DE60018437T2

DE60018437T2 - Phenoloxidierendes enzyme von stachybotrys

Info

Publication number: DE60018437T2
Application number: DE60018437T
Authority: DE
Inventors: Huaming Wang
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1999-09-22
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2020-09-12
Also published as: CN1391611A; EP1214421B1; EP1214421A2; JP4995389B2; MXPA02003035A; US6168936B1; CA2384954A1; JP2003528582A; BR0014229A; CN100378224C; KR20020034195A; CA2384954C; NO20021386L; WO2001021809A3; NZ518004A; DE60018437D1; AU7476700A; ATE290085T1; WO2001021809A2; NO20021386D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Phenol-oxidierende Enzyme, insbesondere neue Phenol-oxidierende Enzyme, die von Stämmen von Stachybotrys herrühren, sowie neue Stämme der Gattung Stachybotrys, die diese Enzyme produzieren. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Wirtszellen zur Expression von Phenol-oxidierende Stachybotrys-Enzymen sowie Verfahren zur Herstellung von Expressionssystemen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Phenol-oxidierende Enzyme funktionieren durch Katalyse von Redox-Reaktionen, d.h. mittels Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise eine Phenolverbindung) auf molekularen Sauerstoff (der als Elektronenakzeptor wirkt), der zu H₂O reduziert wird. Während Phenol-oxidierende Enzyme zahlreiche verschiedene Phenolverbindungen als Elektronendonoren nutzen können, sind sie in Bezug auf molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor sehr spezifisch.
Phenol-oxidierende Enzyme können in einem breiten Anwendungsbereich eingesetzt werden, umfassend die Waschmittelindustrie, die Papier- und Zellstoffindustrie, die Textilindustrie und die Nahrungsmittelindustrie. In der Waschmittelindustrie wurden bisher Phenol-oxidierende Enzyme zur Vermeidung der Übertragung von Farbstoffen in Lösung von einer Textilie zur anderen während des Waschens mit dem Waschmittel verwendet, eine Anwendung, die üblicherweise als Farbübertrittshemmung bezeichnet wird.
Die meisten Phenol-oxidierenden Enzyme haben ihr pH-Wert-Optimum im sauren pH-Bereich, während sie bei neutralen oder basischen pH-Werten inaktiv sind.
Phenol-oxidierende Enzyme sind dafür bekannt, von zahlreichen verschiedenen Pilzen, umfassend Spezies der Gattungen Aspergillus, Neurospora, Podospora, Boty tis, Pleurotus, Fomes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Rhizoctonia und Lentinus, produziert zu werden. Es besteht jedoch weiterhin der Bedarf, Phenol-oxidierende Enzyme zu identifizieren und zu isolieren, sowie Organismen, die in der Lage sind, Phenol-oxidierende Enzyme natürlich zu produzieren, die zur Verwendung in reinigenden Waschverfahren und -zusammensetzungen optimale pH-Werte im basischen Bereich aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Phenol-oxidierende Enzyme. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Phenol-oxidierende Enzyme, die aus Stachybotrys erhältlich sind. Insbesondere sind die Enzyme der vorliegenden Erfindung in der Lage, die Farbe, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen assoziiert ist, zu modifizieren, insbesondere bei neutralem oder basischem pH. Auf Grundlage ihrer Fähigkeit zur Farbveränderung können Phenol-oxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung beispielsweise zum Bleichen von Zellstoff und Papier, zum Bleichen der Farbe von Flecken auf Textilien sowie in Reinigungs- und Textilanwendungen eingesetzt werden. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Phenol-oxidierende Enzym in der Lage, die Farbe eines Farbstoffes oder einer farbigen Verbindung in Abwesenheit eines Verstärkers zu modifizieren. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Phenol-oxidierende Enzym in der Lage, die Farbe in Gegenwart eines Verstärkers zu modifizieren.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifikation und Charakterisierung einer genomischen Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), die für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, das aus Stachybotrys erhältlich ist und die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Phenol-oxidierende Enzyme bereit, die zwischen zumindest 68 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 68 % Identität, zumin dest 70 % Identität, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität mit dem Phenol-oxidierenden Enzym aufweisen, das die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist, solange das Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer Ausführungsform weist das Phenol-oxidierende Enzym die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte oder die in Stachybotrys chartarum mit der MUCL-Zugriffsnummer 38898 enthaltene Aminosäuresequenz auf.
In einer Ausführungsform ist das Phenol-oxidierende Enzym aus einer Stachybotrys-Spezies, umfassend Stachybotrys parvispora, Stachybotrys chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica, erhältlich. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Stachybotrys Stachybotrys chartarum MUCL 38898 und S. chartarum MUCL 30782.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotid bereit, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, worin dieses Polynucleotid eine Nucleinsäuresequenz mit zwischen zumindest 65 % und 100 % Identität, d.h. mit zumindest 65 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 %, zumindest 85 %, zumindest 90 % und zumindest 95 % Identität, zu Seq.-ID Nr. 1 umfasst, solange das Polynucleotid für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst Polynucleotidsequenzen, die unter hochstringenten Bedingungen an das in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Polynucleotid hybridisieren, solange die Sequenz in der Lage ist, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, die für die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren. In einer Ausführungsform weist das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte oder die in Stachybotrys chartarum mit der MUCL-Zugriffsnummer 38898 enthaltene Nucleinsäuresequenz auf. Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassende Expressionsvektoren und Wirtszellen bereit. Die vorliegende Erfindung betrifft weiters Verfahren zur Herstellung eines Phenol-oxidierenden Enzyms der vorliegenden Erfindung. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Phenol-oxidierenden Enzyms bereit, umfassend den Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle, die ein isoliertes Polynucleotid umfasst, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym mit einer Sequenz kodiert, die unter für die Produktion dieses Phenol-oxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen zwischen zumindest 68 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 68 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität, mit dem Phenol-oxidierenden Enzym aufweist, das die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist; und gegebenenfalls den Schritt des Gewinnens dieses produzierten Phenol-oxidierenden Enzyms. In einer Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Sequenz. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Sequenz. In einer zusätzlichen Ausführungsform hybridisiert das Polynucleotid unter hochstringenten Bedingungen an das Polynucleotid mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigten oder in Stachybotrys chartarum mit der MUCL-Zugriffsnummer 38898 enthaltenen Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform weist das Polynucleotid zwischen 65 % und 100 %, d.h. zumindest 65 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität mit Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 auf.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, bereit, umfassend die Schritte des Gewinnens eines isolierten Polynucleotids, das für dieses Phenol-oxidierende Enzym kodiert, wobei das Polynucleotid zwischen zumindest 65 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 65 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität, mit Seq.-ID Nr. 3, aufweist; des Einführens dieses Polynucleotids in die Wirtszelle; und das Züchten dieser Wirtszelle unter für die Produktion des Phenol-oxidierenden Enzyms geeigne ten Bedingungen. In einer Ausführungsform wird das Polynucleotid in das Wirtsgenom integriert, und in einer anderen Ausführungsform ist das Polynucleotid auf einem Replikationsplasmid vorhanden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotidsequenzen, die unter hochstringenten Bedingungen an das in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Polynucleotid hybridisieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynucleotide bereit, die für die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren. In einer Ausführungsform weist das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte oder in Stachybotrys chartarum mit der MUCL-Zugriffsnummer 38898 enthaltene Nucleinsäuresequenz auf.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, die für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, Fadenpilze, Hefe und Bakterien ein. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Fadenpilz, umfassend Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies und Mucor-Spezies. In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst die Fadenpilz-Wirtszelle Aspergillus niger var. awamori und Trichoderma reseei.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine Hefe, die Saccharomyces-, Pichia-, Hansenula-, Schizosaccharomyces-, Kluyveromyces- und Yarrowia-Spezies umfasst. In wiederum einer anderen Ausführungsform ist die Saccharomyces-Spezies Saccharomyces cerevisiae. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Bakterie, umfassend gram-positive Bakterien, wie beispielsweise eine Bacillus-Spezies, und gram-negative Bakterien, wie beispielsweise eine Escherichia-Spezies.
Auch hierin bereitgestellt sind enzymatische Zusammensetzungen, die eine Aminosäure mit zwischen zumindest 68 % und 100% Identität, d.h. zumindest 68 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität, mit dem Phenol-oxidierenden Enzym mit der in Seq.-ID Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz umfassen. In einer Ausführungsform weist die Aminosäure die in Seq.-ID Nr. 2 ge zeigte Sequenz auf. Solche enzymatischen Zusammensetzungen können beispielsweise zur Herstellung von Waschmitteln und anderen Reinigungszusammensetzungen; Zusammensetzungen zur Verwendung in Zellstoff- und Papieranwendungen; und Textilanwendungen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Modifikation der Farbe, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen assoziiert ist, die in Flecken auf Proben auftreten, umfassend die Schritte des Kontaktierens der Probe mit einer Zusammensetzung, die eine Aminosäure mit einer Sequenz, die zwischen zumindest 68 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 68 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität, mit dem Phenol-oxidierenden Enzym aufweist, das die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz hat, umfasst, solange das Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens entspricht die Aminosäure jener, die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt ist.
In einem Aspekt des Verfahrens liegt der optimale pH zwischen 5,0 und 11,0, in einem anderen Aspekt liegt der optimale pH zwischen 7 und 10,5, und wiederum in einem anderen Aspekt liegt der optimale pH zwischen 8,0 und 10. In einem weiteren Aspekt des Verfahrens liegt die optimale Temperatur zwischen 20 und 60 °C, und in einem anderen Aspekt zwischen 20 und 40 °C.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1) für ein aus Stachybotrys chartarum durch PCR erhältliches Phenol-oxidierendes Enzym, wie in Beispiel 5 beschrieben.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) der Aminosäure, die hierin als das Stachybotrys-Oxidase-B-Gen bezeichnet wird.
3 veranschaulicht die genomische Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) eines aus Stachybotrys chartarum erhältlichen Phenol-oxidierenden Enzyms. Diese Nucleinsäuresequenz wird hierin als Stachybotrys-Oxidase-B-Gen bezeichnet.
4 ist eine Aminosäureabgleich von Stachybotrys-Phenol-Oxidase-B-Enzym der Seq.-ID Nr. 2 (untere Linie) und Bilirubin-Oxidase (Seq.-ID Nr. 4).
5 zeigt eine Illustration des Vektors pGATP2-spoB, der zur Expression von Stachybotrys-Phenol-oxidierendem Enzym in Aspergillus verwendet wurde. Die Basen 1 bis 1.134 enthalten den Aspergillus-niger-Glucoamylase-Genpromotor. Die Basen 3.098 bis 3.356 und 4.950 bis 4.971 enthalten den Aspergillus-niger-Glucoamylase-Terminator. Das Aspergillus-nidulans-pyrG-Gen wurde von 3.357 bis 4.949 als Pilztransformationsmarker insertiert. Der Rest des Plasmids enthält pBR322-Sequenzen zur Fortpflanzung in E. coli. Nucleinsäure, die für das Stachybotrys-Phenol-oxidierende Enzym von Seq.-ID Nr. 1 kodiert, wurde in die Restriktionsstellen von Bgl II und Age I kloniert.
6 ist eine Illustration der Expression des Stachybotrys-Oxidase-B-Proteins in einem Replikationsplasmid. Die Stachybotrys-Oxidase-Expression steht unter der Steuerung von Aspergillus-Glucoamylase-Promotor und -Terminator. Das Transformationsmarker-pyrG-Gen und die AMA-1-Sequenz sind aus Aspergillus nidulans.
7 zeigt das pH-Profil für Stachybotrys-Oxidase-B gegenüber dem Substrat 2,6-DMP.
8 zeigt nicht-denaturierte (native) Gelelektrophorese von Stachybotrys-chartarum-Fraktionen aus einer Ionenaustausch-Säule (silbergefärbt), wie in Beispiel 1 beschrieben.
9 zeigt nicht-denaturierte Gelelektrophorese von Fraktionen mit ABTS-Deckschicht, wie in Beispiel 1 beschrieben.
10 zeigt ein SDS-PAGE-Gel von Banden, die aus einer ABTS-Deckschicht des in 9 gezeigten Gels identifiziert und isoliert wurden. Stachybotrys-chartarum-Oxidase-B ist in der Spur mit der Benennung "Deckschicht 2" gezeigt. Die Spur "Deckschicht 2" zeigt das beobachtete Bandenmuster von Stachybotrys-chartarum-Oxidase-B unter den beschriebenen Bedingungen.
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
Hierin bezieht sich die Bezeichnung Phenol-oxidierendes Enzym auf jene Enzyme, die in der Lage sind, Redox-Reaktionen zu katalysieren, worin der Elektronendonor eine Phenolverbindung ist, und die für molekularen Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor spezifisch sind. Ein veranschaulichendes Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung, das aus Stachybotrys chartarum erhältlich ist, ist in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt. Die vorliegende Erfindung umfasst Phenol-oxidierende Enzyme, die zwischen zumindest 68 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 68 % Identität, zumindest 70 % Identität, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 Identität, mit dem Phenol-oxidierenden Enzym mit der in Seq.-ID Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweisen. Hierin wird Identität durch das GAP-Programm der GCG-Software (University Research Park, Madison, Wisconsin) mit den folgenden Parametern gemessen: Gap Weight = 12; Length Weight = 4; Gap Creation Penalty = 8; und Gap Extension Penalty = 2.
Wie hierin verwendet bezieht sich Stachybotrys auf jede beliebige Stachybotrys-Spezies, die ein Phenol-oxidierendes Enzym bildet, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Derivate von natürlichen Isolaten von Stachybotrys, einschließlich Nachkommenschaft und Mutanten, solange das Derivat in der Lage ist, ein Phenol-oxidierendes Enzym zu produzieren, das in der Lage ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren.
Wie hierin in Bezug auf Phenol-oxidierende Enzyme verwendet, beschreibt die Bezeichnung "erhältlich aus" Phenol-oxidierende Enzyme, die vom jeweils erwähnten Mikroorganismenstamm herrühren oder von diesen natürlich produziert werden. Beispielsweise beziehen sich Phenol-oxidierende Enzyme, die aus Stachybotrys erhältlich sind, auf jene Phenol-oxidierenden Enzyme, die von Stachybotrys natürlich produziert werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Phenol-oxidierende Enzyme, die mit jenen identisch sind, die von Stachybotrys-Spezies produziert werden, die jedoch mittels gentechnologischer Verfahren von Organismen wie beispielsweise Bakterien, Pilze oder Hefe produziert werden, die mit einem für dieses Phenol-oxidierende Enzym kodierenden Gen transformiert sind, oder von Organismen produziert werden, die mit jenen von Stachybotrys identisch oder zu jenen von Stachybotrys äquivalent sind, wie beispielsweise Nachkommenschaft oder Mutanten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Phenol-oxidierende Enzyme, die durch ein Polynucleotid kodiert werden, das in der Lage ist, an das Polynucleotid mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigten Sequenz unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren. Die vorliegende Erfindung umfasst Polynucleotide, die für Phenol-oxidierende Enzyme kodieren, die zumindest 65 % Identität, zumindest 70 %, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität oder zumindest 95 % Identität mit dem Polynucleotid aufweisen, das die in Seq.-ID Nr. 1 offenbarte Sequenz aufweist. Die Identität in Bezug auf die Nucleinsäure wird mittels des GAP-Programms der GCG-Software (University Research Park, Madison, Wisconsin) mit den folgenden Parametern gemessen: Gap Weight = 50; Length Weight = 4; Cap Creation Penalty = 50; und Gap Extension Penalty = 3. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mutanten, Varianten und Derivate, umfassend Abschnitte, der Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung, solange das mutierte, variierte oder derivierte Phenol-oxidierende Enzym in der Lage ist, zumindest eine charakteristische Aktivität des natürlich vorkommenden Phenol-oxidierenden Enzyms beizubehalten.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "farbige Verbindung" auf eine Substanz, die Textilien oder Substanzen Farbe verleiht, was in fleckigem Aussehen resultiert. Wie im Dictionary of Fiber and Textile Technology (Hoechst Celanese Corporation (1990), PO-Box 32414, Charlotte NC 28232) definiert, ist ein Farbstoff eine farbige Verbindung, die mittels chemischer Reaktion, Absorption oder Dispersion in die Faser eingebunden wird. Beispiele für Farbstoffe umfassen Direktblau-Farbstoffe, Säureblau-Farbstoffe, Direktrot-Farbstoffe, Reaktivblau- und Reaktiv-Schwarzfarbstoffe. Ein Katalog von herkömmlich verwendeten Textilfarbstoffen ist im Colour Index, 3. Ausgabe, Bd. 1–8, zu finden. Beispiele für Substanzen, die zu fleckigem Aussehen führen, sind Polyphenole, Carotenoide, Anthocyanine, Tannine, Maillard-Reaktionsprodukte usw.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe zu modifizieren" oder "die Modifikation der farbigen Verbindung", dass der Farbstoff oder die Verbindung durch Oxidation, entweder direkt oder indirekt, so verändert wird, dass entweder die Farbe modifiziert erscheint, d.h. dass die Farbe sichtbar schwächer, blasser, entfärbt, gebleicht oder entfernt zu sein scheint, oder nicht die Farbe beeinflusst ist, jedoch die Verbindung so modifiziert wird, dass neuerliche Farbstoffablagerung verhindert wird. Die vorliegende Erfindung umfasst Modifikationen der Farbe durch jedes beliebige Mittel, umfassend beispielsweise die vollständige Entfernung der farbigen Verbindung von einem Fleck auf einem Stoffstück durch jedes beliebige Mittel sowie eine Reduktion der Farbintensität oder eine Veränderung der Farbe der Verbindung.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Mutanten oder Varianten" im Zusammenhang mit Phenol-oxidierenden Enzymen auf Phenol-oxidierende Enzyme, die durch Änderung der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz und/oder deren Struktur erhalten wurden, beispielsweise durch Änderung der DNA-Nucleotidsequenz des Strukturgens und/oder durch direkte Substitution und/oder Änderung der Aminosäuresequenz und/oder Struktur des Phenol-oxidierenden Enzyms. Die Bezeichnung Phenol-oxidierendes Enzym-"Derivat" bezieht sich wie hierin verwendet auf einen Abschnitt oder ein Fragment der natürlich vorkommenden oder variierten Aminosäuresequenz des Phenol-oxidierenden Enzym mit voller Länge, der/das zumindest eine Aktivität des natürlich vorkommenden Phenol-oxidierenden Enzyms beibehält. Wie hierin verwendet beziehen sich die Bezeichnungen "Mutanten und Varianten" im Zusammenhang mit Mirkoorganismenstämmen auf Zellen, die aus einem natürlichen Isolat erhalten auf gewisse Weise geändert wurden, die beispielsweise eine geänderte DNA-Nucleotidsequenz aufweisen, beispielsweise des Strukturgens, das für das Phenol-oxidierende Enzym kodiert; oder auf Zellen mit anderen Änderungen, die die Expression von Phenol-oxidierendem Enzym beeinflussen.
Die Bezeichnung "Verstärker" oder "Vermittler" bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, die in der Lage ist, die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe in Verbindung mit einem Phenol-oxidierenden Enzym zu modifizieren, oder auf eine Verbindung, die die Oxidationsaktivität des Phenol-oxidierenden Enzyms verstärkt. Das Verstärkungsmittel ist typischerweise eine organische Verbindung.
Phenol-oxidierende Enzyme
Die Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung funktionieren durch Katalyse von Redox-Reaktionen, d.h. über Transfer von Elektronen von einem Elektronendonor (üblicherweise eine Phenolverbindung) auf molekularen Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid (der/das als Elektronenakzeptor wirkt), der/das zu Wasser reduziert wird. Beispiele für solche Enzyme sind Laccasen (EC 1.10.3.2), Bilirubinoxidasen (EC 1.3.3.5), Phenoloxidasen (EC 1.14.18.1) und Catecholoxidasen (EC 1.10.3.1).
Für Phenol-oxidierende Enzyme kodierende Nucleinsäure
Die vorliegende Erfindung umfasst Polynucleotide, die für Phenol-oxidierende Enzyme kodieren, die aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind, worin die Polynucleotide zwischen zumindest 65 % und 100 % Identität, d.h. zumindest 65 % Identität, zumindest 70 % Identität, zumindest 75 % Identität, zumindest 80 % Identität, zumindest 85 % Identität, zumindest 90 % Identität und zumindest 95 % Identität, mit der in Seq.-ID Nr. 3 offenbarten Polynucleotidsequenz aufweisen, solange das durch das Polynucleotid kodierte Enzym in der Lage ist, die mit Farbstoffen und farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren. In einer Ausführungsform weist das Phenol-oxidierende Enzym die in Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Polynucleotidsequenz auf oder weist die in Stachybotrys chartarum mit der MUCL-Zugriffsnummer 38898 enthaltene Polynucleotidsequenz auf. Für Fachleute versteht es sich, dass aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zahlreiche Polynucleotide für das in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Phenol-oxidierende Enzym kodieren können. Die vorliegende Erfindung umfasst alle derartigen Polynucleotide.
Die Nucleinsäure, die für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, kann mittels herkömmlicher Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten werden, beispielsweise klonierte DNA (z.B. eine DNA-"Bibliothek") durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonieren, durch PCR oder durch das Klonieren von genomischer DNA oder Fragmenten davon, gereinigt aus einer gewünschten Zelle wie beispielsweise einer Stachybotrys-Spezies (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D.M. Glover (Hrsg.), DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Bd. I, II (1985)). Nucleinsäuresequenzen, die von genomischer DNA abgeleitet sind, können zusätzlich zu Kodierregionen Regulatorregionen aufweisen. Unabhängig von ihrer Quelle sollte die isolierte Nucleinsäure, die für ein Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert, zur Fortpflanzung des Gens molekular in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
Im Rahmen des molekularen Klonierens des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente gebildet, von denen manche für das gewünschte Gen kodieren. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktions enzyme gespalten werden. Alternativ dazu kann DNase in Gegenwart von Mangan verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann, beispielsweise durch Beschallung, physisch geschert werden. Die linearen DNA-Fragmente können anschließend je nach Größe mittels herkömmlicher Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie, getrennt werden.
Nachdem die Nucleinsäurefragmente gebildet wurden, kann die Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, auf zahlreiche verschiedene Weisen erfolgen. Beispielsweise kann ein Phenol-oxidierendes Enzym, das für das Gen der vorliegenden Erfindung oder seine spezifische RNA kodiert, oder ein Fragment davon, wie beispielsweise eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert werden, um anschließend in Hybridisierungstests verwendet zu werden, um ein gebildetes Gen nachzuweisen (W. Benton und R. Davis, Science 196, 180 (1977); M. Grunstein & D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)). Diese DNA-Fragmente, die substanzielle Sequenzähnlichkeit mit der Sonde aufweisen, hybridisieren unter hochstringenten Bedingungen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Phenol-oxidierende Enzyme, erhältlich aus Stachybotrys-Spezies, die durch Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 als eine Sonde oder Primer und Screening von Nucleinsäure entweder genomischen oder cDNA-Ursprungs identifiziert werden. Nucleinsäure, die für Phenol-oxidierende Enzyme kodiert, die aus Stachybotrys-Spezies erhältlich sind und zumindest 65 % Identität mit Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 aufweisen, kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Abschnitten oder Fragmenten von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 nachgewiesen werden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Nucleinsäure bereit, die für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, das Teil der vorliegenden Erfindung ist, umfassend das Hybridisieren eines Teils einer oder einer gesamten Nucleinsäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 mit Stachybotrys-Nucleinsäure entweder genomischen oder cDNA-Ursprungs.
Demgemäß liegen Polynucleotidsequenzen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, an die in Seq.-ID Nr. 3 offenbarte Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren. Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäure-Bindungskomplexes, wie Berger & Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego, CA (1987)) beschreiben, und verleihen, wie nachstehend beschrieben wird, eine definierte "Stringenz".
"Maximale Stringenz" tritt typischerweise bei etwa Tm –5 °C auf (5 °C unter der Tm der Sonde); "hohe Stringenz" bei etwa 5 °C bis 10 °C unter Tm; "mittlere Stringenz" bei etwa 10 °C bis 20 °C unter Tm; und "geringe Strigenz" bei etwa 20 °C bis 25 °C unter Tm. Beispielsweise sind in der vorliegenden Erfindung die folgenden Bedingungen relevant für hohe Stringenz: Hybridisierung erfolgte bei 37 °C in Puffer mit 50 % Formamid, 5× SSPE, 0,5 % SDS und 50 μg/ml gescherter Hering-DNA. Das Waschen erfolgte einmal bei 65 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1 % SDS, einmal bei 65 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 × SSC und 0,1 % SDS und einmal bei 65 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,1 × SSC und 0,1 % SDS; nachstehend sind Bedingungen für mittlere Stringenz genannt: Hybridisierung erfolgte bei 37 °C in Puffer, der 25 % Formamid, 5× SSPE, 0,5 % SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Das Waschen erfolgte einmal, bei 50 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1 % SDS, einmal bei 50 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 × SSC und 0,1 % SDS; im Folgenden sind die Bedingungen für geringe Stringenz genannt: Hybridisierung erfolgte bei 37 °C in Puffer, der 25 % Formamid, 5× SSPE, 0,5 % SDS und 50 μg/ml gescherte Hering-DNA enthielt. Das Waschen erfolgte einmal bei 37 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 1 × SSC und 0,1 % SDS und einmal bei 37 °C 30 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 × SSC und 0,1 % SDS. Eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, an eine Nucleinsäuresonde unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren, weist etwa 80 % bis 100 % Identität zur Sonde auf; eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, an eine Nucleinsäurensonde unter mittelstringenten Bedingungen zu hybridisieren, weist etwa 50 % bis etwa 80 % Identität zur Sonde auf. Die hierin verwendete Bezeichnung "Hybridisierung" soll "das Verfahren, mittels dessen sich ein Nucleinsäurestrang mit einem komplementären Strang über Basenpaarung verbindet" (J. Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY (1994)), einschließen.
Das Amplifikationsverfahren wurde im Rahmen von Polymerasekettenreaktion-(PCR-) Verfahren durchgeführt, wie sie von C.W. Dieffenbach und G.S. Dveksler (PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY (1995)) beschrieben werden. Eine Nucleinsäuresequenz mit zumindest 10 Nucleotiden und bis zu etwa 60 Nucleotiden aus Seq.-ID Nr. 3, vorzugsweise mit etwa 12 bis 30 Nucleotiden, und noch bevorzugter mit etwa 25 Nucleotiden, können als PCR-Primer verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren eines Nucleinsäurekonstrukts der Erfindung aus einer cDNA oder einer genomischen Bibliothek erfolgt mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotidsonden, die auf Grundlage der Aminosäuresequenz des Proteins gebildet wurden, die die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Beispielsweise kann PCR unter Verwendung der im US-Patent Nr. 4.683.202 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt Wirtszellen, Expressionsverfahren und Systeme zur Produktion von Phenol-oxidierenden Enzymen in Wirts-Mikroorganismen wie beispielsweise Pilzen, Hefe und Bakterien bereit. Nachdem die für ein Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kodierende Nucleinsäure erhalten wurde, können rekombinante Wirtszellen, die Nucleinsäure enthalten, unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren konstruiert werden. Verfahren der Molekularbiologie sind in Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), offenbart. Für Phenol-oxidierende Enzyme kodierende Nucleinsäure, die zwischen zumindest 65 % und 100 %, zumindest 65 %, zumindest 70 %, zumindest 75 %, zumindest 80 %, zumindest 85 %, zumindest 90 % und zumindest 95 % Identität mit der Nucleinsäure aus Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3, gemessen mit dem GAP-Programm der GCG-Software (University Research Park, Madinson, Wisconsin) mit den folgenden Parametern: Gap Weight = 50; Length Weight = 4; Cap Creation Penalty = 50; und Gap Extension Penalty = 3, aufweist, wird erhalten und unter Verwendung geeigneter Vektoren zu einer Wirtszelle transformiert. Zahlreiche verschiedene Vektoren und. Transformations- und Expressionskassetten, die zum Klonieren, zur Transformation und Expression in Pilzen, Hefe und Bakterien geeignet sind, sind Fachleuten bekannt.
Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, die Transkription und Translation der Nucleinsäure steuern, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, die autonome Replikation oder chromosomale Integration ermöglichen. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' des Gens, die Transkriptionsstartkontrollen in sich trägt, und eine Region 3' des DNA-Fragments, die die Transkriptionstermination kontrolliert. Diese Kontrollregionen können von Genen abgeleitet sein, die zum Wirt homolog oder heterolog sind, solange die ausgewählte Kontrollregion in der Lage ist, in der Wirtszelle zu funktionieren.
Startkontrollregionen oder Promotoren, die nützlich sind, um Expression der Phenol-oxidierenden Enzyme in einer Wirtszelle zu steuern, sind Fachleuten bekannt. Praktisch ist jeder beliebige Promotor, der in der Lage ist, diese Phenol-oxidierenden Enzyme zu steuern, für die vorliegende Erfindung geeignet. Nucleinsäure, die für das Phenol-oxidierende Enzym kodiert, ist für wirksame Expression der oxidativen oder reduzierenden Enzyme durch Startcodons operabel an Expressionskontrollregionen gebunden. Nachdem geeignete Kassetten konstruiert wurden, werden sie verwendet, um die Wirtszelle zu transformieren.
Allgemeine Transformationsverfahren werden in Current Protocols In Molecular Biology (Bd. 1, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Inc., Kapitel 9 (1987)) beschrieben und umfassen Calciumphosphatverfahren, Transformation unter Verwendung von PEG und Elektroporation. Für Aspergillus und Trichoderma kann PEG- und Calcium-vermittelte Transformation verwendet werden (Finkelstein, DB, Transformation. In: Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Produkts (Finkelstein & Bill (Hrsg.)), 113, 156 (1992)). Elektroporation von Protoplasten wird in Finkelstein, DB, Transformation. In: Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Pro ducts (Finkelstein & Bill (Hrsg.)), 113 – 156 (1992) offenbart. Mikroprojektions-Beschuss von Konidia wird in Fungaro et al., Transformation of Aspergillus ridulans by microprojection bombardment on intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125, 293-298 (1995), beschrieben. Agrobacterium-vermittelte Transformation wird in Groot et al., Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi, Nature Biotechnologie 16, 839-842 (1998), offenbart. Zur Transformation von Saccharomyces sind Fachleuten Lithiumacetat-vermittelte Transformation und PEG- und Calcium-vermittelte Protoplastentransformation sowie Elektroporationverfahren bekannt.
Wirtszellen, die die Kodiersequenz für ein Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung enthalten und das Protein exprimieren, können durch vielzählige Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Proteinbioassay- oder Immunoassay-Verfahren, die Membran-basierte, Lösungs-basierte oder Chip-basierte Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung der Nucleinsäure oder des Proteins umfassen.
Wie hierin beschrieben wurde die genomische Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), die für aus Stachybotrys chartarum (MUCL 38898) erhältliches Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, isoliert und in Aspergillus niger var. awamori und Trichoderma reesei exprimiert.
Aktivität von Phenol-oxidierenden Enzymen
Die Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, zahlreiche verschiedene Phenolverbindungen als Elektronendonor zu verwenden, während sie für molekularen Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor sehr spezifisch sind.
Je nach dem spezifischen Substrat und den Reaktionsbedingungen, z.B. Temperatur, Gegenwart oder Abwesenheit von Verstärkern usw., hat jede Oxidationsreaktion von Phenol-oxidierendem Enzym ihren optimalen pH.
Anwendungen von Polyphenol-oxidierenden Enzymen
Wie nachstehend beschrieben sind die Stachybotrys-Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung in der Lage, zahlreiche verschiedene Farbstoffe und farbige Verbindungen mit verschiedenen chemischen Strukturen unter Verwendung von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor zu oxidieren. Demgemäß werden Phenol-oxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung bei Anwendungen verwendet, bei denen es wünschenswert ist, die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe zu modifizieren, beispielsweise beim Reinigen, zur Entfernung von Speiseflecken aus Stoffen; und für Anwendungen mit Textilien, Papier und Zellstoff. Ein Vermittler oder Verstärker kann erforderlich sein, um gewünschte Wirkung zu erzielen.
Farbige Verbindungen
In der vorliegenden Erfindung können zahlreiche farbige Verbindungen Ziele für Oxidation durch Phenol-oxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung sein. Beispielsweise können in Reinigungsanwendungen farbige Substanzen, die als Flecken auf Stoffen auftreten können, ein Ziel sein. Mehrere Arten oder Klassen farbiger Substanzen können in Form von Flecken auftreten, wie beispielsweise Porphyrin-abge leitete Strukturen wie Häm in Blutflecken oder Chlorophyll in Pflanzen; Tannine und Polyphenole (siehe P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edinburgh, 169-198 (1972)), die in Teeflecken, Weinflecken, Bananenflecken, Pfirsichflecken auftreten; Carotenoide, die farbigen Substanzen, die in Tomaten (Lycopin, rot), Mango (Carotin, orange-gelb) auftreten (G.E. Bartley et al., The Plant Cell, Bd. 7, 1027-1038 (1995)); Anthocyanine, die stark gefärbten Moleküle, die in vielen Früchten und Blumen auftreten (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Hrsg. Oliver & Boyd, Edinburgh, 135-169 (1972)); und Maillard-Reaktionsprodukte, die gelb/braun-gefärbten Substanzen, die beim Erhitzen von Gemischen von Kohlehydratmolekülen in Gegenwart von Protein/Peptid-Strukturen, beispielsweise von Speiseölen, auftreten.
Verstärker
Ein Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kann so wirken, dass es die mit Farbstoffen oder farbigen Verbindungen assoziierte Farbe, je nach den Eigenschaften der Verbindung in Gegenwart oder Abwesenheit von Verstärkern, modifiziert. Ist eine Verbindung in der Lage, als ein direktes Substrat für das Phenol-oxidierende Enzym zu wirken, wird das Phenol-oxidierende Enzym die mit einem Farbstoff oder einer farbigen Verbindung assoziierte Farbe in Abwesenheit eines Verstärkers modifizieren, wobei ein Verstärker für optimale Aktivität des Phenol-oxidierenden Enzyms stets bevorzugt werden kann. Für andere farbige Verbindungen, die nicht in der Lage sind, als direktes Substrat für das Phenol-oxidierende Enzym so wirken, oder die für das Phenol-oxidierende Enzym nicht direkt zugänglich sind, ist für optimale Aktivität des Phenol-oxidierenden Enzyms und Modifikation der Farbe ein Verstärker erforderlich.
Verstärker werden beispielsweise in der WO 95/01426, veröffentlicht am 12. Januar 1995; der WO 96/06930, veröffentlicht am 7. März 1996; und der WO 97/11217, veröffentlicht am 27. März 1997, beschrieben. Verstärker umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Phenothiazin-10-propionsäure (PTP), 10-Methylphenothiazin (MPT), Phenoxazin-10-propionsäure (PPO), 10-Methylphenoxazin (MPO), 10-Ethylpheno thiazin-4-carbonsäure (EPC), Acetosyringon, Syringaaldehyd, Methylsyringat und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS).
Kulturen
Die vorliegende Erfindung umfasst Stachybotrys-Stämme und natürliche Isolate sowie Derivate solcher Stämme und Isolate, wie beispielsweise Stämme der Spezies Stachybotrys parvispora, insbesondere einschließlich Stachybotrys parvispora var. hughes MUCL 38996; Stämme der Spezies Stachybotrys chartarum, insbesondere einschließlich Stachybotrys chartarum MUCL 38898; S. parvispora MUCL 9485; S. chartarum MUCL 30782; S. kampalensis MUCL 39090; S. theobromae MUCL 39293; und Stämme der Spezies S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica, die Phenol-oxidierende Enzyme der vorliegenden Erfindung produzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt biologisch reine Kulturen neuer Stämme der Gattung Stachybotrys bereit, und insbesondere im Wesentlichen biologisch reine Kulturen der Stämme Stachybotrys parvispora MUCL 38996 und Stachybotrys chartarum MUCL 38898, aus denen Phenol-oxidierende Enzyme gereinigt werden können.
Reinigung
Die Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können durch Kultivieren von Stachybotrys-Stämmen, die Phenol-oxidierende Enzyme produzieren (wie beispielsweise S. parvispora MUCL 38996, S. chartarum MUCL 38898), unter aeroben Bedingungen in Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit (einem) anderen essentiellen Nährstoffen) enthält, produziert werden. Das Medium kann gemäß den auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Prinzipien zusammengesetzt werden.
Während des Kultivierens sekretieren die Phenol-oxidierendes Enzym produzierenden Stämme Phenol-oxidierendes Enzym extrazellulär. Dies ermöglicht das Isolieren und die Reinigung (Gewinnung) des Phenol-oxidierenden Enzyms beispielsweise durch Abtrennen der Zellmasse aus einem Kulturmedium (z.B. durch Filtration oder Zentrifugation). Das resultierende zellfreie Kulturmedium kann als solches verwendet werden oder kann, falls gewünscht, zuerst konzentriert werden (z.B. durch Eindampfen oder Ultrafiltration). Falls gewünscht kann das Phenol-oxidierende Enzym anschließend vom zellfreien Medium getrennt und bis zu einem gewünschten Reinheitsgrad mittels herkömmlicher Verfahren, z.B. mittels Säulenchromatographie, gereinigt werden.
Die Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können aus dem Kulturmedium, in das sie durch Konzentration des Überstandes der Wirtskultur extrazellulär sekretiert wurden, isoliert und gereinigt werden, woraufhin Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Gelpermeations-Chromatographie durchgeführt werden.
Die Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung können gemäß ihren beabsichtigten Verwendungszwecken formuliert und verwendet werden. In dieser Hinsicht kann das Phenol-oxidierende Enzym, sofern es in einer Waschmittelzusammensetzung verwendet wird, unter Verwendung des im US-Patent Nr. 4.689.297 beschriebenen Verfahrens direkt aus dem Fermentationsmedium als beschichteter Feststoff formuliert werden. Weiters kann, falls gewünscht, das Phenol-oxidierende Enzym in einer flüssigen Form mit einem geeigneten Träger formuliert werden. Das Phenol-oxidierende Enzym kann auf Wunsch auch immobilisiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Expressionsvektoren und rekombinante Wirtszellen, die ein Stachybotrys-Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung umfassen, und die darauffolgende Reinigung des Phenol-oxidierenden Enzyms aus der rekombinanten Wirtszelle.
Enzym-Zusammensetzungen
Ein Phenol-oxidierendes Enzym der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um beispielsweise enzymatische Zusammensetzungen zur Verwendung in Waschmittel- oder Reinigungszusammensetzungen; bei Textilien, d.h. beim Behandeln, Verarbeiten, Veredeln, Polieren oder Produzieren von Fasern; bei der Produktion von Papier und Zellstoff; und bei Anwendungen zur Stärkeverarbeitung verwendet werden. Enzymatische Zusammensetzungen können auch zusätzliche Komponenten wie beispielsweise für Formulierungen oder als Leistungsverstärker umfassen.
Beispielsweise kann eine Waschmittelzusammensetzung zusätzlich zum Phenol-oxidierenden Enzym herkömmliche Waschmittelkomponenten wie beispielsweise Tenside, Aufbaumittel und weiter Enzyme wie z.B. Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen oder Peroxidasen, umfassen. Andere Komponenten umfassen Verstärker, Stabilisatoren, Bakterizide, optische Aufheller und Dufstoffe. Die enzymatischen Zusammensetzungen können in jeder geeigneten äußeren Form vorliegen, wie beispielsweise als Pulver, als wässrige oder nicht wässrige Flüssigkeit, als Paste oder als Gel.
Im Anschluss an die Beschreibung der Phenol-oxidierenden Enzyme der vorliegenden Erfindung werden nun die folgenden Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung dargestellt und sind weder als Einschränkung gedacht noch sollten sie als solche verstanden werden. Verdünnungen, Mengen usw., die hierin als Prozentsätze dargestellt sind, sind, sofern nichts anderes angegeben wird, als Prozentsätze Gewicht pro Volumen (Gew./Vol.) zu verstehen. Verdünnungen, Mengen usw., die hierin als Vol.-% angegeben sind, beziehen sich auf Prozentsätze Volumen pro Volumen. Hierin erwähnte Temperaturen sind stets in Grad Celsius (C) angegeben. Fachleute können die Art und das Verfahren der Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Verweis auf die folgenden Beispiele besser verstehen, wobei die Beispiele keinesfalls den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung oder der beiliegenden Ansprüche einschränken sollen.
Beispiel 1
Reinigung
Dieses Beispiel veranschaulicht die Reinigung des Stachybotrys-chartarum-Phenol-oxidierenden Enzyms, das die in 2 gezeigte Sequenz aufweist.
Stachybotrys chartarum wurde auf PDA-Platten (Difco) etwa 5–10 Tage lang gezüchtet. Ein Teil der Plattenkultur (etwa ¾ × ¾ Zoll) wurde verwendet, um 100 ml von PDB (Kartoffel-Glucose-Nährmedium) in einem 500-ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Der Kolben wurde bei 26 bis 28 °C, 150 U/min, 3 bis 5 Tage lang inkubiert, bis gutes Wachstum erreicht war.
Die Nährmediumkultur wurde dann in 1 l PDB in einem 2,8-l-Schüttelkolben inokuliert. Der Kolben wurde bei 26 bis 28 °C, 150 U/min, 2 bis 4 Tage lang inkubiert, bis gutes Wachstum erreicht war.
Ein 10-l-Fermenter, der ein Produktionsmedium enthielt, wurde vorbereitet (und enthielt in Gramm/Liter die folgenden Komponenten: Glucose 15; Lecithin 1,51; t-Aconitsäure 1,73; KH₂PO₄ 3; MgSO₄.7H₂O 0,8; CaCl₂.2H₂O 0,1; Ammoniumtartrat 1,2; Sojapepton 5; Staley 7359; Benzylalkohol 1; Tween 20 1; Nitrilotriessigsäure 0,15; MnSO₄.7H₂O 0,05; NaCl 0,1; FeSO₄.7H₂O 0,01; CoSO₄ 0,01; CaCl₂.2H₂O 0,01; ZnSO₄.7H₂O 0,01; CuSO₄ 0,001; ALK(SO₄)2.12H₂O 0,001; H₃BO₃ 0,001; NaMoO₄.2H₂O 0,001). Der Fermenter wurde anschließend mit der 1-l-Nährmediumkultur beimpft, und Fermentation wurde bei 28 °C 60 Stunden lang unter einem konstanten Luftstrom von 5,0 l/min und einem konstanten Schütteln von 120 U/min durchgeführt. Der pH wurde auf 6,0 gehalten.
Die Zellen aus einem Liter Nährmedium wurden durch Zentrifugation aus dem Fermentationsnährmedium entfernt, und der Überstand wurde mittels Filtrieren durch ein DE-Filter weiter geklärt. Die niedermolekularen Salze wurden durch Diafiltration gegen 4 Volumen eines Puffers, der 20 mM MOPS enthielt, eingestellt auf pH 7,0, unter Verwendung einer Amicon-YM10-Membran entfernt.
Eine Ionenaustauschsäule, die 25 ml Poros-HG-20-Harz enthielt, wurde verwendet, um das Enzym zu reinigen. Die Säule wurde zuerst mit 5 Säulenvolumina (125 ml) von 20 mM MOPS, pH 7,0, äquilibriert. 5 ml der Probe, die 5–10 mg Gesamtprotein enthielten, wurden auf die Säule geladen. Die Säule wurde dann mit 3 Säulenvolumina des MOPS-Puffers gewaschen und anschließend mit einem Gradienten von 0–0,5 M Ammoniumsulfat in einem Volumen von 250 ml eluiert. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 10 ml/min. Fraktionen wurden in 5-ml-Volumina abgenommen. Jede Fraktion wurde mittels des ABTS-Verfahrens auf Phenaloxidase-Aktivität getestet. Die Fraktionen, die ABTS-Aktivität aufwiesen, wurden Elektrophorese auf SDS-PAGE unterzogen. Die Banden auf dem Gel, die der ABTS-Aktivität entsprachen, wurden ausgeschnitten, und die Aminosäuresequenz wurde bestimmt.
Die nachstehend dargestellten Daten stammen von einem anderen Reinigungsdurchgang und zeigen die Gegenwart von Stachybotrys-Oxidase-B-Bande auf einer SDS-PAGE. Bei dieser Reinigung wurde Rohmaterial aus der Fermentation auf einer Ionenaustauschsäule unter Verwendung von HQ20 gereinigt. Die Fraktionen wurden anfänglicher nicht-denaturierender (nativer) Gelelektrophorese auf 4- bis 20%igem Tris-Glycin-Gel unterzogen. Proben wurden mit Elektrophorese-Farbmarker verdünnt, und der Laufpuffer war Lämmli-Puffer. Dieses Ausgangsgel zur Untersuchung der Reinheit wurde an allen Fraktionen des Elutions-Peaks von Interesse angewandt, und das resultierende Gel wurde silbergefärbt. Das zweite Gel zur Bestätigung des aktiven Proteins wurde mit jeder zweiten Fraktion desselben Peaks verwendet und bei pH 7 und pH 10 mit ABTS überschichtet. Für die ABTS-Deckschicht wurden 4,5 mM ABTS mit pH 7 und pH 10 (pH 7 mit 50 mM Natriumacetat und pH 10 mit 50 mM Natriumborat) hergestellt. Das Gel wurde in zwei Teile für die Deckschicht geteilt: die Spuren 1–5 wurden mit pH 7 überschichtet, und die Spuren 6–10 wurden mit pH 10 überschichtet. Die Banden, die in Bezug auf ABTS positiv waren, wurden ausgeschnitten und mit Lämmli-Puffer und Elektrophorese-Farbmarker, der BME enthielt, homogenisiert. Proben wurden dann 5 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und auf ein 4- bis 20%iges Tris-Glycin-Gradientengel geladen. Der Laufpuffer war Lämmli mit 20 % SDS. Das Gel wurde dann silbergefärbt.
Die Resultate des anfänglichen denaturierenden Gels, des ABTS-überschichteten Gels und der SDS-PAGE-Gele sind in den 8, 9 bzw. 10 dargestellt.
Beispiel 2
Aminosäure-Sequenzanalyse von Phenol-oxidierendem Enzym von Stachybotrys-chartarum
Stachybotrys-charatrum-Phenol-oxidierendes Enzym, hergestellt wie in Beispiel 1, wurde SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und isoliert. Die isolierte Fraktion wurde mit Harnstoff und Iodacetamid behandelt und mit dem Enzym endo-LysC verdaut. Die aus dem endoLysC-Verdau resultierenden Fragmente wurden mittels HPLC (Umkehrphasen-Monobor-C18-Säule, CH₃CN-Gradient) getrennt und in einer Multititerplatte gesammelt. Die Fraktionen wurden durch MALDI zur Massenbestimmung analysiert und über Edman-Abbau sequenziert. Die folgenden Aminosäuresequenzen wurden bestimmt und sind in Amino-Terminus-zu-Carboxyl-Terminus-Ausrichtung dargestellt: Die folgenden Aminosäuresequenzen wurden bestimmt und sind in Amino-Terminus-zu-Carboxyl-Terminus-Ausrichtung dargestellt:
N' FVNSGENTSPNSVHLHGSFSR C'
N' GVEPYEAAGLKDVVWLAR C'
Beispiel 3
Klonieren genomischer Nucleinsäure
Zwei degenerierte Primer wurden auf Grundlage der Peptidsequenzen, die in Beispiel 2 bereitgestellt sind, entworfen. Primer 1 enthält die folgende Sequenz: GTC AACAGTGGNGARAAYAC und Primer 2 enthält die folgende Sequenz: GCGGCCTCATANGGCTCNAC, worin N für ein Gemisch aus allen vier Nucleotiden (A, T, C und G) steht, R für ein Gemisch aus A und G steht und Y für ein Gemisch aus T und C steht.
Zur Isolierung genomischer DNA, die für Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, wurde DNA, die aus Stachybotrys chartarum (MUCL Nr. 38898) isoliert war, als eine Matrize für PCR verwendet. Die DNA wurde 100fach mit Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 88 ng/μl verdünnt. 10 μl verdünnter DNA wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das 0,2 mM von jedem Nucleotid (A, G, C und T), 1 × Reaktionspuffer, 0,542 μg Primer 1 und 0,62 μg Primer 2 in insgesamt 100 μl Reaktionsgemisch in einem Eppendorf-Röhrchen enthielt. Nach 5-minütigem Erhitzen des Gemischs auf 100 °C wurden dem Reaktionsgemisch 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase zugesetzt. Die PCR-Reaktion wurde bei 95 °C 1 Minute lang durchgeführt, der Primer wurde an die Matrize bei 50 °C 1 Minute lang anelliert, und Extension erfolgte bei 72 °C 1 Minute lang. Dieser Kreislauf wurde 30-mal mit einem zusätzlichen Extensionszyklus bei 68 °C 7 Minuten lang wiederholt. Das durch Agarosegel nachgewiesene PCR-Fragment enthielt ein Fragment von etwa 1,3 kB, das anschließend in den Plasmidvektor pCR-II (Invitrogen) kloniert wurde. Der 1,3-kB-Insert wurde dann Nucleinsäure-Sequenzierung unterzogen. Die Sequenzdaten zeigten, dass es das Gen war, das für Stachybotrys-chartarum-Phenoloxidase-B kodiert, da die abgeleitete Peptidsequenz mit der in Beispiel 2 offenbarten Peptidsequenz, die durch Edman-Abbau sequenziert wurde, übereinstimmte. Die PCR-Fragmente, die das 5'-Gen und das 3'-Gen enthielten, wurden dann unter Verwendung des inversen PCR-Verfahrens mit vier Primern isoliert, die basierend auf den Sequenzdaten aus dem 1,3-kB-PCR-Fragment abgeleitet worden waren. 3 zeigt die Volllängen-Genomsequenz (Seq.-ID Nr. 3) des Stachybotrys-Phenoloxidase-B-Gens (spoB), umfassend die Promotor- und Stoppsequenzen.
Beispiel 4
Vergleich des Phenol-oxidierenden Enzyms B von Stachybotrys charatarum mit anderen oxidierenden Enzymen
Die translatierte Proteinsequenz (in 2 gezeigt) (Seq.-ID Nr. 2) wurde als Abfrage verwendet, um DNA und Protein-Datenbanken zu durchsuchen. Es zeigte, dass Stachybotrys-Oxidase-B in Bezug auf die Proteinsequenz 67 % Identität mit Bilirubinoxidase aufwies. 4 zeigt die Sequenzanordnung der zwei Proteine unter Verwendung des GAP-Programms der GCG-Software (University Research Park, Madison, Wisconsin) mit den folgenden Parametern: Gap Weight = 12; Length Weight = 4; Gap Creation Penalty = 8; und Gap Extension Penalty = 2.
Beispiel 5
Expression von Stachybotrys-Oxidase-B in Aspergillus niger var. awamori
Das DNA-Fragment, das Nucleinsäure enthielt, die für das Stachybotrys-Phenol-oxidierende Enzym B, flankiert durch zwei neu eingeführte Restriktionsenzymstellen (BamHI und AgeI), kodiert, wurde durch PCR isoliert. Dieses PCR-Fragment wurde zuerst in den Plasmid-Vektor pCR-II kloniert und dann Nucleinsäuresequenzierung unterzogen, um die Gensequenz (1) zu überprüfen. Dieses DNA-Fragment wurde dann in die Stelle Bgl-II bis Age-I des Vektors (pGAPT2) kloniert, um ein Plasmid von pGAPT2-spoB zu schaffen (siehe 5). Das Expressionsplasmid wurde als pGAPT2-spoB (5) bezeichnet, das in der Lage ist, sich in das Wirtsgenom zu integrieren. Das DNA-Fragment, das Nucleinsäure enthielt, die für das Stachybotrys-Phenol-oxidierende Enzym, flankiert mit zwei neu eingeführten Restriktionsenzymstellen (BamHI und AgeI), kodiert, wurde auch in den Plasmidvektor pRAX1 kloniert, der mit dem Plasmid pGAPT2 identisch ist, unter Ausnahme eines 5259-bp-HindIII-Fragments von genomischer DNA-Fragment-AMA1-Sequenz von Aspergillus nidulans (Molecular Microbiology 19, 565-574 (1996)), das insertiert war. Das Expressionsplasmid, bezeichnet als pRAX1-sopB (6), das in der Lage ist, als ein Repli kationsplasmid erhalten zu werden, wurde dann mittels herkömmlicher PEG-Verfahren zum Aspergillusstamm GCAP4 (Gene 86, 153-162 (1990)) transformiert. Die Transformanten wurden auf Platten ohne Uridin ausgewählt. Drei Transformanten wurden auf Uridinplatten 3 Tage lang gezüchtet. Die Sporen aus den Transformanten wurden in Wasser mit 0,01 % Tween 80 resuspendiert. Die Sporen (100, 1.000 oder 10.000) wurden den 96-Well-Mikrotiterplatten, die 160 μl PROC-Medium enthielten, zugesetzt. Nach 5 Tagen Wachstum bei 30 °C zeigte sich, dass diese Proben ABTS-Aktivitäten aufwiesen. Tausend Sporen wurden 50 ml PROC-Medium in 250-ml-Schüttelkolben nach 3 Tagen Wachstum bei 30 °C zugesetzt, die ABST-Aktivität belief sich auf 0,33 Einheiten/ml. Nach 4 Tagen Wachstum bei 30 °C belief sich die ABTS-Aktivität auf 4,8 Einheiten/ml. Etwa 1,2 Millionen Sporen wurden auch einem Liter PROC-Medium in einem 2,8-l-Schüttelkolben zugesetzt. Die Produktion von Stachybotrys-Phenoloxidase-B-Protein erreichte 1 Einheit/ml am Tag 3 und 4 Einheiten/ml am Tag 4, und Aktivität wurde im ABTS-Test nachgewiesen.
Beispiel 6
Expression von Phenol-oxidierendem Enzym in Trichoderma reesei
Das Expressionsplasmid zur Verwendung bei der Transformation von Trichoderma reesei wurde wie folgt konstruiert. Die Enden des BamHI-bis-AgeI-Fragments, das in 5 gezeigt ist und das Gen enthält, das für das Stachybotrys-Phenol-oxidierende Enzym B kodiert, wurde durch T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und in die PmeI-Restriktionsstelle des Trichoderma-Expressionsvektors, pTREX, eine modifizierte Version von pTEX, offenbart in der PCT-Anmeldung Nr. WO 96/23928, insertiert, der einen CBHI-Promotor und -Terminator für Genexpression und ein Trichoderma-pyr4-Gen als einen Selektionsmarker für Transformanten enthält. Das lineare DNA-Fragment, das nur den CBH1-Promotor enthält, das Phenol-oxidierende Gen (spoB), der CBH1-Terminator und der Selektionsmarker pyr4 wurden aus einem Gel isoliert und verwendet, um einen auxotrophen Uridin-Stamm von Trichoderma reesei zu transformieren (siehe US-Patent Nr. 5.472.864), in dem die vier Haupt-Cellulase gene deletiert sind. Stabile Transformanten wurden auf Trichoderma-Minimalplatten ohne Uridin isoliert. Die Transformanten wurden auf 50 ml Proflo-Medium in Schüttelkolben 4 Tage lang bei 28 °C bis 30 °C gezüchtet, und Expression des Phenol-oxidierenden Enzyms B wurde durch ABTS wie in Beispiel 8 beschrieben getestet. Proflo-Medium setzt sich zusammen aus (g/l): Proflo 22,5; Lactose 30,0; (NH₄)₂SO₄ 6,5; KH₂PO₄ 2,0; MgSO₄.7H₂O 0,3; CaCl₂ 0,2; CaCO₃ 0,72; Spurenmetall-Stammlösung 1,0 ml/l und 10 % Tween 80 2,0 ml/l. Die verwendete Spurenmetall-Stammlösung enthielt (g/l) FeSO₄.7H₂O 5,0; MnSO₄.H₂O 1,6; ZnSO₄.7H₂O 1,4; CoCl₂.6H₂O 2,8.
Beispiel 7
Reinigung von Stachybotrys-Phenol-Oxidase B
Das wie in Beispiel 5 beschrieben erhaltene Stachybotrys-Phenol-Oxidase-B-Kulturnährmedium wurde aus dem Schüttelkolben entnommen, auf 4 °C gekühlt und in einer Sorval-Zentrifuge 15 Minuten lang bei 10.500 U/min unter Verwendung eines GAS-Rotors zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dann vom Pellet entfernt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer TFF-Haltevorrichtung und Patrone OF von Millipore Corporation (6ft^2 PTGC 10K Polyethersulfon Kat.-Nr. CDUF006TG) 6- bis 10fach konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 4 Volumen Di-Wasser durch Diafiltration gewaschen, was eine Ausbeute zwischen 40–80 % ergab. Das Material wurde dann wieder zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen, und durch ein 0,45-μ-Filter filtriert. Das Enzym-hältige Filtrat wurde anschließend unter Verwendung von Anionenaustausch-Säulenchromatographie weiter gereinigt. Hierbei wurde eine Q-Sepharose-Anionenaustauschsäule mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, äquilibriert. Das Konzentrat (Enzymgemisch, zuvor beschrieben) wurde 1 Teil zu 4 Teile (5 Teile gesamt) mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, verdünnt und auf die Säule mit 120 ml/min geladen. Der Großteil der Verunreinigungen wurde mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, der 300 mM NaCl enthielt, eluiert. Daraufhin wurde die Säule mit dem Puffer, der 500 mM NaCl enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 120 ml/min eluiert. Jeweilige Fraktionen wurden erhalten. Die je weiligen Fraktionen, die die höchste Phenol-oxidierende Enzymaktivität aufwiesen, wurden gepoolt, konzentriert und unter Verwendung eines Amicon-Konzentrators mit einer YM10-Membran zu Milli-Q diafiltriert.
Phenol-oxidierende Enzymaktivität wurde dann unter Verwendung des herkömmlichen Testverfahrens auf Grundlage der Oxidation von ABTS, wie in Beispiel 8 beschrieben, bestimmt. Die so gemessene Enzymaktivität belief sich auf 61,4 Einheiten/ml bei pH 5 und auf 6,1 Einheiten/ml bei pH 9.
Beispiel 8
ABTS-Test
Das folgende Beispiel beschreibt den ABTS-Test, der zur Bestimmung von Phenol-oxidierender Aktivität eingesetzt wurde. Der ABTS-Test ist ein spektralphotometrischer Aktivitätstest, bei dem die folgenden Reagenzien verwendet werden: Testpuffer = 50 mM Natriumacetat, pH 5,0; 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0; 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,0. Das ABTS (2,2'-Azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) war eine 4,5-mM-Lösung in destilliertem Wasser. 0,75 ml Testpuffer und 0,1 ml ABTS-Substratlösung werden kombiniert, vermischt und einer Küvette zugesetzt. Eine Küvette, die Puffer-ABTS-Lösung enthielt, wurde als eine Blindprobenkontrolle verwendet. 0,05 ml Enzymprobe wurden zugesetzt, rasch vermischt und in die die Puffer-ABTS-Lösung enthaltende Küvette gefüllt. Die Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bei 420 nm, ΔOD 420/min, wurde 15 Sekunden lang (oder länger bei Proben, die Aktivitätsraten von < 0,1 aufwiesen) bei 30 °C gemessen. Enzymproben mit hohen Aktivitätsraten wurden mit Testpuffer auf ein Niveau zwischen 0,1 und 1 verdünnt.
Beispiel 9
Bleichen von Tomatenflecken
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Stachybotrys-Phenol-oxidierenden Enzyms mit der in 2 gezeigten Sequenz zum Modifizieren der mit Tomatenflecken assoziierten Farbe.
Das Experiment wurde in 250-ml-Behältern durchgeführt, denen 15 ml Waschlösung zugesetzt wurden (in den Tabellen angegeben). Der pH der Waschlösung wurde auf pH9 eingestellt. Gereinigte Phenoloxidase aus Stachybotrys wurde der Waschlösung mit 6 mg/ml zugesetzt. Als Verstärker wurde Phenothiazin-10-propionat (PTP) bei einer Dosierung von 250 mM verwendet. Die folgende Formulierung wurde als Waschlösung (2 g/l) verwendet: Waschmittelzusammensetzung:

LAS 24 %

STP 14,5 %

Natriumcarbonatanhydrid 17,5 %

Silicat 8,0 %

SCMC 0,37 %

Blaupigment 0,02 %

Feuchtigkeit/Salze 34,6 %
Die Stoffmuster wurden 30 Minuten lang bei 30 °C gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Stoffmuster im Wäschetrockner getrocknet, und die Reflexionsspektren wurden unter Verwendung eines Spektrometers von Minolta gemessen. Die Farbunterschiede zwischen den Stoffmustern vor und nach dem Waschgang wurden im CIELAB-L*a*b*-Farbraum exprimiert. In diesem Farbraum bezeichnet L* Helligkeit und a* und b* sind Farbton-Koordinaten. Farbunterschiede zwischen zwei Stoffmustern sind als ΔE ausgedrückt, das aus der folgenden Gleichung berechnet wird:
Die Resultate als ΔE-Werte sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt:
Wie aus den ΔE-Werten ersichtlich ist, kann das Bleichen des Tomatenflecks in Gegenwart des Enzym/Verstärker-Systems verbessert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Phenol-oxidierendes Enzym mit zumindest 68 % Identität mit dem Phenol-oxidierenden Enzym, das die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist.
Phenol-oxidierendes Enzym nach Anspruch 1, worin das Enzym aus einem Stachybotrys, umfassend S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theobromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica, erhältlich ist.
Phenol-oxidierendes Enzym nach Anspruch 1 mit der in Seq.-ID Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz.
Isoliertes Polynucleotid, das in der Lage ist, an das Polynucleotid mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellten Sequenz unter hoch stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und das für das Enzym nach Anspruch 1 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 4, das für die Aminosäure mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Sequenz kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 5 mit zumindest 65 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 offenbarten Nucleinsäuresequenz.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 6, das die in Seq.-ID Nr. 1 offenbarte Nucleinsäuresequenz aufweist.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 6, das die in Seq.-ID Nr. 3 offenbarte Nucleinsäuresequenz aufweist.
Expressionsvektor, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 8.
Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 9.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die ein Fadenpilz ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin der Fadenpilz eine Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies oder Mucor-Spezies ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Hefe ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die Hefe eine Saccharomyces-, Pichia-, Schizosaccharomyces-, Hansenula-, Kluyveromyces- oder Yarrowia-Spezies ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Wirt eine Bakterie ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, worin die Bakterie eine Bacillus- oder Escherichia-Spezies ist.
Verfahren zur Herstellung eines Phenol-oxidierenden Enzyms in einer Wirtszelle, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das für das Phenol-oxidierende Enzym kodiert, worin das Enzym zumindest 68 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist, unter für die Herstellung des Phenol-oxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen; und (b) gegebenenfalls Gewinnen des hergestellten Phenol-oxidierenden Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Phenol-oxidierende Enzym aus einem Stachybotrys, umfassend S. parvispora, S. chartarum, S. kampalensis, S. theo bromae, S. bisbyi, S. cylindrospora, S. dichroa, S. oenanthes und S. nilagerica, erhältlich ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Phenol-oxidierende Enzym aus S. chartarum erhältlich ist und die in Seq.-ID Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Wirtszelle ein Fadenpilz, eine Hefe oder eine Bakterie ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Hefe eine Saccharomyces-, Pichia-, Schizosaccharomyces-, Hansenula-, Kluyveromyces- oder Yarrowia-Spezies ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin der Fadenpilz eine Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies oder Mucor-Spezies ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin der Fadenpilz eine Spezies von Aspergillus ist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin der Fadenpilz Aspergillus niger var. awamori ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin der Fadenpilz eine Spezies von Trichodermaist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin die Trichoderma-Spezies Trichoderma reseei ist.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, die folgenden Schritte umfassend: (a) Erhalten eines Polynucleotids, das für ein Phenol-oxidierendes Enzym kodiert, das zumindest 68 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz aufweist; (b) Einführen des Polynucleotids in die Wirtszelle; und (c) Züchten der Wirtszelle unter für die Herstellung des Phenol-oxidierenden Enzyms geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 28, worin die Wirtszelle ein Fadenpilz, eine Hefe oder eine Bakterie ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin der Fadenpilz eine Aspergillus-Spezies, Trichoderma-Spezies oder Mucor-Spezies ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die Aspergillus-Spezies Aspergillus niger var. awamori ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die Trichoderma-Spezies Trichoderma reseei ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Hefe eine Saccharomyces-Spezies ist.
Verfahren nach Anspruch 33, worin die Saccharomyces-Spezies Saccharomyces cerevisiae ist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Polynucleotid zumindest 65 % Identität mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäure aufweist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Polynucleotid die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Nucleinsäuresequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Polynucleotid in ein replizierendes Plasmid eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Polynucleotid in das Wirtszellengenom integriert ist.
Enzymatische Zusammensetzung, umfassend das Phenol-oxidierende Enzym nach Anspruch 1.
Enzymatische Zusammensetzung nach Anspruch 39, umfassend das Phenol-oxidierende Enzym mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Sequenz.