JPH025876A - フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業の利用分野〕 本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関す
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｈｉｒｓｕｔｕｓ　ＩＦＯ４９
１７）　）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
に関する。

ＣＧＴＣＴＧＧ（：ＡＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴ（：
（：（１：ＧＴＣＡＡＡＣＧＣＧＧＡＴＡＴフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）は種々の生物に導入すること
により、バイオロジカルパルピングやバイオブリーチン
グや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試
薬として利用することができるフェノールオキシダーゼ
を生産することができる。

〔従来技術〕

フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。

白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている（特開昭５０−４６９０
３号）、シかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、バルブの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下と
いう問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。

白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産、分
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッテ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ａ。

Ｇａｒｍａｎｎ、　Ｋ、Ｌｅｒｃｈ；（１９８８）　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３＋　８８５−８９６）が
報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるものであり
、またノイロスポラ・クラッテのラッカーゼによるリグ
ニン分解についても、まだ報告されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。

自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。

したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物として白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ生
産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノー
ルオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、次式、 ５ｅｒＰｒｏＡｓ　ｐＧ　ＩｙＰｈｅＡ　ｌ　ａＡｒｇ
Ｇ　１　ｎＡ　ｌａ　Ｖａ　ｌ　Ｖａ　ＩＶａ　ＩＡｓ
ｎＡｓｎ　Ｖａ　！Ａｌａ１１ｅＧｌｙＰｒｏＴｈｒＡ
１ａＡｓｐＬｅｕＴｈｒｌ　１ｅｓｅｒＡｓｎＡ１ａＧ
１ｕＶａ１ＡｓｎＬ１１ｕｖａｔ　ＡｓｐＬｅｕＨｉｓ
ＰｒｏＬｅｕＡｌａＴｈｒＭｅｔＡｌａＶａｌＰｒｏＧ
ｌｙ５ｅｒＰｒｏＶａ　Ｉ　Ａ　１　ａＧ　１　ｙＧ　
１ｙＶａ　Ｉ　ＡｓｐＴｈｒＡ　ｌ　ａ　１１　ｅＡｓ
ｎＭｅ　ｔＡ　ｌ　ａＰｈｅのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡがイントロンにより分断されてなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子（’Ｌ）に関する。

さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子（
Ｉ）にハイブリッドするＤＮＡであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡに対して、ヌクレオチドの
置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位
その他の突然変異によって関連づけられており、かつ、
フェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡであり、または該遺伝子がイントロンで
分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）に
関する。

さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関する。

さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
が下記配列のＤＮＡを有するものであるフェノールオキ
シダーゼ遺伝子（１）に関する。

ＧＴＡＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＣＧＧＴＣＴＧ
ＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＴ鳳０５０１１１６０Ｉ
ｌｌフａｔｏｓ。

ＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＧ
ＣＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡ
ＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧ
ＧＴＴＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧ
ＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＣＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣ
ＧＣＴＴＣＣＧＣＡＣ以下に本発明の詳細な説明する。

（ＤＮＡプローブの合成〉 コスミドライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼー
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
をクローニングするために必要となるＤＮＡプローブは
、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに
合成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭６１−２８５９８９号、特開昭６２−２２０
１８９号、及び、特開昭６２−２２０１９０号の方法で
生産、精製したフェノールオキシダーゼのＮ末端からの
アミノ酸配列と精製したフェノールオキシダーゼをＢｒ
ＣＮ分解（Ｃｏｌｅ、Ｒ。

Ｄ、：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１１．３１
５−３１７（１９６７））またはトリプシン分解（Ｌｉ
ｎ、Ｌ、−Ｎ、＆　Ｂｒａｎｄｔｓ、Ｊ、Ｆ、：　Ｂｉ
ｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．５５３（１９８３）　
）　Ｌ、分離したポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸
配列をエドマン分解法（Ｅｄｍａｎ、　Ｐ、＆　Ｈｅｎ
５ｃｈｅｎ、Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ＋２’ｎｄ　ｄｅ、＋ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ＋ｐｐ２３２
〜２７９　（１９７５）参照〕によって決定する。

ＤＮＡプローブの合成は、フォスフオシエステル法、フ
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことが
できる。

く染色体ＤＮＡの調製〉 本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＰＯ８７１４））が良い。

白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成は、主炭素源と
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が資化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができる
。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩
、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩や
コーンステイープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、核
酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも可
能である。

前記の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。

培養後、集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破砕後
、フェノール抽出法により染色体ＤＮＡを抽出、精製し
、コスミドライブラリー構築に使用する染色体ＤＮＡを
得る。

染色体ＤＮＡのフェノール抽出の前にあらかじめプロテ
イナーゼ処理を行なうと高率よく染色体ＤＮＡを抽出す
ることができる。

〈染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーの構築〉コスミ
ドベクターｐＨｃ７９　　（Ｈｏｈｎ、Ｂ、ａｎｄ　Ｃ
ｏ１１ｉｎｓ。

Ｊ、（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１，２９１）を用いて
染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを構築する。コス
ミドベクターｐｉ（Ｃ７９は市販のもの〔例えば、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）社製５
３５８ＳＡ　、ベーリンガー・マンハイム山之内■社製
５６７７９５　）が使用できる。

上記染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩ　（宝酒造■
社製１０８２Ａ　）で部分分解し、３２〜４６Ｋｂ　（
キロ塩基対）の大きさの染色体ＤＮＡ断片を得る。一方
、コスミドベクターｐＨｃ７９を制限酵素ＢａｍＨＩ（
宝酒造■社製１０１Ｏ３〕で完全分解し、脱リン酸処理
し、上記の部分分解した染色体ＤＮＡの断片を加え、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ〔宝酒造■社製２０１１Ａ）によって
ＤＮＡ鎖の結合反応を行なう。

得られた結合反応物を市販のイン・ビトロ・パッケージ
ングキット〔例えば、アマジャム・ジャパン■社製Ｎ、
３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック（Ｐｒ。

ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）社製Ｐ３１５１　）を用いて
成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ
３３８４９）に感染させ、１μｇの染色体ＤＮＡ当り、
約５０．０００株のＡｐ’　（アンピシリン耐性）株を
得て、染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーとする。

〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）のクローニング
〉 コスミドライブラリーの約１０，０００株の組換え大腸
菌をアンピシリンを含むＬＢ培地（バタトトリプトン１
０ｇ／　ｌ　、バイトイーストエキス５　ｇ／　ｌ　、
塩化ナトリウム１０ｇ／　ｌ　、寒天１５ｇ／　ｌ　）
上にコロニーを形成させる。

コロニーヲ市販のニトロセルロースフィルターまたはナ
イロンフィルター〔例えば、アマジャム・ジャパン■社
製ＲＰＮ、８２Ｇ、東洋濾紙■社製ＡＯ４５ＢＯ８２Ｃ
）にレプリカし、常法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、＆
　Ｄ、Ｓ、Ｈｏｇｎｅｓｓ　：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７２＋３９６１（１９
７５）　）により、フィルター上にＤＮＡを固定する。

フィルター上のＤＮＡと放射性同位元素３２Ｐ（アマジ
ャム・ジャパン■社製ＰＢ１０１６８）でラベル（Ｒｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

υ、Ｓ、Ａ、５４．１５８〜１６１．参照コした合成り
ＮＡプローブをハイブリダイズさせフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（１）を組込んだ大腸菌を選抜し、常法によ
りコスミドを抽出、精製する。

コスミドに組込まれた染色体ＤＮＡ断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制限酵素旧ｎｄｌ［（
全酒造■社製１０６０Ｓ　）またはＥｃｏＲＩ　　（全
酒造■社製１０４０Ｓ　）またはＳｍａＩ　（全酒造■
社製１０８５Ａ　）で切断し、アガロースゲル電気泳動
法で分子量刑に分離し、フィルターに固定化した染色体
ＤＮＡ断片と３ｔＰでラベルした合成りＮＡプローブと
ハイブリダイズさせる。合成りＮＡプローブとハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１９
　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，Ｖｉｅｉｒａ
、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８５）　Ｇ
ｅｎｅ、　３３，１０３．Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ（１９８
３）　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１
０１．２０〜７８゜全酒造■社製３２１９　）にサブク
ローニングし、制限酵素地図を作成する。

得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を含むＤ
ＮＡ断片のベクターＤＮＡへの組み込みは以下のように
行なう、ベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切断してベ
クターＤＮＡ断片を調製する０次いでフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（１）を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
断片の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する。用いら
れるベクターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１
８　、ｐＵｃ１９、〔全酒造■社製３０５０．３２１８
．３２１９　）等があげられる。また制限酵素としては
旧ｎｄｌｌ［、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ■〔全酒造■社製１
０７３Ｓ）　、Ｂａｍｆｌ　Ｉ等があげられる。

このようにしてフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を
ベクターＤＮＡに結合した組換えＤＮＡを得ることがで
きる。

〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（■）の塩基配列の決
定〉 プラスミドベクターｐＵｃ１９にサブクローニングした
ＤＮＡ断片は、原理的にＨｅｎ１ｋｏｆｆの方法および
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの方法（Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆ、Ｓ、　（１９８４）Ｇｅｎｅ＋　２１１３５１〜３
５９　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ＋Ｃ，＋Ｖｉｅｉ
ｒａ。

Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８５）　Ｇｅ
ｎｅ、３３，１０３〜１１９　）でデリーションミュー
タントを作成するが市販のプリージョン・キット〔全酒
造■社製６０３０　）も使用できる。

デリーションミュータントは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｆ、（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ、　」貝、　
１２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販
のシーフェンシング・キット〔全酒造■社製６０１０Ａ
、６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１１
２１　）も使用できる。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）を含むアラゲカワ
ラタケの染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片はプラスミドｐ
Ｕｃ１９のマルチクローニング部位内のＨｃｏＲ１部位
にサブクローニングした形態で大腸菌ＪＭ１０９　（Ａ
ＴＣＣ５３３２３）に常法〔例えば、Ｌｅｄｅｒｂｅｒ
ｇ、Ｅ。

Ｌ＆　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋ユ１１０７２〜１０７４（１
９７４）　）により形質転換した。この形質転換大腸菌
０Ｊ−ＰＯＧ−１！　１は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌寄第１００４
８号（ＦＩＥＲＭ　Ｐ−１００４８）である。

〈組換えＤＮＡ） このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
（Ｉ）の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
ＤＮＡ等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフ
ェノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量
生産する新規な生物を作成するとこを可能ならしめるこ
とにある。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）のベクターへの組
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができる
。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）のＤＮＡ両端を必
要によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要
なりＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数個重合させる。

その後、これを目的とするベクターに組込む。組込む方
法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により
適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基
を複数個重合させる。このように加工した二重鎖ＤＮＡ
とベクター、ｐＮＡを混合し、Ｔ４リガーゼを用いて接
続させる。

得られた組換えＤＮＡは、ベクターの宿主である微生物
、植物細胞および動物細胞に導入する。

ここで用い得る宿主としては各種のものがあり、例えば
サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロミセス属等の
酵母、タバコ、ペチュニア等のナス科植物細胞、Ｂａ１
ｂＩＣ３Ｔ３等の動物培養細胞が好適である。これら宿
主に使用されるベクターを以下に例示する。酵母ベクタ
ーとしてｐＪＤＢ２１９．　ＹＥｐ１３゜ＹＲｐ７．　
ＹＩｐｌ、　ｐＹＣ，ｐＴＣ２、植物ベクターとしてＴ
ｉプラスミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイ
クウィルス由来の各種ベクター類（バイナリ−型ベクタ
ーをも含む）、動物ベクターとしてＳｖ４゜由来（７）
ｐＳＶＫ”、　ｐＩ−１１／３−、　ｐｓＶＨａ、＋に
＋、　ｐβ２Ｘ、　ｐＳＸβ＋などがある。ただし、Ｔ
ｉプラスミド由来の植物ベクターの場合は、得られた組
換えＤＮＡを一旦アグロバクテリウム・ツメファシェン
ス７３７等に導入し、木組換え微生物を植物細胞にＧｏ
−ｃｕｌｔｕｒｅすることなどにより感染させることに
よって宿主植物に組換えＤＮＡを導入することができる
。

なお、本発明において、アミノ酸、ポリペプチドは　Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢ　Ｎ）で採用され
た方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を
用いる。

ｌａ ｒｇ ｓｎ ｓｐ ｙｓ ｎ ｕ ｙ Ｈ’ｓ ｅ ｅｕ ｙｓ ｅｔ ｈｅ Ｐｒ。

ｅｒ ｈｒ ｒｐ ｙｒ ａｌ Ｌ−アラニン し−アルギニン し−アスパラギン Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−システィン し−グルタミン し−グルタミン酸 グリシン Ｌ−ヒスチジン し−イソロイシン Ｌ−ロイシン Ｌ−リジン Ｌ−メチオニン し−フェニルアラニン し−プロリン Ｌ−セリン し−スレオニン Ｌ−）リプトファン し−チロシン Ｌ〜バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下
記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌の染色体由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。

実施例１ （１）ＮＡプローブの合成〉 ＤＮＡプローブの合成は、アミダイト法により、ＤＮＡ
合成機（日本ゼオンＧｅｎｅｔＡ　ｍ　）を用いて行な
った。

３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７
）。

カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタケ（ＩＦ
Ｏ８７１４）］から精製したフェノールオキシダーゼの
Ｎ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段目
まで分析した結果を次に示す。

ｔＩ７ラタク カイガラタケ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇＬＧＩｎ−＾１ａ−Ｖａｌ−上記配列の１７段目の
Ｐｒｏから２５段目のＶａｌに対応するように、次のＤ
ＮＡプローブを合成した。但しＩはデオキシイノシン。

また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
（溶出条件、カラム：　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　ＲＰ（
東洋ソーダ社製）、　溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０．１％ＴＦ
Ｌへの濃度勾配溶出、室温）〕で分離したポリペプチド
のアミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に
示す。

７ラゲカヲラタケ　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅカワラタケ　　　　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅカイガラタケ　　　　　　Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。

１５ｍｅｒ−Ａ（１６ｍｉｘ）　３’−ＴＡＣ−ＣＧＡ
−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５’ＧＧＧ １５ｍｅｒ−８（１６ｍｉｘ）　　３’−ＴＡＣ−ＣＧ
Ｃ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−ＡＡＡ−５′ＧＧＧＧ 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクロー
ニングすることができる。したがって以下の実施例では
、アラガカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子（
１）のクローニング方法について説明する。

実施例２ （染色体ＤＮＡの調製〉 アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７）を１２のＹＰＤ培
地（酵母エキス１０ｇ／　ｊ！　、ポリペプトン２０ｇ
／　ｌ　、グルコース２０ｇ／　ｌ　）が入った５１容
三角フラスコに植菌し、２７℃、７日間振盪培養した。

培養後、集菌し、液体窒素中で凍結した結果、約２０ｇ
の凍結菌体を得た。

Ｌｏｇの凍結菌体を液体窒素下で乳鉢を用いて約１５分
間破砕した。あらかじめ４２°Ｃに保温した緩衝液（０
，ＩＭ　ＮａＣ１，０，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩｃＩ、　
０．ＩＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８）１０−にプロティナー
ゼＫ（最終濃度１００μｇｏｄベーリンガー・マンハイ
ム山之内１６１５１９）を加え、その中に５ｇの破砕菌
体を入れ穏やかに撹拌しながら２時間反応させた０等量
のＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ１，１ｄ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）飽和フェノールで染色体ＤＮＡを抽出後、
エタノール沈澱を行ない、再び５−のＴＥに溶かし、３
７°Ｃ，３０分間ＲＮａｓｅ＾　（最終濃度１００μｇ
／−宝酒造■）処理し、ＲＮＡを除いた。ＣｓＣ１を用
いた平衡密度勾配遠心分離（ベック７ン、　ＶＴｉ８０
　ローター、１５℃、　５０ｋｒｐｍ、　１６時間）を
行ない、精製した染色体ＤＮＡを１．５■得た。

実施例３ 〈染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーの構築〉上述の
精製した染色体ＤＮＡ２５０μｇに制限酵素５ａｕ３Ａ
　Ｉを加え、３７℃で部分分解し、部分分解物から５〜
２５％シｇ糖密度勾配遠心分離法（ベックマン５Ｗ４０
　Ｔｉローター、１５°Ｃ、２２，５ｋｒｐｍ、　１６
時間）により３２〜４６Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片を約４
μｇ得た。

制限酵素Ｂａ＋ｍ）ｌ　Ｉを加え３７°Ｃ，１２時間反
応させて完全分解した後、アルカリフォスファターゼ〔
全酒造■社製２２５０Ａ　）で３７°Ｃ，３０分間脱リ
ン酸処理し、フェノール抽出したコスミドベクター１０
＃ｇと３２〜４６Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片１μｇを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加えて１５°Ｃ，１晩反応さ
せてＤＮＡ鎖の結合反応を行なった。

得られた結合反応物を、アマジャム・ジャパン社製のイ
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパッケージ
ングを行ない、指示菌ＤＨＩに感染させた結果、１Ｈｇ
の染色体ＤＮＡ当り、約５０，０００株のＡｐ’　（ア
ンピシリン耐性）株を得て、染色体ＤＮＡのコスミドラ
イブラリーとした。

実施例４ 〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニング
〉 コスミドライブラリーの約５，０００株の組換え大腸菌
をアンピシリン（最終濃度５０ｕｇ／ｍＺ）を含む２０
枚のＬＢ寒天培地上にコロニーを形成させた。

コロニーを２枚のニトロセルロースフィルター（アマジ
ャム・ジャパン■社製）に移し取った。

コロニーを上にして、フィルターを変性溶液（１，５Ｍ
　ＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）に浸した濾紙の上に
置き、７分間放置し、次にフィルターを中和溶液（１，
５ＭＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）に浸した濾紙の上
に置き３分間放置後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に
置き３分間放置した。フィルターを２　Ｘ、ＳＳＣ（０
，３Ｍ　ＮａＣｌ。

０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム）で洗浄、風乾後、８
０℃で２時間処理し、ＤＮＡをフィルターに固定した。

合成りＮＡプローブ１５ｍｅｒ−ＡとＢ、および２６ｍ
ｅｒ−ＣとＤを放射性同位元素（７−”Ｐ）ＡＴＰ（ア
マジャム・ジャパン■社製）とＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ　）を用いてラベルし
、フィルターに固定したＤＮＡとハイブリダイズさせた
結果、１５ｍｅｒおよび２６ｍｅｒの２種類の合成りＮ
Ａプローブとハイブリダイズする。

クローン、すなわちフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
）が組込まれたコスミドを持つ大腸菌を得ることができ
た。

コスミドに組込まれた染色体ＤＮＡ断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（１）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素、
旧ｎｄＩ［［、またはＥｃｏＲＩまたはＳｍａ　Ｉで切
断し、１％のアガロースゲル電気泳動法で分子量刑に分
離し、サザンブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ
、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３〜５
１７＋１９７５によりフィルターに固定化し、３ｔｐで
ラベルした合成りＮＡプローブ（２６ｍｅｒ−Ｃ、Ｄお
よび１５ｍｅｒ−Ａ、　Ｂ）と、ハイブリダイズさせた
結果、２６ｍｅｒ−Ｃ，Ｄプローブは、旧ｎｄＩ［Ｉ　
５．３Ｋｂ、　ＥｃｏＲＩ　４．６Ｋｂ。

Ｓｍａｌ　１．９ＫｂのＤＮＡ断片にハイブリダイズし
、１５ｍｅｒ−Ａ、Ｂプローブは、旧ｎｄＩ［５，３Ｋ
ｂ、　ｔ！ｃｏＲＩ　４．６Ｋｂ、　ＳｍａＩ　２．４
ＫｂのＤＮＡ断片にハイブリダイズした。

それぞれのＤＮＡ断片をｐＵｃ１９にサブクローニング
した後、制限酵素物理地図を作成した（第１図）。

実施例５ 〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）の塩基配列〉 プラスミドｐＵｃ１９にサブクローニングしたＥｃｏＲ
Ｉ４．６Ｋｂ、　Ｓｍａｌ　２．４Ｋｂ、　Ｓｍａｌ　
１．９Ｋｂ、　　Ｈｉｎｄｌｌ［５，３ＫｂＤＮＡ断片
を宝酒造社製のプリージョンキットを使用し、１００〜
２００ｂｐおきにデリーションミュータントを作成し、
宝酒造社製のシーフェンシングキットを用いて、フェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の塩基配列を決定し、同
時にアミノ酸配列も決定した（第２図）。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）は、ＥｃｏＲｒ　
４．６ＫｂＤＮＡ断片内で１０個のイントロンに分断さ
れた形態で染色体ＤＮＡにコードされていることが判明
した。

〔発明の効果〕

本発明により、次の効果がある。

■　フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供に
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡは
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、Ｄ
ＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法）で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダー
ゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオ
ロジカルパルピングに利用でき、かつ、バルブ収量の低
下がない。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、染色体ＤＮＡ上のフェノールオキシダーゼ遺
伝子（１）付近の制限酵素切断地図を示す、斜線部分に
フェノールオキシダーゼがコードされている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。 第 図 （その ｒ１１ｅ ｈｅＶａＩＶａＩＴｙｒＡｓｐＰｒｏＡｓｎＡｓｐＰｒ
ｏｌ−１第２ １ｙＰｈｅＡ１ａＧ１ｙＧ１ｙ１１ｅＡｓｎＳｅｒＡ１
ａＩｒｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒ−ＧｌｎＴｈｒＴｈｒＰｒ
ｏＴｈｒＬｌａＴｈｒＭｅｔＡｌａＶａＩ ＰｒｏＧ１ｙＳｅｒＰｒｏＶａＩＡ１ 図 （その ｅＡｓｎＰｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｓ
ｎＧｌｙＴｈｒＡｓｎＰｈｅＰｈｅＩ　１ｅＡｓｎＧ１
ｙＡ１ａＧ１ｎＩ　１ｅＩ　１ｅＳｅｒＧ１ｙＡ１ａＧ
１ｎＡｓｎＡ１ａＬｅｕＰｒｏＳｅｒＡｓｎＡ１ａＡｓ
ｐＩ　１ｅＧ１ｕＩ　１ｅＰｒｏＨｉｓＰｒｏＰｈｅＨ
ｉｓＬｅｕＨｉｓＧ１ｙＨｉｓＡ１ａＰｈｅＡ１ａＶａ
ＩＶａＩＡｒｇＳｅｒＡ１ａＧ１ｙＳｅｒＴｈｒＶａＩ
ＴｙｒＡｓｎ第　２　図　（その４） ＴｙｒＡｓ　ｐＡｓ　ｎＰｒｏ　Ｉ　１　ｅＰｈｅＡｒ
ｇＡｓ　ｐＶａ　ＩＶａ　Ｉ　Ｔｈｒ　Ｉ　１　ｅＡｒ
ｇＰｈｅＡｒｇＴｈｒＡｓｐＡｓｎＰｈｅＨｉｓＬｅｕ
ＧｌｕＡｌａＧｌｙＰｈｅＡｌａＶａｌＡ　１　ａＡｓ
　ｎ　Ｐｒ０Ｖａ　Ｉ　ＰｒｏＧ　１　ｎＡ　１　ａＴ
ｒｐＳｅｒＡｓ　ｐＬｅｕＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ｉ　１　ｅ
ＴｙｒＡｓ　、ｐＡ　１　ａＬｅｕＡｓ　ｐＶａ　１Ａ
ＡＣＧＡＣＣＡＧ ＡｓｎＡｓｐＧ１ｎ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡがイントロ
   ンにより分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子
   （ I ）。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項１記載のＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
   配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
   られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
   、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
   オチド配列の逆位その他の突然変異によって関連づけら
   れており、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有する
   ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、または該遺伝
   子がイントロンで分析されてなるフェノールオキシダー
   ゼ遺伝子（ I ）。
3. （３）請求項１乃至２のいずれかの項に記載のフェノー
   ルオキシダーゼ遺伝子（ I ）をベクターＤＮＡに結合
   した組換えＤＮＡ。
4. （４）フェノールオキシダーゼ遺伝子（ I ）が下記配
   列のＤＮＡを有するものである請求項１記載のフェノー
   ルオキシダーゼ遺伝子（ I ）。 【遺伝子配列があります】