SU1756350A1 - Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 - Google Patents
Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 Download PDFInfo
- Publication number
- SU1756350A1 SU1756350A1 SU904890833A SU4890833A SU1756350A1 SU 1756350 A1 SU1756350 A1 SU 1756350A1 SU 904890833 A SU904890833 A SU 904890833A SU 4890833 A SU4890833 A SU 4890833A SU 1756350 A1 SU1756350 A1 SU 1756350A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- polysaccharide
- strain
- producer
- necrosis factor
- formation
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Использование: биотехнологи . Сущность изобретени : штамм Corynebacterium Insldlosum выделен из стеблей люцерны. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используют хлористый аммоний, а углерода - глюкозу, клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование фактора некроза опухоли и ин- терлейкина-1 в клетках человека и животных Полисахарид состоит из нейтральных моносахаридов - галактозы и рамнозы, кисла природа обусловлена присутствием пи- ровиноградной кислоты. Полисахарид может быть использаван при лечении опухолевых процессов, а также различных имму- нодефицитных состо ний. 2 ил.
Description
Изобретение относитс к микробиологии , а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности дл получени иммуномодул торов в частности полисахаридов , обладающих способностью стимулировать образование фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) в клетках человека и животных.
Известно использование Mycobacterlum tuberculosis, M. bovls, Proplonlbacterlum acnes в качестве продуцентов липоарабино- маннанов, про вл ющих иммунотерапев- тическое действие против опухолей. Выращивание указанных продуцентов проводитс на средах, содержащих дорогосто щие реактивы. Культивирование продуцентов провод т в течение длительного периода времени (от 4-х суток до 5-ти недель в зависимости от исследуемой культуры). Выделение
липоарабиноманнанов из указанных продуцентов вл етс трудоемким многостадийным процессом, включающим сложную технологию концентрации и очистки препарата на молекул рных ситах и аффинных сорбентах. M. tuberculosis вызывает у человека туберкулез, поэтому вл етс опасным дл работы продуцентом.
В качестве продуцента липополисаха- рида, про вл ющего способность индуцировать образование ФНО и ИЛ-1, используетс Escherlchia coli. Выращивание указанного продуцента проводитс на средах, содержащих дорогосто щие реактивы - м со-пептонный бульон, м со-пептон- ный агар. Выход липополисэхарида -- 4-5% от сухой массы клеток. Липополисахарид получают экстракцией клеток. Липополиса- харид получают экстакцией клеток гор чим водным фенолом. Этот реактив рл егс
XS
О
СА СЯ
очень токсичным дл людей. Наличие липи да А в составе липополисахарида обусловливает его токсические свойства, пирогенность. Максимально переносима доза липополисахарида в опытах на белых мышах 0,125 - 5,00 мг/мг; ЛД so равн етс 2 - 3, 5 мг/кг. Кроме того, получаемые вод- нофенольным методом липополисахармды содержат обычно высокий процент нуклеиновых кислот. Указанные обсто тельства обусловливают невозможность терапевтического применени липополисахаридов дл человека и животных..
6 свЯзй с этим перспективным вл етс использование штампов микроорганизмов, выращивание которых проводитс на дешевых синтетических средах, получение полисахаридов из которых будет более экономичным, безвредным и менее трудоемким и про вл ют высокую активность в стимул ции образовани ФИО и ИЛ-1, Предлагаемый биополимер иной химической природы, в нем отсутствует липид А, обусловливающий токсичность липополисахаридов . В св зи с тем, что полисахариды нетоксичны, они могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов.
Предлагаемый штамм - продуцент полисахарида , вл ющегос эффективным индуктором образовани р да цитокинов ФИО и ИЛ-1.
Целью изобретени вл етс получение активного штамма, наход щегос в отечественной коллекции, - продуцента полисахарида, про вл ющего способность стимулировать образование ФИО и ИЛ-1.
Штамм Corynebacterium Insldlosum ИМВ 7246 б, обладающий указанными свойставми, выделен из пораженных стеблей люцерны. Дл этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезали скальпелем, промывали в течение 15-20 мин несколькими порци ми стерильной воды. Затем растительную ткань растирали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюс гомогенную кашицу высевали петлей на поверхность агара в чашках Петри. Чашки помещали в термостат (температура (25 ±3}°С. Питательными средами дл выделени бактерий обычно служат: картофельный агар, картофельный агар + 1 % глюкозы, картофельный агар +1 % дрожжевого экстракта, м со-пептонный агар.
Культуру хран т: на кос ках с картофельным агаром при комнатной температуре либо в пробирках на кос ках с картофельным агаром , поверхность которого заливают минеральным маслом.
Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофел , 0.5% хлористого натри , 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7,2. Штамм Corynebacterium
Insidiosum ИМВ 7246 б депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно- исследовательского института антибиотиков Минмедмикропрома и имеет регистрационный N 2060.
Штамм С. Insldlosum ИМВ 7246 б имеет следующие морфологические и биохимические признаки.
Морфологические признаки, Клетки - неспороносные палочки (0,4-0,6 0,7-1,1
мкм), пр мые, иногда слабо изогнутые. Располагаютс одиночно, парами, могут Y-об- разно. Грамположительные.
Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных средах. На картофельном агаре - колонии круглые, гладкие, приподн тые, блест щие, слабо слизистые, прозрачные, желтого цвета.
На м со-пептонном агаре - колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем
при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистинции.
При росте в м со-пептонном бульоне - культура растет умерен но, образует нежную
пленку и осадок.
Культура растет а аэробных услови х, оптимальна температура роста 21-24°С, минимальна 1°С, максимальна 28-31°С. Биохимические признаки Культура не
образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтозы , сахарозы, мзннита, рамнозы,салицина Молоко пептонизирует, желатин слабо разжижает, нитраты не редуцирует, не образует индол и сероводород
Используют глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, глицерин, крахмал.
Факторы роста - биотин, никотинова кислота, гистадин, пуриновые и пиримиди- нсвые основани .
Безвредность. Штамм С. insidiosum ИМВ 7246 б не вирулентен, не токсичен дл теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры С. insidiosum ИМВ7246бвнутрибрюшинно , подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста (после культивировани бактерий на жидкой синтетической среде) не вызывала у животних патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.
Штамм ИМВ 7246 б С. insidiosum не патогенен дл теплокровных животных.
Выращивание бактериальной массы С. insidlosum ИМВ 7246 б и получение полисахарида из него осуществл ли следующим образом. Дл получени инокул та используют 24-часовую культуру, выращенную на картофельном агаре при (25 ± 3)°С. Выращивание продуцента осуществл ют в колбах объемом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: MgSCh 0,2; Na2HPO-i 6,0; КН2Р04 3,0; NHoCI 1,0; глюкоза 5.0. Стоимость 1 л среды дешевле более, чем в 10 раз.
Из выращенной культуры продуцента выдел ют целевой продукт м гким щелочным гидролизом клеток.
Пример 1. Культуру С. Insldiosum ИМВ 7246 б, хран ющуюс на кос ках с картофельным агаром, засевают на кос к с той же средой и выращивают в термостате при (25 ± 3)°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с кос ков жидкой питательной средой описанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной среды; выращивают в услови х качалок (240 об/мин) в течение 35 ч. Клатки осаждают центрифугированием при 5 СОО об/мин в течение 20-25 мин. промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН/100 мл на 10 г влажных клеток в течение 1,5-2,0 ч. Гидролизат диализуют против водопроводной.а затем дистиллированной воды до нейтрального значени рН, центрифугируют дл осаждени неразрушенных клеток, а также загр зн ющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК гел х. Полисахарид, целевой продукт, элюируют 0,25 М фосфатным буфером , рН 6,0 (фиг.1). Фракции полисахарида собирают, диализуют против водопроводной , а затем дистиллированной воды, лио- фильно высушивают. В целевом продукте содержитс до 80% углеводов.
Моносахаридыый состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг.2) и 13С-ЯМР-спектро- скопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повтор ющихс звеньв, представленных остатками галактозы и рамнозы. В качестве кислого компонента присутствует пировиноградна кислота.
Молекул рна масса полисахарида, установленна гель-фильтрацией на сефарэзе 6В. составл ет 70 000.
Выход очищенного полисахарида составл ет 10% от сухой массы клеток.
Выделенный полисахарид провер ют на способность стимулировать образование ФИО и ИЛ-1.
Способность полисахарида индуцировать образование ФИО и ИЛ-1 исследовали в культуре стимулированных тиогликолэтом мышиных перитонеальных микрофагов (МФ). Перитонеальные МФ собирали путем промы вачи брюшной полости мышей линии DBA средой RPMI-1640. отмывали центрифугированием и вносили в лунки плат (Linbro) в концентрации 1,0 106 клеток/мл. После 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5% С02 и 95% влажности монослой МФ в
каждой лунке тщательно отмывали дл удалени неприлипших клеток. Затем в лунки вносили свежую среду с 2 мМ L-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, а также исследуемый полисахарид в соответствующей концентрации .
После 20 ч культивировани надосадоч- ные жидкости культур МФ тестировали на наличие в них ФИО и ИЛ-1.
Исследование активности ФИО в супер- натантах макрофагальных культур проводили по методу (Fish et а). В качестве клеток-мишеней используют мышиные фиб- робласты линии L 929, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. Единицы цитотоксиче- ской активности ФНО рассчитывали по уровню 50%-ной цитотоксичности путем использовани Logit-log преобразовани и
анализа полученных пр мых. Стандартна крива , построена по рекомбинант- ному ФНО.
Содержание ИЛ-1 в исследуемых супер- натантах МФ оценивали по их комитогенно- му эффекту в реакции блаонок трансформации (РБТ) мышиных тимоцитов в присутствии субоптимальной дозы (0.5 мкг/мл КонА). Результаты РБТ оценивали по уровню включени 3Н-тимидина во вновь синтезируемую ДНК лимфоцитов. Интенсивность включени метки в культуры лимфоцитов определ ли на / -счетчике.
Способность полисахарида С. insHiosum ИМВ 7246 б в концентрации 10 мкг/мл стимулировать образование ФНО и ИЛ-1 перитонеальными МФ мышей более, чем в два раза превышает способность ли- пополисахарида Escherlchia coll 055:B5,
производимого американской фирмой Sigma (таблица).
Таким образом, предлагаемый штамм ИМА 7246 . Insldiosum вл етс штаммом, продуцирующим полисахарид , вл ющийс активным индуктором образовани фактора некроза опухоли и интерлейкина-1.
Вли ние полисахарида на способность макрофагов стимулировать образование ФИО и ИЛ-1
Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивани Е. coll.
0
Полисахарид в отличие от липополиса- харидэ Е. coll вл етс не токсичным и не обладает побочными действи ми.
Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности и в медицине, при этом не требуетс дополнительных ассигнований дл осуществлени технологических процессов выращивани продуцента и выделени из него полисахарида.
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм бактерий Corynebacterium Insldiosum ВНИИА 2060 - продуцент полисахарида , стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина -1.«№ 2,0W 0 ,01 М 0,25 М NafyPOt NafyPOb. о50WOШНомера фракций ИМВ 72М б мв МЭАЭ-7СК гелеФиг.10,50 Ш Vaty/tyФиг. 2
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904890833A SU1756350A1 (ru) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904890833A SU1756350A1 (ru) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1756350A1 true SU1756350A1 (ru) | 1992-08-23 |
Family
ID=21549963
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904890833A SU1756350A1 (ru) | 1990-12-10 | 1990-12-10 | Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1756350A1 (ru) |
-
1990
- 1990-12-10 SU SU904890833A patent/SU1756350A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Тгасеу К., Loury S,, Cerami A. Cachectfn: a hormone that triggers acute shoch and Chroniccachexia //. J. Infect. Dis., 1988.157., p. 413-420. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6292725B2 (ja) | リポ多糖、リポ多糖製造方法及びリポ多糖配合物 | |
US4767623A (en) | Method of binding microflora and preparations therefor | |
GB2137649A (en) | A lipopolysaccharide and a process for its preparation | |
EP0196042A2 (en) | Antibiotic prepared from lysobacter sp. SC 14,067 | |
CN102559816A (zh) | 一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用 | |
Uchida et al. | Improved microbial production of colominic acid, a homopolymer of N-acetylneuraminic acid | |
SU1756350A1 (ru) | Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 | |
CN102102095A (zh) | 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法 | |
CN103555630B (zh) | 一种中华戈登氏菌及制备方法和应用 | |
SU509246A3 (ru) | Способ получени антибиотика | |
US3912811A (en) | Antibiotic pholipomycin and its preparation | |
HUT60526A (en) | Fermenting process for producing staurosporin | |
CN107058266B (zh) | 一种通过发酵工艺制备溶菌酶的方法 | |
SU1756349A1 (ru) | Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм - продуцент полисахарида, индуцирующего образование интерферона | |
RU2158302C2 (ru) | Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий | |
RU2639569C1 (ru) | Пробиотический штамм Bacillus megaterium - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов | |
SU1042602A3 (ru) | Способ получени вещества 41 200 @ ,обладающего иммуностимулирующим действием | |
RU2101020C1 (ru) | Препарат, обладающий иммуностимулирующим действием | |
CN1052049A (zh) | 抗肿瘤生物制剂的制造方法 | |
TANAKA et al. | WS1279, a novel lipopeptide isolated from streptomyces willmorei fermentation, isolation and physico-chemical properties | |
JPH0572921B2 (ru) | ||
JPS6196988A (ja) | 新規アクチノプラネス菌株により生産された抗生物質a26201‐1および抗生物質a26201‐2 | |
KR830002817B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법 | |
AU589384C (en) | A method of binding microflora | |
RU2217493C2 (ru) | Биопрепарат-пробиотик, способ его получения и штамм streptococcus faecium те-17 для получения биопрепарата-пробиотика для животных и птицы |