JPS62155086A - α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法 - Google Patents
α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法Info
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- JPS62155086A JPS62155086A JP29543085A JP29543085A JPS62155086A JP S62155086 A JPS62155086 A JP S62155086A JP 29543085 A JP29543085 A JP 29543085A JP 29543085 A JP29543085 A JP 29543085A JP S62155086 A JPS62155086 A JP S62155086A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はα−Ｌ−フコシダーゼの製造法に関する。さら
に詳しくは細菌を培養して、その培養物よりα−Ｌ−フ
コシダーゼを製造する方法に関する。
に詳しくは細菌を培養して、その培養物よりα−Ｌ−フ
コシダーゼを製造する方法に関する。
α−Ｌ−フフシダーゼはα−Ｌ−フコシドに作用して、
Ｌ−７コースを遊離する酵素で、細菌、カビ、植物、軟
体動物、哺乳類などに広く、分布している。高等動物由
来の複合糖鎖の非還元末端、または枝分れ部分には、α
−Ｌ−フコシル基が頻繁に見いだされ、これらの糖鎖の
構造と機能の解明には、α−も一フフシダーゼの使用が
強力な手段となる。
Ｌ−７コースを遊離する酵素で、細菌、カビ、植物、軟
体動物、哺乳類などに広く、分布している。高等動物由
来の複合糖鎖の非還元末端、または枝分れ部分には、α
−Ｌ−フコシル基が頻繁に見いだされ、これらの糖鎖の
構造と機能の解明には、α−も一フフシダーゼの使用が
強力な手段となる。
従来より、アスペルギルス属（ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー第２４５巻、第２９９頁、１
９７０年）、クロストリディウム属（ジャーナル・オブ
φバイオロジカル・ケミストリー第２４５巻、第１６５
９頁、１９７０年）などの微生物がα−Ｌ−フコシダー
ゼを生産することが知られている。しかしこれらの菌株
の生産するα−Ｌ−フコシダーゼはブタ顎下腺ムチンや
２′−フコシルラクトースなどの複合糖質には作用する
が、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドには全く作
用しない。そのため、α−Ｌ−フコシダーゼを生産する
場合、培養および精製工程における酵素活性測定が非常
に繁雑となる。また、動物起源ではサザエ（アーカイプ
ズ拳オブ書バイオケミストリー・アンド・バイオフイジ
クス第１４５巻、第５０頁、１９７１年）、ボウシュウ
ポラ（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー第７０巻
、第７５頁、１９７１年）にアグリコン特異性の広いα
−り一７コシダーゼが見い出されている。これら巻貝の
酵素はムチン型側タンパク質、糖ペプチド、糖脂質など
の天然基質のみならず、ｐ−ニトロ７ｘニル−α−Ｌ−
フコシドのごとき合成基質にも作用する。しかし、サザ
エ、ポウシュウボラのような動物由来の酵素を工業生産
する場合原料の安定供給の而から不利であり、微生物酵
素の開発が望まれる。
オロジカル・ケミストリー第２４５巻、第２９９頁、１
９７０年）、クロストリディウム属（ジャーナル・オブ
φバイオロジカル・ケミストリー第２４５巻、第１６５
９頁、１９７０年）などの微生物がα−Ｌ−フコシダー
ゼを生産することが知られている。しかしこれらの菌株
の生産するα−Ｌ−フコシダーゼはブタ顎下腺ムチンや
２′−フコシルラクトースなどの複合糖質には作用する
が、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドには全く作
用しない。そのため、α−Ｌ−フコシダーゼを生産する
場合、培養および精製工程における酵素活性測定が非常
に繁雑となる。また、動物起源ではサザエ（アーカイプ
ズ拳オブ書バイオケミストリー・アンド・バイオフイジ
クス第１４５巻、第５０頁、１９７１年）、ボウシュウ
ポラ（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー第７０巻
、第７５頁、１９７１年）にアグリコン特異性の広いα
−り一７コシダーゼが見い出されている。これら巻貝の
酵素はムチン型側タンパク質、糖ペプチド、糖脂質など
の天然基質のみならず、ｐ−ニトロ７ｘニル−α−Ｌ−
フコシドのごとき合成基質にも作用する。しかし、サザ
エ、ポウシュウボラのような動物由来の酵素を工業生産
する場合原料の安定供給の而から不利であり、微生物酵
素の開発が望まれる。
最近、フサリウム属に属する微生物がα−Ｌ−フコシダ
ーゼを生産することが報告された（日本農芸化学会昭和
６０年度大会講演要旨集、第６８５頁）。この酵素は天
然基質のみならず、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコ
シトニモ作用し、従来の微生物起源のα−Ｌ−フコシダ
ーゼとは異なるタイプの酵素である。しかし、酵素の反
応至適ｐＨが酸性側にあることから、細胞に障害を与え
ることなく糖鎖の構造と機能を解明するためには満足な
ものではない。そこで、中性付近に至適ｐＨを有するα
−Ｌ−フコシダーゼを高収率で有利に工業生産するため
には、さらに優れたα−Ｌ−フコシダーゼを生産する微
生物の検索が望まれる。
ーゼを生産することが報告された（日本農芸化学会昭和
６０年度大会講演要旨集、第６８５頁）。この酵素は天
然基質のみならず、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコ
シトニモ作用し、従来の微生物起源のα−Ｌ−フコシダ
ーゼとは異なるタイプの酵素である。しかし、酵素の反
応至適ｐＨが酸性側にあることから、細胞に障害を与え
ることなく糖鎖の構造と機能を解明するためには満足な
ものではない。そこで、中性付近に至適ｐＨを有するα
−Ｌ−フコシダーゼを高収率で有利に工業生産するため
には、さらに優れたα−Ｌ−フコシダーゼを生産する微
生物の検索が望まれる。
従って本発明の目的は、上記現状に鑑みｐ−二トロフェ
ニルーα−Ｌ−７コシドに作用シ、かつ中性付近に至ａ
ｐＨを有するα−Ｌ−フコシダーゼを工業的に安価に製
造する方法を提供することにある。
ニルーα−Ｌ−７コシドに作用シ、かつ中性付近に至ａ
ｐＨを有するα−Ｌ−フコシダーゼを工業的に安価に製
造する方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明はα−Ｌ−フコシダーゼの
製造法に関するものであって、コリネバクテリウム属ま
たはフラボバクテリウム属に属し、α−Ｌ−フコシダー
ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からα−Ｌ−
フコシダーゼを採取することからなる。
製造法に関するものであって、コリネバクテリウム属ま
たはフラボバクテリウム属に属し、α−Ｌ−フコシダー
ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からα−Ｌ−
フコシダーゼを採取することからなる。
本発明で用いられるコリネバクテリウム属またはフラボ
バクテリウム属に属する細菌はα−Ｌ−フコシダーゼを
培養物中に著量生産することが可能で、また後述するご
とく非常に精製が容易であり、かつ優れた性質を有して
いる。
バクテリウム属に属する細菌はα−Ｌ−フコシダーゼを
培養物中に著量生産することが可能で、また後述するご
とく非常に精製が容易であり、かつ優れた性質を有して
いる。
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本発明に使用される菌株としては、コリネバクテ
リウム属またはフラボバクテリウム属に属するα−Ｌ−
フコシダーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株
でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。そして
、コリネバクテリウム属に１しα−Ｌ−フコシダーゼ生
産能を有する菌株の具体例としては、例えば、コリネバ
クテリウム（Ｃ！ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
８ｐａＦＳ−００７７が挙げられる。本閑は、滋賀県内
の土壌中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、
その菌学的性質は次のとおりである。
リウム属またはフラボバクテリウム属に属するα−Ｌ−
フコシダーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株
でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。そして
、コリネバクテリウム属に１しα−Ｌ−フコシダーゼ生
産能を有する菌株の具体例としては、例えば、コリネバ
クテリウム（Ｃ！ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
８ｐａＦＳ−００７７が挙げられる。本閑は、滋賀県内
の土壌中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、
その菌学的性質は次のとおりである。
ａ、形態的性質
顕微視的観察（肉汁寒天培地上で３０℃で培養）
（１）細胞の形および大きさ：
通常細胞の大きさは０３〜０．５ Ｘ ３〜５声ｍ。直
線状あるいは若干彎曲した杆菌であり、片端あるいは両
端がグラブ状に曲がったものもあり、多形成である。
線状あるいは若干彎曲した杆菌であり、片端あるいは両
端がグラブ状に曲がったものもあり、多形成である。
（２）運動性の有無： なし
く３）周鞭毛の有無： なし
く４）ダラム染色性： 陽性
（５）胞子の有無： なし
く６）抗酸性： 陰性
す洛培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培養：
３０℃の培養で、直径２〜４ｒｒｎの凸円形コロニー企
形成する。表面および川縁はなめらかである。コロニー
の色は白黄色不透明で光沢がある。
形成する。表面および川縁はなめらかである。コロニー
の色は白黄色不透明で光沢がある。
（２）肉汁寒天針面培養：
３０℃培養で拡幅によく生育する。
（３）肉汁液体培養：
３０℃静置培養で皮膜の形成はないが、沈殿物の形成が
ある。
ある。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：
２０℃静置培養で表面および穿刺線に沿つて生育し、ゆ
っくりとゼラチンを液化する。
っくりとゼラチンを液化する。
（５）リドマスミルク培養：
３０℃静置培養でミルクのアルカリ化が見られる。
Ｃ１生理学的性質
（１）硝酸塩の還元： 陽性
（２）脱窒反応： 陰性
（３） ＭＲテスト： 陰性
（４） ＶＰテスト： 陰性
（５）インドールの生成： 陰性
（６）硫化水素の生成： 陽性
（′７）デンプンの加水分解二 極少量あるいは分解し
ない （８）クエン酸の利用： 陽性 （９）無機窒素源の利用： 陽性（アンモニウム塩およ
び硝酸塩） （１０）色素の生成： 陰性 （１１）ウレアーゼ： 陰性 （１２）カタラーゼ： ＠性 （１３）オキシダーゼ： 陰性 （１４）最適生育条件： ２２℃〜３７℃、ｐＨ７〜８
．５ （１５）ｌ！Ｆ）素に対する態度： 好気性（１６）Ｏ
Ｆテスト： 陰性 （１７〕ビタミン要求性： 陰性 （１８）炭素源の利用： Ｌ−７コース、Ｄ−アラビ／−ス、Ｌ−ガラクトース、
Ｌ−アラビノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−グルコース
、Ｄ−ガラクトース、マルトース、ラクトース、グリセ
ロール、シュクロース、デキストリンナト（１９）ＤＮ
ＡのＧＣ含量： ５８％（Ｔｍ法による）上記したごと
く、本菌はその性状より、バーシーズ・マニュアル・オ
プ拳デターミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ Ｅａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第８版（１９７４
年）と対比すると、フリネバクテリウム属に属するもの
と認められる。よって、本菌株をコリネバクテリウム（
Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） ｓｐ、 ＦＳ−
００７７と称することとした。なお、本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８５４５号（Ｆ
ＩＲＭ Ｐ −８５４５）として寄託されている。
ない （８）クエン酸の利用： 陽性 （９）無機窒素源の利用： 陽性（アンモニウム塩およ
び硝酸塩） （１０）色素の生成： 陰性 （１１）ウレアーゼ： 陰性 （１２）カタラーゼ： ＠性 （１３）オキシダーゼ： 陰性 （１４）最適生育条件： ２２℃〜３７℃、ｐＨ７〜８
．５ （１５）ｌ！Ｆ）素に対する態度： 好気性（１６）Ｏ
Ｆテスト： 陰性 （１７〕ビタミン要求性： 陰性 （１８）炭素源の利用： Ｌ−７コース、Ｄ−アラビ／−ス、Ｌ−ガラクトース、
Ｌ−アラビノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−グルコース
、Ｄ−ガラクトース、マルトース、ラクトース、グリセ
ロール、シュクロース、デキストリンナト（１９）ＤＮ
ＡのＧＣ含量： ５８％（Ｔｍ法による）上記したごと
く、本菌はその性状より、バーシーズ・マニュアル・オ
プ拳デターミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ Ｅａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第８版（１９７４
年）と対比すると、フリネバクテリウム属に属するもの
と認められる。よって、本菌株をコリネバクテリウム（
Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） ｓｐ、 ＦＳ−
００７７と称することとした。なお、本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８５４５号（Ｆ
ＩＲＭ Ｐ −８５４５）として寄託されている。
また、７ラボバクテリウム属に属し、α−も一７フシダ
ーゼ生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、７
ラボパクテリウム・ファルギニューム（Ｆｌａｖｏｂｏ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｒｕｇｉｎｓｕｍ ）工ＡＭ １
４９３が挙げられる。
ーゼ生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、７
ラボパクテリウム・ファルギニューム（Ｆｌａｖｏｂｏ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｒｕｇｉｎｓｕｍ ）工ＡＭ １
４９３が挙げられる。
本発明において培地に加える栄養源は使用する菌株が利
用し、α−Ｌ−フコシダーゼを生産するものであればよ
く、炭素源としては、例えばグリセロール、グルコース
、シュクロース、マルトース、ラクトース、Ｌ−フコー
スなどが利用でき、窒素源としては酵母エキス、ペプト
ン、コーンステイープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫
安、塩化アンモニウムなどが適当である。その他にリン
糟塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機
質および金属塩類を加えてもよい。なお、本発明のα−
Ｌ−フコシダーゼは誘導酵緊である故、Ｌ−７コースを
培地に添加すれば著しく酵素生産量が増大する。
用し、α−Ｌ−フコシダーゼを生産するものであればよ
く、炭素源としては、例えばグリセロール、グルコース
、シュクロース、マルトース、ラクトース、Ｌ−フコー
スなどが利用でき、窒素源としては酵母エキス、ペプト
ン、コーンステイープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫
安、塩化アンモニウムなどが適当である。その他にリン
糟塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機
質および金属塩類を加えてもよい。なお、本発明のα−
Ｌ−フコシダーゼは誘導酵緊である故、Ｌ−７コースを
培地に添加すれば著しく酵素生産量が増大する。
例えばＬ−７コース０．１％添加により無添加に比べて
約５０倍の本発明によるα−Ｌ−フコシダーゼが生産さ
れる。
約５０倍の本発明によるα−Ｌ−フコシダーゼが生産さ
れる。
α−Ｌ−フコシダーゼ生産菌を培養するにあたり、生産
量は培養条件により大きく変動するが、一般に培′ｉ！
！温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ５〜７．５が良く、
１５〜４８時間の通気撹拌培養で本発明によるα−Ｌ−
フコシダーゼの生産は最高に達する。培養条件は使用す
る菌株、培地組成などに応じ、α−Ｌ−フコシダーゼの
生産量が最大になるように設定するのは当然である０ 本発明の菌によって生産されたα−９Ｌ−フコシダーゼ
は主に菊体内に存在するので、培イＩ−物を固液分離し
、得られた湿菌体から通常用いられる超音波処理、フレ
ンチプレス、ダイナミルなどの種々の破壊手段を用いて
の体を破壊すると、あるいはりゾチームのごとき細胞壁
溶解醇素を用いて菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出液
が得られる。次いでこの抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、疎水
結合カラムクロマト、ゲルー過、凍結乾燥などにより、
精製を行ない、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一な精製α−Ｌ−フコシダーゼを得ることがで
きる。
量は培養条件により大きく変動するが、一般に培′ｉ！
！温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ５〜７．５が良く、
１５〜４８時間の通気撹拌培養で本発明によるα−Ｌ−
フコシダーゼの生産は最高に達する。培養条件は使用す
る菌株、培地組成などに応じ、α−Ｌ−フコシダーゼの
生産量が最大になるように設定するのは当然である０ 本発明の菌によって生産されたα−９Ｌ−フコシダーゼ
は主に菊体内に存在するので、培イＩ−物を固液分離し
、得られた湿菌体から通常用いられる超音波処理、フレ
ンチプレス、ダイナミルなどの種々の破壊手段を用いて
の体を破壊すると、あるいはりゾチームのごとき細胞壁
溶解醇素を用いて菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出液
が得られる。次いでこの抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、疎水
結合カラムクロマト、ゲルー過、凍結乾燥などにより、
精製を行ない、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一な精製α−Ｌ−フコシダーゼを得ることがで
きる。
本発明により得られるα−Ｌ−フコシダーゼの酵素化学
的および理化学的性質は次のとおりである。
的および理化学的性質は次のとおりである。
（１）作用：
ＯＨＯＨ
α−Ｌ−フコシド Ｌ−７コ一ス本
酵素は上記反応式のごとく、α−Ｌ−フコシドに作用し
て、Ｌ−７コースを遊離する。
酵素は上記反応式のごとく、α−Ｌ−フコシドに作用し
て、Ｌ−７コースを遊離する。
（２）基質特異性：
合成ｗ ｒｔでは１ノーニトロフェニル−α−Ｌ−フコ
シドのみに作用し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−フコ
シド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−グルコシドなどに
は全く作用しない。また、天然基質では人乳出来の２１
−７コシルラクトースやブタ顎下腺ムチンなどの複合糖
質に作用する。
シドのみに作用し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−フコ
シド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−グルコシドなどに
は全く作用しない。また、天然基質では人乳出来の２１
−７コシルラクトースやブタ顎下腺ムチンなどの複合糖
質に作用する。
（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：
本酵素の至適ｐ）ｔは第１図の曲線で表わされるごと＜
ｐＨ８，５付近に極めて高い活性を有しいる。本酵素
を２５℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理したと
きのｐＨ安定性を第３図に示した。第３図より明らかな
ように本酵素はｐＨ５，５〜９．５の間で安定である。
ｐＨ８，５付近に極めて高い活性を有しいる。本酵素
を２５℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理したと
きのｐＨ安定性を第３図に示した。第３図より明らかな
ように本酵素はｐＨ５，５〜９．５の間で安定である。
（４）至適温度および熱安定性：
本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされるごとく３
４℃に至適温度を有している。
４℃に至適温度を有している。
本酵素をｐＨ８，０においてそれぞれの温度で６０分間
処理したときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は２
６℃まで安定であったが、５０℃でも約７０％の残存活
性を示した。
処理したときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は２
６℃まで安定であったが、５０℃でも約７０％の残存活
性を示した。
（５）分子量：
本酵素の分子量はセファクリルＳ−２００（ファルマシ
ア製）によるゲｐｖｆｓ過法では約４３０００であった
・。
ア製）によるゲｐｖｆｓ過法では約４３０００であった
・。
（６）等電点：
ファルマライト（ｐＨ３〜１０、ファルマシア製）を用
いた等電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点け３
．８±０．１であった。
いた等電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点け３
．８±０．１であった。
（７）金属イオンの影響：
本酵素は第１表に示すように、Ａｇ＋、ＨＩ！＋および
Ｏｕ なとにより強力に阻害された。
Ｏｕ なとにより強力に阻害された。
第 １ 表
金属塩（１ｍＭ） 相対活性（灼熱添加
１１０ ０Ａ＋Ｏ Ｈｇ・＋ Ｏ Ｃｕ” Ｑ Ｚｎ″ ９Ｏ Ｎｉｔ＋９４ ＋ 血 、ＭｇＮ ＮＩＬまたはＣｕａ １０
０（８）にｍ値： ラインライバー−パーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂ
ｕｒｋ ） ７’ロツトにより本酵素のｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｌ−７フシドに対するにｍ値を求めたところ
、４．５Ｘ１０−’Ｍであった。
１１０ ０Ａ＋Ｏ Ｈｇ・＋ Ｏ Ｃｕ” Ｑ Ｚｎ″ ９Ｏ Ｎｉｔ＋９４ ＋ 血 、ＭｇＮ ＮＩＬまたはＣｕａ １０
０（８）にｍ値： ラインライバー−パーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂ
ｕｒｋ ） ７’ロツトにより本酵素のｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｌ−７フシドに対するにｍ値を求めたところ
、４．５Ｘ１０−’Ｍであった。
（９）酵素活性測定法：
α−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定は次のようにして求め
た。即ちＩＱｍＭｐ−二）ロフ工二ルーα−Ｌ−フコシ
ド０．１”ｓｌｏＯｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）
１．３ ｍｌおよび適当に希釈した酵素液０．１ ｍｅ
、反応液量１．５ ｍｅで３５℃、１０分間反応させ
た後、０．２５ Ｍ Ｎ＆ｚＣＯ３１，５ｒｒｄ！を
添加して反応を停止させ、４０５ ｎｍの吸光度を測定
する（０・Ｄ−９ｙグル ）０別に対照として酵素溶液
の代りに蒸留水０．１ ｄ加え、同様の操作によって吸
光度を測定しく ０．Ｄ、プッ、り）△ Ｏ，Ｄ、ａｏ
ｓＣ０−Ｄ−ｔｙｙｈ Ｏ，Ｄ−プラｙｐ ）
を求？ｂた。
た。即ちＩＱｍＭｐ−二）ロフ工二ルーα−Ｌ−フコシ
ド０．１”ｓｌｏＯｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）
１．３ ｍｌおよび適当に希釈した酵素液０．１ ｍｅ
、反応液量１．５ ｍｅで３５℃、１０分間反応させ
た後、０．２５ Ｍ Ｎ＆ｚＣＯ３１，５ｒｒｄ！を
添加して反応を停止させ、４０５ ｎｍの吸光度を測定
する（０・Ｄ−９ｙグル ）０別に対照として酵素溶液
の代りに蒸留水０．１ ｄ加え、同様の操作によって吸
光度を測定しく ０．Ｄ、プッ、り）△ Ｏ，Ｄ、ａｏ
ｓＣ０−Ｄ−ｔｙｙｈ Ｏ，Ｄ−プラｙｐ ）
を求？ｂた。
α−Ｌ−フコシダーゼ活性は下記の計算式によって求め
られる。
られる。
−へへ一一〜へ〜 。
ｄ：光路長（Ｃ１）
ｄｆ：希釈率
〔実施例〕
以下に本発明によるα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法を
実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例の範囲の
みに限定されるものではない。なお、％は他に特記せぬ
限りｗ／ｖ％である。
実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例の範囲の
みに限定されるものではない。なお、％は他に特記せぬ
限りｗ／ｖ％である。
実施例 １
コリネバクテリウム８ｐ、 ＦＳ −００７７（微工研
菌寄第８５４５号）を、酵母エキス０．５％、ペプトン
１６０％、ＫＨｚＰＯａ ０．３％およびＭｇ５Ｏ４
Ｃ７ＨｚＯ０，１％、ｐＨ７，Ｏからなる培地１０〇−
を分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００ｍｅ
の三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間培養して種
培養液とした。Ｌ−７コース０．１％、ペプトン０．５
％、ＫＨｚＰＯａ ｏ、 ３％、Ｍｇ５０４１１７
ＨｚＯ０，１％および消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４
２）０．０１ｖ／ｖ％、ｐＨ７，０からなる培地１５ｔ
を３０１容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で
２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液１００ｒｎ
ｌを接種し、３０℃で４０時間、毎分１５ｔの通気量と
毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体を集め、５０ ｍＭ ’
）ン酸緩衝液（ｐＨ８，０）５００−に懸濁した後、超
音波処理で菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して
上澄液５５０−を得た。この上澄液のα−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性は２６．５単位／−であった。この上澄液をあ
らかじめ５０ｍＭ！Ｊン醗緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝
化したＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）のカラム（直径５０１×長さ１０ ａｎ ）に
吸着させ、吸着物を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）！８
．０）で洗浄後、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）で溶出して活性画分を集めた。次にこの活性画分を限
外沖過で濃縮、脱塩後、５ＯｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース（！Ｌ−５
Ｂのカラム（直径２．５ ＣＩ Ｘ長さ１０ ｃｍ ）
に再び吸着させ、上記と同様な方法で溶出して得た活性
画分に塩化ナトリウムを添加し４Ｍ濃度とした。これを
あらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩
衝液（１）Ｈ８，Ｏ）で緩衝化したフェニルセファロー
ス（！Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社りのカラム（直径２．
５ ｃｍ Ｘ長さ２０ｃｍ）に吸着させ、吸着物を４Ｍ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で洗浄後、３λべ塩化す） ＩＪウム含有ｌＱｍＭ
リン酸緩衝液（１）Ｈ８，０）で溶出し、活性画分を集
めた。この活性画分をコロジオン膜で濃縮後、あらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化した
セファロース０Ｌ−６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム
（Ｕ径２．５Ｇ×長さ９０ Ｃｌ ）でゲル洲過を行な
い、得た活性画分に安定化剤としてＥＤＴＡを最終濃度
１ ｍＭになるように加えて凍結乾燥し、精製酵素粉末
７８０岬を得た。この粉末の比活性は９．５９単位／岬
であった。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディ
スク電気泳動的に単一であった０以上の精製工程を第２
表に示す。
菌寄第８５４５号）を、酵母エキス０．５％、ペプトン
１６０％、ＫＨｚＰＯａ ０．３％およびＭｇ５Ｏ４
Ｃ７ＨｚＯ０，１％、ｐＨ７，Ｏからなる培地１０〇−
を分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００ｍｅ
の三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間培養して種
培養液とした。Ｌ−７コース０．１％、ペプトン０．５
％、ＫＨｚＰＯａ ｏ、 ３％、Ｍｇ５０４１１７
ＨｚＯ０，１％および消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４４
２）０．０１ｖ／ｖ％、ｐＨ７，０からなる培地１５ｔ
を３０１容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で
２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液１００ｒｎ
ｌを接種し、３０℃で４０時間、毎分１５ｔの通気量と
毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体を集め、５０ ｍＭ ’
）ン酸緩衝液（ｐＨ８，０）５００−に懸濁した後、超
音波処理で菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して
上澄液５５０−を得た。この上澄液のα−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性は２６．５単位／−であった。この上澄液をあ
らかじめ５０ｍＭ！Ｊン醗緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝
化したＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）のカラム（直径５０１×長さ１０ ａｎ ）に
吸着させ、吸着物を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）！８
．０）で洗浄後、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）で溶出して活性画分を集めた。次にこの活性画分を限
外沖過で濃縮、脱塩後、５ＯｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース（！Ｌ−５
Ｂのカラム（直径２．５ ＣＩ Ｘ長さ１０ ｃｍ ）
に再び吸着させ、上記と同様な方法で溶出して得た活性
画分に塩化ナトリウムを添加し４Ｍ濃度とした。これを
あらかじめ４Ｍ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸緩
衝液（１）Ｈ８，Ｏ）で緩衝化したフェニルセファロー
ス（！Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社りのカラム（直径２．
５ ｃｍ Ｘ長さ２０ｃｍ）に吸着させ、吸着物を４Ｍ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で洗浄後、３λべ塩化す） ＩＪウム含有ｌＱｍＭ
リン酸緩衝液（１）Ｈ８，０）で溶出し、活性画分を集
めた。この活性画分をコロジオン膜で濃縮後、あらかじ
め１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化した
セファロース０Ｌ−６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム
（Ｕ径２．５Ｇ×長さ９０ Ｃｌ ）でゲル洲過を行な
い、得た活性画分に安定化剤としてＥＤＴＡを最終濃度
１ ｍＭになるように加えて凍結乾燥し、精製酵素粉末
７８０岬を得た。この粉末の比活性は９．５９単位／岬
であった。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディ
スク電気泳動的に単一であった０以上の精製工程を第２
表に示す。
実施例 ２
フラボバクテリウム・ファルギニュームエＡＭ１４９３
をＬ−７コース ０．１％、酵母エキス１．０％、ペプ
トン１．０％、ＫＨ！ＰＯ４０，３％およびＺｎ０１ｇ
４０ ｐｐｍ ％ ｐＨ７，０からなる培地１００
ｍｅを分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００
ｄの三角フラスコに接種して、３０℃で４８時間培養し
た。この培養物中のα−Ｌ−フコシダーゼ活性は０．１
単位／−であった。
をＬ−７コース ０．１％、酵母エキス１．０％、ペプ
トン１．０％、ＫＨ！ＰＯ４０，３％およびＺｎ０１ｇ
４０ ｐｐｍ ％ ｐＨ７，０からなる培地１００
ｍｅを分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５００
ｄの三角フラスコに接種して、３０℃で４８時間培養し
た。この培養物中のα−Ｌ−フコシダーゼ活性は０．１
単位／−であった。
本発明により、複合糖鎖の構造と機能の解明に有用なα
−Ｌ−フコシダーゼの新たな工業的生産に適した製造法
が提供された。
−Ｌ−フコシダーゼの新たな工業的生産に適した製造法
が提供された。
第１図は本発明により得られるα−Ｌ−フコシダーゼの
ｐＨと活性の関係ご表わすグラフであり、第２図は温度
と活性の関係を表わすグラフであり、第３図はα−Ｌ−
フコシダーゼを２５℃において、それぞれのｐＨで６０
分間処理した後のｐＨと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図はｐｌｔ８．０においてそれぞれの温度で６
０分間処理した後の温度と活性の関係を表わすグラフで
ある。
ｐＨと活性の関係ご表わすグラフであり、第２図は温度
と活性の関係を表わすグラフであり、第３図はα−Ｌ−
フコシダーゼを２５℃において、それぞれのｐＨで６０
分間処理した後のｐＨと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図はｐｌｔ８．０においてそれぞれの温度で６
０分間処理した後の温度と活性の関係を表わすグラフで
ある。
Claims (1)
- １、コリネバクテリウム属またはフラボバクテリウム属
に属するα−Ｌ−フコシダーゼ生産菌を培養し、培養物
よりα−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴とする
α−Ｌ−フコシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29543085A JPS62155086A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29543085A JPS62155086A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62155086A true JPS62155086A (ja) | 1987-07-10 |
| JPH0561911B2 JPH0561911B2 (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=17820499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29543085A Granted JPS62155086A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | α−Ｌ−フコシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62155086A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0919237A4 (en) * | 1996-01-26 | 2004-10-13 | Takara Bio Inc | APOPTOSIS INDUCERS |
-
1985
- 1985-12-26 JP JP29543085A patent/JPS62155086A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0919237A4 (en) * | 1996-01-26 | 2004-10-13 | Takara Bio Inc | APOPTOSIS INDUCERS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0561911B2 (ja) | 1993-09-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |