JPH025876A - フェノールオキシダーゼ遺伝子(1) - Google Patents
フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業の利用分野〕
本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子(I)に関す
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ(Coriolus hirsutus IFO49
17) )由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
に関する。
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ(Coriolus hirsutus IFO49
17) )由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
に関する。
CGTCTGG(:AGCGTCTACTCCCT(:
(:(1:GTCAAACGCGGATATフェノール
オキシダーゼ遺伝子(I)は種々の生物に導入すること
により、バイオロジカルパルピングやバイオブリーチン
グや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試
薬として利用することができるフェノールオキシダーゼ
を生産することができる。
(:(1:GTCAAACGCGGATATフェノール
オキシダーゼ遺伝子(I)は種々の生物に導入すること
により、バイオロジカルパルピングやバイオブリーチン
グや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試
薬として利用することができるフェノールオキシダーゼ
を生産することができる。
フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、0−キノンあるいはp−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
ール類を酸化し、0−キノンあるいはp−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている(特開昭50−4690
3号)、シかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、バルブの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下と
いう問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている(特開昭50−4690
3号)、シかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、バルブの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下と
いう問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。
白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産、分
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッテ(Ne
urosporacrassa)のラッカーゼ遺伝子の
クローニング(U、A。
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッテ(Ne
urosporacrassa)のラッカーゼ遺伝子の
クローニング(U、A。
Garmann、 K、Lerch;(1988) J
、Biol、Chem、263+ 885−896)が
報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるものであり
、またノイロスポラ・クラッテのラッカーゼによるリグ
ニン分解についても、まだ報告されていない。
、Biol、Chem、263+ 885−896)が
報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるものであり
、またノイロスポラ・クラッテのラッカーゼによるリグ
ニン分解についても、まだ報告されていない。
本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物として白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ生
産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノー
ルオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(I)を提供するものである。
新規生物として白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ生
産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノー
ルオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(I)を提供するものである。
本発明は、次式、
5erProAs pG IyPheA l aArg
G 1 nA la Va l Va IVa IAs
nAsn Va !Ala11eGlyProThrA
1aAspLeuThrl 1eserAsnA1aG
1uVa1AsnL11uvat AspLeuHis
ProLeuAlaThrMetAlaValProG
ly5erProVa I A 1 aG 1 yG
1yVa I AspThrA l a 11 eAs
nMe tA l aPheのアミノ酸配列をコードす
るDNAがイントロンにより分断されてなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子(’L)に関する。
G 1 nA la Va l Va IVa IAs
nAsn Va !Ala11eGlyProThrA
1aAspLeuThrl 1eserAsnA1aG
1uVa1AsnL11uvat AspLeuHis
ProLeuAlaThrMetAlaValProG
ly5erProVa I A 1 aG 1 yG
1yVa I AspThrA l a 11 eAs
nMe tA l aPheのアミノ酸配列をコードす
るDNAがイントロンにより分断されてなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子(’L)に関する。
さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子(
I)にハイブリッドするDNAであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするDNAに対して、ヌクレオチドの
置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位
その他の突然変異によって関連づけられており、かつ、
フェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNAであり、または該遺伝子がイントロンで
分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)に
関する。
I)にハイブリッドするDNAであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするDNAに対して、ヌクレオチドの
置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位
その他の突然変異によって関連づけられており、かつ、
フェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNAであり、または該遺伝子がイントロンで
分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)に
関する。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
をベクターDNAに連結した組換えDNAに関する。
をベクターDNAに連結した組換えDNAに関する。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
が下記配列のDNAを有するものであるフェノールオキ
シダーゼ遺伝子(1)に関する。
が下記配列のDNAを有するものであるフェノールオキ
シダーゼ遺伝子(1)に関する。
GTATCGTGAGTCTACATTCGGTCTG
ATATGATCAATTACT鳳05011160I
llフatos。
ATATGATCAATTACT鳳05011160I
llフatos。
CTCCATCCAGATTTTCGCTGCGCAG
CGGTACTCCTTTGTGTCGAGGTGGA
CTCCATCAACTCGCAACCTCTGGTG
GTTGATACGACAACCCCATCTTCCG
CGACGTCGTCAGCACGGGGACGCCT
GCGGCCGGTGACAACGTCACCATCC
GCTTCCGCAC以下に本発明の詳細な説明する。
CGGTACTCCTTTGTGTCGAGGTGGA
CTCCATCAACTCGCAACCTCTGGTG
GTTGATACGACAACCCCATCTTCCG
CGACGTCGTCAGCACGGGGACGCCT
GCGGCCGGTGACAACGTCACCATCC
GCTTCCGCAC以下に本発明の詳細な説明する。
(DNAプローブの合成〉
コスミドライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼー
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
をクローニングするために必要となるDNAプローブは
、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに
合成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭61−285989号、特開昭62−220
189号、及び、特開昭62−220190号の方法で
生産、精製したフェノールオキシダーゼのN末端からの
アミノ酸配列と精製したフェノールオキシダーゼをBr
CN分解(Cole、R。
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子(1)
をクローニングするために必要となるDNAプローブは
、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに
合成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭61−285989号、特開昭62−220
189号、及び、特開昭62−220190号の方法で
生産、精製したフェノールオキシダーゼのN末端からの
アミノ酸配列と精製したフェノールオキシダーゼをBr
CN分解(Cole、R。
D、: Methods Enzymol、11.31
5−317(1967))またはトリプシン分解(Li
n、L、−N、& Brandts、J、F、: Bi
o−chemistry 22.553(1983)
) L、分離したポリペプチドのN末端からのアミノ酸
配列をエドマン分解法(Edman、 P、& Hen
5chen、A、Protein sequenced
etermination+2’nd de、+spr
inger−Verlag、Berlin+pp232
〜279 (1975)参照〕によって決定する。
5−317(1967))またはトリプシン分解(Li
n、L、−N、& Brandts、J、F、: Bi
o−chemistry 22.553(1983)
) L、分離したポリペプチドのN末端からのアミノ酸
配列をエドマン分解法(Edman、 P、& Hen
5chen、A、Protein sequenced
etermination+2’nd de、+spr
inger−Verlag、Berlin+pp232
〜279 (1975)参照〕によって決定する。
DNAプローブの合成は、フォスフオシエステル法、フ
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことが
できる。
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことが
できる。
く染色体DNAの調製〉
本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ(IFO49
17)、カワラタケ(IFO30340)、カイガラタ
ケ(IPO8714))が良い。
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ(IFO49
17)、カワラタケ(IFO30340)、カイガラタ
ケ(IPO8714))が良い。
白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成は、主炭素源と
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が資化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができる
。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩
、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩や
コーンステイープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、核
酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも可
能である。
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が資化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができる
。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩
、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩や
コーンステイープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、核
酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも可
能である。
前記の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。
培養後、集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破砕後
、フェノール抽出法により染色体DNAを抽出、精製し
、コスミドライブラリー構築に使用する染色体DNAを
得る。
、フェノール抽出法により染色体DNAを抽出、精製し
、コスミドライブラリー構築に使用する染色体DNAを
得る。
染色体DNAのフェノール抽出の前にあらかじめプロテ
イナーゼ処理を行なうと高率よく染色体DNAを抽出す
ることができる。
イナーゼ処理を行なうと高率よく染色体DNAを抽出す
ることができる。
〈染色体DNAのコスミドライブラリーの構築〉コスミ
ドベクターpHc79 (Hohn、B、and C
o11ins。
ドベクターpHc79 (Hohn、B、and C
o11ins。
J、(1980) Gene 11,291)を用いて
染色体DNAのコスミドライブラリーを構築する。コス
ミドベクターpi(C79は市販のもの〔例えば、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−(Bethesda R
e5earch Labo−ratories)社製5
358SA 、ベーリンガー・マンハイム山之内■社製
567795 )が使用できる。
染色体DNAのコスミドライブラリーを構築する。コス
ミドベクターpi(C79は市販のもの〔例えば、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−(Bethesda R
e5earch Labo−ratories)社製5
358SA 、ベーリンガー・マンハイム山之内■社製
567795 )が使用できる。
上記染色体DNAを制限酵素5au3AI (宝酒造■
社製1082A )で部分分解し、32〜46Kb (
キロ塩基対)の大きさの染色体DNA断片を得る。一方
、コスミドベクターpHc79を制限酵素BamHI(
宝酒造■社製101O3〕で完全分解し、脱リン酸処理
し、上記の部分分解した染色体DNAの断片を加え、T
4DNAリガーゼ〔宝酒造■社製2011A)によって
DNA鎖の結合反応を行なう。
社製1082A )で部分分解し、32〜46Kb (
キロ塩基対)の大きさの染色体DNA断片を得る。一方
、コスミドベクターpHc79を制限酵素BamHI(
宝酒造■社製101O3〕で完全分解し、脱リン酸処理
し、上記の部分分解した染色体DNAの断片を加え、T
4DNAリガーゼ〔宝酒造■社製2011A)によって
DNA鎖の結合反応を行なう。
得られた結合反応物を市販のイン・ビトロ・パッケージ
ングキット〔例えば、アマジャム・ジャパン■社製N、
334Y、プロメガ・バイオチック(Pr。
ングキット〔例えば、アマジャム・ジャパン■社製N、
334Y、プロメガ・バイオチック(Pr。
mega Biotec)社製P3151 )を用いて
成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸菌DH1(ATCC
33849)に感染させ、1μgの染色体DNA当り、
約50.000株のAp’ (アンピシリン耐性)株を
得て、染色体DNAのコスミドライブラリーとする。
成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸菌DH1(ATCC
33849)に感染させ、1μgの染色体DNA当り、
約50.000株のAp’ (アンピシリン耐性)株を
得て、染色体DNAのコスミドライブラリーとする。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)のクローニング
〉 コスミドライブラリーの約10,000株の組換え大腸
菌をアンピシリンを含むLB培地(バタトトリプトン1
0g/ l 、バイトイーストエキス5 g/ l 、
塩化ナトリウム10g/ l 、寒天15g/ l )
上にコロニーを形成させる。
〉 コスミドライブラリーの約10,000株の組換え大腸
菌をアンピシリンを含むLB培地(バタトトリプトン1
0g/ l 、バイトイーストエキス5 g/ l 、
塩化ナトリウム10g/ l 、寒天15g/ l )
上にコロニーを形成させる。
コロニーヲ市販のニトロセルロースフィルターまたはナ
イロンフィルター〔例えば、アマジャム・ジャパン■社
製RPN、82G、東洋濾紙■社製AO45BO82C
)にレプリカし、常法(Grunstein、 M、&
D、S、Hogness : Proc、 Natl
、 Acad、Sci、USA 72+3961(19
75) )により、フィルター上にDNAを固定する。
イロンフィルター〔例えば、アマジャム・ジャパン■社
製RPN、82G、東洋濾紙■社製AO45BO82C
)にレプリカし、常法(Grunstein、 M、&
D、S、Hogness : Proc、 Natl
、 Acad、Sci、USA 72+3961(19
75) )により、フィルター上にDNAを固定する。
フィルター上のDNAと放射性同位元素32P(アマジ
ャム・ジャパン■社製PB10168)でラベル(Ri
chardson、C,C,(1965) Proc、
Natl Acad、Sci。
ャム・ジャパン■社製PB10168)でラベル(Ri
chardson、C,C,(1965) Proc、
Natl Acad、Sci。
υ、S、A、54.158〜161.参照コした合成り
NAプローブをハイブリダイズさせフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子(1)を組込んだ大腸菌を選抜し、常法によ
りコスミドを抽出、精製する。
NAプローブをハイブリダイズさせフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子(1)を組込んだ大腸菌を選抜し、常法によ
りコスミドを抽出、精製する。
コスミドに組込まれた染色体DNA断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(I)が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制限酵素旧ndl[(
全酒造■社製1060S )またはEcoRI (全
酒造■社製1040S )またはSmaI (全酒造■
社製1085A )で切断し、アガロースゲル電気泳動
法で分子量刑に分離し、フィルターに固定化した染色体
DNA断片と3tPでラベルした合成りNAプローブと
ハイブリダイズさせる。合成りNAプローブとハイブリ
ダイズするDNA断片をプラスミドベクターpUc19
(Yanisch−Perron、C,Vieira
、J、and Messing、J、(1985) G
ene、 33,103.Messing、J(198
3) Method in Enzymology、1
01.20〜78゜全酒造■社製3219 )にサブク
ローニングし、制限酵素地図を作成する。
ルオキシダーゼ遺伝子(I)が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制限酵素旧ndl[(
全酒造■社製1060S )またはEcoRI (全
酒造■社製1040S )またはSmaI (全酒造■
社製1085A )で切断し、アガロースゲル電気泳動
法で分子量刑に分離し、フィルターに固定化した染色体
DNA断片と3tPでラベルした合成りNAプローブと
ハイブリダイズさせる。合成りNAプローブとハイブリ
ダイズするDNA断片をプラスミドベクターpUc19
(Yanisch−Perron、C,Vieira
、J、and Messing、J、(1985) G
ene、 33,103.Messing、J(198
3) Method in Enzymology、1
01.20〜78゜全酒造■社製3219 )にサブク
ローニングし、制限酵素地図を作成する。
得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子(I)を含むD
NA断片のベクターDNAへの組み込みは以下のように
行なう、ベクターDNAを適当な制限酵素で切断してベ
クターDNA断片を調製する0次いでフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子(1)を含むDNA断片とベクターDNA
断片の混合物をT4DNAリガーゼで処理する。用いら
れるベクターDNAとしては、pBR322、pUc1
8 、pUc19、〔全酒造■社製3050.3218
.3219 )等があげられる。また制限酵素としては
旧ndll[、EcoRI、Pst■〔全酒造■社製1
073S) 、Bamfl I等があげられる。
NA断片のベクターDNAへの組み込みは以下のように
行なう、ベクターDNAを適当な制限酵素で切断してベ
クターDNA断片を調製する0次いでフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子(1)を含むDNA断片とベクターDNA
断片の混合物をT4DNAリガーゼで処理する。用いら
れるベクターDNAとしては、pBR322、pUc1
8 、pUc19、〔全酒造■社製3050.3218
.3219 )等があげられる。また制限酵素としては
旧ndll[、EcoRI、Pst■〔全酒造■社製1
073S) 、Bamfl I等があげられる。
このようにしてフェノールオキシダーゼ遺伝子(I)を
ベクターDNAに結合した組換えDNAを得ることがで
きる。
ベクターDNAに結合した組換えDNAを得ることがで
きる。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子(■)の塩基配列の決
定〉 プラスミドベクターpUc19にサブクローニングした
DNA断片は、原理的にHen1koffの方法および
Yanisch−Perronの方法(Henikof
f、S、 (1984)Gene+ 211351〜3
59 Yanisch−Perron+C,+Viei
ra。
定〉 プラスミドベクターpUc19にサブクローニングした
DNA断片は、原理的にHen1koffの方法および
Yanisch−Perronの方法(Henikof
f、S、 (1984)Gene+ 211351〜3
59 Yanisch−Perron+C,+Viei
ra。
J、and Messing、J、(1985) Ge
ne、33,103〜119 )でデリーションミュー
タントを作成するが市販のプリージョン・キット〔全酒
造■社製6030 )も使用できる。
ne、33,103〜119 )でデリーションミュー
タントを作成するが市販のプリージョン・キット〔全酒
造■社製6030 )も使用できる。
デリーションミュータントは、ジデオキシ法(Sang
er、F、(1981) 5cience、 」貝、
1205〜1210)により塩基配列を決定する。市販
のシーフェンシング・キット〔全酒造■社製6010A
、6015A、ニラポン・ジーン■社製317−011
21 )も使用できる。
er、F、(1981) 5cience、 」貝、
1205〜1210)により塩基配列を決定する。市販
のシーフェンシング・キット〔全酒造■社製6010A
、6015A、ニラポン・ジーン■社製317−011
21 )も使用できる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)を含むアラゲカワ
ラタケの染色体DNAのEcoRI断片はプラスミドp
Uc19のマルチクローニング部位内のHcoR1部位
にサブクローニングした形態で大腸菌JM109 (A
TCC53323)に常法〔例えば、Lederber
g、E。
ラタケの染色体DNAのEcoRI断片はプラスミドp
Uc19のマルチクローニング部位内のHcoR1部位
にサブクローニングした形態で大腸菌JM109 (A
TCC53323)に常法〔例えば、Lederber
g、E。
L& Cohen、S、N、Journal of B
acteriology+ユ11072〜1074(1
974) )により形質転換した。この形質転換大腸菌
0J−POG−1! 1は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌寄第1004
8号(FIERM P−10048)である。
acteriology+ユ11072〜1074(1
974) )により形質転換した。この形質転換大腸菌
0J−POG−1! 1は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌寄第1004
8号(FIERM P−10048)である。
〈組換えDNA)
このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
(I)の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
DNA等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフ
ェノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量
生産する新規な生物を作成するとこを可能ならしめるこ
とにある。
(I)の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
DNA等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフ
ェノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量
生産する新規な生物を作成するとこを可能ならしめるこ
とにある。
フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)のベクターへの組
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができる
。
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができる
。
フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)のDNA両端を必
要によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要
なりNAを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数個重合させる。
要によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要
なりNAを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数個重合させる。
その後、これを目的とするベクターに組込む。組込む方
法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により
適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基
を複数個重合させる。このように加工した二重鎖DNA
とベクター、pNAを混合し、T4リガーゼを用いて接
続させる。
法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により
適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基
を複数個重合させる。このように加工した二重鎖DNA
とベクター、pNAを混合し、T4リガーゼを用いて接
続させる。
得られた組換えDNAは、ベクターの宿主である微生物
、植物細胞および動物細胞に導入する。
、植物細胞および動物細胞に導入する。
ここで用い得る宿主としては各種のものがあり、例えば
サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロミセス属等の
酵母、タバコ、ペチュニア等のナス科植物細胞、Ba1
bIC3T3等の動物培養細胞が好適である。これら宿
主に使用されるベクターを以下に例示する。酵母ベクタ
ーとしてpJDB219. YEp13゜YRp7.
YIpl、 pYC,pTC2、植物ベクターとしてT
iプラスミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイ
クウィルス由来の各種ベクター類(バイナリ−型ベクタ
ーをも含む)、動物ベクターとしてSv4゜由来(7)
pSVK”、 pI−11/3−、 psVHa、+に
+、 pβ2X、 pSXβ+などがある。ただし、T
iプラスミド由来の植物ベクターの場合は、得られた組
換えDNAを一旦アグロバクテリウム・ツメファシェン
ス737等に導入し、木組換え微生物を植物細胞にGo
−cultureすることなどにより感染させることに
よって宿主植物に組換えDNAを導入することができる
。
サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロミセス属等の
酵母、タバコ、ペチュニア等のナス科植物細胞、Ba1
bIC3T3等の動物培養細胞が好適である。これら宿
主に使用されるベクターを以下に例示する。酵母ベクタ
ーとしてpJDB219. YEp13゜YRp7.
YIpl、 pYC,pTC2、植物ベクターとしてT
iプラスミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイ
クウィルス由来の各種ベクター類(バイナリ−型ベクタ
ーをも含む)、動物ベクターとしてSv4゜由来(7)
pSVK”、 pI−11/3−、 psVHa、+に
+、 pβ2X、 pSXβ+などがある。ただし、T
iプラスミド由来の植物ベクターの場合は、得られた組
換えDNAを一旦アグロバクテリウム・ツメファシェン
ス737等に導入し、木組換え微生物を植物細胞にGo
−cultureすることなどにより感染させることに
よって宿主植物に組換えDNAを導入することができる
。
なお、本発明において、アミノ酸、ポリペプチドは I
UPAC−IUB生化学委員会(CB N)で採用され
た方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を
用いる。
UPAC−IUB生化学委員会(CB N)で採用され
た方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を
用いる。
la
rg
sn
sp
ys
n
u
y
H’s
e
eu
ys
et
he
Pr。
er
hr
rp
yr
al
L−アラニン
し−アルギニン
し−アスパラギン
L−アスパラギン酸
L−システィン
し−グルタミン
し−グルタミン酸
グリシン
L−ヒスチジン
し−イソロイシン
L−ロイシン
L−リジン
L−メチオニン
し−フェニルアラニン
し−プロリン
L−セリン
し−スレオニン
L−)リプトファン
し−チロシン
L〜バリン
また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下
記の略号を用いる。
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下
記の略号を用いる。
A アデニン(デオキシアデニル酸を示す。)Cシトシ
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。)T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌の染色体由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(I)のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。
ン(デオキシシチジル酸を示す。)G グアニン(デオ
キシグアニル酸を示す。)T チミン (デオキシチミ
ジル酸を示す。)〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌の染色体由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(I)のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。
実施例1
(1)NAプローブの合成〉
DNAプローブの合成は、アミダイト法により、DNA
合成機(日本ゼオンGenetA m )を用いて行な
った。
合成機(日本ゼオンGenetA m )を用いて行な
った。
3種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ(IFO4917
)。
)。
カワラタケ(IFO30340)、カイガラタケ(IF
O8714)]から精製したフェノールオキシダーゼの
N末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で25段目
まで分析した結果を次に示す。
O8714)]から精製したフェノールオキシダーゼの
N末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で25段目
まで分析した結果を次に示す。
tI7ラタク
カイガラタケ
Ala−Arg−Gln−Ala−Val−Ala−A
rgLGIn−^1a−Val−上記配列の17段目の
Proから25段目のValに対応するように、次のD
NAプローブを合成した。但しIはデオキシイノシン。
rgLGIn−^1a−Val−上記配列の17段目の
Proから25段目のValに対応するように、次のD
NAプローブを合成した。但しIはデオキシイノシン。
また、3種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをB
rCNで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
(溶出条件、カラム: Phenyl−5PW RP(
東洋ソーダ社製)、 溶出液20%アセトニトリル10
.1%TFAから75%アセトリトリル10.1%TF
Lへの濃度勾配溶出、室温)〕で分離したポリペプチド
のアミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に
示す。
rCNで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
(溶出条件、カラム: Phenyl−5PW RP(
東洋ソーダ社製)、 溶出液20%アセトニトリル10
.1%TFAから75%アセトリトリル10.1%TF
Lへの濃度勾配溶出、室温)〕で分離したポリペプチド
のアミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に
示す。
7ラゲカヲラタケ Met−Ala−Phe−A
sn−Pheカワラタケ Met−Ala
−Phe−Asn−Pheカイガラタケ M
et−Ala−Phe−Asn−Phe上記アミノ酸配
列に対応するように次のDNAプローブを合成した。
sn−Pheカワラタケ Met−Ala
−Phe−Asn−Pheカイガラタケ M
et−Ala−Phe−Asn−Phe上記アミノ酸配
列に対応するように次のDNAプローブを合成した。
15mer−A(16mix) 3’−TAC−CGA
−AAA−TTA−AAA−5’GGG 15mer−8(16mix) 3’−TAC−CG
C−AAA−TTA−AAA−5′GGGG 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するDNAプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクロー
ニングすることができる。したがって以下の実施例では
、アラガカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子(
1)のクローニング方法について説明する。
−AAA−TTA−AAA−5’GGG 15mer−8(16mix) 3’−TAC−CG
C−AAA−TTA−AAA−5′GGGG 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するDNAプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクロー
ニングすることができる。したがって以下の実施例では
、アラガカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子(
1)のクローニング方法について説明する。
実施例2
(染色体DNAの調製〉
アラゲカワラタケ(IFO4917)を12のYPD培
地(酵母エキス10g/ j! 、ポリペプトン20g
/ l 、グルコース20g/ l )が入った51容
三角フラスコに植菌し、27℃、7日間振盪培養した。
地(酵母エキス10g/ j! 、ポリペプトン20g
/ l 、グルコース20g/ l )が入った51容
三角フラスコに植菌し、27℃、7日間振盪培養した。
培養後、集菌し、液体窒素中で凍結した結果、約20g
の凍結菌体を得た。
の凍結菌体を得た。
Logの凍結菌体を液体窒素下で乳鉢を用いて約15分
間破砕した。あらかじめ42°Cに保温した緩衝液(0
,IM NaC1,0,IM Tris−)IcI、
0.IM EDTA、 pH8)10−にプロティナー
ゼK(最終濃度100μgodベーリンガー・マンハイ
ム山之内161519)を加え、その中に5gの破砕菌
体を入れ穏やかに撹拌しながら2時間反応させた0等量
のTE (10mM Tris−IC1,1d EDT
A、pH8)飽和フェノールで染色体DNAを抽出後、
エタノール沈澱を行ない、再び5−のTEに溶かし、3
7°C,30分間RNase^ (最終濃度100μg
/−宝酒造■)処理し、RNAを除いた。CsC1を用
いた平衡密度勾配遠心分離(ベック7ン、 VTi80
ローター、15℃、 50krpm、 16時間)を
行ない、精製した染色体DNAを1.5■得た。
間破砕した。あらかじめ42°Cに保温した緩衝液(0
,IM NaC1,0,IM Tris−)IcI、
0.IM EDTA、 pH8)10−にプロティナー
ゼK(最終濃度100μgodベーリンガー・マンハイ
ム山之内161519)を加え、その中に5gの破砕菌
体を入れ穏やかに撹拌しながら2時間反応させた0等量
のTE (10mM Tris−IC1,1d EDT
A、pH8)飽和フェノールで染色体DNAを抽出後、
エタノール沈澱を行ない、再び5−のTEに溶かし、3
7°C,30分間RNase^ (最終濃度100μg
/−宝酒造■)処理し、RNAを除いた。CsC1を用
いた平衡密度勾配遠心分離(ベック7ン、 VTi80
ローター、15℃、 50krpm、 16時間)を
行ない、精製した染色体DNAを1.5■得た。
実施例3
〈染色体DNAのコスミドライブラリーの構築〉上述の
精製した染色体DNA250μgに制限酵素5au3A
Iを加え、37℃で部分分解し、部分分解物から5〜
25%シg糖密度勾配遠心分離法(ベックマン5W40
Tiローター、15°C、22,5krpm、 16
時間)により32〜46Kbの染色体DNA断片を約4
μg得た。
精製した染色体DNA250μgに制限酵素5au3A
Iを加え、37℃で部分分解し、部分分解物から5〜
25%シg糖密度勾配遠心分離法(ベックマン5W40
Tiローター、15°C、22,5krpm、 16
時間)により32〜46Kbの染色体DNA断片を約4
μg得た。
制限酵素Ba+m)l Iを加え37°C,12時間反
応させて完全分解した後、アルカリフォスファターゼ〔
全酒造■社製2250A )で37°C,30分間脱リ
ン酸処理し、フェノール抽出したコスミドベクター10
#gと32〜46Kbの染色体DNA断片1μgを混合
し、T4DNAリガーゼを加えて15°C,1晩反応さ
せてDNA鎖の結合反応を行なった。
応させて完全分解した後、アルカリフォスファターゼ〔
全酒造■社製2250A )で37°C,30分間脱リ
ン酸処理し、フェノール抽出したコスミドベクター10
#gと32〜46Kbの染色体DNA断片1μgを混合
し、T4DNAリガーゼを加えて15°C,1晩反応さ
せてDNA鎖の結合反応を行なった。
得られた結合反応物を、アマジャム・ジャパン社製のイ
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパッケージ
ングを行ない、指示菌DHIに感染させた結果、1Hg
の染色体DNA当り、約50,000株のAp’ (ア
ンピシリン耐性)株を得て、染色体DNAのコスミドラ
イブラリーとした。
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパッケージ
ングを行ない、指示菌DHIに感染させた結果、1Hg
の染色体DNA当り、約50,000株のAp’ (ア
ンピシリン耐性)株を得て、染色体DNAのコスミドラ
イブラリーとした。
実施例4
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子(I)のクローニング
〉 コスミドライブラリーの約5,000株の組換え大腸菌
をアンピシリン(最終濃度50ug/mZ)を含む20
枚のLB寒天培地上にコロニーを形成させた。
〉 コスミドライブラリーの約5,000株の組換え大腸菌
をアンピシリン(最終濃度50ug/mZ)を含む20
枚のLB寒天培地上にコロニーを形成させた。
コロニーを2枚のニトロセルロースフィルター(アマジ
ャム・ジャパン■社製)に移し取った。
ャム・ジャパン■社製)に移し取った。
コロニーを上にして、フィルターを変性溶液(1,5M
NaC1,0,5M Na0H)に浸した濾紙の上に
置き、7分間放置し、次にフィルターを中和溶液(1,
5MNaC1,0,5M Na0H)に浸した濾紙の上
に置き3分間放置後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に
置き3分間放置した。フィルターを2 X、SSC(0
,3M NaCl。
NaC1,0,5M Na0H)に浸した濾紙の上に
置き、7分間放置し、次にフィルターを中和溶液(1,
5MNaC1,0,5M Na0H)に浸した濾紙の上
に置き3分間放置後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に
置き3分間放置した。フィルターを2 X、SSC(0
,3M NaCl。
0.03Mクエン酸三ナトリウム)で洗浄、風乾後、8
0℃で2時間処理し、DNAをフィルターに固定した。
0℃で2時間処理し、DNAをフィルターに固定した。
合成りNAプローブ15mer−AとB、および26m
er−CとDを放射性同位元素(7−”P)ATP(ア
マジャム・ジャパン■社製)とT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ〔宝酒造■社製2021A )を用いてラベルし
、フィルターに固定したDNAとハイブリダイズさせた
結果、15merおよび26merの2種類の合成りN
Aプローブとハイブリダイズする。
er−CとDを放射性同位元素(7−”P)ATP(ア
マジャム・ジャパン■社製)とT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ〔宝酒造■社製2021A )を用いてラベルし
、フィルターに固定したDNAとハイブリダイズさせた
結果、15merおよび26merの2種類の合成りN
Aプローブとハイブリダイズする。
クローン、すなわちフェノールオキシダーゼ遺伝子(I
)が組込まれたコスミドを持つ大腸菌を得ることができ
た。
)が組込まれたコスミドを持つ大腸菌を得ることができ
た。
コスミドに組込まれた染色体DNA断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子(1)が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素、
旧ndI[[、またはEcoRIまたはSma Iで切
断し、1%のアガロースゲル電気泳動法で分子量刑に分
離し、サザンブロッティング法(Southern、E
、M、、J、Mo1.Biol、、 98.503〜5
17+1975によりフィルターに固定化し、3tpで
ラベルした合成りNAプローブ(26mer−C、Dお
よび15mer−A、 B)と、ハイブリダイズさせた
結果、26mer−C,Dプローブは、旧ndI[I
5.3Kb、 EcoRI 4.6Kb。
ルオキシダーゼ遺伝子(1)が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素、
旧ndI[[、またはEcoRIまたはSma Iで切
断し、1%のアガロースゲル電気泳動法で分子量刑に分
離し、サザンブロッティング法(Southern、E
、M、、J、Mo1.Biol、、 98.503〜5
17+1975によりフィルターに固定化し、3tpで
ラベルした合成りNAプローブ(26mer−C、Dお
よび15mer−A、 B)と、ハイブリダイズさせた
結果、26mer−C,Dプローブは、旧ndI[I
5.3Kb、 EcoRI 4.6Kb。
Smal 1.9KbのDNA断片にハイブリダイズし
、15mer−A、Bプローブは、旧ndI[5,3K
b、 t!coRI 4.6Kb、 SmaI 2.4
KbのDNA断片にハイブリダイズした。
、15mer−A、Bプローブは、旧ndI[5,3K
b、 t!coRI 4.6Kb、 SmaI 2.4
KbのDNA断片にハイブリダイズした。
それぞれのDNA断片をpUc19にサブクローニング
した後、制限酵素物理地図を作成した(第1図)。
した後、制限酵素物理地図を作成した(第1図)。
実施例5
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)の塩基配列〉
プラスミドpUc19にサブクローニングしたEcoR
I4.6Kb、 Smal 2.4Kb、 Smal
1.9Kb、 Hindll[5,3KbDNA断片
を宝酒造社製のプリージョンキットを使用し、100〜
200bpおきにデリーションミュータントを作成し、
宝酒造社製のシーフェンシングキットを用いて、フェノ
ールオキシダーゼ遺伝子(I)の塩基配列を決定し、同
時にアミノ酸配列も決定した(第2図)。
I4.6Kb、 Smal 2.4Kb、 Smal
1.9Kb、 Hindll[5,3KbDNA断片
を宝酒造社製のプリージョンキットを使用し、100〜
200bpおきにデリーションミュータントを作成し、
宝酒造社製のシーフェンシングキットを用いて、フェノ
ールオキシダーゼ遺伝子(I)の塩基配列を決定し、同
時にアミノ酸配列も決定した(第2図)。
フェノールオキシダーゼ遺伝子(I)は、EcoRr
4.6KbDNA断片内で10個のイントロンに分断さ
れた形態で染色体DNAにコードされていることが判明
した。
4.6KbDNA断片内で10個のイントロンに分断さ
れた形態で染色体DNAにコードされていることが判明
した。
本発明により、次の効果がある。
■ フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供に
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているDNAは
、他の生物に様々な方法(例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、D
NA断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法)で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
、他の生物に様々な方法(例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、D
NA断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法)で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているDNAを
組換えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダー
ゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオ
ロジカルパルピングに利用でき、かつ、バルブ収量の低
下がない。
組換えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダー
ゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオ
ロジカルパルピングに利用でき、かつ、バルブ収量の低
下がない。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているDNAを
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
第1図は、染色体DNA上のフェノールオキシダーゼ遺
伝子(1)付近の制限酵素切断地図を示す、斜線部分に
フェノールオキシダーゼがコードされている。 第2図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。 第 図 (その r11e heVaIVaITyrAspProAsnAspPr
ol−1第2 1yPheA1aG1yG1y11eAsnSerA1
aIroThrThrThr−GlnThrThrPr
oThrLlaThrMetAlaVaI ProG1ySerProVaIA1 図 (その eAsnPhe
As
nGlyThrAsnPhePheI 1eAsnG1
yA1aG1nI 1eI 1eSerG1yA1aG
1nAsnA1aLeuProSerAsnA1aAs
pI 1eG1uI 1eProHisProPheH
isLeuHisG1yHisA1aPheA1aVa
IVaIArgSerA1aG1ySerThrVaI
TyrAsn第 2 図 (その4) TyrAs pAs nPro I 1 ePheAr
gAs pVa IVa I Thr I 1 eAr
gPheArgThrAspAsnPheHisLeu
GluAlaGlyPheAlaValA 1 aAs
n Pr0Va I ProG 1 nA 1 aT
rpSerAs pLeuCys Pro I 1 e
TyrAs 、pA 1 aLeuAs pVa 1A
ACGACCAG AsnAspG1n
伝子(1)付近の制限酵素切断地図を示す、斜線部分に
フェノールオキシダーゼがコードされている。 第2図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子(1)の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。 第 図 (その r11e heVaIVaITyrAspProAsnAspPr
ol−1第2 1yPheA1aG1yG1y11eAsnSerA1
aIroThrThrThr−GlnThrThrPr
oThrLlaThrMetAlaVaI ProG1ySerProVaIA1 図 (その eAsnPhe
As
nGlyThrAsnPhePheI 1eAsnG1
yA1aG1nI 1eI 1eSerG1yA1aG
1nAsnA1aLeuProSerAsnA1aAs
pI 1eG1uI 1eProHisProPheH
isLeuHisG1yHisA1aPheA1aVa
IVaIArgSerA1aG1ySerThrVaI
TyrAsn第 2 図 (その4) TyrAs pAs nPro I 1 ePheAr
gAs pVa IVa I Thr I 1 eAr
gPheArgThrAspAsnPheHisLeu
GluAlaGlyPheAlaValA 1 aAs
n Pr0Va I ProG 1 nA 1 aT
rpSerAs pLeuCys Pro I 1 e
TyrAs 、pA 1 aLeuAs pVa 1A
ACGACCAG AsnAspG1n
Claims (4)
- (1)次のアミノ酸配列をコードするDNAがイントロ
ンにより分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子
( I )。 【遺伝子配列があります】 - (2)請求項1記載のDNAにハイブリッドするDNA
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項1記載のDNA配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の突然変異によって関連づけら
れており、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするDNAであり、または該遺伝
子がイントロンで分析されてなるフェノールオキシダー
ゼ遺伝子( I )。 - (3)請求項1乃至2のいずれかの項に記載のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子( I )をベクターDNAに結合
した組換えDNA。 - (4)フェノールオキシダーゼ遺伝子( I )が下記配
列のDNAを有するものである請求項1記載のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子( I )。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63149102A JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子(1) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63149102A JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子(1) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH025876A true JPH025876A (ja) | 1990-01-10 |
JPH0746995B2 JPH0746995B2 (ja) | 1995-05-24 |
Family
ID=15467741
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63149102A Expired - Fee Related JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子(1) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0746995B2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62220190A (ja) * | 1986-03-18 | 1987-09-28 | Oji Paper Co Ltd | リグニン分解酵素およびその製造方法 |
-
1988
- 1988-06-16 JP JP63149102A patent/JPH0746995B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62220190A (ja) * | 1986-03-18 | 1987-09-28 | Oji Paper Co Ltd | リグニン分解酵素およびその製造方法 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0746995B2 (ja) | 1995-05-24 |
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