JPS643878B2

JPS643878B2 -

Info

Publication number: JPS643878B2
Application number: JP52149354A
Authority: JP
Inventors: Yoko Kusakabe; Shojiro Mitsuoka; Yukiko Komuro; Akio Kyono; Tadashi Aryoshi; Yasuo Iwagaya
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1977-12-14
Publication date: 1989-01-23
Also published as: JPS5484576A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規抗生物質6016物質に関する。本発明者らは、ストレプトミセス属に属する特
定の菌株を培養すると、グラム陽性菌、抗酸性菌
及びカビ類等の広範囲の微生物に対して強い発育
阻止作用を示す物質の少なくとも２種が培養物中
に生産蓄積されることを見出し、これら有効物質
の主成分を採取することに成功した。更に本発明者等は、この有効物質を結晶状で純
粋に単離し、その性質を調べた結果、既知の物質
とは異なる新抗生物質であることを見出し、この
有効物質を6016物質と命名した。本発明の抗生物質6016物質は、ナトリウム塩と
して下記の理化学的性質を有する。 (1) 色及び性状：無色プリズム晶で、6016物質自
体は酸性物質である。 (2) 融点：192〜195℃（分解）、188℃附近より
徐々に着色する。 (3) 分子式及び構造式： ¹³C―NMRスペクトル
によれば炭素数は43個と測定されたが、Ｘ線回
折によれば構造式は下記のとおりである。分子
式C₄₆H₇₇O₁₆Na (4) 元素分析値：C₄₆H₇₇O₁₆NaしてＣＨＯ Na 実測値(%) 60.50 8.61 28.06 2.77 計算値(%) 60.79 8.47 28.19 2.53 (5) 比旋光度：〔α〕²⁵ _D―42.5（C1，CH₃OH）。 (6) 紫外線吸収スペクトル：末端吸収を示す。 (7) 赤外線吸収スペクトル：臭化カリウム錠によ
る吸収スペクトルを第１図に示す。 (8) NMR：第２図に示す。δ3.30ppm、3.34ppm
及び3.46ppmにより３個のメトキシ基の存在が
認められる。 (9) 薄層クロマトグラフイー：次表に示す〔シリ
カゲル（メルク社製キーゼルゲルGF₂₅₄）プレ
ート上〕。溶媒系 R_f値ベンゼン―酢酸エチル（１：１） 0.40 ベンゼン―アセトン（５：１） 0.28 クロロホルム―アセトン（５：１） 0.46 クロロホルム―メタノール（20：１） 0.43 (10) 溶解性：メタノール、エタノール、酢酸エチ
ル、クロロホルム、エーテル、アセトン及びベ
ンゼン等に可溶であり、水にきわめて難溶であ
る。 (11) 呈色反応：ニンヒドリン及びレミユーの反応
は陰性、ヨード蒸気で着色する。 6016物質のナトリウム塩の各種微生物に対する
抗菌スペクトルを次表に示す（6016物質のナトリ
ウム塩の寒天希釈法による最小発育阻止濃度）。

【表】前記の抗菌スペクトルから明らかなように、
6016物質は特にグラム陽性菌に対して強力な抗菌
作用を示す。本6016物質はこれらの理化学的性質及び生物学
的性質から、ポリエーテル群と総称される抗生物
質に属する。ポリエーテル群抗生物質のうち、３
個のメトキシ基を有する既知の抗生物質として
は、C20―12（特開昭51―91396号明細書）、Ａ―
28695B（特開昭48―68795号明細書）、Ａ―204B
（ハンドブツク・オブ・マイクロバイオロジイ
410，Vol.3 CRC Press）、Ｔ―42082（特開昭51
―79730号明細書）、Ｔ―40517（特開昭50―10581
号明細書）及び38295（特開昭51―125793号明細
書）があげられる。しかし6016物質は融点、比旋
光度、分子式又は赤外線吸収スペクトルなどの性
質が前記の既知物質と異なり、新規な抗生物質で
ある。新抗生物質6016物質は、抗生物質6016物質を生
産する能力を有するストレプトミセス属菌を培養
し、その培養物から6016物質を採取することによ
り製造される。抗生物質6016物質を有利に生産する微生物とし
ては、特にストレプトミセスsp.6016号菌が用い
られるが、6016物質生産能力を有する限りストレ
プトミセスsp.6016号菌の変異株その他も本発明
方法に用いることができる。ストレプトミセス
sp.6016号菌は微工研菌寄第4285号として寄託さ
れており、その菌糸の直径、分生子の大きさ、全
細胞の加水分解物中の２，６―ジアミノピメリン
酸がLL―型であることから、放線菌類中のスト
レプトミセス属の１菌株と同定された。 6016号株の菌学的性質は下記のとおりである。形態学的性質：栄養菌糸は通常のストレプトミセス属の菌株と
等しく、よく発達し分岐するが、通常は隔壁を生
ぜず、また胞子を作ることもない。栄養菌糸の直
径はほぼ0.6μ内外で、ジグザグ型分岐を示すよう
なことはない。また液体培地、例えばトリプト
ン・イーストエキス培地に本菌を接種し28℃２週
間静置培養しても、菌糸は桿菌状又は球菌状に分
断して培地を混濁させることはない。気菌糸は通
常放線菌に用いられる諸種の寒天培地を用いる
と、きわめて良好に着生し、外観は白色粉状で顕
微鏡下では主軸は直線状又は波状で、やや長い側
糸を分岐する。側糸の分岐様式は時に疑似輪生分
岐状であるが、真正の輪生分岐は認められず、多
くの単軸分岐が存在する。側糸の先端は成熟する
にしたがつて下端から長い胞子の連鎖を形成する
が、培地によつては胞子と胞子の境界が明らかで
ないことがある。胞子柄の形状は典型的にはやや
ゆるく巻いたらせん形を呈し、らせんの直径は約
３〜6μで、７〜８回転以上回転するものもある。
もちろん胞子の連鎖の分化が不良な培地では、典
型的ならせん状となることは稀で、レクチフレキ
シビルスまたレチナクリアペルテイとなることも
ある。胞子は大体円柱形で大きさは、0.6〜0.7×
0.8〜0.9μ位で表面は平滑である。その他ある種
の培地、例えばイースト・麦芽寒天培地上では気
菌糸及び胞子柄の一部に粘液塊が見られる。菌核
や胞子嚢、遊走子は観察されない。培養上の諸性質：実験の方法はイー・ビー・シヤーリングらの報
文（インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・シ
ステマチツク・バクテリオロジー、16巻、313〜
340頁、1966年）に準じ、その他付加的に公知の
培地及び実験方法を併用した。色調の決定はキセ
ノンランプを光源とする標準光源下で、標準色票
としてカラー・ハーモニー・マニユアル、第４版
（コンテナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリ
カ・シカゴ、1958年）を用い、一致する色票があ
れば初めに一般名を示し、次いで括弧内にカラ
ー・ハーモニー・マニユアルの色票コードを併記
した。以下は特記しないかぎり、28℃、３週後の
各培地における生育の状態である。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地（デイフコ）生育：中等度の生育、アイボリー（2db）裏面：2db 気菌糸：うすい中等度に着生する。粉状でほと
んど白色溶性色素：作らない (2) グルコース・アスパラギン寒天培地生育：コロニーの中央部で隆起する中等度の生
育、バンブー、バフ、ストロー、ホイート
（2fb）裏面：2fb 気菌糸：やや良好に着生し、粉状、白色溶性色素：作らない (3) グリセリン、アスパラギン寒天培地（ISP
＃５、デイフコ）生育：隆起する良好な生育、2fd 裏面：2fd 気菌糸：良好に着生し、白色溶性色素：作らない (4) スターチ寒天培地（ISP＃４、デイフコ）生育：あまり広がらない、隆起する良好な生
育、2fbないしバンブー、シヤムワー（2gc）裏面：2fbないし2gc 気菌糸：良好に着生し粉状、白色溶性色素：作らないその他：培地中の炭酸カルシウムは生育の裏面
で溶解され、透明帯ができることがある (5) チロシン寒天培地（ISP＃７、デイフコ）生育：あまり広がらない、隆起する中等度の生
育、2fb 裏面：2fb 気菌糸：良好に着性し、白色溶性色素：作らない (6) 栄養寒天培地（デイフコ）生育：ほとんど隆起しないが良好な生育、2fb 裏面：2fb 気菌糸：中等度に着性し、白色、粉状溶性色素：作らない (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP＃２、デイフ
コ）生育：やや広がる、隆起した旺盛な生育、ハニ
ーゴールド、ライトゴールド（2ic）裏面：2ic 気菌糸：きわめて良好に厚く着性、粉状、白色溶性色素：ごくうすい黄色 (8) オートミール寒天培地（ISP＃８）生育：やや隆起し、広がる旺盛な生育、ライト
アイボリー、エツグシエル（2ca）裏面：2ca 気菌糸：やや貧弱ないし中等度に着生し、粉
状、白色溶性色素：作らない (9) イースト・スターチ寒天培地生育：やや広がる、隆起した中等度ないし良好
な生育、2fb 裏面：2fb 気菌糸：良好に着性し、粉状、白色溶性色素：作らない生理、生化学的諸性質： (1) 生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、PH
7.3）適温：21〜38℃ 生育不能温度：12℃以下、44℃以上では生育し
ない生育の下限と上限：125℃及び42℃ (2) グルコース・ペプトン、ゼラチン培地の液
化：液化する (3) スターチの加水分解（ヨード・ヨードカリ反
応）：陽性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（デイフコ・ス
キム・ミルク）（37℃）：凝固し、次第にペプト
ン化する。 (5) メラニンの生成：トリプトン・イーストエキ
ス液体培地（ISP＃１、デイフコ）、チロシン
寒天培地（ISP＃７、デイフコ）、ペプトン・
イースト鉄寒天培地（ISP＃６、デイフコ）メ
ラニン形成培地（28℃、２週間目）いづれも陰
性炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒
天培地、28℃、２週間目の生育をもつて示す）利用陽性：（）Ｄ―グルコース、アラビノース、フラ
クトース、ラムノース、Ｄ―マンニトール（＋）Ｄ―キシロース、シユクロース、ラフ
イノース利用疑陽性：（±）イノシトール耐塩性（ベネツト寒天培地）：13％でも生育
する以上の菌学的諸性質を要約すると、ストレプト
ミセス6016号株は胞子柄の先端は典型的ならせん
状で、10箇以上の胞子の連鎖よりなり、胞子の表
面は平滑で、気菌糸の色調は白色、菌体の色調は
淡い黄色であり、PH指示色ではない。メラニン産
生能は陰性で、耐塩性はかなり高い。公知文献に
よればこの6016号株に類似する種としては、スト
レプトミセス・アルブス（ロツシ・ドーリア）ワ
クスマン・アンド・ヘンリツチ、1943があげられ
る。しかし6016号株は、生理生化学的諸性質のう
ち殿粉を加水分解すること（ヨード・ヨードカリ
反応）及びアラビノースとラムノースを利用する
ことの２点で、ストレプトミセス・アルブスの新
標準株の記載（ジヤーナル・オブ・バクテリオロ
ジー、82巻、２号、370〜380頁、1962年参照）と
は明らかに異なつている。バーギース・マニユア
ル・オブ・デターミネーテイーブ・バクテリオロ
ジー（アール・イー・ブチヤナンら編著：ザ・ウ
イリアムス・アンド・ウイルキンス・カンパニ
ー、ボルテイモア、1974年、第８版）から検索す
ると、白色の気菌糸を有し、スパイラルを作り、
メラニン陰性で胞子表面が平滑な種の中で、Ｄ―
キシロース及びＬ―ラムノースを利用するものと
しては、ストレプトミセス・アルブス、サブ・エ
スピー・パトシジクス・ナガツ・エト・アル・ス
トレプトミセス・ヘルベセンス（クラシルニコ
フ・エト・アル）プリドハム及びストレプトミセ
ス・オクラセイスクレロテイクス・プリドリムが
あげられる。しかしストレプトミセス・アルブ
ス・サブ・エスピー・パトシジクスは食塩耐性が
≧４％で７％では生育しないこと及び抗生物質の
生産能の点で異なる。ストレプトミセス・ヘルベ
センスは、ある培地では緑色の生育を示すことで
異なる。ストレプトミセス・オクラセイ・スクレ
ロテイクスは事実上うす黄又は明るい茶色及び明
るいオレンジ黄色の気菌糸を作り、生育の裏面が
濃褐色で、ある培地ではスクレロチユームを形成
する点で6016号株と区別される。したがつて6016
号株はこれらの種と一致しないが、これらのうち
最も古典的な種であるストレプトミセス・アルブ
スの一新亜種又は変異株と考えられる。本発明の6016物質を製造するには、普通に知ら
れている放線菌の培養方法を用いることができ
る。例えば液体培養法、特に深部培養法が適して
おり、好気的条件下で培養することが好ましい。生産培地は6016物質生産能を有する微生物が利
用できる栄養源を含有し、栄養源としては、従来
ストレプトミセス属の菌の培養に利用されている
公知のものが使用できる。一般に炭素源として
は、例えばグルコース、殿粉、グリセリン、デキ
ストリン、蔗糖、動植物油等、窒素源としては、
例えば大豆粉、コーンステイープリカー、小麦胚
芽、アンモニア等が用いられる。更に必要に応
じ、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、リン酸塩などの無機塩を添加するほ
か、菌の発育を助け、6016物質の生産を促進する
作用を有する有機塩及び他の無機塩を適宜に添加
することができる。培養に適する温度は一般に25〜35℃であるが、
多くの場合30℃で培養することが好ましい。こう
して振盪培養及びタンク培養のいずれの場合に
も、6016物質の生産は４〜８日で最高に達する。 6016物質は、前記の理化学的性質から明らかな
ように脂溶性酸性物質であり、これを採取するに
は一般の醗酵生産物質を採取する方法に準じて行
うことができる。例えば各種有機溶媒による抽出
法、各種活性吸着剤によるクロマトグラフイーな
どを適宜組合せて用いることにより、目的物質を
得ることができる。例えば次のように操作するこ
とができる。培養液に過助剤を加えて過し、
液及び菌体をそれぞれ適宜な溶媒で抽出する。
菌体抽出液と液抽出液とを合併し、溶媒を留去
した残渣をクロマトグラフイーに付する。溶出液
を減圧濃縮したのち残査を適宜な溶媒で処理する
と、6016物質が結晶として得られる。本発明の6016物質はコクシジウム症防除剤とし
て有用であり、6016物質又はその塩を単独で、あ
るいは生理的に無害な固体又は液体の賦形剤もし
くは希釈剤と混合し、例えば散剤、粉剤、錠剤、
カプセル剤、顆粒剤などとして用いられる。また
6016物質又はその塩を飼料、水などに混合して用
いてもよい。固体賦形剤としては、例えば小麦
粉、大豆粉、米糠、殿粉、ブドウ糖、酵母、魚
粉、タルク、硅藻土等があげられ、液体賦形剤と
しては、例えば生理食塩水、蒸留水、生理的に無
害な有機溶媒等が用いられる。そおほか適宜な補
助剤、例えば乳化剤、分散剤、懸濁剤、湿潤剤、
ゲル化剤などを添加してもよい。更に本防除剤は
例えば殺菌剤、防腐剤、酵素剤、他の抗生物質、
乳酸菌製剤等を含有することができる。本発明の化合物を成分とするコクシジウム症防
除剤は、特に固体の状態で使用することが好まし
く、この場合に有効成分を固体飼料例えば市販の
飼育飼料又は発育促進飼料等に撹拌、振盪又は粉
砕等の手段で混入するか、あるいは有効成分を前
記のような生理的に無害な賦形剤を含む粉末濃厚
物の形で前記の飼料に混合することができる。本
発明の化合物を成分とするコクシジウム症防除剤
は、約0.00005重量％以上の有効成分6016物質を
含有することが好ましい。一般に本防除剤の投与量は家禽、家畜の種類、
日令、投与方法、症状等により変化するが、例え
ばにわとりのコクシジウム症の予防の目的には、
飼料の全重量に対し約0.0001〜0.005％、治療の
目的には約0.0005〜0.005％の6016物質の量で投
与することが好ましい。いずれの場合にも飼料中
の6016物質の濃度が約５〜50ppmになるように混
和して投与することができる。本剤は特にアイメリア・テネラによる疾患の予
防及び治療において優れた結果が得られる。本発明の6016物質は抗コクシジウム作用のほか
に、反芻動物の飼料効率改善、家畜の赤痢による
下痢の治療、循環不全の改善にも有効であり、更
に殺ダニ作用をも有する。実施例１ブドウ糖1.5％、可溶性殿粉1.5％、大豆粉2.0
％、ビール酵母0.5％及び食塩0.2％を含有する培
地に6016物質生産菌（ストレプトミセスsp.6016
号菌）を接種し、30℃で48時間培養する。この培
養液150mlを、可溶性殿粉6.0％、大豆粉2.0％、
ビール酵母0.2％及び食塩0.2％を含有する培地
（PH6.5）15を入れた内容30のジヤーに接種
し、30℃、通気量15／分及びプロペラ回転数
350rpmの条件下で144時間撹拌培養する。この培養液に過助剤（ラジオライト700）300
ｇを加えて過し、液と菌体とに分離する。
液を酢酸エチル６で抽出し、菌体をアセトン５
で抽出する。菌体のアセトン抽出液を濃縮して
アセトンを除去したのち、酢酸エチル３で抽出
し、この抽出液を液からの抽出液と合併する。
合併した酢酸エチル抽出液を減圧下に濃縮し、残
査をｎ―ヘキサン―酢酸エチル（２：１）の混合
溶媒に溶解し、ｎ−ヘキサンで充填した活性アル
ミナ50ｇのカラムに吸着させ、次いでｎ―ヘキサ
ン―酢酸エチル（１：１）で溶離する。得られた
溶離液の各分画をシリカゲル薄層クロマトグラフ
イーに付し、クロロホルム―メタノール（20：
１）の混合溶媒で展開したとき0.43のR_f値を示す
主活性部分のみを集め、同時に生産された微量成
分（R_f値0.23）等と分離する。主活性区分を合併
し、減圧下に濃縮すると、粗結晶98ｇが得られ
る。この粗生成物を酢酸エチルに溶解し、希塩酸
と共に振盪したのち、酢酸エチル層を希炭酸ソー
ダ溶液と共に振盪する。次いで酢酸エチル層を減
圧下に濃縮し、生成した結晶をｎ―ヘキサン―酢
酸エチルから再結晶すると、6016物質のナトリウ
ム塩４ｇが無色プリズム晶として得られる。こう
して得られた6016物質のナトリウム塩は前記の理
化学的性質及び生物学的性質を示す。参考例（抗コクシジウム作用）供試薬剤及び飼料：抗生物質6016は供試濃度となるよう抗コクシジ
ウム剤無添加のオリエンタル社製の幼すう用完全
配合飼料に均等に混和し、オーシストの接種２日
前から試験終了日まで投薬を続けた。給餌は自由
給餌とした。供試ヒナ：供試ヒナは産卵鶏種シエーバー・スタークロス
の雄ヒナで、コクシジウムの感染を完全に防止し
て飼育した７日令（感染時９日令）のものを一群
５羽ずつ使用した。接種オーシスト及び接種量：農林省家畜衛生試験場で分離同定されたアイメ
リア・テネラの感受性株を用いた。その接種量
は、ヒナ１羽当たり成熟オーシスト５×10⁴個で、
それぞれ金属製ゾンデで経口的にそ嚢内に接種し
た。効果判定：ヒナの相対体重増加率、生存率及びオーシスト
値及び腸管の病変値から抗コクシジウム脂数を計
算し、指数値による判定を行つた。各試験項目に
ついての測定又は判定は次のように行つた。 (1) 腸管内オーシスト数及びオーシスト値：８日目に腸管ホモジネートにより盲腸内のオー
シストを数え、オーシスト値は下記のように定め
た。腸管内オーシスト数オーシスト値 0.0〜0.1×10⁶ ０ 0.1〜1.0×10⁶ １ 2.0×5.0×10⁶ 10 6.0〜10.0×10⁶ 20 ＞11.0×10⁶ 40 (2) 腸管病変度及び病変値：ヒナは試験終了時（８日目）に殺して、腸管を
肉眼的に精査し、角田−石井の方法により病変度
の判定を行つた。−は病変度０、＋は１、は２、
は３、は４とし、病変値は平均病変度を10
倍した値である。 (3) 相対体重増加率：投薬開始時（−２日）、接種時２，４，５，６，
７及び８日目に体重を測定し、試験終了時に各試
験群ごとの体重増加量を求め、非感染無投薬群を
100として相対体重増加率を求めた。 (4) 抗コクシジウム指数：抗コクシジウム指数＝（相対体重増加率＋生存率）−
（オーシスト値＋病変値）試験結果を次表に示す。

【表】＊＊へい死羽数は括弧内の数字

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質6016物質のナトリウム塩の赤
外線吸収スペクトル（KBr法）、第２図はその核
磁気共鳴スペクトル（100MHz、CDCl₃）を示す
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の構造式で表わされ、融点が192〜195℃（分解）、比旋光
度が〔α〕²⁵ _D―42.5（メタノール）である抗生物質
6016物質。