CN1052049A - 抗肿瘤生物制剂的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤生物制剂的制造方法，用 其生产的制剂对多种小鼠移植性肿瘤。Ehrlich腹水 癌、小鼠原发性肝癌、S180肉瘤、Lewis肺癌、L1210淋 巴细胞白血病、LA-795肺腺癌、MA-737乳腺癌均 有较好的抑制和杀伤作用。

临床试验中已证实对于人原发性肝癌、恶性淋巴 瘤、子宫颈癌白血病等有显著疗效；对乳腺癌、肺癌、 胃癌、结肠癌等有效。瘤体生长抑制率。生存时间， 均优于化疗和其它治疗。毒副作用小，生产工艺比较 简单，社会和经济效益好的一种新型生物抗癌制剂。

Description

本发明涉及一种高效、谱广的抗肿瘤生物制剂（简BC-369以下同）的制造方法。利用本发明方法制造的BC-369对肝癌、肺癌、恶性淋巴癌、宫颈癌、白血病、乳腺癌、结肠癌、胃癌都有明显的治疗效果。

目前尚未发现抗肿瘤效果较高的生物制剂，因此也未发现相应的制造方法。现在国内外承认和使用的抗肿瘤生物制剂为“卡介菌”其制造方法是从结核菌培养、分离而得。用这种方法制造的“卡介菌”对肿瘤虽有抑制作用，但主要增强机体的免疫力、食欲和抵抗力，对肿瘤的治疗作用很小。

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤谱广、治疗作用显著，既有免疫作用、又有对癌细胞有杀伤作用的生物制剂的制造方法。

本发明的制造方法是将鸡新城病毒、神经氨酸酶、唾液酸酶、核酸酶、生物素、磷脂、胆固醇、岩藻糖和附加剂糖蛋白G₁，糖蛋白G₂，尿嘧啶、维生素C、三磷酸腺戎（ATP）、氯化钾、半乳糖、吐温-80，硫酸镁等配制而成。

本发明的制造方法包括下列步骤：

1、鸡新城病毒的培养和选择。

首先选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡。然后，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城病毒。

选择健康母鸡孵育的鸡胚，最好为9-11令的鸡胚，将上述分离的鸡新城病毒接种于鸡胚的尿囊腔中。置于37-38℃下培养48-72小时。至胚内含大量病毒，呈现较高血凝性。

从鸡胚中抽出尿囊液，利用血凝集抑制试验方法，进行病毒定性。

2、鸡新城病毒的扩大种植，培养和鸡新城病毒尿囊液的收集

先用抗菌素处理病料（即上述鸡新城病毒尿囊液），使病料中的抗菌素浓度分别为每毫升青霉素1000单位和链霉素1000毫克。也可以用静脉滴注金霉素处理，浓度为每毫升1毫克，处理的病料置于4℃中感作1-2小时。

选择10-12日令的鸡胚，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂3%的碘酒和75%的酒精消毒，用无菌钢锥穿一小孔，随后将注射器沿小孔插入0.5～1.0厘米处，注入0.1～0.2毫升接种物（即上述采用抗菌素处理过的鸡新城病毒尿囊液），用石蜡封口，在孵育箱中孵育48-72小时。

将孵育好的鸡胚冻死，用碘酒和酒精消毒后，除去气室端的卵壳或人工卵窗的封盖物，除去卵壳、撕去内层壳膜和绒毛尿囊膜，直接吸收尿囊液。

以上各项操作必须在无菌条件下进行。

3、鸡新城病毒尿囊液效价测定及效价调整。

利用红细胞凝集法测定效价，然后将测定的鸡新城病毒尿囊液的效价调整到1∶640。方法是：取鸡新城病毒尿囊液10毫升测定其效价，若效价低于1∶640，则滴加无菌高效价1∶1280鸡新城病毒尿囊液，使抽样10毫升的效价达1∶640为止，算出滴加无菌高效价的毫升数。

利用公式计算：

配制效价1∶640鸡新城病毒尿囊液X毫升需加无菌高效价（1∶1280）鸡新城病毒尿囊液的毫升数＝效价低于1∶640的鸡新城病毒尿囊液X毫升× (滴加高效价毫升数（1∶1280）)/(抽样毫升数（10毫升）)

取鸡新城病毒尿囊液10毫升测效价若高于1∶640则滴加生理盐水（0.85%），使取样10毫升效价为1∶640为止，算出滴加无菌生理盐水毫升数。

利用计算公式：

配制效价1∶640鸡新城病毒尿囊液X毫升需加无菌高效价（1∶1280）鸡新城病毒尿囊液的毫升数＝效价高于1∶640的鸡新城病毒尿囊液X毫升× (生理盐水毫升数)/(抽样毫升数（10毫升）)

4、对调整好效价的尿囊液进行灭菌，灭菌方法可采用中速低温离心法灭菌，也可以采用过滤法灭菌，即用0.2-0.5mμ滤膜过滤灭菌。还可以采用低温灭菌即在-70℃以下或-196℃以下（液氮）中保存灭菌。

5、鸡新城病毒尿囊液、酶、附加剂注射液的配制。

鸡新城病毒尿囊液三酶及附加剂配制成BC-369注射液的具体方法。

A：糖蛋白G₁0.72克

糖蛋白G₂0.36克

按顺序溶于160毫升0.075NHCL溶液中，置水浴中半小时。

B：生物素1.0毫克

先溶于7.5毫升去离子水中，再加入0.1毫升1NHCL再加去离子水至10毫升。

C：磷脂2.0毫克

胆固醇4.0毫克

将磷脂溶于4毫升95%酒精中，然后加入胆固醇，用力振荡使之溶化，再加入5%吐温-80水溶液10毫升。

D：唾液酸酶2毫克，溶于10毫升去离子水中。

E：尿嘧啶10毫克

溶于100毫升去离子水中，予先在瓶内加0.35毫升的浓NH₄OH。

F：神经氮酸酶2毫克

溶于20毫升去离子水中，4℃冰箱中避光保存备用。

G：Vjt  C5毫克溶于10毫升去离子水中。

H：核酸酶2毫克。

溶于10毫升去离子水中，4℃冰箱中避光保存备用。

I：95%ATP200毫克溶于10毫升去离子水中。

J：鸡新城病毒尿囊液1500毫升去菌备用。

K：凝血素10毫克溶于去离子水中，室温保存。

L：各组溶液混合秩序：

1.先加160毫升A溶液。

2.加B溶液2毫升。

3.加F溶液20毫升。

4.加10%KCL22毫升。

5.加MgSO₄·7H₂O3.6克。

6.加半乳糖水溶液25毫升。

7.加岩藻糖水溶液10毫升。

8.加唾液酸酶水溶液10毫升。

9.加C溶液14毫升。

10.加H溶液10毫升。

11、加J200毫升。

12、加E溶液54毫升。

13、加G溶液10毫升。

14、加J溶液1500毫升。

15、加K溶液20毫升。

配制好的注射液进行灌封，灌封必须在同一室内进行，间隔不能超过6小时，且要在严格的无菌操作条件下进行，室温4℃以下为宜。

本发明具有如下的优点和效果：

利用本发明的方法所制备的生物制剂BC-369，对动物试验和对人的临床试验都显示了较好的治疗效果。

一、对动物试验结果。

①BC369对昆明杂系小鼠EAC的影响：

BC369  24μg/kg48μg/kg腹腔注射给药后12只小鼠长期存活30天以上，4只死亡小鼠均为30天后意外死亡或处死。而非治疗组则于接种后第16天内全部死亡，平均生存时间为12.7天。

②BC369对S180、HAC和Lewis肺癌的抑制作用

不同剂量的BC369经腹腔给药后对S180、HAC和LeWis肺癌有较强的抑制作用（P＜0.001）：见表1

Claims (1)

1、一种抗肿瘤生物制剂(BC-369)的制造方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)鸡新城病毒的培养和选择：

①选择患鸡瘟的病鸡。

②从病鸡的呼吸道或肺组织中分离病毒。

③将病毒接种于鸡胚尿囊腔中。

④将接种病毒的鸡胚在37～38℃继续培养48～72小时内含大量病毒。

⑤病毒定性。

⑥选择高效价病毒1∶1280或1∶2560为毒种、

(2)鸡新城病毒的种植、培养和鸡新城尿囊液收集。

①鸡胚的培养。

②将高效价病毒尿囊液用抗菌素处理后在4℃冰箱中放置1～2小时后，无菌操作下接种于鸡胚尿囊腔中，并继续培养48-72小时，然后放入4℃冰箱中12小时使鸡胚死亡。

③将培养好的鸡卵剖开收获尿囊液。

④利用红细胞凝聚法测定效价和滴定法调整效价至1∶640。

⑤病毒尿囊液利用过滤法和冷冻法灭菌。

(3)病毒尿囊液、酶、附加剂注射液配制。

在效价为1∶640的鸡新城病毒尿囊液1500毫升中顺序加入下列灭菌后的成份：

①糖蛋白G0.36～0.72g浓度为0.075N的稀盐酸溶液160毫升。

②含生物素1.0毫克浓度为1NHCL的0.1毫升溶液。

③神经氮酸酶2毫克的无离子水溶液20毫升。

④10%KCL水溶液22毫升。

⑤MgSO₄·7H₂O3.6克。

⑥半乳糖10克无离子水溶液25毫升。

⑦岩藻糖5克无离子水溶液10毫升。

⑧含唾液酸酶2.0毫克无离子水溶液10毫升。

⑨含磷脂2.0毫克，胆固醇4.0毫克，95%酒精-吐温80，水溶液14毫升。

⑩核酸酶2毫克无离子水溶液10毫升。

⑾95%ATP200毫克。

⑿含尿嘧啶10毫克0.35毫升的浓NaOH。

⒀含VitC5毫克无离子水溶液10毫升。

⒁含凝血素10毫克无离子水溶液20毫升。