JPH026512B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フコース・デヒドロゲナーゼの製
造法に関する。さらに詳しくは細菌を培養して、
その培養物よりＬ−フコース・デヒドロゲナーゼ
を製造する方法に関する。 〔従来の技術〕 Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼはＬ−フコー
スを酸化してＬ−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る酵素で、微生物および動物組織にその存在が報
告されている。高等動物由来の複合糖鎖の非還元
末端、または枝分れ部分には、α−Ｌ−フコシル
基が頻繁に見いだされており、これらの糖鎖の構
造と機能の解明のためには、その糖鎖からＬ−フ
コース残基を遊離させた後、Ｌ−フコース含量を
定量することが非常に重要である。この遊離Ｌ−
フコースの定量法としては、試料中の遊離Ｌ−フ
コース画分をゲル過またはイオン交換法によつ
て精製し、ガスクロマトグラフイーで定量する方
法（メソツズ・イン・エンジモロジー第28巻、第
738頁、1972年）、過ヨウ素酸酸化によつて生ずる
アセトアルデヒドを定量する方法（ジヤーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー第245巻、
第1659頁、1970年）などがあるが操作が非常に繁
雑でありまた精度にも問題がある。これらの化学
法に比べてＬ−フコース・デヒドロゲナーゼを用
いる酵素法では試料中の遊離Ｌ−フコースを精製
する必要もなく、敏速かつ正確に定量することが
出きる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このＬ−フコース・デヒドロゲナーゼは微生物
では既にプルラリア・プルランが生産することが
報告されている（IRCS Med.Sci.Libr.Compend.
第１巻、第73頁、1973年）。しかし、該酵素の反
応至適PHは10.2とかなりアルカリ側にあることか
ら、中性付近に至適PHを有するＬ−フコース・デ
ヒドロゲナーゼを生産する微生物の検索が望まれ
ている。また、動物組織ではブタ肝臓（ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第244
巻、第4785頁、1969年）やウサギ肝臓（ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー第86巻、第1559
頁、1979年）などにその存在が報告されている
が、該酵素もPH10付近に至適PHを有しており、ま
た、動物由来の酵素を工業生産する場合、原料の
安定供給の面から微生物酵素に比べて不利とな
る。 本発明の目的は、上記現状に鑑み中性付近に反
応至適PHを有するＬ−フコース・デヒドロゲナー
ゼを工業的に安価に製造する方法を提供すること
にある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はＬ−フコース・
デヒドロゲナーゼの製造法に関するものであつ
て、コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培
養し、培養物からＬ−フコース・デヒドロゲナー
ゼを採取することからなる。 本発明で用いられるコリネバクテリウム属に属
する細菌はＬ−フコース・デヒドロゲナーゼを培
養物中に著量生産することが可能で、また後述す
るごとく非常に精製が容易であり、かつ優れた性
質を有している。 まず、本発明に使用される菌株としては、コリ
ネバクテリウム属に属するＬ−フコース・デヒド
ロゲナーゼ生産能を有する菌株であればいかなる
菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよ
い。そして、コリネバクテリウム属に属しＬ−フ
コース・デヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株の
具体例としては、例えばコリネバクテリウム
（Corynebacterium）sp.FS−0077が挙げられる。
本菌は、滋賀県内の土壌中より本発明者らが新た
り検索して得た菌株で、その菌学的性質は次のと
おりである。 ａ 形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地上で30℃で培
養） (1) 細胞の形および大きさ： 通常細胞の大きさは0.3〜0.5×３〜5μｍ、
直線状あるいは若干彎曲した桿菌であり、片
端あるいは両端がクラブ状に曲がつたものも
あり、多形成である。 (2) 運動性の有無：なし (3) 周鞭毛の有無：なし (4) グラム染色性：陽性 (5) 胞子の有無：なし (6) 抗酸性：陰性 ｂ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養： 30℃の培養で、直径２〜４mmの凸円形コロ
ニーを形成する。表面および周縁はなめらか
である。コロニーの色は白黄色不透明で光沢
がある。 (2) 肉汁寒天斜面培養： 30℃培養で拡幅によく生育する。 (3) 肉汁液体培養： 30℃静置培養で皮膜の形成はないが、沈殿
物の形成がある。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養： 20℃静置培養で表面および穿刺線に沿つて
生育し、ゆつくりとゼラチンを液化する。 (5) リトマスミルク培養： 30℃静置培養でミルクのアルカリ化が見ら
れる。 ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陽性 (7) デンプンの加水分解： 極少量あるいは分解しない。 (8) クエン酸の利用：陽性 (9) 無機窒素源の利用：陽性（アンモニウム塩
および硝酸塩） (10) 色素の生成：陰性 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) カタラーゼ：陽性 (13) オキシダーゼ：陰性 (14) 最適生育条件：22℃〜37℃、PH７〜8.5 (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OFテスト：陰性 (17) ビタミン要求性：陰性 (18) 炭素源の利用： Ｌ−フコース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガ
ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトー
ス、マルトース、ラクトース、グリセロー
ル、シユクロース、デキストリン (19) DNAのGC含量：58％（Tm法による） 上記したごとく、本菌はその性状より、バージ
ーズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第８版（1974年）
と対比すると、コリネバクテリウム属に属するも
のと認められる。よつて、本菌株をコリネバクテ
リウムsp.FS−0077と称することとした。なお、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1234号（旧受託番号：微工研菌寄第8545
号）として寄託されている。 本発明において培地に加える栄養源は、使用す
る菌株が利用し、Ｌ−フコース・デヒドロゲナー
ゼを生産するものであればよく、炭素源として
は、例えばＬ−フコース、グリセロール、グルコ
ース、シユクロース、マルトース、ラクトースな
どが利用でき、窒素源としてはペプトン、酵母エ
キス、コーンステイープリカー、肉エキス、脱脂
大豆、硫安、塩化アンモニウムなどが適当であ
る。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩などの無機質および金属塩類を加えてもよ
い。なお、本発明のＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼは誘導酵素である故、Ｌ−フコースを培地に
添加すれば著しく酵素生産量が増大する。例えば
Ｌ−フコース0.1％添加により無添加に比べて約
100倍のＬ−フコース・デヒドロゲナーゼが生産
される。 Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ生産菌を培養
するにあたり、生産量は培養条件により大きく変
動するが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH
５〜７が良く、10〜48時間の通気撹拌培養で本発
明によるＬ−フコース・デヒドロゲナーゼの生産
は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地
組成などに応じ、Ｌ−フコース・デヒドロゲナー
ゼの生産量が最大になるように設定するのが当然
である。 本発明の菌によつて生産されたＬ−フコース・
デヒドロゲナーゼは菌体内に存在するので、培養
物を固液分離し、得られた湿菌体から通常用いら
れる超音波処理、フレンチプレス、ダイナミルな
どの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊、あるい
はリゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体
細胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得られる。次
に、この抽出液から通常用いられる精製手段によ
り精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、除核酸、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、吸着剤によるカラムクロマ
ト、ゲル過、凍結乾燥などにより、精製を行な
い、ポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動的
に単一な精製Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを
得ることができる。 本発明により得られるＬ−フコース・デヒドロ
ゲナーゼの酵素化学的および理化学的性質は次の
とおりである。 (1) 作用： 本酵素は下記反応式のごとく、Ｌ−フコース
を酸化してＬ−フコノ−δ−ラクトンを生成す
る。 Ｌ−フコース＋NAD⁺→Ｌ−フコノ−δ −ラクトン＋NADH＋H⁺ (2) 基質特異性： 本酵素はＬ−フコースに最も特異性が高い
が、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−アラビノースなど
にも作用する（第１表）。

〔実施例〕

以下に本発明によるＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼの製造方法を実施例をもつて示すが、本発
明が以下の実施例の範囲のみに限定されるもので
はない。なお、％は他に特記せぬ限りＷ／Ｖ％で
ある。 実施例 １ Ｌ−フコース0.1％、ペプトン0.5％、
KH₂PO₄0.3％およびMgSO₄・7H₂O0.1％、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌（120℃、20分
間）した500mlの三角フラスコにコリネバクテリ
ウムsp.FS−0077（微工研条寄第1234号）を接種
し30℃で48時間培養した。この培養物中のＬ−フ
コース・デヒドロゲナーゼ活性は1.02単位／mlで
あつた。 実施例 ２ コリネバクテリウムsp.FS−0077（微工研条寄
第1234号）を酵母エキス0.5％、ペプトン1.0％、
KH₂PO₄0.3％およびMgSO₄・7H₂O0.1％、PH7.0
からなる培地100mlを分注して殺菌（120℃、20分
間）した500mlの三角フラスコに接種し、30℃で
24時間培養して種培養液とした。Ｌ−フコース
0.1％、ペプトン0.5％、KH₂PO₄0.3％、MgSO₄・
7H₂O0.1％および消泡剤（日本油脂社製CB−
442）0.01v／ｖ％、PH7.0からなる培地15を30
容のジヤーフアーメンターに入れ、120℃で20
分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液100mlを
接種し、30℃で36時間、毎分15の通気量と毎分
300回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌株を集め、50mMリ
ン酸緩衝液（PH8.0；以下の全操作はPH８で行な
つた）500mlに懸濁した後、超音波処理で菌体を
破砕した菌体破砕液を遠心分離して上澄液540ml
を得た。この上澄液のＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ活性は37.8単位／mlであつた。この上澄液
をあらかじめ50mMリン酸緩衝液で緩衝化した
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア社
製）のカラム（直径5.0cm×長さ10cm）に吸着さ
せ、吸着物を100mMリン酸緩衝液で洗浄後、
300mMリン酸緩衝液で溶出して活性画分を集め
た。次にこの活性画分に、塩化ナトリウムを添加
し4M濃度とした。これをあらかじめ4M塩化ナト
リウム含有100mMリン酸緩衝液で緩衝化したフ
エニルセフアロースCL−4B（フアルマシア社製）
のカラム（直径2.5cm×長さ20cm）に吸着させ、
吸着物を3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩
衝液で洗浄後、1M塩化ナトリウム含有20mMリ
ン酸緩衝液で溶出し、活性画分を集めた。この活
性画分を再びフエニルセフアロースCL−4Bのカ
ラム（直径2.5cm×長さ10cm）に吸着させ、2M塩
化ナトリウム含有5mMリン酸緩衝液で溶出した
後、コロジオン膜で濃縮した。この濃縮液をあら
かじめ100mMリン酸緩衝液で緩衝化したセフア
ロースCL−6Bのカラム（直径2.5cm×長さ90cm）
でゲル過を行ない、得られた活性画分を再び濃
縮後、セフアクリルＳ−200のカラム（フアルマ
シア社製）（直径2.5cm×長さ100cm）でゲル過
をくり返したのち、安定化剤としてEDTAを最
終濃度1mMになるように加えて、凍結乾燥し、
精製酵素粉末820mgを得た。この粉末の比活性は
8.41単位／mgであつた。この酵素粉末はポリアク
リルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一であつ
た。以上の精製工程を第３表に示す。

〔発明の効果〕

本発明により、複合糖鎖の構造と機能の解明に
有用なＬ−フコース・デヒドロゲナーゼの新たな
工業的生産に適した製造法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるＬ−フコース・
デヒドロゲナーゼのPHと活性の関係を表わすグラ
フであり、第２図は温度と活性の関係を表わすグ
ラフであり、第３図はＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼを30℃において、それぞれのPHで60分間処
理した後のPHと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図はPH8.0においてそれぞれの温度で10
分間処理した後の温度と活性の関係を表わすグラ
フである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属に属するＬ−フコー
   ス・デヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物よ
   りＬ−フコース・デヒドロゲナーゼを採取するこ
   とを特徴とするＬ−フコース・デヒドロゲナーゼ
   の製造法。