥ 90 %.
Die molekulare Größe der gereinigten M. albomyces Laccase war 80 kDa, bestimmt durch eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. In der isoelektrischen Fokussierung durch das Muliphor II Elektrophoresegertä (Pharmacia LKB) wurde 4,0 als isoelektrischer Punkt bestimmt. Die Aktivität der M. albomyces Laccase war am höchsten bei einer Temperatur von 70 °C und ihr pH-Optimum war 7,5. Nach zwei Stunden Inkubation bei 60 °C behielt die M. albomyces Laccase 100 % ihrer Aktivität. Darüber hinaus verbesserte sich ihre pH-Stabilität, sofern der pH angehoben wurde.
Herstellung der Laccase
Die Laccase gemäß der Erfindung kann in einer Kulturlösung ihres natürlichen Wirtes oder eines Produktionswirtes, aus welcher sie isoliert und aufgereinigt werden kann, unter Verwendung bekannter Verfahren der Proteinchemie, hergestellt werden. Wenn die Kulturlösung eine ausreichend hohe Menge der Laccase enthält, jedoch keine anderen schädlichen Proteine, kann es möglich sein, die Kulturlösung als solche durch einfaches Abtrennen der Zellen zu verwenden. Sofern es erwünscht ist, kann die Kulturlösung konzentriert und/oder aufgereinigt werden. Es wird bevorzugt, in verschiedenen Anwendungen eine Enzymzubereitung zu verwenden, die eine erhöhte Menge der Laccase enthält. Eine solche Enzymzubereitung kann hergerichtet werden durch das Produzieren einer erhöhten Menge eines Laccaseenzyms in einer Kulturlösung eines Produktionswirtes unter dem Einsatz von Gentechnologie. Die erhöhte Menge bezieht sich auf eine Menge des Laccaseenzyms, welches die Menge des Laccaseenzyms, wie es normalerweise durch den M. albomyces Stamm, insbesondere Stamm IMI 255989 produziert wird, übertrifft.
Die Laccase gemäß der Erfindung kann auch durch rekombinante Techniken, nämlich durch das Isolieren der Gene, die die Laccase gemäß der Erfindung kodieren und durch Transferieren derselben in einen geeigneten Produktionswirt hergestellt werden. Die laccasekodierenden Gene können aus einer cDNA-Bibliothek in einer der nachfolgend aufgezeigten Wege isoliert werden. Die cDNA-Bibliothek kann in einem geeigneten Hefeexpresionsvektor eingebaut sein und wird z. B. in Saccharomyces cerevisiae Hefe transformiert. Die Klone, die Laccase produzierten, werden identifiziert, z. B. aufgrund der Aktivität bei der Verwendung von Platten, die ABTS-Substrat enthalten. Eine andere Möglichkeit ist es, die cDNA Bibliothek mit einem λZAP-Vektor zu verbinden und Escherichia coli Zellen mit der erhaltenen Produktionsbank zu infizieren. Die Klone, welche Laccase kodieren, werden entweder mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers oder DNA-Hybridisierung identifiziert. Sofern polyklonale Antikörper verwendet werden, sind diese gegen ein gereinigtes Laccase-Protein z. B. in einem Hasen gezogen. Bei der Hybridisierung werden Fragmente des Laccasegels, wie durch PCR bereitgestellt werden, als Proben eingesetzt. In solchen Fällen werden die Sequenzen für die PCR-Primer entweder basierend auf Regionen, die normalerweise in Laccasegenen konserviert sind (z. B. Regionen, die den Aminosäuren im aktiven Zentrum entsprechen) und/oder auf Sequenzen des aminoterminalen Endes des gereinigten Laccaseproteins oder auf die Sequenz von einem internen Peptid gestützt. Darüber hinaus kann die OligodT-Region, die an die PolyA-Region des Endes einer jeden Messenger-RNA gebunden ist, als PCR-Primer verwendet werden.
Die isolierten Laccase cDNAs werden sequenziert. Die Verbindung zwischen der isolierten cDNA und dem isolierten Enzym kann durch eine Aminosäuresequenzierung, die von dem Enzym durchgeführt wurde, nachgeprüft werden. Die chromosomale Kopie des Laccasegens kann entweder durch PCR oder aus einer genomischen Bibliothek, die in einem λ-Vektor erzeugt wurde, isoliert werden und die Lage der Introns kann mittels Sequenzierung erfasst werden.
Isolierung des Gens der M. albomyces Laccase
Es war nicht möglich, das Gen der M. albomyces Laccase basierend auf der Messenger-RNA und der cDNA-Bibliothek zu isolieren. Das Erzeugen einer repräsentativen cDNA-Bibliothek war nicht erfolgreich. Überraschenderweise verursachte die Tatsache, dass M. albomyces die Laccase in einer späten Kultivationsphase produziert, in welcher viele Zellen bereits autolyziert sind, ein Problem und die Messenger-RNA war teilweise degradiert oder schwierig in reiner Form zu isolieren. Daher musste das Gen statt aus einer cDNA-Bibliothek aus einer genomischen Bibliothek isoliert werden. Diese Isolierung des Gens wird im Detail in Beispiel 9 beschrieben.
Die Sequenz des Laccasegens ist in 15 gezeigt, sowie in der Sequenzliste (SEQ ID NO. 1). Die Länge des Gens beträgt 2279 Bp eingeschlossene Introns. Wie in 15 gezeigt, startet die kodierende Region bei der Base mit der Nummer 286, Introns befinden sich an den Positionen 541-618, 698-770, 783-869, 1913-1999, 2069-2150. Die letzte kodierende Base ist 2561.
Das Gen kodiert ein Polypeptid mit einer Länge von 623 Aminosäuren. Sofern die Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Blastverfahrens (Altschul et al., 1990) mit der Aminosäuresequenz von Myceliophtera, wie sie in der Patentanmeldung WO 95/33836 offenbart wird, verglichen wird, konnte festgestellt werden, dass die Aminosäuresequenzen zu 72 % identisch waren (Übereinstimmungen 450/623, 72 %) und zu 82 % homolog waren (Positive 518/623, 82 %; Positive beziehen sich auf homologe Aminosäuren), (Lücken = 4/623, 0 %).
Wenn ein entsprechender Vergleich mit der Podospora anserina Laccase (Fernandez-Larrea und Stahl, 1996) durchgeführt wurde, wurde festgestellt, dass die Sequenzen zu 68 % identisch (Übereinstimmungen 427/627, 68 %) und zu 79 % homolog (Positive 502/627, 79 %), (Lücken = 12/627, 1 %) waren.
Das isolierte Laccasegen wurde in der Proteinherstellung in anderen Organismen eingesetzt. Solche Produktionswirte schließen das oben genannte Aspergillus Produktionssystem, wie A. oryzae oder A. niger ( US 5,843,745 ; US 5,770,418 ; WO 97/08325 und WO 95/33386 ) ein; ebenso das Produktionssystem, das aus dem Pilz Trichoderma ( EP 244 234 ) entwickelt wurde, oder das Produktionssystem, das aus den Pilzarten des Fusarium, wie F. oxysporum (Malardier et al., 1989) entwickelt wurde, oder das Produktionssystem, das für Bazillus-Bakterien wie B. Subtilis oder E. coli Bakterien, die Hefen Saccharomyces, Shizosaccharomyces oder Pichia patoris, Streptomyces actinomycete oder einige andere Mikroben oder Säugerzellen entwickelt wurde.
Optimierung der Herstellung von Laccase
Die Produktion der Laccase kann auch durch das Optimieren der Kulturbedingungen und des Kulturmediums für einen Wildtyp oder einen rekombinanten Stamm verbessert werden. Beim Optimieren des Kulturmediums sind z. B. die Qualität (unter anderem einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle) und die Quantität der Stickstoffquelle für die Laccaseproduktion entscheidend. Sofern es von Nöten ist, wird die Stickstoffquelle begrenzt, um eine höhere Ausbeute zu erzielen. In ähnlicher Art und Weise wird die Wirkung der Kohlenstoffquelle etabliert. Es wird die optimale Kohlenstoffquelle für die Enzymproduktion ausgewählt. Sofern dies von Nöten ist, kann die Menge der Kohlenstoffquelle ebenfalls begrenzt werden. Das Kohlenstoff-/Stickstoffverhältnis ist für die bestmögliche Enzymproduktion optimiert. Die Wachstumsbedingungen werden auf das bestmögliche für die in Frage stehende Enzymproduktion optimiert. Die Mikroben wachsen bei einem pH und einer Temperatur, die optimal für die Enzymproduktion ist.
Eine entsprechende Durchmischung und Luftversorgung garantiert eine optimale Belüftung während der Fermentation. Während der Fermentation können auch Inducer der Laccaseproduktion wie Veratrylalkohol, Xylidin oder Lignin verwendet werden. Die Art und Weise und der Zeitpunkt für die Zugabe der Inducer sowie deren Konzentration werden optimiert.
Verwendung der Laccase in verschiedenen Anwendungen
Im Allgemeinen ist die Laccase gemäß der Erfindung gut geeignet, um in Anwendungen, in denen Laccase verwendet wird, eingesetzt zu werden, wie Gelbildung, das Verleimen von Fasern, die Behandlung von Kork, das Entfernen von Farbe (insbesondere Textilfarben), das Färben von Fasern, die Proteinbehandlung, Detergenzien, antimikrobielle Anwendungen, Stärkeanwendungen, die Oxidation von Chemikalien, die Entfernung von Biofilmen, die Zubereitung von Ligninderivaten, medizinische Analysen, die Verminderung des Schrumpfen von Wolle, Backen, die Verbesserung der Haltbarkeit von Bier, die Herstellung von Farbe, das Entfernen von Sauerstoffaus ölhaltigen Produkten und die Herstellung von Jod. Sofern es erwünscht ist, kann die Laccase gemäß der Erfindung für bestimmte Zwecke auch immobilisiert sein.
Die Laccase gemäß der Erfindung ist insbesondere gut geeignet für industrielle Anwendungen, bei denen die vorherrschenden pH- und Temperaturbedingungen hoch sind. Solche Anwendungen schließen unter anderem Anwendungen der Forstindustrie, der Erzeugung von Faserprodukten und Brettern aus mechanisch hergestelltem ligninhaltigem Holzschliff, die Verbesserung der Laufeigenschaften von Papiermaschinen und anderen Anwendungen, die Oxidation von Polymeren und anderen Chemikalien, wie Farbstoffmolekülen ein. Bei diesen Anwendungen ist die Temperatur oft über 60 °C, gewöhnlich so hoch wie 80 °C und der pH ist nahe dem Neutralen oder leicht Alkalischen.
In allen Anwendungen ist es wichtig, dass genügend Sauerstoff zu der Reaktion gebracht wird. Sauerstoff ist das reduzierende Substrat, welches von der Laccase benötigt wird. In einigen Fällen, insbesondere wenn die Substratkonzentration niedrig ist, kann genügend Sauerstoff in der Reaktionsmischung als solche sein, er kann jedoch auch zugeführt werden entweder durch das Einbringen von Luft oder Sauerstoff oder mit Sauerstoffangereicherter Luft in die Reaktionsmischung.
Sofern benötigt, werden Mediatoren als Additive in der Reaktion eingesetzt.
Die Laccase gemäß der Erfindung ist gut geeignet zur Oxidation von z. B. Farbagenzien. Die Farbstoffmoleküle werden mit der Laccase bei einem pH 4 bis 8, z. B. bei pH 4,5 bis 7,5, vorzugsweise bei pH 6 bis pH 8, weiter vorzugsweise bei pH 7 bis 8 und Temperaturen, die sich in einem Bereich zwischen 25 bis 80 °C, vorzugsweise 40 bis 80 °C, weiter vorzugsweise 50 bis 80 °C und besonders bevorzugt 60 bis 80 °C bewegen, in Kontakt gebracht. Sauerstoff wird der Reaktion nach Bedarf zugeführt. Die Menge der Laccase ist 1 bis 1000 nkat/g, vorzugsweise 10 bis 500 nkat/g, besonders bevorzugt 20 bis 200 nkat/g des Farbagenz. Die Reaktion wird für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise für 30 Minuten bis 2 Stunden, zugelassen.
Die Laccase gemäß der Erfindung ist auch gut geeignet zur Polymerisation. Die ausgewählte Verbindung, die polymerisiert werden soll, wird mit der Laccase bei denselben Bedingungen wie bei denselben Bedingungen wie oben beschrieben in Kontakt gebracht. Die Reaktionsmischung kann während der Testphase belüftet werden. Die Polymerisation kann durch das Verfolgen der Zunahme des Molekulargewichts der polymerisierten Verbindung z. B. durch GPC (Gel Permeationschromatographie) überwacht werden.
Die Laccase gemäß der Erfindung kann auch dazu verwendet werden, die Laufeigenschaften von Papiermaschinen zu verbessern. Die Laccase kann verwendet werden, um die Laufeigenschaften von Papiermaschinen durch die Polymerisation von Verbindungen, die vom Lignin und Extrakten stammen und durch das Verringern des schädlichen Wachstums von Mikroben in der Papiermaschine verbessert werden. Gewöhnlich sind die Bedingungen in Papiermaschinen etwa bei pH 5 bis 7 und die Temperatur 60 bis 80 °C. Die Laccase kann dem Prozesswasser oder in den Stoffauflauf oder das Kreislaufwassersystem der Papiermaschine zugegeben werden, ohne dass Veränderungen der vorherrschenden Bedingungen in der Papiermaschine nötig sind. Der pH kann in einem Bereich von 5 bis 8 und die Temperatur in einem Bereich von 50 bis 80 °C sein. Die Menge der Laccase kann 1 bis 1000 nkat/g, vorzugsweise 10 bis 500 nkat/g der Trockensubstanz, Fasern oder Liter des Kreislaufwassers sein. Die Behandlungszeit kann 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 2 Stunden sein.
Die Laccase gemäß der Erfindung kann auch zur Oxidation von Fasern verwendet werden. Ligninhaltige Fasern können mit Laccase bei einer Temperatur von 50 bis 80 °C, sogar so hoch als 50 bis 100 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 60 bis 80 °C und bei pH 5 bis 8, vorzugsweise bei pH 6 bis 8 in Kontakt gebracht werden, wobei die Laccasekonzentration 1 bis 1000 nkat/g der Fasern, vorzugsweise 10 bis 500 nkat/g Fasern beträgt und die Reaktionszeit 2 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 2 Stunden, ist. Aufgrund der Laccasebehandlung verbessern sich die Festigkeitseigenschaften der Fasern, die z. B. in der Fertigung von Faserplatten wie MDF Platten oder in Papier und Kartonageprodukten, die aus mechanisch hergestelltem ligninhaltigem Holzschliff gemacht werden, eingesetzt werden können.
Zusätzlich zu den oben genannten Anwendungsbeispielen kann die Laccase gemäß der Erfindung auch bei der Delignifizierung von Fasern verwendet werden. Die Laccase kann dazu mit den Fasern, die zu Delignifizieren sind, wie Kraftzellstoff mit einem Kappa-Wert von 20 bis 30, vorzugsweise etwa 25, einer Konsistenz von 5 bis 15, vorzugsweise etwa 10 %, vorzugsweise in Anwesenheit eines Mediators, wobei die Menge des Mediators 1 bis 5 % der Pulpe, vorzugsweise 3 % der Pulpe, ist, der pH-Wert innerhalb 5 bis 8, vorzugsweise im Rahmen von 6 bis 8 ist, die Temperatur zwischen 50 und 80 °C, vorzugsweise zwischen 60 und 80 °C liegt, in Kontakt gebracht werden. Die Reaktionszeit kann zwischen 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 2 Stunden, liegen. Die Menge der Laccase kann 10 bis 1000 nkat/g, vorzugsweise 10 bis 500 nkat/g bei einem Sauerstoffdruck von 0,5 Mpa sein.
Die nachfolgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu illustrieren und sollten nicht als Limitierung der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Art und Weise ausgelegt werden.
Beispiel 1
Herstellung der M. albomyces Laccase
Der M. albomyces Pilz wurde auf Hafer-Aga-Platten (Difco) gezogen. Sowohl das Inoculum wie auch das Produktionsmedium enthalten
25 g/l Glukose (AnalaR)
27,5 g/l Bactohefeextrakt (Difco)
0,5 mg/ml Indulin AT (Sigma)
0,04 l/l Mineralstofflösung enthaltend:
1,0 g/l CaCl₂ × 2H₂O (Riedel-de Haën)
1,0 g/l FeSO₄ × 7H₂O (Riedel-de Haën)
0,1 g/l ZnSO₄ × 7H₂O (Merck)
0,16 g/l CuSO₄ × 5H₂O (Merck)
1,0 g/l Na₂EDTA (Riedel-de Haen)
Die Glukoselösung wurde separat sterilisiert.
Zunächst wurden 100 ml Medium mit 3 bis 4 Stücken (etwa 1 cm²), welche aus dem Well, in dem das Mycel auf Haferflockenagar gewachsen war, ausgeschnitten wurden, beimpft. Die Kultivationstemperatur war 37 °C und die Schüttelgeschwindigkeit 120 rpm. Nach 2 Tagen der Kultivierung wurde das Mycel homogenisiert und 900 ml der sterilen Kultur wurden mit 100 ml des homogenisierten Inoculums beimpft. Das Volumen der Produktionskultur war 1 1; die Kultivierungstemperatur war 37 °C und die Schüttelgeschwindigkeit 160 rpm. Die Kultivierung wurde für 14 Tage fortgeführt. Es wurden 4 parallele Kulturen angesetzt.
Enzymaktivitätsuntersuchung
Die Laccaseaktivität der M. albomyces Kulturlösung wurde durch die Verwendung von ABTS gemessen. Laccase oxidiert ABTS zu einem dunkelgrünen Kationenradikal. Das Aktivitätsuntersuchung wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren, welches von Niku-Paavola et al. (1988) entwickelt wurde, ausgeführt. Die Probe wurde mit 0,025 M Succinatpuffer, pH 4,5, verdünnt, es wurden 0,350 ml ABTS-Lösung (11 g/l) zu 1,15 ml der Verdünnung zugegeben und die Reaktion wurde für 2 Minuten in einem Perkin Elmer Lamda 20 Spektrophotometer bei einer Wellenlänge 436 nm verfolgt.
Die gemessene Laccaseaktivität von M. albomyces Kulturen ist in 1 dargestellt.
Beispiel 2
Aufreinigung der M. albomyces Laccase
Bestimmung des Proteingehalts
Der Proteingehalt wurde durch das DC Proteinassaykit von Bio-Rad, welches auf einem Verfahren, welches von Lowry et al. (1951) entwickelt wurde, beruht, bestimmt. Das Essay wurde unter Verwendung der Reagenzien des Kits ausgeführt und die Intensität der Farbreaktion, die sich zeigte, wurde bei einer Wellenlänge von 750 nm durch das Hitachi U-2000 Spektrophotometer gemessen. Zu jeder Messung wurde eine Standardkurve definiert unter Verwendung von Lösungen, die 0,25 bis 1,25 g/l bovines Serum Albumin (BSA, Bio-Rad) enthielten.
Aufreinigung
Die Kulturlösung, aus der die Zellen durch Filtration entfernt wurden, wurde mit dem Amicon 8400 Filterequipment ultrafiltriert unter Verwendung einer PM30 Membran (Millipore). Während der Filtration war die Lösung konzentriert und destilliertes Wasser wurde zugegeben, so dass es möglich war, die Leitfähigkeit der Lösung auf ein für die Ionenaustauschchromotographie benötigtes Level zu reduzieren. Die Leitfähigkeit wurde unter Verwendung eines EDV-Instruments Leitfähigkeitsinstrument (Platinelektrode Mettler Toledo) gemessen.
Nach der Ultrafiltration wurde die Lösung durch Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose Fast Flow, h = 10 cm, V = 20 ml, Pharmacia) aufgereinigt. Das Granulat wurde bei Raumtemperatur mit 0,01 M Acetatpuffer, pH 5, equilibriert. Die Proteine wurden mit einem ansteigenden linearen Salinegradienten unter Verwendung von 0 bis 0,5 M Natriumsulfat (Merck) eluiert. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug 90 ml und die Fließgeschwindigkeit 2 ml/min. Während des Durchflusses wurden 4 ml Fraktionen gesammelt. Der Proteingehalt, die Laccaseaktivität und die Leitfähigkeit der Fraktionen wurden untersucht. Die Laccaseaktivität und der Proteingehalt der Fraktionen sind in 2 gezeigt.
Die besten Laccasefraktionen des Anionenaustausches wurden zusammengeführt und sie wurden weiter aufgereinigt durch eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) (Phenyl Sepharose Fast Flow, h = 9 cm, V = 18 ml, Pharmacia). Die Hydrophobität der Proteine wurde vor dem Durchlauf durch Zugabe von Na₂SO₄ zu der Probe erhöht, so dass der Salzgehalt 0,7 M wurde. Das Granulat wurde mit 1 M Na₂SO₄ in 0,02 M Zitratpuffer, pH5, bei Raumtempera tur equilibriert. Die Probe wurde aus der Säule mittels abnehmend linearer Salzgradienten unter Verwendung von 0,7 bis 0 M Na₂SO₄ in Zitratpuffer ausgeschwemmt. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug 90 ml und die Fließgeschwindigkeit 2 ml/min. Nach dem Gradientenlauf wurde das Granulat mit dem Equilibrierungspuffer und schlussendlich mit Wasser gewaschen. Während des Gradientenlaufes und der nachfolgenden Waschschritte sowohl mit Puffer wie mit Wasser wurden 3,5 ml Fraktionen gesammelt, von denen die Laccaseaktivität, der Proteingehalt und der Salzgehalt gemessen wurden (3).
Die am interessantesten erscheinenden Fraktionen sowohl des Ionenaustausches und der HIC wurden mittels SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Überwachung der Aufreinigung der Laccase gemäß der Methode von Laemmli (1970) untersucht. Für die Gelelektrophorese wurde die Ausrüstung von Bio-Rad (Bio-Rad Ready Gel Cell) und fertige Polyacrylamidgele (12 % Tris-HCl Ready Gel) verwendet. Die Gele wurden mit einer Coomassie Brilliant Blue R 350 Farblösung (Pharmacia) gefärbt. Ein vorgefärbter Proteinmarker Broad Range # 77085 (New England BioLabs) wurde als Proteinstandard eingesetzt.
Das Molekulargewicht der M. albomyces Laccase wurde mittels SDS-PAGE auf 80 kDa definiert.
Beispiel 3
Charakterisierung der M. albomyces Laccase
Temperaturabhängigkeit der Aktivität
Die Abhängigkeit der Aktivität der gereinigten M. albomyces Laccase von der Temperatur wurde durch das Messen der Laccaseaktivität durch ABTS bei Temperaturen von 25, 40, 50, 60, 70, 80 und 90 °C definiert. Das Enzym wurde in 0,025 M temperierten Succinatpuffer, pH 4,5, verdünnt. Direkt nach Zugabe des Enzyms wurde temperierte ABTS-Lösung zugegeben. Die Probe wurde für 2 Minuten bei der gewünschten Temperatur inkubiert und hiernach wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 436 nm gemessen. Um durch die Zugabe der Enzymlösung die Temperatur des Puffers nicht wesentlich zu senken, betrug das Volumen des zugegebenen Enzyms zum Puffer in allen Verdünnungen unter 7 % des Gesamtvolumens. Die Abhängigkeit der Aktivität der M. albomyces Laccase von der Temperatur ist in 4 gezeigt.
pH-Optimum
Das pH-Optimum der gereinigten M. albomyces Laccase wurde durch das Messen der Laccaseaktivität mittels des Guaiacol-Verfahrens in Mcllvaine-Puffer bei pH-Werten von 3, 4, 5, 6, 7 und 8 bestimmt. Guaiacol wurde ausgewählt, da ABTS nicht funktioniert, sofern der pH über 7 ist. Das Enzym wurde in den Puffern verdünnt und direkt nach der Enzymzugabe wurden 25 μl einer 1 %igen Guaiacol-Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde für 5 Minuten in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 465 nm verfolgt. Die Abhängigkeit der Aktivität der M. albomyces Laccase auf den pH ist in 5 gezeigt.
Thermische Stabilität
Die thermische Stabilität der M. albomyces Laccase wurde durch Inkubation des Enzyms bei 50, 60, 70 und 80 °C in 0,06 M Zitratpuffer, pH 6, bestimmt. Die Restaktivität des Enzyms bei jeder Temperatur wurde durch das ABTS-Verfahren nach einer Inkubation von 15, 30, 60 und 120 Minuten definiert. Die Ergebnisse der Messungen zur thermischen Stabilität sind in 6 gezeigt.
Die thermische Stabilität der aufgereinigten M. albomyces Laccase wurde nach den oben beschriebenen Bedingungen bestimmt. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Ergebnisse deuten an, dass die Restaktivität des Enzyms bei 60 °C für so viel wie zwei Stunden im Wesentlichen unverändert liegt. Nach einer vierstündigen Inkubation war noch 60 % der Restaktivität erhalten und nach 6 Stunden 40 %.
pH-Stabilität
Die pH-Stabilität der M. albomyces Laccase wurde durch Inkubation des Enzyms bei pH-Werten von 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 in McIlvaine-Puffer bei Raumtemperatur bestimmt. Die Restaktivität des Enzyms in den inkubierten Proben bei dem jeweiligen pH wurde durch die Verwendung des ABTS-Verfahrens nach einer Inkubation von 1, 3, 5 und 22 Stunden definiert. Die Ergebnisse der pH-Stabilitätsmessungen sind in 8 gezeigt.
Isoelektrischer Punkt
Der isoelektrische Punkt der M. albomyces Laccase wurde durch isoelektrische Fokussierung bestimmt. Das 0,5 mm dicke Polyacrylamidgel enthielt 7,5 % Acrylamid (Merck), 0,225 % N,N'-bis-Methylenacrylamid (Merck), 6 % Ampholyt (Pharmalyt 2,5-5 für IEF, Pharmacia), 0,05 % Ammonium Persulphat (Merck) und 0,05 % N,N,N,N'-Tetramethylendiamin (Merck). Diese isoelektrische Fokussierung wurde unter Verwendung der Multiphor II Elektrophoreseausrüstung (Pharmacia LKB) durchgeführt. Die Gele wurden gefärbt durch die Verwendung aktiver Farbstoffe, wobei die Gele für etwa 10 Sekunden in eine verdünnte ABTS-Lösung (1 g/l) getaucht wurden. Nach etwa 15 Minuten erschienen die Laccasebanden grün. Die pH-Verteilung im Gel wurde unter Verwendung einer pH-Oberflächenelektrode (Mettler Toledo) bestimmt. Bezogen auf die isoelektrische Fokussierung war der isoelektrische Punkt der M. al bomyces Laccase 4,0.
Beispiel 4
Verwendung von M. albomyces Laccase zur Oxidation von Farben
Die Tests wurden durchgeführt unter Verwendung einer thermophilen M. albomyces Laccase und die Referenzuntersuchungen verwendeten eine gut bekannte Laccase, die aus dem Trametes hirsuta Pilz isoliert wurde. Als Substrat wurde ein herkömmliches Substrat, 2,6-Dimethoxyphenol, eingesetzt. Die Substratkonzentration betrug 1 mmol/l, pH 4,5-7,5, und die Temperatur war 40 oder 60° C. Die Menge der Laccase betrug 15 nkat/g. Die Reaktionsmischung wurde während der Untersuchung belüftet. Am Ende der Untersuchung (30 Minuten) stellte sich heraus, dass die thermostabile M. albomyces Laccase bei höheren Temperaturen und pH besser arbeitete, wenn die Bildung der Farbe aus Dimethoxyphenol bei einer Wellenlänge von 468 nm gemessen wurde (9 und 10).
Laccasen können verwendet werden, um die Farbe aus Textilfarbstoffen zu entfernen. Laccasen oxidieren viele Farbstoffe, was in Form einer Entfärbung beobachtet werden kann. Die Entfärbung von Textilfarbstoffen wurde unter Verwendung eines Farbstoffes, der gewöhnlich in der Textilindustrie eingesetzt wird, Diamond Black PLC, gemessen. Die Laccasebehandlung wurde bei pH 7,5 und Temperaturen von 40 und 60° C für 2 Stunden durchgeführt, die Laccasedosis betrug 20 nkat/mg der Farbe. Bezogen auf eine maximale Absorptionsmessung (560 nm) entfernte die Melanocarpus Laccase 34 % der Farbe bei 40 °C und 16 % bei 60 °C, während die Trametes Laccase nur 14 % bei 40 °C und nur 1 % bei 60 °C entfernte (1).

Die Fähigkeit der M. albomyces Laccase, Farbe zu entfernen, wurde mit der T. hirsuta Laccase bei pH 5 und pH 8 verglichen. Die Fähigkeit, Farbe zu entfernen, wurde unter Verwendung von Farbstoffen, die gewöhnlich in der Textilindustrie eingesetzt werden, untersucht. Eine Farblösung (50 mg/l) wurde mit einer Laccasedosis von 1 nkat/ml in 50 mM Sukzinatpuffer (pH 5) oder in einem Phosphatpuffer (pH 8) für 24 Stunden bei einer Temperatur von 40 °C oxidiert. Die Entfärbung wurde visuell verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie den Ergebnissen zu entnehmen ist, oxidieren beide Enzyme die zu testenden Farbstoffe, so dass diese bei einem pH 5 farblos wurden. Die T. hirsuta Laccase war bei einem pH von 8 ineffektiv und oxidierte die zu testende Farbe nicht. Anders die M. albomyces Laccase, die sogar bei einem pH 8 in der Lage war, den Farbstoff zu oxidieren. Die Ergebnisse deuten an, dass das Verhalten der M. albomyces Laccase während der Oxidation von Farbstoffen wesentlich umfassender ist als das der hcrkömmlichen Trametes Laccase. Tabelle 1 Entfernung von Textilfarben mit der T. hirsuta und der M. albomyces Laccase bei pH 5 und 8. (+ = Entfernung der Farbe aus der Lösung, – = keine Entfärbung der Lösung)

Farbstoff	T. hirsuta Laccase		M. albomyctes Laccase
	pH 5	pH 8	pH 5	pH 8
Säure + Metallkomplexfarbstoffe
Acid Blue 113	+	–	+	+
Lanasat Blue 5 G	+	–	+	+
Chromfarbstoffe
Diamond Fast Brown	+	–	+	+
Diamant Schwarz PLC	+	–	+	+

Beispiel 5
Verwendung der M. albomyces Laccase zur Polymerisation
Das Experiment untersuchte die Polymerisation einer Modelverbindung (Lignin, Westvaco oder Indulin AT, Sigma) mit einer thermophilen Laccase. Lignin ist ein typisches aromatisches Substrat der Laccase. Das Kontrollelement wurde unter Verwendung einer Laccase, die aus Trametes hirsuta isoliert wurde, durchgeführt. Die Untersuchungsbedingungen waren wir nachfolgend: Substratkonzentration 1 %, pH 7,5 und Temperaturen 40 oder 60° C. Die Menge der Laccase betrug 200 nkat/g. Die Reaktionsmischungen wurden während des Experiments belüftet. Im Anschluss an die Polymerisation wurde die Zunahme des Molekulargewichts des polymerisierten Lignins durch GPC (Gelpermeationschromatographie) bestimmt. Am Ende der Reaktion (30 Minuten) wurde festgestellt, dass die thermophile M. albomyces Laccase bei hoher Temperatur und pH effizienter arbeitet als die Kontrolllaccase. 12 illustriert eine Situation, bei der die Polymerisation von Lignin bei 40 °C ausgeführt wird und entsprechend bei 60 °C in 13. Die Melanocarpus Laccase versucht eine durchschnittliche Zunahme in der Molekülgröße und eine Abnahme im Anteil der kleinen Moleküle, offensichtlich besser als die Trametes Laccase.
Beispiel 6
Die Verwendung der M. albomyces Laccase zur Verbesserung der Leichtläufigkeit von Papiermaschinen
Laccase kann dazu eingesetzt werden, um die Leichtläufigkeit von Papiermaschinen durch das Polymerisieren von Verbindungen, die aus Lignin und Extrakte stammen und durch das Vermindern der mikrobiologischen Probleme der Papiermaschine, zu verbessern. Im Allgemeinen sind die Bedingungen der Papiermaschine: der pH ist 5 bis 7 und die Temperatur 60 bis 80 °C. Behandlungstests wurden durchgeführt unter Verwendung einer thermophilen und einer herkömmlichen Referenzlaccase bei den Papiermaschinenbedingungen unter Verwendung von löslichen Verbindungen, die aus Lignin und Extrakten stammen, und die aus der Papiermaschine isoliert wurde. Die Substratkonzentration betrug 0,5 % Trockengewicht, der pH war 7 und die Temperatur 70 °C. Intensives Schütteln stellte einen ausreichenden Sauerstoffgehalt in der Reaktion sicher. Die Reaktion wurde über die Polymerisation der aromatischen und anderen Verbindungen, die als Substrate für die Laccase fungierten, mittels Gelfiltration (GPC) überwacht. Es stellte sich heraus, dass die Reaktion mit dem thermophilen M. albomyces Laccase effizienter war als mit der Referenzlaccase.
14 zeigt, wie die Melanocarpus und Trametes Laccasen sich bei der Polymerisation von Verbindungen, die aus Lignin und Extrakte stammen, bei 70 °C verhalten. Ebenfalls in 14, die Melanocarpus Laccase reduziert die Menge der kleinen Moleküle deutlich.
Beispiel 7
Verwendung der M. albomyces Laccase zur Oxidation von Fasern
Ligninhaltige Fasern, die mechanisch ohne chemische Delignifizierung hergestellt wurden, wurden mit thermophiler M. albomyces Laccase behandelt, um das Lignin auf der Oberfläche der Fasern zu aktivieren und zu polymerisieren. Die Behandlung wurde bei den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die Temperaturen waren 50 und 70 °C, der pH war 6 und die Laccasekonzentration 200 nkat/g Fasern. Die Reaktionsmischung wurde durch Einblasen von Sauerstoff in die Reaktionsmischung belüftet. Als Referenz diente eine herkömmliche Laccase, die aus dem Pilz Trametes hirsuta isoliert wurde. Es wurden Prüfblätter aus den behandelten Fasern hergestellt. Die physikalischen Eigenschaften der Blätter wurden gemessen. Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigen, dass die Dichte der Blätter, die aus Fasern, die mit M. albomyces Laccase behandelt wurden, deutlich höher war und dass die Lichtstreuung geringer war als bei denen der Referenzblätter. Es wurde keine entsprechende Veränderung bei Blättern bemerkt, die aus Fasern hergestellt wurden, die mit T. hirsuta Laccase behandelt waren. Der Effekt war insbesondere offensichtlich bei einer erhöhten Temperatur von 70 °C, bei welcher die M. albomyces Laccase sich aufgrund ihrer guten thermischen Stabilität vorteilhaft verhielt verglichen mit der Referenzlaccase, die aus dem Pilz T. hirsuta isoliert wurde. Basierend auf diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass es möglich ist, die M. albomyces Laccase zu verwenden, um Lignin auf der Oberfläche von Fasern bei den eingesetzten Bedingungen zu polymerisieren.
Tabelle 2
Die Dichte und Lichtstreuung der Blätter, die aus Fasern, die mit M. albomyces und T. hirsuta Laccase behandelt wurden, hergestellt wurden.

Experiment T (° C) Dichte (kg/m³) Lichtstreuung (m²/kg)

Kein Enzym 70 339 55,0

T. hirsuta Laccase 70 347 55,2

M. albomyces Laccase 70 367 53,6
Beispiel 8
Verwendung der M. albomyces Laccase bei der Delignifizierung von Fasern
Es können Mediatoren eingesetzt werden, um die Einsatzbreite der möglichen Substrate der Laccase unter anderem bei der Delignifizierung oder anderen indirekten Oxidationen von Polymeren zu erweitern. Hydroxybenzotriazol wurde als Mediator ausgewählt. Es wurde die thermophile Laccase eingesetzt, um das Lignin des Kraftzellstoffes in einer mediatorunterstützten Oxidation abzubauen. Die Reaktionsbedingungen waren wie nachfolgend: Kraftzellstoffsuspension, die Kappa-Zahl etwa 29, die Konsistenz 4 %, die Menge des Mediators 1 % der Pulpe, der pH auf 7 eingestellt und die Temperatur 70 °C, die Reaktionszeit 2 Stunden, die Menge der Laccase 500 nkat/g, unter Sauerstoffdruck (0,5 mPa). Trametes Laccase diente als Referenzmaterial. Nach dem Behandeln wurde die Pulpe einer alkalischen Extraktion, Chelatbildung und einer einstufigen Gleichung mit Peroxyd unterzogen. Das Auflösen des Lignings wurde durch Messen der Absorption des Filtrats bei einer Wellenlänge von 280 nm nach der alkalischen Extraktion überwacht. Probeblätter wurden aus der Pulpe hergestellt und der ISO-Weißgrad und die Kappa-Zahl wurden gemessen. Wie die Ergebnisse zeigen (Tabelle 3), funktioniert M. albomyces Laccase bei den experimentellen Bedingungen effektiver als die Referenzlaccase; sie setzte den Kappa-Wert der Blätter (Menge des Lignins) herab und erhöhte die Absorption_280nm des Filtrats besser als die Referenzlaccase. Tabelle 3 Wirkung der LM-Behandlung auf die Bleichfähigkeit der Kraftzellstoffsuspension (κ 29) mit einer LQ-E-P-Sequenz

Experiment A280 des Filtrats Kappa-Wert

Kein Enzym 11,9 18,9

T. hirsuta Laccase 14,3 16,3

M. albomyces Laccase 32,7 15,4
Beispiel 9
Isolierung des Gens und der cDNA der M. albomyces Laccase
Die Gesamt-DNA wurde aus Zellen gemäß Raeder und Broda (1985) isoliert. Eine genomische Bibliothek wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reaktionssets (SuperCos I Cosmid Vector Kit, Stratagene) gemäß den Instruktionen des Herstellers erstellt. 100 μg der DNA wurden mit 5 U eines Sau3AI Restriktionsenzyms (New England Biolabs) durch Inkubation für 10 Minuten bei 37 °C teilweise verdaut. Die verdaute DNA wurde dephosphoryliert mit 20 U der CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (Alkalische Phosphatase aus dem Kälbermagen), Finnzymes). Die DNA Moleküle der verschiedenen Längen wurden über einen 15-30 % Sukrosegradienten mittels Ultrazentrifugation für 22 Stunden bei einer Temperatur von 20 °C und einer Rotationsgeschwindigkeit von 22.000 rpm (Beckmann SW 41 TI Rotor) aufgetrennt. Der 12 ml Sukrosegradient wurden in 300 μl Fraktionen aufgeteilt und 10 μl jeder zweiten Fraktion wurden auf einem 0,5 % Agarosegel mittels Elektrophorese untersucht. Die Fraktionen, die gemäß des Gelelektrophoreseergebnisses DNA-Fragmente in einer Länge von mehr als 20 Kilobasenpaaren enthielten, wurden kombiniert und die DNA wurde aus ihnen mit Ethanol gefällt. Die erhaltene DNA (etwa 2 μg) wurde in den SuperCos I Cosmidvektor (etwa 1 μg) inseriert, welcher mit XbaI (New England Biolabs) verdaut worden war und anschließend mit CIAP dephosphoryliert und schließlich mit BamHI (Boehringer Mannheim) verdaut wurde,. Die Ligation wurde mit T4 DNA-Ligase (Promega) durch Inkubation der Mischung bei 4 °C über Nacht ausgeführt. Die Reaktionsmischung wurde in λ Partikel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reaktionssets (Gigapack III Gold Verpackungsextrakt, Strategene) gemäß den Instruktionen des Herstellers verpackt und die verpackten Phagen wurden verwendet, um E. Coli Wirtszellen (XL1-Blue MR-Stamm, Stratagene) zu infizieren. Eine Ligation führte zu mehr als 5 × 10 Klonen, die als repräsentative Genbank betrachtet werden können.
Die Hybridisierungsprobe zum Screenen der Genbank wurde vom lac2 Gen des Pilzes Podospora anserina erhalten. Dieses Gen wurde als Probe ausgesucht, da die N-terminale Aminosäuresequenz und die internen Peptide der M. albomyces Laccase homolog zu der Aminosäuresequenz der P. anserina Laccase sind. Der Pilz P. anserina wurde auf einem Substrat gezogen, welches in 1 beschrieben ist. Genomische DNA wurde aus dem Mycel isoliert, welches nach drei Tagen Wachstum gesammelt und gefriergetrocknet wurde, wobei ein kommerziell erhältliches Reaktionsset (Easy DNA Kit, Invitrogen) gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt wurde. Das lac2 Gen wurde durch eine PCR-Reaktion vervielfältigt, welche Primer einsetzte, die auf der publizierten Sequenz des lac2 Gens basierten: 5'-TGCCACACTGCCGCCAACCGTGCT-3' (SEQ ID NO: 3) (vorwärts) und 5'-GTTCTTGATATACCAATCAGGATG-3' (SEQ ID NO: 4) (revers). Das zur Vervielfältigung verwendete PCR-Programm umfasste 26 Zyklen, wobei das Temperaturprogramm wie nachfolgend war: Denaturierung der DNA bei 94 °C für 45 Sekunden, Insertion der Primer bei 55 °C für 1 Minute, verlängern des DNA-Strangs mit der Polymerase bei 72 °C für 2,5 Minuten. Abschließend wurde der Strang bei 72 °C für 5 Minuten verlängert. Das erhaltene Fragment von etwa 1,9 Kilobasenpaaren Länge wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Sein Verhalten als Probe wurde mittels Southern-Hybridisierung mit genomischer DNA des Pilzes M. albomyces wie nachfolgend beschrieben, untersucht: In zwei verschiedenen Reaktionen wurden 40 μg DNA mit 80 U EcoRI und HindIII Restriktionsenzymen (New England Biolabs) bei 37 °C für 5 Minuten gespalten. Die Fragmente wurden mittels Elektrophorese auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt; die DNA wurde denaturiert und auf Hybond N Membranen (Amersham Pharmacia Biotech) übertragen (die Methode ist bei Sambrook et al., 1989, beschrieben). Das P. anserina lac2 Gen wurde mit α-³²P-dCTP unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reaktionssets (Random primed DNA labelling kit, Boehringer Mannheim) gemäß der Instruktion des Herstellers markiert und die Bindung der Probe wurde bei vier verschiedenen Hybridisierungstemperaruren: 48, 50, 55 und 60° C untersucht. Die Hybridisierungslösung enthielt 6 × SSC, 1 × Denhardt's (Sambrook et al., 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml Heringssperma DNA (das SSC enthielt 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat bei pH 7,0). Die Hybridisierung enthielt etwa 5 × 10⁵ cpm/ml der markierten Probe. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen in 2 × SSC, das 0,1 % SDS enthielt, zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur und hieran anschließend für 30 Minuten bei derselben Temperatur, bei welcher die Hybridisierung durchgeführt wurde, gewaschen. Die Membranen wurden in eine Expositionskassette mit einem Film eingelegt und die Exposition auf dem Film zeigte, dass das P. ansernia lac2 Gen mit einem DNA-Fragment hybridisierte, welches etwa 4,5 Kilobasenpaare lang war und mit ExoRI Enzym gespalten war.
Etwa 5 × 10⁵ Klone der erhaltenen genomischen Genbank wurden auf Agarplatten ausplattiert und die Kolonien, die über Nacht gewachsen waren, wurden auf Nitrozellulosemembranen (Protran, Schleicher & Schuell) überführt. Die DNA, die in diesen Kolonien enthalten war, wurde denaturiert (Sambrook et al., 1989) und dann an die Membranen durch Erhitzen auf 80 °C für zwei Stunden angeheftet. Nach dem Anheften der DNA wurde der Rest der Bakterienkolonien von den Membranen durch Abreiben mit einer Waschflüssigkeit bei 48 °C abgewaschen (Sambrook et al., 1989). Die an die Membran gebundene DNA wurde über Nacht bei einer Temperatur von 57 °C mit einem P. anserina lac2 Gen, welches mit α-³²P-dCTP markiert war, in einer wie oben beschriebenen Hybridisierungslösung hybridisiert. Entsprechend dem erhaltenen Hybridisierungssignal wurden mehrere Kolonien von den Originalplatten genommen, nämlich solche Kolonien, die mit dem P. anserina lac2 Gen hybridisierten. Diese Kolonien wurden weiter mit dem P. anserina lac2 Gen hybridisiert und entsprechend den radioaktiven Signalen wurden sechs Kolonien für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Cosmide wurden aus ihnen isoliert (Plasmidaufreinigungsprotokoll, Tip-500, QIAGEN). Das Restriktionsenzym, welches es möglich macht, das Laccasegen aus dem Cosmid zu isolieren, wurde ausgesucht, nachdem das Cosmid mit 19 verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten wurde. Die erhaltenen Fragmente wurden einer Southern-Hybridisierung bei einer Temperatur von 57 °C unterzogen, bei welcher das P. anserina lac2 Gen wie oben verwendet wurde. Ein EcoRI-Fragment von etwa 4,5 Kilobasenpaaren Länge wurde erneut mit dem lac2 Gen hybridisiert. Das Cosmid wurde mit EcoRI gespalten und das Fragment mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Das erhaltene Fragment wurde in das Plasmid pBluescriptSK^– (Stratagene) inseriert und das Plasmid wurde in E. Coli Wirtszellen (Stamm DH5α, Gibco BRL) mittels Elektroporation transformiert. Ein aus der Transformation erhaltener Klon enthielt das erwünschte EcoRI-Fragment im pLLK1-Plasmid. Ein Laccasegen wurde von diesem Plasmid sequenziert unter der Verwendung von synthetisierten Oligonucleotidprimern. Die Sequenzierreaktionen wurden unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reaktionssets (DNA-Sequenzierungskit, dRhodamine Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction, PE Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.
Um die Introns, die im M. albomyces Laccasegen enthalten waren, zu erfassen, wurde eine komplimentäre DNA (cDNA), die der M. albomyces Laccase entspricht, mittels RACE-PCR unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reaktionssets in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers kloniert (FirstChoice^TM RLM-RACE Kit, Ambion, Inc.). Die RNA wurde aus den M. albomyces Zellen mittels eines kommerziell erhältlichen Reaktionssets (TRIZOL^® Reagent, Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die RNA wurde dephosphorylisiert und in DNA umgeschrieben unter Verwendung eines invers transkribierenden Enzyms, danach wurden das 5' und das 3' Ende des Gens mittels verschiedener PCR-Reaktionen gemäß den Instruktionen des Herstellers vervielfältigt. Die Vervielfältigung der beiden cDNA-Enden wurde durch zwei sequenzielle PCR-Reaktionen unter der Verwendung verschiedener Primer ausgeführt. In der ersten Reaktion wurde der gewünschte Teil der Laccase cDNA unter Verwendung eines genspezifischen Primers vervielfältigt und in der zweiten Reaktion wurde die Vervielfältigung der Laccase cDNA durch die Verwendung eines anderen genspezifischen Primers sichergestellt. In jeder PCR-Reaktion kam jeweils einer der für die Vervielfältigung der DNA-benötigten Primer aus dem RLM-RACE Kit und er war an die Adapterregionen, die mit den Enden der cDNA verbunden waren, gebunden. Das für die Vervielfältigung verwendete PCR-Programm umfasste 35 Zyklen, wobei der Temperaturverlauf wie nachfolgend war: Denaturierung der DNA bei 94 °C für 30 Sekunden, Insertion der Primer bei 60 bis 62 °C für 30 Sekunden, Verlängerung des DNA-Strangs bei 72 °C für 2 Minuten. Bei der Vervielfältigung des 5' Endes betrug die Insertionstemperatur der Primer 60° C und in jener für das 3' Ende 62 °C C. Abschließend wurde die Strangverlängerung für 7 Minuten bei 72 °C ausgeführt. Die genspezifischen Primer, die für die Vervielfältigung des 5' Endes verwendet wurden, waren wie folgt: In der ersten PCR-Reaktion 5'-GCCGGTGAGGATGTAGTCGATGAT-3' (SEQ ID NO: 5) und in der zweiten Reaktion 5'-AGGTGACGTTGAACCAGTAGTTGTC-3' (SEQ ID NO: 6). Die genspezifischen Primer, die für die Vervielfältigung des 3' Endes verwendet wurden, waren wie nachfolgend: In der ersten PCR-Reaktion 5'-CTGGTGCACTTCACGCAGAACAA-3' (SEQ ID NO: 7) und in der zweiten Reaktion 5'-AGAACCACTTCCAGGTGTCGCT-3' (SEQ ID NO: 8). Aus den RLM-RACE Reaktionen wurde ein Fragment von 1194 Basenpaaren Länge vom 5' Ende erhalten und ein Fragment mit 1322 Basenpaaren Länge des 3' Endes. Die Fragmente wurden mittels Agarorsegelelektrophorese isoliert und in einen pCR2.1-TOPO^TM unter Verwendung eines kommerziellen Reaktionssets (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen) gemäß den Instruktionen des Herstellers, kloniert. Das Plasmid wurde in E. coli Wirtszellen (Stamm TAP10F', Invitrogen) mittels Elektroporation gemäß den Instruktionen des Reaktionssets transformiert. Die klonierten Fragmente wurden sequenziert und die Positionen der Introns dem Gen der M. albomyces Laccase durch Vergleich der genomischen Sequenz mit der erhaltenen cDNA-Sequenz etabliert.
Die genomische Sequenz des Gens ist in 15 gezeigt. Die Introns sind unterstrichen.
Literaturverzeichnis

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SEQUENZLISTE

Claims

Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das Laccase-Enzymaktivität hat, mit einem pH-Optimum innerhalb 5-8 und bei pH 3-9 und bei einer Temperatur von 30-80 °C aktiv ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend: a) ein Nucleinsäuremolekül, umfassend die codierende Region der Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt; b) ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, codiert; c) ein Nucleinsäuremolekül, umfassend eine codierende Sequenz, die sich von der codierenden Sequenz von SEQ ID NO: 1 auf Grund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet; d) ein Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisiert; und e) ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das Laccase-Aktivität hat und dessen Aminosäuresequenz mindestens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zeigt.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids mindestens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zeigt.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, umfasst.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die codierende Region der Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfasst.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Laccase-Enzym mit einem pH-Optimum innerhalb 6 bis 8 codiert.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Laccase-Enzym mit einem Temperaturoptimum von 50 bis 80 °C codiert.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Laccase-Enzym mit einem pH-Optimum von etwa 7,5 und einem Temperaturoptimum von etwa 70 °C codiert.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Laccase-Enzym codiert, das bei 60 °C für 2 Stunden im Wesentlichen unverändert bleibt.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,0, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung, und ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa, wie mittels SDS-PAGE bestimmt, hat.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Mikroorganismus-Wirt, dadurch gekennzeichnet, dass er durch das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder durch den Vektor gemäß Anspruch 10 transformiert wurde.
Wirt gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein filamentöser Pilz, eine Hefe oder ein Bakterium ist.
Wirt gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass er zu den Genera Aspergillus, Trichoderma oder Fusarium gehört.
Verfahren zum Herstellen von Laccase, gekennzeichnet durch – Übertragen eines Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des Vektors gemäß Anspruch 10 in eine Mikroorganismus-Wirtszelle zum Exprimieren des – Nucleinsäuremoleküls und gegebenenfalls zum Sekretieren dessen aus der Wirtszelle; und – Gewinnen des Polypeptids mit Laccase-Aktivität entweder aus den Zellen oder aus der Kulturlösung des Mikroorganismus-Wirts.
Polypeptid mit Laccase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend: a) ein Nucleinsäuremolekül, das die codierende Region der Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfasst; b) ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, umfasst, codiert; c) ein Nucleinsäuremolekül, das sich von der codierenden Sequenz der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 auf Grund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet; d) ein Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisiert; und e) ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das Laccase-Aktivität hat und dessen Aminosäuresequenz mindestens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO.: 2 zeigt, und dass das pH-Optimum des Polypeptids innerhalb von 5-8 ist und das Polypeptid bei pH 3-9 und bei einer Temperatur von 30-80 °C aktiv ist.
Polypeptid mit Laccase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zeigt, und dass das pH-Optimum des Polypeptids innerhalb 5-8 ist und das Polypeptid bei pH 3-9 und bei einer Temperatur von 30-80 °C aktiv ist.
Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es an dem Polypeptid gemäß Anspruch 15 oder 16, welches Laccase-Aktivität hat, angereichert ist, verglichen damit, was die Stämme des Melanocarpus-Genus natürlicherweise in ihren Kulturlösungen produzieren.
Enzympräparat gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es mehr als 10 mg/l, vorzugsweise ≥ 30 mg/l, Laccase umfasst.
Enzympräparat gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Additiv, wie einen Stabilisator und/oder einen Puffer, umfasst.
Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, des Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, beim Oxidieren von färbenden Mitteln.
Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, des Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, beim Polymerisieren von Verbindungen.
Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, des Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, beim Oxidieren von Fasern.
Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, des Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, bei der Delignifizierung von Fasern.
Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, des Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, beim Verbessern der Laufeigenschaft von Papiermaschinen.
Verfahren zum Oxidieren von färbenden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, dass das färbende Mittel in Gegenwart einer ausreichenden Menge Sauerstoff mit dem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, dem Enzympräparat gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, bei pH 4-8, einer Temperatur von 40-80 °C für 5 min-24 Stunden mit einer Menge an Laccase, die etwa 1-1000 nkat/g färbendes Mittel beträgt, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zum Polymerisieren von Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass die zu polymerisierende Verbindung in Gegenwart einer ausreichenden Menge Sauerstoff mit dem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, dem Enzympräparat gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, bei pH 4-8, einer Temperatur von 40-80 °C für 5 min-24 Stunden mit einer Menge an Laccase, die etwa 1-1000 nkat/g der Substanz, die polymerisiert werden soll, beträgt, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zum Oxidieren von Fasern, dadurch gekennzeichnet, dass die Fasern, die oxidiert werden sollen, in Gegenwart einer ausreichenden Menge Sauerstoff mit dem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, dem Enzympräparat gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, bei pH 5-8, einer Temperatur von 50-80 °C für 5 min-24 Stunden mit einer Menge an Laccase, die etwa 1-1000 nkat/g Trockenmasse der Fasern beträgt, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zum Delignifizieren von Fasern, dadurch gekennzeichnet, dass die Faser, die delignifiziert werden soll, in Gegenwart einer ausreichenden Menge Sauerstoff mit dem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, dem Enzympräparat gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder der Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, für 5 min-24 Stunden, wobei der pH innerhalb 5-8, die Temperatur innerhalb 50-80 °C ist, mit einer Menge an Laccase, die etwa 1-1000 nkat/g Trockenmasse der Fasern beträgt, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zum Verbessern der Laufeigenschaft von Papiermaschinen, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, das Enzympräparat gemäß eifern der Ansprüche 17 bis 19 oder die Laccase, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 erhalten wurde, 1-1000 nkat/g Trockenmasse, Fasern oder Liter Kreislaufwasser, in das Prozesswasser oder den Stoffauflaufkasten der Papiermaschine zugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass, falls benötigt, ein Vermittler bzw. Mediator in dem Verfahren verwendet wird.