JPH0678781A - 硫酸酸性多糖ポルフィラン資化性微生物による多糖分解 物の製造方法 - Google Patents
硫酸酸性多糖ポルフィラン資化性微生物による多糖分解 物の製造方法Info
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- JPH0678781A JPH0678781A JP26410091A JP26410091A JPH0678781A JP H0678781 A JPH0678781 A JP H0678781A JP 26410091 A JP26410091 A JP 26410091A JP 26410091 A JP26410091 A JP 26410091A JP H0678781 A JPH0678781 A JP H0678781A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 硫酸酸性多糖ポルフィランに、アシネトバク
ター属に属するポルフィラン資化性微生物であるアシネ
トバクター属SP.KP-47 株を作用させてオリゴ糖を製造
することを特徴とするオリゴ糖を製造法。 【効果】 本発明により硫酸酸性多糖ポルフィランから
オリゴ糖を効率よく製造することができた。
ター属に属するポルフィラン資化性微生物であるアシネ
トバクター属SP.KP-47 株を作用させてオリゴ糖を製造
することを特徴とするオリゴ糖を製造法。 【効果】 本発明により硫酸酸性多糖ポルフィランから
オリゴ糖を効率よく製造することができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物を用いて硫酸酸
性多糖ポルフィランを分解してオリゴ糖を製造する方法
に関し、この方法により硫酸酸性多糖ポルフィランが効
率よく多糖分解物に分解される。
性多糖ポルフィランを分解してオリゴ糖を製造する方法
に関し、この方法により硫酸酸性多糖ポルフィランが効
率よく多糖分解物に分解される。
【０００２】
【従来の技術】最近、食品の三次機能いわゆる生理活性
機能についての研究が盛んに行われている。その中で、
糖質の生理活性機能が数多く明らかにされている。例え
ば、多糖のコレステロール低下作用及び整腸作用（未来
食品技術研究所：食品と開発，Vol 24,No.2,34-38(198
8) ）、オリゴ糖の低う蝕性（鈴木一正，中島良和：食
品工業，4 下34−39(1983)）、水分活性調整作用（伊東
祐四：月刊フードケミカル，10,4-9(1988)）及びビフィ
ズス菌生長促進（岡田厳太郎等：蛋白質核酸酵素，V0l2
9,No13,1486-1507(1984)）などである。特に注目される
ものに、海苔及び海苔の硫酸酸性多糖ポルフィランには
抗腫瘍活性があると野田ら(H.Noda, H.Amano, K.Arashi
ma, S.Hashimoto, and K.Nisizawa: Nippon Suisan Gak
kaishi, 55,1265-1271 (1989)）により報告がされてい
る。さらに、硫酸酸性多糖には血液抗凝固作用、結合組
織刺激作用(R.L.Whistlor, A.H.King, G.Ruffini, and
F.A.Lucas: Arch. Biochem. Biophys., 121, 358-363
(1967))等の生理活性があることで、生化学的にも重要
なものである。また、人間が常用しており安全性は保証
されていることから、今後硫酸酸性多糖ポルフィランの
医薬分野での利用価値はかなり高いものといえる。しか
し、ポルフィランそのものは高粘性であるため経口及び
注射投与には適していない。
機能についての研究が盛んに行われている。その中で、
糖質の生理活性機能が数多く明らかにされている。例え
ば、多糖のコレステロール低下作用及び整腸作用（未来
食品技術研究所：食品と開発，Vol 24,No.2,34-38(198
8) ）、オリゴ糖の低う蝕性（鈴木一正，中島良和：食
品工業，4 下34−39(1983)）、水分活性調整作用（伊東
祐四：月刊フードケミカル，10,4-9(1988)）及びビフィ
ズス菌生長促進（岡田厳太郎等：蛋白質核酸酵素，V0l2
9,No13,1486-1507(1984)）などである。特に注目される
ものに、海苔及び海苔の硫酸酸性多糖ポルフィランには
抗腫瘍活性があると野田ら(H.Noda, H.Amano, K.Arashi
ma, S.Hashimoto, and K.Nisizawa: Nippon Suisan Gak
kaishi, 55,1265-1271 (1989)）により報告がされてい
る。さらに、硫酸酸性多糖には血液抗凝固作用、結合組
織刺激作用(R.L.Whistlor, A.H.King, G.Ruffini, and
F.A.Lucas: Arch. Biochem. Biophys., 121, 358-363
(1967))等の生理活性があることで、生化学的にも重要
なものである。また、人間が常用しており安全性は保証
されていることから、今後硫酸酸性多糖ポルフィランの
医薬分野での利用価値はかなり高いものといえる。しか
し、ポルフィランそのものは高粘性であるため経口及び
注射投与には適していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
硫酸酸性多糖ポルフィランをそれらを資化する微生物に
より加水分解し多糖分解物を得るべく、有明海沿岸から
の海苔腐敗物及び土壌からポルフィラン資化性細菌のス
クリーニングを行ない、多糖分解物生産能の高い微生物
を採取し、これを用いて本発明を完成するに至った。
硫酸酸性多糖ポルフィランをそれらを資化する微生物に
より加水分解し多糖分解物を得るべく、有明海沿岸から
の海苔腐敗物及び土壌からポルフィラン資化性細菌のス
クリーニングを行ない、多糖分解物生産能の高い微生物
を採取し、これを用いて本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、硫酸酸性多糖
ポルフィランにアシネトバクター属に属するポルフィラ
ン資化性微生物を作用させて多糖分解物を製造すること
を特徴とする多糖分解物の製造法にある。そして、アシ
ネトバクター属に属する硫酸酸性多糖ポルフィラン資化
性微生物としては、アシネトバクター属SP.KP-47株があ
げられる。
ポルフィランにアシネトバクター属に属するポルフィラ
ン資化性微生物を作用させて多糖分解物を製造すること
を特徴とする多糖分解物の製造法にある。そして、アシ
ネトバクター属に属する硫酸酸性多糖ポルフィラン資化
性微生物としては、アシネトバクター属SP.KP-47株があ
げられる。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
方法に使用する微生物としては、硫酸酸性多糖ポルフィ
ランを資化、分解してオリゴ糖を生成する微生物であれ
ばいずれも使用できるが、たとえば、アシネトバクター
（Acinetobacter ）属SP.KP−43株が用いられる。この
微生物は、有明海沿岸から海苔腐敗物及び土壌を採取
し、この中に含まれる微生物からフラスコ振盪培養によ
りポルフィラン資化能の高い74株を分離し、この74株の
中で多糖分解物生産能の最も高いものを選択して得たも
のである。
方法に使用する微生物としては、硫酸酸性多糖ポルフィ
ランを資化、分解してオリゴ糖を生成する微生物であれ
ばいずれも使用できるが、たとえば、アシネトバクター
（Acinetobacter ）属SP.KP−43株が用いられる。この
微生物は、有明海沿岸から海苔腐敗物及び土壌を採取
し、この中に含まれる微生物からフラスコ振盪培養によ
りポルフィラン資化能の高い74株を分離し、この74株の
中で多糖分解物生産能の最も高いものを選択して得たも
のである。
【０００６】この微生物の培養に使用する培地には、炭
素源として、グルコース、蔗糖、デキストリン、澱粉、
グリセリンなどが、窒素源として、は、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ソーダ
の無機窒素源、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コー
ンスチープリカー、アミノ酸等の有機窒素源が、無機塩
として、リン酸塩、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、
コバルト、亜鉛、カルシウムなどを、また、必要に応じ
てビタミン類などを適宜に組み合わせて用いる。培地に
は、場合によっては消泡のために界面活性剤を含ませる
こともできる。
素源として、グルコース、蔗糖、デキストリン、澱粉、
グリセリンなどが、窒素源として、は、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ソーダ
の無機窒素源、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コー
ンスチープリカー、アミノ酸等の有機窒素源が、無機塩
として、リン酸塩、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、
コバルト、亜鉛、カルシウムなどを、また、必要に応じ
てビタミン類などを適宜に組み合わせて用いる。培地に
は、場合によっては消泡のために界面活性剤を含ませる
こともできる。
【０００７】本発明で使用する粗製ポルフィランは、次
のように調製したものが用いられる。即ち、スサビノリ
2.5kg を100 ℃で４時間熱水処理し、濾過した後、その
濾液を真空薄膜式濃縮機（大川原製作所製）を用いて濃
縮する。その後、この濃縮液にエタノールを66％になる
ように加えてポルフィランを沈澱させ濾別した後、この
濾過ケーキをエタノールで洗浄し、減圧乾燥により粗製
ポルフィランを得る。
のように調製したものが用いられる。即ち、スサビノリ
2.5kg を100 ℃で４時間熱水処理し、濾過した後、その
濾液を真空薄膜式濃縮機（大川原製作所製）を用いて濃
縮する。その後、この濃縮液にエタノールを66％になる
ように加えてポルフィランを沈澱させ濾別した後、この
濾過ケーキをエタノールで洗浄し、減圧乾燥により粗製
ポルフィランを得る。
【０００８】この粗製ポルフィランの成分組成を表１に
示すが、有機物含有率は乾物ベースで86.7％であった。 なお、粗製ポルフィランの培地への添加量は20ｇ/Lであ
る。 （１）ポルフィラン資化性微生物のスクリーニング ポルフィラン資化性微生物の分離には、有明海沿岸（熊
本県、佐賀県）周辺の土壌、汚水及び海苔腐敗物等から
採取した139サンプルを用いた。
示すが、有機物含有率は乾物ベースで86.7％であった。 なお、粗製ポルフィランの培地への添加量は20ｇ/Lであ
る。 （１）ポルフィラン資化性微生物のスクリーニング ポルフィラン資化性微生物の分離には、有明海沿岸（熊
本県、佐賀県）周辺の土壌、汚水及び海苔腐敗物等から
採取した139サンプルを用いた。
【０００９】サンプルを合成培地（粗製ポルフィラン2.
０％とNH4NO3 0.１％、KH2PO4 0.01％、FeCl3・6H2O 0.
６×10-4％から成るものである）10mlの入った試験管に
接種し、２日間、振盪培養（30℃、pH7.6)した後、さら
に同条件で試験管培養を行った（集積培養）。集積培養
後、三角フラスコで５日間、振盪培養（30℃、pH7.6)
し、培養液の粘度、OD値の経時変化、及び培養上澄液の
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりポルフィラン
資化能の高い４菌群を選択した。
０％とNH4NO3 0.１％、KH2PO4 0.01％、FeCl3・6H2O 0.
６×10-4％から成るものである）10mlの入った試験管に
接種し、２日間、振盪培養（30℃、pH7.6)した後、さら
に同条件で試験管培養を行った（集積培養）。集積培養
後、三角フラスコで５日間、振盪培養（30℃、pH7.6)
し、培養液の粘度、OD値の経時変化、及び培養上澄液の
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりポルフィラン
資化能の高い４菌群を選択した。
【００１０】選択した菌群を無菌水で10-5〜10-8に希釈
し、平板培地（上記合成培地に寒天2.0 ％を加えたも
の) に塗布した。その後、30℃で２日間培養した後、出
現したコロニーの中で大きかった74コロニーを単離し
た。この74コロニーを試験管で２日間、振盪培養（30
℃、pH7.6)した後、培養上澄液をＴＬＣ分析した（１次
スクリーニング）。１次スクリーニングにより４菌株
（OD値；KP-3, 3.98；KP-6, 5.50；KP-7, 3.82；KP-43,
4.50)選択した。この４菌株についてフラスコ振盪培養
を再度行ない、培養液の粘度、OD値を測定しその結果を
図１に示した。また、生成物を確認するためＴＬＣを行
った（２次スクリーニング）。その結果を図２に示す。
し、平板培地（上記合成培地に寒天2.0 ％を加えたも
の) に塗布した。その後、30℃で２日間培養した後、出
現したコロニーの中で大きかった74コロニーを単離し
た。この74コロニーを試験管で２日間、振盪培養（30
℃、pH7.6)した後、培養上澄液をＴＬＣ分析した（１次
スクリーニング）。１次スクリーニングにより４菌株
（OD値；KP-3, 3.98；KP-6, 5.50；KP-7, 3.82；KP-43,
4.50)選択した。この４菌株についてフラスコ振盪培養
を再度行ない、培養液の粘度、OD値を測定しその結果を
図１に示した。また、生成物を確認するためＴＬＣを行
った（２次スクリーニング）。その結果を図２に示す。
【００１１】菌の増殖はKP-6株以外は対数増殖期もなく
増殖し、１日で定常増殖期に達した。また培養液の粘度
は、１日で急激に下がり菌の増殖に伴ってポルフィラン
が低分子化されていることが分った。そこで、それぞれ
の培養上澄液糖成分をＴＬＣで分析した( 図２）。その
結果、４株ともスポットが上昇し、ポルフィランが分解
されていることが分った。図中右端は標準物質のＴＬＣ
の結果を示しているが、これらのＲf値から多糖分解物
の平均重合度は約17と算出された。特にKP-43株は目的
の多糖分解物のスポットが大きかったので、多糖分解物
生成菌として選択した。 （２）菌の同定 菌株の形態及び運動性は倒立型システム顕微鏡（OLYMPU
S TO41）により、また鞭毛の有無は透過型電子顕微鏡
（JEOL, JEM-100C）により観察した。生理的性質は、Co
wan and Steel の特性表(Cowan, S.T. and K.J.Steel:
Manual for the Identification of Medical Bacteria,
2nd ed., Cambridge University Press,London (1974)
）及び、Stanier らの方法(R.Y.Stainer, N.J.Pallero
ni and M.J.Doudoroff, J.Gen.Microbiol., 43, 159(19
66)）であるオキシファームチューブII（日本ロッシュ
製）を用いて行った。
増殖し、１日で定常増殖期に達した。また培養液の粘度
は、１日で急激に下がり菌の増殖に伴ってポルフィラン
が低分子化されていることが分った。そこで、それぞれ
の培養上澄液糖成分をＴＬＣで分析した( 図２）。その
結果、４株ともスポットが上昇し、ポルフィランが分解
されていることが分った。図中右端は標準物質のＴＬＣ
の結果を示しているが、これらのＲf値から多糖分解物
の平均重合度は約17と算出された。特にKP-43株は目的
の多糖分解物のスポットが大きかったので、多糖分解物
生成菌として選択した。 （２）菌の同定 菌株の形態及び運動性は倒立型システム顕微鏡（OLYMPU
S TO41）により、また鞭毛の有無は透過型電子顕微鏡
（JEOL, JEM-100C）により観察した。生理的性質は、Co
wan and Steel の特性表(Cowan, S.T. and K.J.Steel:
Manual for the Identification of Medical Bacteria,
2nd ed., Cambridge University Press,London (1974)
）及び、Stanier らの方法(R.Y.Stainer, N.J.Pallero
ni and M.J.Doudoroff, J.Gen.Microbiol., 43, 159(19
66)）であるオキシファームチューブII（日本ロッシュ
製）を用いて行った。
【００１２】KP-43 株の形態的及び生理的性質を図９及
び表２に示した。本菌は 1.0×1.15μm のグラム陰性桿
菌であり、運動性はなく、鞭毛も有していなかった（図
９）。また絶対好気性、オキシダーゼ陰性、カタラーゼ
陽性であった。資化性試験では、クエン酸は資化した
が、尿素、アルギニン、リジンは資化できなかった。ま
た各種炭素源からの酸生成は見られなかった。
び表２に示した。本菌は 1.0×1.15μm のグラム陰性桿
菌であり、運動性はなく、鞭毛も有していなかった（図
９）。また絶対好気性、オキシダーゼ陰性、カタラーゼ
陽性であった。資化性試験では、クエン酸は資化した
が、尿素、アルギニン、リジンは資化できなかった。ま
た各種炭素源からの酸生成は見られなかった。
【００１３】これらの特徴から、 Cowan and Steelの特
性表に従い、 KP-43株をアシネトバクター（Acinetobac
ter ）属 sp.と同定した。既に報告されているVibrio、
Pseudomonas(L.M.Morrice et al.,J.Biochem.,135,553-
558(1983) と異なるが、Acinetobacter は一般に数種の
分泌酵素を持つと報告されていることから、ガラクトー
スを構成糖とする硫酸酸性多糖を分解、資化できたと思
われる。
性表に従い、 KP-43株をアシネトバクター（Acinetobac
ter ）属 sp.と同定した。既に報告されているVibrio、
Pseudomonas(L.M.Morrice et al.,J.Biochem.,135,553-
558(1983) と異なるが、Acinetobacter は一般に数種の
分泌酵素を持つと報告されていることから、ガラクトー
スを構成糖とする硫酸酸性多糖を分解、資化できたと思
われる。
【００１４】このアシネトバクター属SP.KP-43株は、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第12329号
として寄託している。 表２ KP-43株の分類学上の特性 ────────────────────────── 性質またはテスト KP-43 ────────────────────────── 形 態 桿菌 運動性 非運動性 大きさ 1.0 −1.15μm 至適温度 33℃ 至適 pH 6.5 グラム染色 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − アルギニンジヒドラーゼ − リジンジカルボキシラーゼ − インドール − ウレアーゼ − クエン酸 ＋ 炭素源からの酸生成 Ana-Glc a) − Aer-Glc b) − キシロース − マルトース − マンニトール − シュークローズ − ────────────────────────── a) 嫌気条件下でのグルコース b) 好気条件下でのグルコース （３）本菌株の好気培養による硫酸酸性多糖ポルフィラ
ンの分解 本菌株の好気培養により硫酸酸性多糖ポルフィランを分
解、資化するための培養条件の検討を行った。
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第12329号
として寄託している。 表２ KP-43株の分類学上の特性 ────────────────────────── 性質またはテスト KP-43 ────────────────────────── 形 態 桿菌 運動性 非運動性 大きさ 1.0 −1.15μm 至適温度 33℃ 至適 pH 6.5 グラム染色 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − アルギニンジヒドラーゼ − リジンジカルボキシラーゼ − インドール − ウレアーゼ − クエン酸 ＋ 炭素源からの酸生成 Ana-Glc a) − Aer-Glc b) − キシロース − マルトース − マンニトール − シュークローズ − ────────────────────────── a) 嫌気条件下でのグルコース b) 好気条件下でのグルコース （３）本菌株の好気培養による硫酸酸性多糖ポルフィラ
ンの分解 本菌株の好気培養により硫酸酸性多糖ポルフィランを分
解、資化するための培養条件の検討を行った。
【００１５】(a)培養温度 KP-43株の多糖分解物生産に及ぼす培養温度の影響を調
べるために、培養温度30、33、35℃でフラスコ振盪培養
を行った。培養液のOD値と直糖の経時変化から、増殖の
最適温度は33℃であった（図３）。しかし、ＴＬＣ分析
で糖成分を分析すると、33℃よりも35℃で培養したほう
が目的のスポットが大きくなり、多糖分解物が多く蓄積
することが分った（図４）。
べるために、培養温度30、33、35℃でフラスコ振盪培養
を行った。培養液のOD値と直糖の経時変化から、増殖の
最適温度は33℃であった（図３）。しかし、ＴＬＣ分析
で糖成分を分析すると、33℃よりも35℃で培養したほう
が目的のスポットが大きくなり、多糖分解物が多く蓄積
することが分った（図４）。
【００１６】(b)培養pH フラスコ振盪培養ではpH制御が難しかったので、ジャー
ファーメンターを用い培養温度35℃で比増殖速度に及ぼ
す培養pHの影響を調べた。図５に示したようにpH6.5に
おいて最大比増殖速度0.168h-1を示した。また、pH5.5,
6.5, 8.0の培養上澄液について、ＴＬＣ分析したとこ
ろ、多糖分解物のスポットには大差はなかったが、培養
pH6.5において原点のスポットが少し上昇していること
が分った（図６）。
ファーメンターを用い培養温度35℃で比増殖速度に及ぼ
す培養pHの影響を調べた。図５に示したようにpH6.5に
おいて最大比増殖速度0.168h-1を示した。また、pH5.5,
6.5, 8.0の培養上澄液について、ＴＬＣ分析したとこ
ろ、多糖分解物のスポットには大差はなかったが、培養
pH6.5において原点のスポットが少し上昇していること
が分った（図６）。
【００１７】以上の結果からポルフィラン分解物の蓄積
条件（以後、生成条件とする）は培養温度35℃、培養pH
6.5とした。なお、上記培養温度及びｐＨの検討は、フ
ラスコ振盪培養およびジャーファーメンターによる好気
培養により行った。それぞれの条件は、次の通りであ
る。 （ａ）フラスコ振盪培養 合成培地を試験管（φ25mm、長さ200mm）及び500ml三角
フラスコにそれぞれ10ml、90mlずつ分注し、オートクレ
ーブで120℃、１kg／cm2G 、10分間滅菌処理した。
条件（以後、生成条件とする）は培養温度35℃、培養pH
6.5とした。なお、上記培養温度及びｐＨの検討は、フ
ラスコ振盪培養およびジャーファーメンターによる好気
培養により行った。それぞれの条件は、次の通りであ
る。 （ａ）フラスコ振盪培養 合成培地を試験管（φ25mm、長さ200mm）及び500ml三角
フラスコにそれぞれ10ml、90mlずつ分注し、オートクレ
ーブで120℃、１kg／cm2G 、10分間滅菌処理した。
【００１８】前培養は、試験管培地に１白金耳植菌した
後、30℃で24時間振盪培養した。この前培養液10mlを滅
菌した 500ml三角フラスコ培地に無菌的に植菌し、ロー
タリーシェーカー（TAKASAKI製作所）でフラスコ振盪培
養（30℃）を行った。なおフラスコ振盪培養に使用した
合成培地は0.１％ Tris-HCl(pH7.6)でpH調整されたもの
である。 （ｂ）ジャーファーメンターによる好気培養 滅菌した合成培地75mlを含む500ml三角フラスコ２本に
菌体を１白金耳植菌し、30時間振盪培養したものを前培
養液とした。
後、30℃で24時間振盪培養した。この前培養液10mlを滅
菌した 500ml三角フラスコ培地に無菌的に植菌し、ロー
タリーシェーカー（TAKASAKI製作所）でフラスコ振盪培
養（30℃）を行った。なおフラスコ振盪培養に使用した
合成培地は0.１％ Tris-HCl(pH7.6)でpH調整されたもの
である。 （ｂ）ジャーファーメンターによる好気培養 滅菌した合成培地75mlを含む500ml三角フラスコ２本に
菌体を１白金耳植菌し、30時間振盪培養したものを前培
養液とした。
【００１９】この前培養液 150mlを、オートクレーブで
滅菌処理（１kg／cm2 、10min)した1.35ｌの合成培地を
含むジャーファーメンター( 実容積1.5 l)に無菌的に植
菌し、培養温度35℃、通気量１VVM 、攪拌速度550rpmで
好気培養した。この培養液を経時的にサンプリングし、
粘度、OD値、全糖及び直糖の分析をおこなった。なお、
このジャーファーメンターを用いた培養においては、１
N NaOHと１N HClでpHを主として6.５になるように制御
した。 （４）ポルフィラン分解物の分析 (a)薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析 ＴＬＣは、薄層ゲルKieselgel 60F254 (MERCK製、20×2
0cm)に４μl スポットした後、溶媒n-ブタノール・イソ
プロピルアルコール・水（３：12：４v/v)からなる展開
液で30℃、150 分間展開した。その後、プレートに検出
剤（２％w/v ジフェニルアミン、２％v/v アニリン、15
％v/v 濃リン酸を含むアセトン溶液）を噴霧した後、90
℃で 15min放置することにより発色させた。 （b)高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 高速液体クロマトグラフィーは島津製作所 LC-3Aを用
い、検出はJasco RID-300 型示差屈折計検出器で行っ
た。カラムは TSK-GEL G3000PWXL（30cm×7.8mm ID、東
ソー製）を用い、カラム温度は70℃とした。移動相とし
て蒸留水を用い、0.５ml/minの流速で送液した。 （ｃ）Sephadex G-50 による分子量分画 ゲル濾過による分子量分画の試料には粗製ポルフィラン
を水に溶解して1.６％w/v 濃度としたものと、培養20時
間目のジャーファーメンター培養（pH6.5, 35℃）上澄
液をエバポレーターで約10倍濃縮したものを用いた。各
溶液0.５mlをSephadex G-50(fine, ファルマシア社製）
を充填したカラム（2.5cm ID×100cm)に添加した。リン
酸 Buffer(pH6.7)を用い、１ml/minの流速で溶出させ、
４mlずつ分取した。得られた画分についてＴＯＣ（全有
機炭素）値を測定し、ピーク画分の全糖、直糖を測定
し、この値から平均重合度を算出した。 （ｄ）その他の分析方法 105℃、２時間乾燥させた粗製ポルフィランについては
有機物、全糖、直糖、タンパク質、灰分を測定した。培
養液もしくは培養上澄液については菌体濃度、粘度、全
糖、直糖、タンパク質を、また酵素反応液については直
糖を分析した。なお、培養上澄液は 8,900×ｇ、20min
遠心分離したものである。ゲル濾過により得た画分につ
いてはＴＯＣを測定した。
滅菌処理（１kg／cm2 、10min)した1.35ｌの合成培地を
含むジャーファーメンター( 実容積1.5 l)に無菌的に植
菌し、培養温度35℃、通気量１VVM 、攪拌速度550rpmで
好気培養した。この培養液を経時的にサンプリングし、
粘度、OD値、全糖及び直糖の分析をおこなった。なお、
このジャーファーメンターを用いた培養においては、１
N NaOHと１N HClでpHを主として6.５になるように制御
した。 （４）ポルフィラン分解物の分析 (a)薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析 ＴＬＣは、薄層ゲルKieselgel 60F254 (MERCK製、20×2
0cm)に４μl スポットした後、溶媒n-ブタノール・イソ
プロピルアルコール・水（３：12：４v/v)からなる展開
液で30℃、150 分間展開した。その後、プレートに検出
剤（２％w/v ジフェニルアミン、２％v/v アニリン、15
％v/v 濃リン酸を含むアセトン溶液）を噴霧した後、90
℃で 15min放置することにより発色させた。 （b)高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 高速液体クロマトグラフィーは島津製作所 LC-3Aを用
い、検出はJasco RID-300 型示差屈折計検出器で行っ
た。カラムは TSK-GEL G3000PWXL（30cm×7.8mm ID、東
ソー製）を用い、カラム温度は70℃とした。移動相とし
て蒸留水を用い、0.５ml/minの流速で送液した。 （ｃ）Sephadex G-50 による分子量分画 ゲル濾過による分子量分画の試料には粗製ポルフィラン
を水に溶解して1.６％w/v 濃度としたものと、培養20時
間目のジャーファーメンター培養（pH6.5, 35℃）上澄
液をエバポレーターで約10倍濃縮したものを用いた。各
溶液0.５mlをSephadex G-50(fine, ファルマシア社製）
を充填したカラム（2.5cm ID×100cm)に添加した。リン
酸 Buffer(pH6.7)を用い、１ml/minの流速で溶出させ、
４mlずつ分取した。得られた画分についてＴＯＣ（全有
機炭素）値を測定し、ピーク画分の全糖、直糖を測定
し、この値から平均重合度を算出した。 （ｄ）その他の分析方法 105℃、２時間乾燥させた粗製ポルフィランについては
有機物、全糖、直糖、タンパク質、灰分を測定した。培
養液もしくは培養上澄液については菌体濃度、粘度、全
糖、直糖、タンパク質を、また酵素反応液については直
糖を分析した。なお、培養上澄液は 8,900×ｇ、20min
遠心分離したものである。ゲル濾過により得た画分につ
いてはＴＯＣを測定した。
【００２０】粗製ポルフィランの灰分は、JIS K 0102-1
986 (Japanese Industrial Standards Committee. Ash
(p.32-33), Testing methods for industrial wasterwa
ter,JIS KO102-1986, Japanese Standards Associatio
n, Tokyo(1986))による強熱減量から算出した。直糖はS
omogyi-Nelson法(Somoyi,M.(1952).J.Biol.Chem.,195,1
9.)により、また全糖は２％ HCl、100℃で150分間加水
分解した後、直糖の分析法に従い分析した。タンパク質
はBovine serum albumin(MERCK) を標準物質としてLowr
y-Folin法(O.H, Lowry, N.J.Rosebrough, A.L.Farr, R.
J.Randa11, J.Biol.Chem., 193,265(1951)）により分析
した。ＴＯＣの値は島津製作所TOC-500を用い測定し
た。
986 (Japanese Industrial Standards Committee. Ash
(p.32-33), Testing methods for industrial wasterwa
ter,JIS KO102-1986, Japanese Standards Associatio
n, Tokyo(1986))による強熱減量から算出した。直糖はS
omogyi-Nelson法(Somoyi,M.(1952).J.Biol.Chem.,195,1
9.)により、また全糖は２％ HCl、100℃で150分間加水
分解した後、直糖の分析法に従い分析した。タンパク質
はBovine serum albumin(MERCK) を標準物質としてLowr
y-Folin法(O.H, Lowry, N.J.Rosebrough, A.L.Farr, R.
J.Randa11, J.Biol.Chem., 193,265(1951)）により分析
した。ＴＯＣの値は島津製作所TOC-500を用い測定し
た。
【００２１】培養中の菌体濃度は吸光光度計（UV-160、
島津製作所）を用い波長 660nmでの吸光度から測定し
た。また、粘度はＢ型粘度計（東京計器）にBLアダプタ
ーを取りつけ、35℃、回転速度30rpmで測定した。 （５）酵素的分解による多糖分解物の生成 本発明のアシネトバクター属SP.KP-43菌株のフラスコ振
盪培養液を80％硫安飽和溶液により塩析し、次いで透析
した溶液を粗酵素液(416mU/ml)として用い、酵素反応を
行わせた。その結果、生成される直糖は898μg/mlであ
り、培養液を作用させたとき程ではないが、硫酸酸性多
糖ポルフィランが分解されている。
島津製作所）を用い波長 660nmでの吸光度から測定し
た。また、粘度はＢ型粘度計（東京計器）にBLアダプタ
ーを取りつけ、35℃、回転速度30rpmで測定した。 （５）酵素的分解による多糖分解物の生成 本発明のアシネトバクター属SP.KP-43菌株のフラスコ振
盪培養液を80％硫安飽和溶液により塩析し、次いで透析
した溶液を粗酵素液(416mU/ml)として用い、酵素反応を
行わせた。その結果、生成される直糖は898μg/mlであ
り、培養液を作用させたとき程ではないが、硫酸酸性多
糖ポルフィランが分解されている。
【００２２】
【発明の効果】本発明により硫酸酸性多糖ポルフィラン
から多糖分解物を効率よく製造することができた。以
下、実施例により本発明を詳細に説明する。
から多糖分解物を効率よく製造することができた。以
下、実施例により本発明を詳細に説明する。
【００２３】
【実施例】滅菌した合成培地（粗製ポルフィラン2.０％
とNH4NO3 0.１％、KH2PO4 0.01％、FeCl3・6H2O 0.６×
10-4％から成るものである)75mlを含む500ml三角フラス
コ２本に菌体を１白金耳植菌し、30時間振盪培養したも
のを前培養液とした。この前培養液 150mlを、オートク
レーブで滅菌処理（１kg／cm2 、10min)した1.351 l の
上記合成培地を含むジャーファーメンター( 実容積1.5
l)に無菌的に植菌し、培養温度35℃、通気量１VVM 、攪
拌速度550rpmで好気培養した。この培養液を経時的にサ
ンプリングし、粘度、OD値、全糖及び直糖の分析をおこ
なった。なお、このジャーファーメンターを用いた培養
においては、１N NaOHと１N HClでpHを主として6.５に
なるように制御した。
とNH4NO3 0.１％、KH2PO4 0.01％、FeCl3・6H2O 0.６×
10-4％から成るものである)75mlを含む500ml三角フラス
コ２本に菌体を１白金耳植菌し、30時間振盪培養したも
のを前培養液とした。この前培養液 150mlを、オートク
レーブで滅菌処理（１kg／cm2 、10min)した1.351 l の
上記合成培地を含むジャーファーメンター( 実容積1.5
l)に無菌的に植菌し、培養温度35℃、通気量１VVM 、攪
拌速度550rpmで好気培養した。この培養液を経時的にサ
ンプリングし、粘度、OD値、全糖及び直糖の分析をおこ
なった。なお、このジャーファーメンターを用いた培養
においては、１N NaOHと１N HClでpHを主として6.５に
なるように制御した。
【００２４】菌の増殖は、OD値の変化から培養２〜３時
間から対数増殖期に入り、20時間で定常増殖期に達する
が、培養液の粘度は培養開始直後から低下し、増殖停止
時に３c.p.まで低下した（図７）。それに伴い平均重合
度は１00から15まで低下した。全糖濃度は増殖停止時に
おいても9.5g/lとかなり残存していたが、培養35時間目
から再度減少した。また、全糖の低下に伴い直糖が大き
く増加した。しかし、全糖、直糖の変化にもかかわらず
平均重合度は15とほぼ一定値を示した。
間から対数増殖期に入り、20時間で定常増殖期に達する
が、培養液の粘度は培養開始直後から低下し、増殖停止
時に３c.p.まで低下した（図７）。それに伴い平均重合
度は１00から15まで低下した。全糖濃度は増殖停止時に
おいても9.5g/lとかなり残存していたが、培養35時間目
から再度減少した。また、全糖の低下に伴い直糖が大き
く増加した。しかし、全糖、直糖の変化にもかかわらず
平均重合度は15とほぼ一定値を示した。
【００２５】以上の結果から、多糖分解物は経時的に変
化していくものと推察された。そこで各培養時間におけ
る多糖分解物生成収率を次式により算出した。なお、培
養上澄液中の全糖値から直糖を差し引いた値を多糖分解
物と仮定した。また、（全糖）ｉは培地中の全糖濃度で
ある。 培養開始20、35、45時間後の多糖分解物生成収率はそれ
ぞれ80.3, 69.2, 55.6％となった。培養時間の経過とと
もに生成収率は低下するが、培養20時間目で達成された
最大値80.3％は、ポルフィラン資化性細菌の好気培養に
よる多糖分解物の生産を可能にするものと期待された。
化していくものと推察された。そこで各培養時間におけ
る多糖分解物生成収率を次式により算出した。なお、培
養上澄液中の全糖値から直糖を差し引いた値を多糖分解
物と仮定した。また、（全糖）ｉは培地中の全糖濃度で
ある。 培養開始20、35、45時間後の多糖分解物生成収率はそれ
ぞれ80.3, 69.2, 55.6％となった。培養時間の経過とと
もに生成収率は低下するが、培養20時間目で達成された
最大値80.3％は、ポルフィラン資化性細菌の好気培養に
よる多糖分解物の生産を可能にするものと期待された。
【００２６】なお、全糖値から直糖を差し引いた値を多
糖分解物とした妥当性を確認するためSephadex G-50に
よる分子量分画を行った。図８に示したように1.6％粗
製ポルフィランをゲル濾過した場合分画している試験管
の28本目にピークが検出されたが、培養20時間目の上澄
み液では28本目は32本目と低分子側にシフトしており、
多糖は完全に分解されていることが確認された。
糖分解物とした妥当性を確認するためSephadex G-50に
よる分子量分画を行った。図８に示したように1.6％粗
製ポルフィランをゲル濾過した場合分画している試験管
の28本目にピークが検出されたが、培養20時間目の上澄
み液では28本目は32本目と低分子側にシフトしており、
多糖は完全に分解されていることが確認された。
【００２７】以上の結果から、硫酸酸性多糖ポルフィラ
ンは短時間で糖化され、多糖分解物が生産されることが
分った。
ンは短時間で糖化され、多糖分解物が生産されることが
分った。
【図１】一次スクリーニングにより選択した４菌株の増
殖（OD値）と粘度の経時変。
殖（OD値）と粘度の経時変。
【図２】一次スクリーニングにより選択した４菌株の培
養上澄のＴＬＣ。
養上澄のＴＬＣ。
【図３】KP-43株の増殖（OD値）と直糖生成におよぼす
培養温度の影響。
培養温度の影響。
【図４】KP-43株の温度別培養上澄液のＴＬＣ。
【図５】KP-43株の増殖（比増殖速度）におよぼす培地p
Hの影響。
Hの影響。
【図６】KP-43株の各pHでの培養上澄液のＴＬＣ。
【図７】KP-43株のジャーファメンター好気培養で経時
変化（pH6.5 、35℃) 。
変化（pH6.5 、35℃) 。
【図８】KP-43株の培養上澄み液のSephadex G-50 によ
る溶出曲線（−○−1.6%粗製ポルフィラン、−●−20時
間培養上澄液）。
る溶出曲線（−○−1.6%粗製ポルフィラン、−●−20時
間培養上澄液）。
【図９】KP-43株の電子顕微鏡写真。
【図10】DEAE-Sephadex A-25によるUF膜濃縮液の溶出曲
線。
線。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月３１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】一次スクリーニングにより選択した４菌株の増
殖（OD値）と粘度の経時変。
殖（OD値）と粘度の経時変。
【図２】一次スクリーニングにより選択した４菌株の培
養上澄のＴＬＣ。
養上澄のＴＬＣ。
【図３】KP-43株の増殖（OD値）と直糖生成におよぼす
培養温度の影響。
培養温度の影響。
【図４】KP-43株の温度別培養上澄液のＴＬＣ。
【図５】KP-43株の増殖（比増殖速度）におよぼす培地p
Hの影響。
Hの影響。
【図６】KP-43株の各pHでの培養上澄液のＴＬＣ。
【図７】KP-43株のジャーファメンター好気培養で経時
変化（pH6.5、35℃）。
変化（pH6.5、35℃）。
【図８】KP-43株の培養上澄液のSephadex G-50による溶
出曲線（−○− 1.6％粗製ポルフィラン、−●−20時間
培養上澄液）。
出曲線（−○− 1.6％粗製ポルフィラン、−●−20時間
培養上澄液）。
【図９】電子顕微鏡で見たKP-43株の形態を示す図。
【図10】DEAE-Sephadex A-25によるUF膜濃縮液の溶出曲
線。
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Claims (2)
- 【請求項１】 硫酸酸性多糖ポルフィランにアシネトバ
クター属に属するポルフィラン資化性微生物を作用させ
て多糖分解物を製造することを特徴とする多糖分解物を
製造法。 - 【請求項２】 アシネトバクター属に属する硫酸酸性多
糖ポルフィラン資化性微生物がアシネトバクター属SP.K
P-47株である請求項１記載の多糖分解物を製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26410091A JPH0678781A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 硫酸酸性多糖ポルフィラン資化性微生物による多糖分解 物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26410091A JPH0678781A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 硫酸酸性多糖ポルフィラン資化性微生物による多糖分解 物の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678781A true JPH0678781A (ja) | 1994-03-22 |
Family
ID=17398515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26410091A Pending JPH0678781A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 硫酸酸性多糖ポルフィラン資化性微生物による多糖分解 物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0678781A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6402659B1 (en) | 1999-10-12 | 2002-06-11 | Isuzu Motors Limited | Starting clutch controls for continuous variable transmissions |
-
1991
- 1991-10-11 JP JP26410091A patent/JPH0678781A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6402659B1 (en) | 1999-10-12 | 2002-06-11 | Isuzu Motors Limited | Starting clutch controls for continuous variable transmissions |
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