JPS5818069B2 - ストレプトミセス属微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、放線菌め新菌種ストレプトミセス・モズネン
シスに関する。

本発明者は、緑膿菌感染症治療剤等の医薬や微生物生育
調節剤として期待できる新規ペプチド誘導体（その塩を
含む）、詳しくは新規金属プロテアーゼ阻害物質（以下
、「ＰＭＰＩＪと略記する。

）を生化学的に生産する能力を有する上記放線菌の新菌
種を見出し、これに後述の如く、ストレプトミセス・モ
ズネンシスと命名し、本発明を完成するに至った。

上記新規ペプチド誘導体は、一般式 で示されるＮ−（６−ジオキシヘキソシルオキシヒドロ
キシフォスフイニル）−Ｌ−ロイシル−し−トリプトフ
ァンにおいて６−デオキシへキソシル基がラムノシル又
はフコシル基でない化合物である。

プロテアーゼ阻害物質は、医学分野において有用であり
、種々の応用例が挙げられる。

特に金属プロテアーゼ阻害物質については、緑膿菌感染
症に対する治療効果が期待される。

緑膿菌の感染症において、緑膿菌の生産する金属プロテ
アーゼの役割の犬なることが知られており、プロテアー
ゼ単独投与で、菌感染症と同じ症状を起すこともある。

従って、緑膿菌の生産する金属プロテアーゼを阻害する
物質を提供することは、現在及び将来の医療において極
めて重要な課題の一つである。

一方、微生物化学分野においても、微生物が生産する金
属プロテアーゼに対し阻害作用を有する物質は有用であ
り、微生物の生育、代謝の調節及び、その応用に基づく
種々の有用な用途が期待されている。

新規なプロテアーゼ阻害物質ＰＭＰＩは、下記の特徴を
有し、放線菌の生産する多くの公知のプロテアーゼ阻害
物質とは、明確に区別される。

すなわち、放線菌の生産する公知プロテアーゼ阻害物質
は、いずれも、セリンプロテアーゼ、ＳＨプロテアーゼ
、酸性プロテアーゼの阻害物質であるのに対し、本発明
のＰＭＰＩは、金属プロテアーゼを特異的に阻害する点
で、明確に区別することができる。

放線菌の生産する金属プロテアーゼ阻害物質としては、
ホスホラミトン（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ ２６． （１０〕、６２１（１９７
３））Ｓ−ＭＰＩ（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、４２． （４，１。

８９９（１９７８））があるが、これらは、ＰＭＰＩと
は、明確に区別される。

すなわち、ホスホラミトンは、構成成分として、ラムノ
ースを有するのに対し、ＰＭＰＩは、後述する様にラム
ノースとは異る６−ジオキシヘキソースを構成成分とし
ており、又、種々の金属プロテアーゼに対する阻害スペ
クトルも異っている。

又、Ｓ−ＭＰＩは分子量約１１．０００〜１２，０００
の物質であり、ＰＭＰＩは分子量約５４３であるので、
両者とは明瞭に異る。

以下にＰＭＰＩの理化学的性質を示す。

（１）元素分析 Ｃ５６，６０％、 Ｈ８，２１％。

Ｎ ９，３１％ ＰＭＰＩのジ−シクロヘキシルアミン塩としての計算値 Ｃ５６，６７％、 Ｈ８，１５％。

Ｎ ９．４４％ （２）分子量 ５４３ （３）融点（ジ−シクロヘキシルアミン塩として）１５
３°−１５６°Ｃ（分解） （４）比旋光度（ジ−シクロヘキシルアミン塩として）
〔α）１１−−２５．６°（Ｃ＝０．５．水）（５）Ｐ
ＭＰＩのアンモニウム塩を臭化カリウムに混じて測定し
た赤外線級収スペクトルを第１図に示す。

（６）呈色反応 ＰＭＰＩは、ライドン・スミス試薬、エールリッヒ試薬
、ジフェニルアミン・アニリン試薬、モリブデン酸アン
モン・過塩素酸試薬に対して陽性の呈色反応を示し、ニ
ンヒドリン試薬に対して陰性の呈色反応を示す。

フ（７）構成アミノ酸 ＰＭＰＩを常法により６Ｎ塩酸又は４Ｎ水酸化すｌ−Ｉ
Ｊウムを用いて加水分解を行い、アミノ酸自動分析計に
てアミノ酸分析を行うことにより、ロイシン、又はトリ
プトファンを夫々検出するり ことができる。

（８）構成糖 ＰＭＰＩを０．５Ｎ塩酸中に、室温−夜装置して加水分
解を行い、セルロース薄層プレートを用い、酢酸エチル
：ピリジン：酢酸：水（５：５ニア１：３）の混液にて
展開し、ジフェニルアミン・アニリン試薬にて発色を行
うと、ラムノースともフコースとも異るＲｆ値を示す糖
を検出することができる。

（９）薄層クロマトグラフィー ｉ ＰＭＰＩは、シリカゲル（メルク社製）の薄層
プレート上で、ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：１
）の混液にて展開すると、ＲｆＯ，４１に単一スポット
を与える。

又、ｎ−ブクノール：ピリジン：酢酸：水（１５：１０
：３：１２）； にて展開するとＲｆｏ、４９に単一ス
ポットを与える。

尚、発色は、１０％硫酸にて行った。ｕＯｌ 紫外線
吸収スペクトル ＰＭＰＩ水溶液の紫外線吸収スペクトルは、２８ Ｏｎ
ｍ付近に吸収極大を示し、かつ、トリプトファンの紫外
線吸収スペクトルに極めてよく類似している。

（１１） 核磁気共鳴（ＮＭＲ） スヘ’７ トル表
１にＰＭＰＩの重水中での水素核の核磁気共鳴スペクト
ル（Ｈ−ＮＭＲ、９０ＭＨｚ ） □ を示す。

尚、化学シフト（δ）は、３−（トＩＪメチルシリル）
−プロパンスルホン酸ナトリウムを内部標準としｐｐｍ
を単位として表示した。

以上の結果より、本物質がトリプトファン、ロイシン及
び糖を構成成分とし、かつその糖はメチル基を有する糖
であることが判る。

表２にＰＭＰＩの重水中での炭素核の核磁気共鳴スペク
トル（１３Ｃ−ＮＭＲ）を示す。

尚、化学シフト（δ）は、ジオキサンを内部標準とし、
ジオキサンより低磁場側を＋、高磁場側を−とし、四を
単位として表示した。

以上の結果より、本物質がトリプトファン、ロイシン及
び六炭糖を構成成分さしており、六炭糖はＩＨ−ＮＭＲ
スペクトルの結果とあわせ、６−ジオキシヘキソースで
あることが判る。

更に、リンは、６−ジオキシヘキソースの１位のＯＨ基
とエステル結合で、ロイシンのアミノ基とアミド結合で
、それぞれ結合していることが判る。

また、前述の糖分析の結果とあわせ、六炭糖は、ラムノ
ース、フコース以外の６−ジオキシヘキソースであるこ
とが判る。

（１２）溶解性 ＰＭＰＩは水、メタノール、エタノールに可淫ベンゼン
、ヘキサン、エーテル、クロロホルムに不溶である。

（１３）物色の色：白色又は淡黄色の粉末（ｔ４）
種々のプロテアーゼに対する作用ＰＭＰＩの特徴的な性
質は、金属プロテアーゼに対して強力な阻害活性を有す
る点にある。

とりわけ、緑膿菌の生産する金属プロテアーゼ、バチル
ス属の生産する金属プロテアーゼであるサーモライシン
を強力に阻害し、アルペルギルス・オリゼの生産する金
属プロテアーゼも阻凋するが、ペプシン、トリプシン、
キモトリプシン、サブチリシン、パパインを阻害しない
。

耐素活性の阻害度（活性）の測定法は以下に示す如くで
ある。

試料を０．０５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
せしめ、その０．２５ｍ１及びサーモライシン（２０μ
ｇ／ｍｌ）の０．０５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
溶液ｏ、２５ｍ１を混合して３７℃。

１０分間予濡した後１．３３％ハンマーステンカゼイン
の０，１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）溶沿１．５ｍ
ｌを加え、３７℃、１０分間反応サセ、然る後に０．４
４モルのトリクロル酢酸溶液２ ｍｌを加えて反応を停
止する。

３７℃、３０分後に濾紙濾過を行い、濾液の１ｍｌを取
って０．５５モル炭酸ナトリウム溶液５Ｍ及びフォリン
（Ｆｏｌ ｉｎ）のフェノール試薬１ｍｌを加え、３７
℃、６０分後に６６０ｍμにおける吸光度Ｉｓを測定す
る。

対照としてサーモライシンの代りに０．０５モルリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５） ０．２５ｍｌを用い、同様の処
理を行って吸光度Ｉｂを測定する。

一方試料溶液の代りに０．０５モルリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）Ｏ１２５ｍｌを用い、同様に処理してＥｓ、Ｅ
ｂを測定する。

酵素阻害率は ５−Ｉｂ （１−−） Ｘ １００ （７ｏ）にて算出する。

５−Ｅｂ なお緑膿菌の生産する金属プロテアーゼに対する阻害活
性はサーモライシン阻害活性測定法に準じて測定し、用
いる酵素量は、前述のサーモライシン阻害活性測定法に
おける（Ｅｓ−Ｅｂ）の値がＩＣＩＩ′Ｌのセルを用い
吸光度０．６となるように設定したものである。

上記の活性測定法において、サーモライシン及び緑膿菌
の金属プロテアーゼの活性を５０％阻害するのに要する
ＰＭＰＩＯ量は、それぞれ０．３５μｇ１４μｇである
。

Ｕ由 安定性 ＰＭＰＩは、弱酸性中性及びアルカリ性の水溶液中で安
定であるか、酸性の水溶液中では不安ノ 定で、ｐＨ１
、室温２４時間で完全に活性を失う。

ＰＭＰＩは、以上の性質を示す物質である。

ＰＭＰＩは塩の形で存在していてもよい。

塩の形としてはリン酸基部分とカルボキシル基部分の一
方又は両方における誘導体が存在するか、いずれも１本
物質に含まれる。

その例としてはすｌ−ＩＪウム、カリウム、ルビジウム
、セシウム、カルシウム等の金属塩又はアンモニウム塩
があげられる。

ＰＭＰＩは、ストレプトミセス属に属し、ＰＭＰ■生産
能を有する放線菌を培養し、培養液中に）ＰＭＰＩを生
成せしめこれを採取することにより製造される。

そのような放線困としては、性菌ストレプトミセス°モ
ズネンシス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｚｕ−ｎ
ｅｎｓｉｓ） ＡＪ ９４０６、微工研菌寄第４５８
９号ｉ （ＦＥＲＭ−Ｐ４５８９）がある。

上記菌株は、大阪府堺市の土壌より以下の方法でスクリ
ーニングを行った結果、単離されたものである。

土壌約０．５７ｎ９を無菌水５ｍｌに溶解し、アルギニ
；ン塩酸塩０．１％、グリセリン１．２５％、ＮａＣ１
０１１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，０５％、Ｆ ｅ ＳＯ，ｉ ・７Ｈ２００，００
１％、ＺｎＳＯ４＋ ７Ｈ２００，０００１％、Ｃｕ
Ｓ ０４ ・５ Ｈ２００、０００１’１ｔｈ Ｍｎ
ＳＯ４・ｎＨ２Ｏ０，０００１％、および寒天１．５％
から成り、ｐＨ値を７．０に調整して作った寒天平板状
に添加し、３０℃にて培養を行って本菌を採取した。

このようにして得られた本菌を、ポリペプトン２％、グ
リセリン１％、ＮａＣｌ Ｏ，１％、Ｋ２ＨＰＯ４・
０．１％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５％、ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２００，００１％、ＺｎＳ０４−７Ｈ２００，
０００１％、Ｃｕ ＳＯ４・５Ｈ２０ｏ、 ０００１％
およびＭｎＳＯ４”ｎＨ２Ｏ０，０００１％から成り、
ｐＨ値を７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で
３〜４日間振とう培養を行い、その遠心上清を用い、前
述の酵素阻害活性の測定法に従って、サーモライシンに
対する阻害活性を測定したところ、強力なサーモライシ
ン阻害活性を有する菌株であった。

ＡＪ ９４０６株の菌学的性状は以下に示す通りであ
る。

ａ）形態 栄養菌糸は、幅０．５〜１．０μで単純分枝し、分断す
ることなく培地中又はその表面に長く伸びる。

気菌糸は、単純分枝し、胞子柄は通常ループ状を呈して
いるが同時に不完全ならせん状、直線状及び波状のもの
も観察される。

これらの胞子柄は、主軸に互生もしくは、対生に分枝し
ており、輪生枝（ｗｈｏｒｌ）を呈することはない。

胞子の連鎖は１０〜３０個よりなり、胞子の大きさは０
．７〜１．２ Ｘ Ｏ１９〜１．６μで、胞子の表面は
平滑である。

胞子のう、鞭毛胞子などの特殊な繁殖帰管及び菌核は認
められない。

ｂ）各種培地上における性状 次の各培地における生育状態の観察はすべてＩＳＰの方
法便覧（Ｍｅｔ ｈｏｄ Ｍａｎｕａ ｌ 、 １９６
４）に従い、記載もＩＳＰの記載例に準じた。

■ シュクロース・硝酸塩寒天培地 気菌糸は、微粉状、灰色系列（Ｇｒａｙ）基底菌糸は無
色で、生育は貧弱である。

可溶性色素はない。

■ グルコース・アスパラギン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列、わずかにオリーブ色を呈す
る場合もある。

基底菌糸は、無色からうす黄色を呈する。

可溶性色素は、わずかに明るいうす黄色を呈する（典型
的色はない）。

■ グリセリン・アスパラギン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、無色からうす黄色を呈する。

可溶性色素は、明るい黄褐色を呈する（典型的色素はな
い）。

■ スターチ無機塩寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、明るいうす黄色、後に、赤褐色を呈する。

可溶性色素はない。

■ チロシン寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、明るい黄褐色、のちに、赤褐色を呈する。

可溶性色素は、わずかに明るい黄褐色を示す（典型的色
素ない）。

■ 栄養寒天培地 気菌糸は、認められない。

基底菌糸は、初めは、うす黄色で後にクリーム色を呈す
る。

可溶性色素はない。

■ イースト麦芽″寒天培地 気菌糸は、粉状、灰色系列 基底菌糸は、明るい黄褐色。

可溶性色素は、明るい黄褐色（典型的色素ない）。

■ オートミール寒天培地 気菌糸、微粉状、灰色系列 基底菌糸は、無色で生育悪い。

可溶性色素はない。

■ ペプトン・イースト・鉄・寒天培地 気菌糸は認められない。

基底菌糸は、うす黄色、後にクリーム色きなる。

可溶性色素はない。

■ ミルク培地（液体培地） 気菌糸は認められない。

基底菌糸は白色後にうす黄色（表面にリング状に生育） 可溶性色素はない。

０ ゼラチン寒天培地 気菌糸は認められない。

基底菌糸は、うす黄色、後にクリーム色 可溶性色素はない。

Ｃ）生理的性質 ■ スターチの加水分解：スターチ寒天培地上（Ｗａｋ
ｓｍａｎ −２１培地）陽性（弱い）■ ゼラチンの
液化ニゲルコース・ペプトンゼラチン培地上（Ｗａｋ
ｓｍａ ｎ−１９培地）陽性（弱い） ■ メラニン様色素の生成： ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地上（Ｉ
ＳＰ−６培地） チロシン寒天培地上（ＩＳＰ−７培地） チロシン・イーストエキストラクト液体培地上（ＩＳＰ
−１培地） 陰性 Ｃ脱脂牛乳の凝固：陽性 ペプトン化 ：陰性 ■ Ｃｅ１ｌ ｗａｌｌ ｔｙｐｅ ：Ｔｙｐｅ
Ｉ■ 生育温度範囲＝１５〜４０℃最適温度は３０Ｃ ｄ）炭素源の利用性ニブリドハム・ゴドリーブ寒天培地
上（ＩＳＰ−９培地） Ｌ−アラビノース − セルロース − Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール − ラクトース − マルトース ＋ Ｄ−マンニトール − マンノース − ラフィノース − Ｌ−ラムノース − サリシン − スターチ ＋ シュクロース − Ｄ−キシロース − （注）十二利用する − 二利用しない 以上、本菌（ＡＪ ９４０６ ）は ■ 基底菌糸に分断が認められない。

■ 気菌糸は、単純分枝し、輪性板を呈することはなく
、気菌糸上に１０〜３０個の胞子を形成する。

■ 胞子のう、鞭毛胞子などの特殊な繁殖器官が。

認められない。

等の点からストレプトミセス属に属する。

上述の観察結果から、本菌ＡＪ−９４０６の性質を要約
すれば、次のようになる。

（１）気菌糸は単純分枝で、胞子の着生形態は通常・ル
ープ状を形成しているが、らせん状及び波状も認められ
る。

（２）胞子の表面は平滑である。

（３）菌叢表面の色は灰色である。

（４）基底菌糸は、薄黄褐色であるが、スターチ寒天培
地では赤褐色を呈する。

（５）典型的な可溶性色素を産生じない。

（６）グルコース、ガラクトース以外の単糖を利用しな
い。

（７）メラノイド色素は産生じない。

これらの結果を基礎にして、既知の菌種との比較同定を
試みた。

ニス・ニー・ワックスマンのザ・アクチノミセ；テス第
２巻（Ｓ、Ａ、ｗａｋｓｍａｎ ： Ｔｈｅ Ａｃｔｉ
ｎｏ−ｍｙｃｅ ｔｅ ｓ ’Ｖｏｌ 、 ＩＩ ）及
びイー・ビー・シャーリングとデー・ボッｌ−ＩＪ−プ
のＩＳＰ記載（Ｅ、Ｂ。

５ｈｉｒｌ ｉｎｑ ａｎｄ Ｄ、 Ｇｏｔｔｌ ｉｅ
ｂ ： Ｃｏｏｐｅｒａ−ｔｉｖｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ’ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙＣｅｓ ＩＩ 、 ＩＩＩ、ｆＶ、
Ｖ、 Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔ、１８，６９〜１８９，２７９〜３９２，１９
，３９１〜５１２、礼２，２６５〜３９４）より、灰色
系列に属し、胞子表面が平滑で、メラノイド色素を産生
じない、かつ、胞子の着生形態が本菌の特徴であるルー
プ［状を示すという点でよく類似している記載様を選出
し、本菌株との比較を行い、表３に示した。

アクチノミセス・シアノカラー （Ａｃｔ ｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｙａｎｏｃｏｌｏｒ）
ストレプトミセス・ツガレイター （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｇ、ａｌａｔｅｒ）
ストレプトミセス・グリセオオウランテイアカス（Ｓｔ
、 ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ストレプト
ミセス・ピリドファシェンス （Ｓｔ、 ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）の４菌種は
、いずれも特徴的な可溶性色素を産生ずる点、更に、糖
の資化性パターンが大きく異っている。

ストレプトミセス・レジフェンシス （Ｓｔ、 ｒｅｃｉ ｆｅｎｓｉｓ） ストレプトミセス・チバエンシス （Ｓｔ、ｃｈｉｂａｅｎｓｉｓ） ストレプトミセス・コルコルツシー （Ｓｔ、 ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉ ｉ）の３菌種は、
いずれも、スターチ無機塩寒天培地にて、集落裏面に特
徴的色素（赤褐色）を呈しない点、更に、糖の資化性パ
ターンが、本菌（ＡＪ９４０６）と大きく異っている。

ストレプトミセス・カルノウサス （Ｓｔ、ｃａｒｎｏｓｕｓ） は、特徴的な可溶性色素（ピンク又は黄色）を産生ずる
点、及びラムノースを利用する点で本菌とは異なる。

以上の様に、集落裏面の色素産生能、可溶性色素産生能
及び糖の資化性パターンなど、分類学士の重要な点で、
これら８菌種のいずれもが、本菌と明らかに異っており
、同一種とは認め難い。

そこで、本菌を性菌と同定し、ストレプトミセス・モズ
ネンシス（ＡＪ ９４０６．ＦＥＲＭ−Ｐ ４５８９
）と命名した。

ＰＭＰＩの製造において使用される液体培地は、通常の
微生物の培養培地である。

即ち、ＰＭＰＩ生産菌が資化しうる炭素源、窒素源及び
無機塩、更に必要ならば、微量栄養素を含有するもので
あればよい。

炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、
マルトース、スターチ、デンプン加水分解物等の炭水化
物、グリセリン等のアルコール類が用いられる。

窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム等のアンモニウム塩、アミノ酸類、ペプトン、
肉エキス、大豆加水分解物等が用いられる。

培養条件は、培地組成その他により異るが、例えば、通
常ｐＨ５，０〜９．０、温度１５〜４０°Ｃで振とう培
養、通気攪拌培養等好気的条件下に培養が行われる。

ハ什Ｉ４ま、ＰＭＰ■生産菌の培養液中及び菌体内に存
在するが、大部分は、培養液中に存在する。

ＰＭＰＩを培養液より単離するには例えば、ブタノール
抽出、透析、活性炭等の吸着剤による吸着、及びイオン
交換、吸着、分配、ゲル濾過等のクロマトグラフィーを
適宜組み合せて行う。

例えば、菌体を除去した培養濾液に活性炭の粉末を加え
て、ＰＭＰＩを活性炭に吸！させた後、濾別し、活性炭
を水洗後、７０〜１００％のメタノール又はアンモニア
を０．０１〜ＩＮ含む７０〜９０％メタノール水にてＰ
ＭＰＩを溶出することにより、精製することができる。

更に溶出液を減圧にて濃縮後酸性にてＰＭＰＩをブタノ
ール抽出し、ブタノール層を中和して、ＰＭＰＩを水層
に転溶する○ 次にＰＭＰＩを含む溶液を、１Ｍ酢酸にて平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファデックスＡ、２５（ファルマシア製）の
カラムに注いでＰＭＰＩを吸着させ、１Ｍ酢酸にてカラ
ムを洗浄後、ＩＮ酢酸と、０．５Ｍの食塩を含むＩＮ酢
酸の直線グラジェント溶出を行い、ＰＭＰＩを溶出する
。

溶出液は、クロマト用活性炭（和光紬薬製）のカラムに
注いでＰＭＰＩを吸着させ、十分な量の純水でカラムを
洗浄した後、アンモニア水を用いてｐＨを１０．５に調
整した８５％メタノール溶液でＰＭＰＩを溶出する。

溶出液は、減圧濃縮し、セファデックスＧ−１０（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトを行い、ＰＭＰＩ画分を
凍結乾燥することにより、純粋なＰＭＰＩ又はその塩を
微黄色粉末として得ることができる。

以上述べた方法は、あくまでも一例であり、培地組成、
培養条件、ＰＭＰＩの生産量等に応じ、更に適切な方法
を工夫することができる。

例えば、前述の方法の一部を省略し、反復し、もしくは
順序を変えて行うことは有効であり、又、他の分離方法
、例えば、オクタデシルシリル化したシリカゲルを用い
る逆相分配クロマトグラフィー、多孔性ポリスチレンを
用いる吸着クロマトグラフィーも有効な方法である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例 １ 水１１につき、ペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ１塩化
す） ＩＪウム３ｇを含有する培養基をｐＨ７，０に調
整後、５００ｍ１坂ロフラスコ１０本に夫夫４０ｍ１ず
つ分注し、１２０℃にて１０分間殺菌した。

この培地にストレプトミセス・モズネンシスＡＪ ９４
０６．ＦＥＲＭ−Ｐ ４５８９株の斜面培地より、夫々
１白金耳を接種し、３０℃で２４時間振とう培養（１２
０回／分）を行った。

この前培養液４００７７１１を、水１１につき、グリセ
ロール１０ｇ、ペプトン４０ｇ、リン酸二カリウム１ｇ
、塩化ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）０
．５ｇ、硫酸第１鉄（７水塩） ０．０１９１硫酸銅（
５水塩）１η、硫酸亜鉛（７水塩）１〜、硫酸マンガン
（６水塩）１■を含有し、ｐＨ７，０に調製し、殺菌し
た培地１’ ５７の入った２０１容ステンレス製ジヤー
フアーメンクーに移し、３０°Ｃで、毎分２０１の無菌
空気を送り、３００回転の攪拌で本培養を行った。

２３時間で培養をやめ、培養液（培養液のｐＨは、約８
゜５）を遠心分離によって菌体を除去し、上清１４Ａを
得た。

この培養上清液５０μｌは、緑膿菌金属プロテアーゼ活
性を５０％阻害した。

この上清１１’に７００ｇの活性炭（和光紬薬製・白鷺
）を加え、３０分間攪拌してＰＭＰＩを吸着せしめ、濾
過し、活性炭を更に純水３１で３回洗った後、０．ＩＮ
となるようにアンモニアを含む９０％メタノール１５１
でＰＭＰＩを溶出し、溶出液を４００ ｍｌ！ｊ乞濃縮
した。

この濃縮液に４℃にて、３Ｎ、ＨＣＩを加えて、ｐＨを
２とし、ｎ−ブタノール４００ＴＬｌにて抽出を行った
。

ブタノール層を４℃にて３Ｎ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７
とし、水４００ｍ１を加えてＰＭＰＩを水層に転溶した
。

次に、この水層を、４℃にて、ＩＮ酢酸で十分洗浄した
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（ファルマシア社製
）の４．５ＣＩｒＬＸ２５ｃＩｒＬのカラムに注ぎ、カ
ラムを２．８４のＩＮ酢酸で洗浄した後、ＩＮ酢酸４１
及び０．５Ｍの食塩を含むＩＮ酢酸４１の直線グラジェ
ント溶出を行った。

溶出液は、フラクションコレクターにて分画し、ＰＭＰ
Ｉを含有する画分を集めた。

とのハ什■両分を、予め、濃塩酸、メタノール、水の順
で十分洗浄したクロマト用活性炭（和光紬薬製）の３．
５ＣＩｒＬＸ １５ｃｍのカラムに注いで、ＰＭＰＩを
吸着し、水でカラム溶出液が硝酸銀反応陰性となるまで
十分洗浄し、その後にアンモニア水でｐＨを１０．５に
調製した８５％メタノールにてＰＭＰ Ｉを溶出した。

ＰＭＰＩ画分を３ｍｌ迄濃縮し、予め水で十分洗浄した
セファデックスＧ−１０（ファルマシア社製）の２．５
ＣＩＩＬＸ ４０ｃｍのカラムに注ぎ、水２００ｍ１に
て溶出を行った。

ＰＭＰＩは１３５ｍ附近に溶出され、このＰＭＰＩ画分
を凍結乾燥して、淡黄色粉末６００ηを得た。

この粉末４μｇは、緑膿菌金属プロテアーゼ活性を５０
％阻害した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＭＰＩのアンモニウム塩を臭化カリウムに
混じて測定した赤外線吸収スペクトルを示し、縦軸に透
過率（％）、横軸に波数（Ｃ１７１−’）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属に属する微生物で、炭素源の利
   用性が下記の如くであるストレプトミセス・モズネンシ
   ス。 Ｌ−アラビノース − セルロース − Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガ゛ラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ グリセリン ＋ 場イノシトー
   ル − ラクトース − マルトース ＋ Ｄ−マンニトール − マンノース − ラフィノース − Ｌ−ラムノース − サリシン − スターチ ＋ シュクロース − Ｄ−キシロース − ただし、＋：利用する、−二利用しない。