JPH026512B2 - - Google Patents
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- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はL−フコース・デヒドロゲナーゼの製
造法に関する。さらに詳しくは細菌を培養して、
その培養物よりL−フコース・デヒドロゲナーゼ
を製造する方法に関する。 〔従来の技術〕 L−フコース・デヒドロゲナーゼはL−フコー
スを酸化してL−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る酵素で、微生物および動物組織にその存在が報
告されている。高等動物由来の複合糖鎖の非還元
末端、または枝分れ部分には、α−L−フコシル
基が頻繁に見いだされており、これらの糖鎖の構
造と機能の解明のためには、その糖鎖からL−フ
コース残基を遊離させた後、L−フコース含量を
定量することが非常に重要である。この遊離L−
フコースの定量法としては、試料中の遊離L−フ
コース画分をゲル過またはイオン交換法によつ
て精製し、ガスクロマトグラフイーで定量する方
法(メソツズ・イン・エンジモロジー第28巻、第
738頁、1972年)、過ヨウ素酸酸化によつて生ずる
アセトアルデヒドを定量する方法(ジヤーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー第245巻、
第1659頁、1970年)などがあるが操作が非常に繁
雑でありまた精度にも問題がある。これらの化学
法に比べてL−フコース・デヒドロゲナーゼを用
いる酵素法では試料中の遊離L−フコースを精製
する必要もなく、敏速かつ正確に定量することが
出きる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このL−フコース・デヒドロゲナーゼは微生物
では既にプルラリア・プルランが生産することが
報告されている(IRCS Med.Sci.Libr.Compend.
第1巻、第73頁、1973年)。しかし、該酵素の反
応至適PHは10.2とかなりアルカリ側にあることか
ら、中性付近に至適PHを有するL−フコース・デ
ヒドロゲナーゼを生産する微生物の検索が望まれ
ている。また、動物組織ではブタ肝臓(ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第244
巻、第4785頁、1969年)やウサギ肝臓(ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー第86巻、第1559
頁、1979年)などにその存在が報告されている
が、該酵素もPH10付近に至適PHを有しており、ま
た、動物由来の酵素を工業生産する場合、原料の
安定供給の面から微生物酵素に比べて不利とな
る。 本発明の目的は、上記現状に鑑み中性付近に反
応至適PHを有するL−フコース・デヒドロゲナー
ゼを工業的に安価に製造する方法を提供すること
にある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はL−フコース・
デヒドロゲナーゼの製造法に関するものであつ
て、コリネバクテリウム属に属し、L−フコー
ス・デヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培
養し、培養物からL−フコース・デヒドロゲナー
ゼを採取することからなる。 本発明で用いられるコリネバクテリウム属に属
する細菌はL−フコース・デヒドロゲナーゼを培
養物中に著量生産することが可能で、また後述す
るごとく非常に精製が容易であり、かつ優れた性
質を有している。 まず、本発明に使用される菌株としては、コリ
ネバクテリウム属に属するL−フコース・デヒド
ロゲナーゼ生産能を有する菌株であればいかなる
菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよ
い。そして、コリネバクテリウム属に属しL−フ
コース・デヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株の
具体例としては、例えばコリネバクテリウム
(Corynebacterium)sp.FS−0077が挙げられる。
本菌は、滋賀県内の土壌中より本発明者らが新た
り検索して得た菌株で、その菌学的性質は次のと
おりである。 a 形態的性質 顕微鏡的観察(肉汁寒天培地上で30℃で培
養) (1) 細胞の形および大きさ: 通常細胞の大きさは0.3〜0.5×3〜5μm、
直線状あるいは若干彎曲した桿菌であり、片
端あるいは両端がクラブ状に曲がつたものも
あり、多形成である。 (2) 運動性の有無:なし (3) 周鞭毛の有無:なし (4) グラム染色性:陽性 (5) 胞子の有無:なし (6) 抗酸性:陰性 b 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養: 30℃の培養で、直径2〜4mmの凸円形コロ
ニーを形成する。表面および周縁はなめらか
である。コロニーの色は白黄色不透明で光沢
がある。 (2) 肉汁寒天斜面培養: 30℃培養で拡幅によく生育する。 (3) 肉汁液体培養: 30℃静置培養で皮膜の形成はないが、沈殿
物の形成がある。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養: 20℃静置培養で表面および穿刺線に沿つて
生育し、ゆつくりとゼラチンを液化する。 (5) リトマスミルク培養: 30℃静置培養でミルクのアルカリ化が見ら
れる。 c 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元:陽性 (2) 脱窒反応:陰性 (3) MRテスト:陰性 (4) VPテスト:陰性 (5) インドールの生成:陰性 (6) 硫化水素の生成:陽性 (7) デンプンの加水分解: 極少量あるいは分解しない。 (8) クエン酸の利用:陽性 (9) 無機窒素源の利用:陽性(アンモニウム塩
および硝酸塩) (10) 色素の生成:陰性 (11) ウレアーゼ:陰性 (12) カタラーゼ:陽性 (13) オキシダーゼ:陰性 (14) 最適生育条件:22℃〜37℃、PH7〜8.5 (15) 酸素に対する態度:好気性 (16) OFテスト:陰性 (17) ビタミン要求性:陰性 (18) 炭素源の利用: L−フコース、D−アラビノース、L−ガ
ラクトース、L−アラビノース、D−フラク
トース、D−グルコース、D−ガラクトー
ス、マルトース、ラクトース、グリセロー
ル、シユクロース、デキストリン (19) DNAのGC含量:58%(Tm法による) 上記したごとく、本菌はその性状より、バージ
ーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオロジー(Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology)第8版(1974年)
と対比すると、コリネバクテリウム属に属するも
のと認められる。よつて、本菌株をコリネバクテ
リウムsp.FS−0077と称することとした。なお、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1234号(旧受託番号:微工研菌寄第8545
号)として寄託されている。 本発明において培地に加える栄養源は、使用す
る菌株が利用し、L−フコース・デヒドロゲナー
ゼを生産するものであればよく、炭素源として
は、例えばL−フコース、グリセロール、グルコ
ース、シユクロース、マルトース、ラクトースな
どが利用でき、窒素源としてはペプトン、酵母エ
キス、コーンステイープリカー、肉エキス、脱脂
大豆、硫安、塩化アンモニウムなどが適当であ
る。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩などの無機質および金属塩類を加えてもよ
い。なお、本発明のL−フコース・デヒドロゲナ
ーゼは誘導酵素である故、L−フコースを培地に
添加すれば著しく酵素生産量が増大する。例えば
L−フコース0.1%添加により無添加に比べて約
100倍のL−フコース・デヒドロゲナーゼが生産
される。 L−フコース・デヒドロゲナーゼ生産菌を培養
するにあたり、生産量は培養条件により大きく変
動するが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH
5〜7が良く、10〜48時間の通気撹拌培養で本発
明によるL−フコース・デヒドロゲナーゼの生産
は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地
組成などに応じ、L−フコース・デヒドロゲナー
ゼの生産量が最大になるように設定するのが当然
である。 本発明の菌によつて生産されたL−フコース・
デヒドロゲナーゼは菌体内に存在するので、培養
物を固液分離し、得られた湿菌体から通常用いら
れる超音波処理、フレンチプレス、ダイナミルな
どの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊、あるい
はリゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体
細胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られる。次
に、この抽出液から通常用いられる精製手段によ
り精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、除核酸、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、吸着剤によるカラムクロマ
ト、ゲル過、凍結乾燥などにより、精製を行な
い、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動的
に単一な精製L−フコース・デヒドロゲナーゼを
得ることができる。 本発明により得られるL−フコース・デヒドロ
ゲナーゼの酵素化学的および理化学的性質は次の
とおりである。 (1) 作用: 本酵素は下記反応式のごとく、L−フコース
を酸化してL−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る。 L−フコース+NAD+→L−フコノ−δ −ラクトン+NADH+H+ (2) 基質特異性: 本酵素はL−フコースに最も特異性が高い
が、L−ガラクトース、D−アラビノースなど
にも作用する(第1表)。
造法に関する。さらに詳しくは細菌を培養して、
その培養物よりL−フコース・デヒドロゲナーゼ
を製造する方法に関する。 〔従来の技術〕 L−フコース・デヒドロゲナーゼはL−フコー
スを酸化してL−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る酵素で、微生物および動物組織にその存在が報
告されている。高等動物由来の複合糖鎖の非還元
末端、または枝分れ部分には、α−L−フコシル
基が頻繁に見いだされており、これらの糖鎖の構
造と機能の解明のためには、その糖鎖からL−フ
コース残基を遊離させた後、L−フコース含量を
定量することが非常に重要である。この遊離L−
フコースの定量法としては、試料中の遊離L−フ
コース画分をゲル過またはイオン交換法によつ
て精製し、ガスクロマトグラフイーで定量する方
法(メソツズ・イン・エンジモロジー第28巻、第
738頁、1972年)、過ヨウ素酸酸化によつて生ずる
アセトアルデヒドを定量する方法(ジヤーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー第245巻、
第1659頁、1970年)などがあるが操作が非常に繁
雑でありまた精度にも問題がある。これらの化学
法に比べてL−フコース・デヒドロゲナーゼを用
いる酵素法では試料中の遊離L−フコースを精製
する必要もなく、敏速かつ正確に定量することが
出きる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このL−フコース・デヒドロゲナーゼは微生物
では既にプルラリア・プルランが生産することが
報告されている(IRCS Med.Sci.Libr.Compend.
第1巻、第73頁、1973年)。しかし、該酵素の反
応至適PHは10.2とかなりアルカリ側にあることか
ら、中性付近に至適PHを有するL−フコース・デ
ヒドロゲナーゼを生産する微生物の検索が望まれ
ている。また、動物組織ではブタ肝臓(ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第244
巻、第4785頁、1969年)やウサギ肝臓(ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー第86巻、第1559
頁、1979年)などにその存在が報告されている
が、該酵素もPH10付近に至適PHを有しており、ま
た、動物由来の酵素を工業生産する場合、原料の
安定供給の面から微生物酵素に比べて不利とな
る。 本発明の目的は、上記現状に鑑み中性付近に反
応至適PHを有するL−フコース・デヒドロゲナー
ゼを工業的に安価に製造する方法を提供すること
にある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はL−フコース・
デヒドロゲナーゼの製造法に関するものであつ
て、コリネバクテリウム属に属し、L−フコー
ス・デヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培
養し、培養物からL−フコース・デヒドロゲナー
ゼを採取することからなる。 本発明で用いられるコリネバクテリウム属に属
する細菌はL−フコース・デヒドロゲナーゼを培
養物中に著量生産することが可能で、また後述す
るごとく非常に精製が容易であり、かつ優れた性
質を有している。 まず、本発明に使用される菌株としては、コリ
ネバクテリウム属に属するL−フコース・デヒド
ロゲナーゼ生産能を有する菌株であればいかなる
菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよ
い。そして、コリネバクテリウム属に属しL−フ
コース・デヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株の
具体例としては、例えばコリネバクテリウム
(Corynebacterium)sp.FS−0077が挙げられる。
本菌は、滋賀県内の土壌中より本発明者らが新た
り検索して得た菌株で、その菌学的性質は次のと
おりである。 a 形態的性質 顕微鏡的観察(肉汁寒天培地上で30℃で培
養) (1) 細胞の形および大きさ: 通常細胞の大きさは0.3〜0.5×3〜5μm、
直線状あるいは若干彎曲した桿菌であり、片
端あるいは両端がクラブ状に曲がつたものも
あり、多形成である。 (2) 運動性の有無:なし (3) 周鞭毛の有無:なし (4) グラム染色性:陽性 (5) 胞子の有無:なし (6) 抗酸性:陰性 b 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養: 30℃の培養で、直径2〜4mmの凸円形コロ
ニーを形成する。表面および周縁はなめらか
である。コロニーの色は白黄色不透明で光沢
がある。 (2) 肉汁寒天斜面培養: 30℃培養で拡幅によく生育する。 (3) 肉汁液体培養: 30℃静置培養で皮膜の形成はないが、沈殿
物の形成がある。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養: 20℃静置培養で表面および穿刺線に沿つて
生育し、ゆつくりとゼラチンを液化する。 (5) リトマスミルク培養: 30℃静置培養でミルクのアルカリ化が見ら
れる。 c 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元:陽性 (2) 脱窒反応:陰性 (3) MRテスト:陰性 (4) VPテスト:陰性 (5) インドールの生成:陰性 (6) 硫化水素の生成:陽性 (7) デンプンの加水分解: 極少量あるいは分解しない。 (8) クエン酸の利用:陽性 (9) 無機窒素源の利用:陽性(アンモニウム塩
および硝酸塩) (10) 色素の生成:陰性 (11) ウレアーゼ:陰性 (12) カタラーゼ:陽性 (13) オキシダーゼ:陰性 (14) 最適生育条件:22℃〜37℃、PH7〜8.5 (15) 酸素に対する態度:好気性 (16) OFテスト:陰性 (17) ビタミン要求性:陰性 (18) 炭素源の利用: L−フコース、D−アラビノース、L−ガ
ラクトース、L−アラビノース、D−フラク
トース、D−グルコース、D−ガラクトー
ス、マルトース、ラクトース、グリセロー
ル、シユクロース、デキストリン (19) DNAのGC含量:58%(Tm法による) 上記したごとく、本菌はその性状より、バージ
ーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオロジー(Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology)第8版(1974年)
と対比すると、コリネバクテリウム属に属するも
のと認められる。よつて、本菌株をコリネバクテ
リウムsp.FS−0077と称することとした。なお、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1234号(旧受託番号:微工研菌寄第8545
号)として寄託されている。 本発明において培地に加える栄養源は、使用す
る菌株が利用し、L−フコース・デヒドロゲナー
ゼを生産するものであればよく、炭素源として
は、例えばL−フコース、グリセロール、グルコ
ース、シユクロース、マルトース、ラクトースな
どが利用でき、窒素源としてはペプトン、酵母エ
キス、コーンステイープリカー、肉エキス、脱脂
大豆、硫安、塩化アンモニウムなどが適当であ
る。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩などの無機質および金属塩類を加えてもよ
い。なお、本発明のL−フコース・デヒドロゲナ
ーゼは誘導酵素である故、L−フコースを培地に
添加すれば著しく酵素生産量が増大する。例えば
L−フコース0.1%添加により無添加に比べて約
100倍のL−フコース・デヒドロゲナーゼが生産
される。 L−フコース・デヒドロゲナーゼ生産菌を培養
するにあたり、生産量は培養条件により大きく変
動するが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH
5〜7が良く、10〜48時間の通気撹拌培養で本発
明によるL−フコース・デヒドロゲナーゼの生産
は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地
組成などに応じ、L−フコース・デヒドロゲナー
ゼの生産量が最大になるように設定するのが当然
である。 本発明の菌によつて生産されたL−フコース・
デヒドロゲナーゼは菌体内に存在するので、培養
物を固液分離し、得られた湿菌体から通常用いら
れる超音波処理、フレンチプレス、ダイナミルな
どの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊、あるい
はリゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体
細胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られる。次
に、この抽出液から通常用いられる精製手段によ
り精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、除核酸、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、吸着剤によるカラムクロマ
ト、ゲル過、凍結乾燥などにより、精製を行な
い、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動的
に単一な精製L−フコース・デヒドロゲナーゼを
得ることができる。 本発明により得られるL−フコース・デヒドロ
ゲナーゼの酵素化学的および理化学的性質は次の
とおりである。 (1) 作用: 本酵素は下記反応式のごとく、L−フコース
を酸化してL−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る。 L−フコース+NAD+→L−フコノ−δ −ラクトン+NADH+H+ (2) 基質特異性: 本酵素はL−フコースに最も特異性が高い
が、L−ガラクトース、D−アラビノースなど
にも作用する(第1表)。
以下に本発明によるL−フコース・デヒドロゲ
ナーゼの製造方法を実施例をもつて示すが、本発
明が以下の実施例の範囲のみに限定されるもので
はない。なお、%は他に特記せぬ限りW/V%で
ある。 実施例 1 L−フコース0.1%、ペプトン0.5%、
KH2PO40.3%およびMgSO4・7H2O0.1%、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌(120℃、20分
間)した500mlの三角フラスコにコリネバクテリ
ウムsp.FS−0077(微工研条寄第1234号)を接種
し30℃で48時間培養した。この培養物中のL−フ
コース・デヒドロゲナーゼ活性は1.02単位/mlで
あつた。 実施例 2 コリネバクテリウムsp.FS−0077(微工研条寄
第1234号)を酵母エキス0.5%、ペプトン1.0%、
KH2PO40.3%およびMgSO4・7H2O0.1%、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌(120℃、20分
間)した500mlの三角フラスコに接種し、30℃で
24時間培養して種培養液とした。L−フコース
0.1%、ペプトン0.5%、KH2PO40.3%、MgSO4・
7H2O0.1%および消泡剤(日本油脂社製CB−
442)0.01v/v%、PH7.0からなる培地15を30
容のジヤーフアーメンターに入れ、120℃で20
分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液100mlを
接種し、30℃で36時間、毎分15の通気量と毎分
300回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌株を集め、50mMリ
ン酸緩衝液(PH8.0;以下の全操作はPH8で行な
つた)500mlに懸濁した後、超音波処理で菌体を
破砕した菌体破砕液を遠心分離して上澄液540ml
を得た。この上澄液のL−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ活性は37.8単位/mlであつた。この上澄液
をあらかじめ50mMリン酸緩衝液で緩衝化した
DEAE−セフアロースCL−6B(フアルマシア社
製)のカラム(直径5.0cm×長さ10cm)に吸着さ
せ、吸着物を100mMリン酸緩衝液で洗浄後、
300mMリン酸緩衝液で溶出して活性画分を集め
た。次にこの活性画分に、塩化ナトリウムを添加
し4M濃度とした。これをあらかじめ4M塩化ナト
リウム含有100mMリン酸緩衝液で緩衝化したフ
エニルセフアロースCL−4B(フアルマシア社製)
のカラム(直径2.5cm×長さ20cm)に吸着させ、
吸着物を3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩
衝液で洗浄後、1M塩化ナトリウム含有20mMリ
ン酸緩衝液で溶出し、活性画分を集めた。この活
性画分を再びフエニルセフアロースCL−4Bのカ
ラム(直径2.5cm×長さ10cm)に吸着させ、2M塩
化ナトリウム含有5mMリン酸緩衝液で溶出した
後、コロジオン膜で濃縮した。この濃縮液をあら
かじめ100mMリン酸緩衝液で緩衝化したセフア
ロースCL−6Bのカラム(直径2.5cm×長さ90cm)
でゲル過を行ない、得られた活性画分を再び濃
縮後、セフアクリルS−200のカラム(フアルマ
シア社製)(直径2.5cm×長さ100cm)でゲル過
をくり返したのち、安定化剤としてEDTAを最
終濃度1mMになるように加えて、凍結乾燥し、
精製酵素粉末820mgを得た。この粉末の比活性は
8.41単位/mgであつた。この酵素粉末はポリアク
リルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一であつ
た。以上の精製工程を第3表に示す。
ナーゼの製造方法を実施例をもつて示すが、本発
明が以下の実施例の範囲のみに限定されるもので
はない。なお、%は他に特記せぬ限りW/V%で
ある。 実施例 1 L−フコース0.1%、ペプトン0.5%、
KH2PO40.3%およびMgSO4・7H2O0.1%、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌(120℃、20分
間)した500mlの三角フラスコにコリネバクテリ
ウムsp.FS−0077(微工研条寄第1234号)を接種
し30℃で48時間培養した。この培養物中のL−フ
コース・デヒドロゲナーゼ活性は1.02単位/mlで
あつた。 実施例 2 コリネバクテリウムsp.FS−0077(微工研条寄
第1234号)を酵母エキス0.5%、ペプトン1.0%、
KH2PO40.3%およびMgSO4・7H2O0.1%、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌(120℃、20分
間)した500mlの三角フラスコに接種し、30℃で
24時間培養して種培養液とした。L−フコース
0.1%、ペプトン0.5%、KH2PO40.3%、MgSO4・
7H2O0.1%および消泡剤(日本油脂社製CB−
442)0.01v/v%、PH7.0からなる培地15を30
容のジヤーフアーメンターに入れ、120℃で20
分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液100mlを
接種し、30℃で36時間、毎分15の通気量と毎分
300回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌株を集め、50mMリ
ン酸緩衝液(PH8.0;以下の全操作はPH8で行な
つた)500mlに懸濁した後、超音波処理で菌体を
破砕した菌体破砕液を遠心分離して上澄液540ml
を得た。この上澄液のL−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ活性は37.8単位/mlであつた。この上澄液
をあらかじめ50mMリン酸緩衝液で緩衝化した
DEAE−セフアロースCL−6B(フアルマシア社
製)のカラム(直径5.0cm×長さ10cm)に吸着さ
せ、吸着物を100mMリン酸緩衝液で洗浄後、
300mMリン酸緩衝液で溶出して活性画分を集め
た。次にこの活性画分に、塩化ナトリウムを添加
し4M濃度とした。これをあらかじめ4M塩化ナト
リウム含有100mMリン酸緩衝液で緩衝化したフ
エニルセフアロースCL−4B(フアルマシア社製)
のカラム(直径2.5cm×長さ20cm)に吸着させ、
吸着物を3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩
衝液で洗浄後、1M塩化ナトリウム含有20mMリ
ン酸緩衝液で溶出し、活性画分を集めた。この活
性画分を再びフエニルセフアロースCL−4Bのカ
ラム(直径2.5cm×長さ10cm)に吸着させ、2M塩
化ナトリウム含有5mMリン酸緩衝液で溶出した
後、コロジオン膜で濃縮した。この濃縮液をあら
かじめ100mMリン酸緩衝液で緩衝化したセフア
ロースCL−6Bのカラム(直径2.5cm×長さ90cm)
でゲル過を行ない、得られた活性画分を再び濃
縮後、セフアクリルS−200のカラム(フアルマ
シア社製)(直径2.5cm×長さ100cm)でゲル過
をくり返したのち、安定化剤としてEDTAを最
終濃度1mMになるように加えて、凍結乾燥し、
精製酵素粉末820mgを得た。この粉末の比活性は
8.41単位/mgであつた。この酵素粉末はポリアク
リルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一であつ
た。以上の精製工程を第3表に示す。
本発明により、複合糖鎖の構造と機能の解明に
有用なL−フコース・デヒドロゲナーゼの新たな
工業的生産に適した製造法が提供された。
有用なL−フコース・デヒドロゲナーゼの新たな
工業的生産に適した製造法が提供された。
第1図は本発明により得られるL−フコース・
デヒドロゲナーゼのPHと活性の関係を表わすグラ
フであり、第2図は温度と活性の関係を表わすグ
ラフであり、第3図はL−フコース・デヒドロゲ
ナーゼを30℃において、それぞれのPHで60分間処
理した後のPHと活性の関係を表わすグラフであ
り、第4図はPH8.0においてそれぞれの温度で10
分間処理した後の温度と活性の関係を表わすグラ
フである。
デヒドロゲナーゼのPHと活性の関係を表わすグラ
フであり、第2図は温度と活性の関係を表わすグ
ラフであり、第3図はL−フコース・デヒドロゲ
ナーゼを30℃において、それぞれのPHで60分間処
理した後のPHと活性の関係を表わすグラフであ
り、第4図はPH8.0においてそれぞれの温度で10
分間処理した後の温度と活性の関係を表わすグラ
フである。
Claims (1)
- 1 コリネバクテリウム属に属するL−フコー
ス・デヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物よ
りL−フコース・デヒドロゲナーゼを採取するこ
とを特徴とするL−フコース・デヒドロゲナーゼ
の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29543185A JPS62155085A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | L−フコ−ス・デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29543185A JPS62155085A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | L−フコ−ス・デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62155085A JPS62155085A (ja) | 1987-07-10 |
JPH026512B2 true JPH026512B2 (ja) | 1990-02-09 |
Family
ID=17820513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29543185A Granted JPS62155085A (ja) | 1985-12-26 | 1985-12-26 | L−フコ−ス・デヒドロゲナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62155085A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6368835B1 (en) * | 1998-05-29 | 2002-04-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing a lactone using corynebacterium sp. NK-1 (FERM BP-6329) |
-
1985
- 1985-12-26 JP JP29543185A patent/JPS62155085A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS62155085A (ja) | 1987-07-10 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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