JPS5819678B2 - ペプチド誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規ペプチド誘導体（その塩を含む）詳しくは
新規金属プロテアーゼ阻害物質及びその製造方法に関し
、その目的とするところは緑膿菌感染症治療剤等医薬や
微生物生育調節剤の提供にある。

本発明者は、構造式 で示される新規ペプチド誘導体の製造に成功し、これが
新規金属プロテアーゼ阻害物質（以下、ｒＰＭＰＩＪと
略記する。

）であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成した。

プロテアーゼ阻害物質は、医学分野において有用であり
、種々の応用例が挙げられる。

特に金属プロテアーゼ阻害物質については、緑膿直感染
症に対する治療効果が期待される。

緑膿菌の感染症において、緑膿菌の生産する金属プロテ
アーゼの役割の犬なることが知られており、プロテアー
ゼ単独投与で、菌感染症と同じ症状を起すこともある。

従って、緑膿菌の生産する金属プロテアーゼを阻害する
物質を提供することは、現在及び将来の医療において極
めて重要な課題の一つである。

一方、微生物化学分野においても、微生物が生産する金
属プロテアーゼに対し阻害作用を有する物質は有用であ
り、微生物の生育、代謝の調節及び、その応用に基づく
種々の有用な用途が期待されている。

本発明の新規なプロテアーゼ阻害物質ＰＭＰ Ｉは、下
記の特徴を有し、放線菌の生産する多くの公知のプロテ
アーゼ阻害物質とは、明確に区別される。

すなわち、放線菌の生産する公知プロテアーゼ阻害物質
は、いずれも、セリンプロテアーゼ、ＳＨプロテアーゼ
、酸性プロテアーゼの阻学物質であるのに対し、本発明
のＰＭＰＩは、金属プロテアーゼを特異的に阻害する点
で、明確に区別することができる。

放線菌の生産する金属プロテアーゼ阻害物質としては、
ホスホラミトン（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２６． （１０）、６２１（
１９７３））、Ｓ −Ｍ Ｐ Ｉ （Ａｇｒｉｃ 。

Ｂ ｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍｏ、４２、〔４〕、８９９（
１，９７８）があるが、これらは、ＰＭＰ Ｉとは、明
確に区別される。

すなわち、ホスホラミトンは、構成成分として、ラムノ
ースを有するのに対し、ＰＭＰ Ｉは、後述する様にラ
ムノースとは異る６−ジオキシヘキソースを構成成分と
しており、又、種々の金属プロテアーゼに対する阻害ス
ペクトルも異っている。

又、Ｓ−ＭＰＩは分子量約１１００’Ｏ〜１２０００の
物質であり、ＰＭＰＩは分子量約５４３であるので、両
者とは明瞭に異る。

以下に本発明のＰＭＰＩの理化学性質を示す。

（１）元素分析 Ｃ５６，６０％、Ｈ８，２１％、Ｈ９
，３１％ ＰＭＰＩのジーシクロヘキシルアミン塩トしての計算値 Ｃ５６，６７％、Ｈ８，１５％、Ｈ９，４４％（２）分
子量 ５４３ （３）融点（ジ−シクロヘキシルアミン塩として）１５
３°−１５６°（分解） （４）比旋光度（ジ−シクロヘキシルアミン塩として）
〔α）”ＩＪ−−２５，６°（Ｃ＝０．５、水）（５）
ＰＭＰＩのアンモニウム塩を臭化カリウムに混じて測定
した赤外吸収スペクトルを第１図に示す。

（６）呈色反応 ＰＭＰＩは、ライドン・スミス試薬、エールリッヒ試薬
、ジフェニルアミン・アニリン試薬、モリブデン酸アン
モン・過塩素酸試薬に対して陽性の呈色反応を示し、ニ
ンヒドリン試薬に対して陰性の呈色反応を示す。

（力 構成アミノ酸 ＰＭＰＩを常法により６Ｎ塩酸又は４Ｎ水酸化ナトリウ
ムを用いて加水分解を行い、アミノ酸自動分析計にてア
ミノ酸分析を行うことにより、ロイシン、又はトリプト
ファンを夫々検出することができる。

（８）構成糖 ＰＭＰＩを０．５Ｎ塩酸中に、室温−夜装置して加水分
解を行（・、加水分解液を、クロマトグラフィー用活性
炭（和光純薬工業■製）、ｒＤｏｗｅｘ ５０ ｊ （
Ｈ十型、ダウケミカル社製）及び「アンバーライトＩＲ
Ａ−４０２ｊ （ＯＨｇ、ローム・アンド・バース社製）ヲ充てんした
カラムを順次通過させ、通過液を減圧下に濃縮すると糖
が単離される。

この糖は比旋光度測定、薄層クロマトグラフィー、ガス
クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーに
よって６−ゾオキシーＬ−タロースと同定される。

（９）薄層クロマトグラフィー ＰＭＰＩは、シリカゲル（メルク社製）の薄層プレート
中で、ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：１）の混液
にて展開すると、ＲｆＯ３４１に単一スポットを与える
。

又、ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水（１５： １
０： ３：１２）にて展開するとＲｆＯ，４９に単一ス
ポットを与える。

尚、発色は、１０％硫酸にて行った。

（１０）紫外線吸収スペクトル ＰＭＰＩ水溶液の紫外線吸収スペクトルは、２８０ｎｍ
付近に吸収極大を示し、かつ、トリプトファンの紫外線
吸収スペクトルに極めてよく類似している。

（１１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル表１にＰＭＰ
Ｉの重水中での水素核の核磁気共鳴スペクトル（ＩＨ−
ＮＭＲ１９０ＭＨｚ ）を示す。

尚、化学シフト（δ）は、３−（トリメチルシリル）−
プロパンスルホン酸ナトリウムを内部標準としｐｐｍ
を単位として表示した。

以上の結果より、本物質がトリプトファン、ロイン／及
び６−ゾオキシタロースを構成成分としたことが判る。

表２にＰＭＰＩの重水中での炭素核の核磁気共鳴スペク
トル（１３Ｃ−ＮＭＲ）を示す。

尚、化学シフト（δ）は、ジオキサンを内部標準とし、
ジオキサンより低磁場側を＋、高磁場側を−とし、ｐｐ
ｍ を単位として表示した。

以上の結果より、本物質がトリプトファン、ロイシン及
び６−ゾオキシタロースを構成成分としていることが判
る。

更に、リンは、６−ゾオキシタロースの１位のＯＨ基と
エステル結合で、ロイシンのアミノ基とアミド結合で、
それぞれ結合していることが判る。

０２）溶解性 ＰＭＰＩは水、メタノール、エタノールに可溶、ベンゼ
ン、ヘキサン、エーテル、クロロホルムに不溶である。

（１３）物質の色二白色又は淡黄色の粉末。

（１４）種々のプロテアーゼに対する作用ＰＭＰＩの特
徴的な性質は、金属プロテアーゼに対して強力な阻害活
性を有する点にある。

とりわけ、緑膿劇の生産する金属プロテアーゼ、バチル
ス属の生産する金属プロテアーゼであるサーモライシン
を強力に阻害し、アスペルギルス・オリゼの生産する金
属プロテアーゼも阻害するが、ペプシン、トリプシン、
キモトリプシン、サブチリシン、パパインを阻害しなし
・。

酵素活性の阻害度（活性）の測定法は以下に示す如くで
ある。

試料を０．０５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
せしめ、その（１２５ｙｄ及びサーモライシン（２０μ
＠／ｒＩｌｌ）の０．０５ モ／１／リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）溶液０．２５ ｒｒｄｌを混合して３７℃、
１０分間予濡した後１．３３％ハンマーステンカゼイン
の０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）溶液１．５ｍ
ｌを加え、３７℃、１０分間反応させ、然る後に０．４
４モルのトリクロル酢酸溶液２ｒＩ′Ｌｌを加えて反応
を停止する。

３７°Ｃ１３０分（＆に？紙ｒ過を行い、Ｐ液の１ｍＡ
を取って０．５５モル炭酸ナトリウム溶液５ｒｎ１．及
びフォリン（Ｆｏｌｉｎ ）のフェノール試薬１ｗＬｌ
を加え、３７℃、６０分後に６６０ｍμにおける吸光度
Ｉｓを測定する。

対照としてサーモライシンの代りに０．０５モルリン酸
緩衝液（１）Ｈ７，５） ０．２５ｍｌを用い、同様の
処理ヲ行って吸光度Ｉｂを測定する。

一方試料溶液の代りに０．０５モルリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５） ０．２５ｒｄを用い、同様に処理してＥｓ、
Ｅｂ を測定する。

酵素阻害率は にて算出する。

なお緑膿菌の生産する金属プロテアーゼに対する阻害活
性はサーモライシン阻害活性測定法に準じて測定し、用
いる酵素量は、前述のサーモライシン阻害活性測定法に
おける（Ｅｓ−Ｅｂ） の値が１ＣｒＩＬのセルを用
い吸光度０．６となるように設定したものである。

上記の活性測定法において、サーモライシン及び緑膿菌
の金属プロテアーゼの活性を５０％阻害するのに要する
ＰＭＰＩの量は、それぞれ０．３５μグ、４μｍである
。

（１４）安定性 ＰＭＰＩは、弱酸性中性及びアルカリ性の水溶液中で安
定であるが、酸性の水溶液中では不安定で、ｐＨ１、室
温２４時間で完全に活性を失う。

ＰＭＰＩは、以上の性質を示す物質である。

本発明のＰＭＰＩは塩の形で存在して（・てもよい。

塩の形としてはリン酸基部分とカルボキシル基部分の一
方又は両方における誘導体が存在するが、いずれも本発
明に含まれる。

その例としてはナトリウム、カリウム、ルビジウム、セ
シウム、カルシウム等の金属塩又はアンモニウム塩があ
げられる。

本発明のＰＭＰＩは、ストレプトミセス属に属し、ＰＭ
ＰＩ生産能を有する放線菌を培養し、培養液中にＰＭＰ
Ｉを生成せしめこれを採取することにより製造される。

そのような放線菌としては、例えば、新閑ストレプトミ
セス・モズネンシス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｏ
ｚｕｎｅｎｓｉｓ ） Ａ Ｊ ９４０６微工研菌寄第
４５８９号（ＦＥＲＭ−Ｐ４５８９）がある。

上記菌株は、大阪府堺市の土壌より以下の方法でスクリ
ーニングを行った結果、単離されたものである。

土壌約０．５ ｒｎｇを無菌水５ｒＩｌｌに溶解し、ア
ルギニン塩酸塩０．１％、グリセリｙ１．２５％、Ｎａ
Ｃ１００１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１％
、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，０００１％、Ｃｕ５Ｏ４Ｈ
５Ｈ２００，０００１％、ＭｎＳＯ４・ｎＨ２００，０
００１％、および寒天１．５％から成り、ｐＨ値を７．
０に調整して作った寒天平板状に添加し、３０°Ｃにて
培養を行って本劇を採取した。

このようにして得られた重態を、ポリペプトン２％、グ
リセリン１％、ＮａＣ１０，１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１
％、Ｍｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ４
・７ Ｈ２００，ＯＯ１％、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，
０００１％、ＣｕＳＯ４＋ ５ Ｈ２００，０００１％
およびＭｎＳＯ４・ｎＨ２００，０００１％から成り、
ｐＨ値を７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で
３〜４日間振とり培養を行い、その遠心上清を用い、前
述の酵素阻害活性の測定法に従って、サーモライシンに
対する阻害活性を測定したところ、強力なサーモライン
阻害活性を有する菌株であった。

ＡＪ９４０６株の閑学的性状は以下に示す通りである。

（ａ） 形態 栄養直系は、幅０．５〜１０μで単純分枝し、分断する
ことな（培地中又はその表面に長く伸びる。

気菌糸は、単純分枝し、胞子柄は通常ループ状を程して
いるが同時に不完全ならせん状、直線状及び波状のもの
も観察される。

これらの胞子柄は、主軸に互生もしくは、対生に分枝し
ており輪生枝（Ｗｈｏｒｌ ）を呈することはない。

胞子の連鎖は１０〜３０個よりなり、胞子の大きさは０
．７−Ｌｌ、 ２ Ｘ ０．９〜１．６μで、胞子の表
面は平滑である。

胞子のう、鞭毛胞子などの特殊な繁殖器管及び菌核は認
められない。

（ｂ） 各種培地上におげろ性状 次の各培地におけろ生育状態の観察はすべてＩＳＰの方
法便覧（Ｍｅｔｈｏｄ Ｍａｎｕａｌ 、 １９６４に
従い、記載もＩＳＰの記載例に準じた。

■ シュクロース・硝酸塩寒天培地 気菌糸は、微粉状、灰色系列（Ｇｒａｙ ）基底菌糸は
無色で、生育は貧弱である。

可溶性色素はない。

■ グルコース・アスパラギン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列、わずかにオリーブ色を呈す
る場合もある。

基底菌糸は、無色からうす黄色を呈する。

可溶性色素は、わずかに明るいうす黄色を呈する（典型
的色はない）。

■ グリセリン・アスパラギン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底繭糸は、無色からうす黄色を呈する。

可溶性色素は、明るい黄褐色を呈する（典型的色素はな
い）。

■ スターチ無機塩寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、明るいうす黄色、後に、赤褐色を呈する。

可溶性色素はない。

■ チロシン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、明るい黄褐色・のちに、赤褐色を呈する。

可溶性色素は、わずかに明るい黄褐色を示す（典型的色
素ない）。

■ 栄養寒天培地 気菌糸は、認められない。

基底菌糸は、初めは、うす黄色で後にクリーム色を呈す
る。

可溶性色素はなし・。

■ イースト′１麦芽１゛寒天培地 気菌糸は、粉状−灰色系列 基底菌糸は、明るい黄褐色。

可溶性色素は、明るい黄褐色（典型的色素ない）。

■ オートミール寒天培地 気菌糸、微粉状、灰色系列 基底繭糸は、無色で生育悪い。

可溶性色素はない。

■ ペプトン・イースト・鉄・寒天培地 気菌糸は認められな℃・。

基底菌糸は、うす黄色・後にクリーム色となる。

可溶性色素はない。

［相］ ミルク培地（液体培地） 気菌糸は認められなし・。

基底菌糸は白色後にうす黄色（表面にリング状に生育） 可溶性色素はない。

０ ゼラチン寒天培地 気菌糸は認められない。

基底菌糸は、うす黄色、後にクリーム色 可溶性色素はない。

（Ｃ）生理的性質 ■ スターチの加水分解：スターチ寒天培地上（Ｗａｋ
ｓｍａｎ −２１培地）陽性（弱い）■ ゼラチンの液
化ニゲルコース・ペプトンゼラチン培地上（Ｗａｋｓｍ
ａｎ −１９培地）陽性（弱い） ■ メラニン様色素の生成： ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地上（Ｉ
ＳＰ−６培地） チロシン寒天培地上（ＩＳＰ−７培地） チロシン・イーストエキストラクト液体培（ＩＳＰ−１
培地） ■ 脱脂牛乳の凝固：陽性 ペプトン化：陰性 ■ Ｃｅ１ｌ ｗａｌｌ ｔｙｐｅ ： Ｔｙ
ｐｅ Ｉ■ 生育温度範囲：１５〜４０℃、最適温度
は３０°Ｃ （ｄ） 炭素源の利用性ニブリドハム・ゴトリーブ寒
天培地上（ＩＳＰ−９培地） Ｌ−アラビノース − セルロース − Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール − ラクトース − マルトース モ Ｄ−マンニトール − マンノース 〜 ラフィノース − Ｌ−ラムノース − サリシン − スターチ ＋ シュクロース − Ｄ−キシロース − （注）＋：利用する ｍ：利用しない 以上、型閉（ＡＪ９４０６）は ■ 基底菌糸に分断が認められない。

■ 気菌糸は、単純分枝し、輪性板を呈することはなく
、気菌糸上に１０〜３０個の胞子を形成する。

■ 胞子のう、鞭毛胞子などの特殊な繁殖器官が認めら
れない。

等の点から、ストレプトミセス属に属する。

上述の観察結果から、型閉ＡＪ−９４０６の性質を要約
すれば、次のようになる。

（１）気菌糸は単純分枝で、胞子の着生形態は通常ルー
プ状を形成しているが、らせん状及び波状も認められる
。

（２）胞子の表面は平滑である。

（３） 菌叢表面の色は灰色である。

（４）基底菌糸は、薄黄褐色であるが、スターチ寒天培
地では赤褐色を呈する。

（５）典型的な可溶性色素を産生じない。

（６）グルコース、ガラクトース以外の単糖を利用しな
い。

（７）メラノイド色素は産生じない。

これらの結果を基礎にして、既知の菌種との比較同定を
試みた。

ニス・ニー・ワックスマンのザ・アクチンミセテス第２
巻（Ｓ、 Ａ、Ｗａｋｓｍａｎ ： ＴｈｅＡｃｔｉｏ
ｎｍｙｃｅｔｅｓ Ｖｏｌ、 ＩＩ ）及びイー、ビー
。

シャーリングとデー・ゴツトリープのＩＳＰ記載（Ｅ、
Ｂ、 Ｓｈｉｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄ、 Ｇｏｔｔ
ｌｉｅｂ ：Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｄｅｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅｏ
ｆ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＩＩ、■、■、
■、Ｉｎｔ、Ｊ。

５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔ、１８．６９〜１８９．２７９〜
３９２．１９．３９．１〜５１２．２２，２６５〜３９
４）より、灰色系列に属し、胞子表面が平滑で、メラノ
イド色素を産生じない、かつ、胞子の着生形態が本閑の
特徴であるループ状を示すという点でよく類似している
記載様を選出し、本菌株との比較を行い、表−３に示し
た。

アクチノミセス・シアノカラー （Ａｃｔｉｏｎｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｏｃｏｌｏｒ
）ストレプトミセス・ツガレイター （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｇａｌａｔｅｒ
）ストレプトミセス・グリセオオウランテイアカス（Ｓ
ｔ、 ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ）ストレ
プトミセス・ピリドファシェンス （Ｓｔ、 ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ ）の４繭種は
、いずれも特徴的な可溶性色素を産生ずる点、更に、糖
の資化性パターンが大きく異っている。

ストレプトミセス・レジフェンシス （Ｓｔ、ｒｅｃｉｆｅｎｓｉｓ ） ストレプトミセス・チバエンシス （Ｓｔ、ｃｈｉｂａｅｎｓｉｓ ） ストレフトミセス・コルコルツシー （Ｓｔ、 ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ ） の３菌種は、いずれも、スターチ無機塩寒天培地にて、
集落裏面に特徴的色素（赤褐色）を呈しない点、更に、
糖の資化性パターンが、型閉（ＡＪ９４０６）と大きく
異っている。

ストレプトミセス・カルノウサス （Ｓｔ、 ｃａｒｎｏｓｕｓ ） は、特徴的な可溶性色素（ピンク又は黄色）を産生ずる
点、及びラムノースを利用する点で型閉とは異なる。

以上の様に、集落裏面の色素産生能、可溶性色素産生能
及び糖の資化性パターンなど、分類学上の重要な点で、
これら８菌種のいずれもが、事態と明らかに異っており
、同一種とは認め難い。

そこで、事態を新劇と同定し、ストレプトミセス・モズ
ネンシスＡＪ９４０６と命名した。

ＰＭＰＩの製造において使用される液体培地は通常の微
生物の培養培地である。

即ち、ＰＭＰ Ｉ生産菌が資化（〜うる炭素源、窒素源
及び無機塩、更に必要ならば、微量栄養素を含有するも
のであればよい。

炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、
マルトース、スターチ、デンプン加水分解物等の炭水化
物、グリセリン等のアルコール類が用いられる。

窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム等ノアンモニウム塩、アミノ酸類、ペプトン、
肉エキス、大豆加水分解物等が用いられる。

培養条件は、培地組成その他により異るが、例えば、通
常ｐＨ５，０〜９．０、温度１５〜４０℃で振とり培養
、通気攪拌培養等好気的条件下に培養が行われる。

本発明のＰＭＰＩは、ＰＭＰＩ生産閑の培養液中及び菌
体内に存在するが、大部分は、培養液中に存在する。

ＰＭＰＩを培養液より単離するには例えば、ブタノール
抽出、透析、活性炭等の吸着剤による吸着、及びイオン
交換、吸着、分配、ゲル濾過等のクロマトグラフィーを
適宜組み合せて行う。

例えば、菌体を除去した培養Ｐ液に活性炭の粉末を加え
て、ＰＭＰＩを活性炭に吸着させた後、ｒ別し、活性炭
を水洗後、７０〜１００％のメタノール又はアンモニア
を０．０１〜ＩＮ含む７０〜９０％メタノール水にてＰ
ＭＰＩを溶出することにより、精製することができる。

更に溶出液を減圧にて濃縮後酸性にてＰＭＰＩをブタノ
ール抽出し、ブタノール層を中和して、ＰＭＰＩを水層
に転溶する。

次にＰＭＰＩを含む溶液を、１Ｍ酢酸にて平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ファルマシア製）の
カラムに注いでＰＩＶＩＰＩを吸着させ、１Ｍ酢酸にて
カラムを洗浄後、ＩＮ酢酸と０．５Ｍの食塩を含むＩＮ
酢酸の直線グラジェント溶出を行い、ＰＭＰＩを溶出す
る。

溶出液は、クロマト用活性炭（和光紬薬製）のカラムに
注いでＰＭＰＩを吸着させ、十分な量の純水でカラムを
洗浄した後、アンモニア水を用いてｐＨを１０．５に調
整した８５％メタノール溶液でＰＭＰＩを溶出する。

溶出液は、減圧濃縮し、セファデックスＧ−１０（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトを行い、ＰＭＰＩ画分を
凍結乾燥することにより、純粋なＰＭＰＩ又はその塩を
微黄色粉末として得ることができろ。

以上述べた方法は、あくまでも一例であり、培地組成、
培養条件、ＰＭＰＩの生産量等に応じ、更に適切な方法
を工夫することができる。

例えば、前述の方法の一部を省略し、反復し、もしくは
順序を変えて行うことは有効であり、又、他の分離方法
、例えば、オクタデシルシリル化したシリカゲルを用い
る逆相分配クロマトグラフィー、多孔性ポリスチレンを
用いる吸着クロマトグラフィーも有効な方法である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例 １ 水１１につき、ペプトン１０１、肉エキス１０２、塩化
ナトリウム３グを含有する培養基をｐＨ７，０に調整後
、５００ｍ１坂ロフラスコ１０本に夫夫４０ｍ１ずつ分
注し、１２０℃にて１０分間殺菌した。

この培地にストレプトミセス・モズネンシスＡＪ９４０
６、ＦＥＲＭ−、−Ｐ４５８９株の斜面培地より、夫々
１白金耳を接種し、３０℃で２４時間振と５培養（１２
０回／分）を行った。

この前培養液４００ｖＬｌを、水１１につき、グリセロ
ール１０Ｌ？、ペア”）ン４０グ、リン酸二カリウム１
２、塩化ナトリウム１７、硫酸マグネシウム（７水塩）
０．５グ、硫酸第１鉄（７水塩） ０．０１グ、硫酸銅
（５水塩）１７、硫酸亜鉛（７水塩）１ｖ、硫酸マンガ
ン（６水塩）１１を含有し、ｐＨ７，０に調整し、殺菌
した培地１５１の入った２０１容ステンレス製ジャーフ
ァーメンタ−に移し、３０℃で、毎分２ｏ１の無菌空気
を送り、３００回転の攪拌で本培養を行った。

２３時間で培養をやめ、培養液（培養液のｐＨは、約８
５）を遠心分離によって菌体を除去し、上清１．４１を
得た。

この培養上清液５０μｌは、緑膿閑金属プロテアーゼ活
性を５０％阻害した。

この上清１４１に７００１の活性炭（和光紬薬製、・白
鷺）を加え、３０分間攪拌してＰＭＰＩを吸着せしめ、
濾過し、活性炭を更に純水３１で３回洗った後、０．Ｉ
Ｎとなるようにアンモニアを含む９０％メタノール１５
１でＰＭＰＩを溶出し、溶出液を４００ｍ７迄濃縮した
。

この濃縮液に４℃にて、３Ｎ、ＨＣＩ を加えて、ｐ
Ｈを２とし、ｎ−ブタノール４００１ｒＬｌにて抽出を
行った。

ブタノール層を４℃にて３Ｎ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７
とし、水４０ Ｑ ｍｌ！を加えてＰＭＰ Ｉを水層に
転溶した。

次に、この水層を、４℃にて、ＩＮ酢酸で十分洗浄した
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ファルマシア社製
）の４．５ ＣｒｒＬＸ ２５ ｃｍのカラムに注ぎ、
カラムを２，８１のＩＮ酢酸で洗浄した後、ＩＮ酢酸４
１及び０．５Ｍの食塩を含むＩＮ酢酸４１の直線グラジ
ェント溶出を行った。

溶出液は、フラクションコレクターにて分画し、ＰＭＰ
Ｉを含有する両分を集めた。

このＰＭＰＩ画分を、予め、濃塩酸、メタノール、水の
順で十分洗浄したクロマト用活性炭（和光紬薬製）の３
５ＣｒｒＬ×１５ＣｒｒＬＯカラムに注いで、ＰＭＰＩ
を吸着し、水でカラム溶出液が硝酸銀反応陰性となるま
で十分洗浄し、その後にアンモニア水でｐＨを１０．５
に調製した８５％メタノールにてＰＭＰＩを溶出した。

ＰＭＰＩ画分を３ｍｌ迄濃縮し、予め水で十分洗浄した
セファデックスＧ−１０（ファルマシア社製）の２．５
ｃｒＩＬＸ４０ＣＩｒＬのカラムに注ぎ、水２００ｒａ
ｌｌにて溶出を行った。

ＰＭＰＩは１３５ ｍｌ！付近に溶出され、このＰＭＰ
Ｉ画分を連結乾燥して、淡黄色粉末６００７を得た。

この粉末４μＶは、緑膿菌金属プロテアーゼ活性を５０
％阻害した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＭＰＩのアンモニウム塩を臭化カリウムに
混じて測定した赤外線吸収スペクトルを示し、縦軸に透
過率（％）、横軸に波数（、ｍ−１）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １Ｎ−（６−ゾオキシーＬ−タロシルオキシヒドロキシ
   フォスフイニル）−Ｌ−ロインル−Ｌ−トリプトファン
   。 ２ ストレプトミセス属に属し、Ｎ−（６−ジオキシ−
   し一タロシルオキシヒドロキシフォスフイニル）〜Ｌ−
   ロイシルーＬ−１リプトファン生産能を有する放線菌を
   培養し、培養液中に該ペプチド誘導体を生成せしめこれ
   を採取することを特徴とするペプチド誘導体の製造方法
   。 ３ 放線ｉカストレフ’ｌ−ミセス・モズネンシス（
   Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｚｕｎｅｎｓｉｓ
   ） に属する放線菌である特許請求の範囲第２項記載
   の方法。