JPS63198993A - 新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規微生物およびこの新規微生物を使用した
メナキノン−４の製造法に関する。

メナキノン−４は、医薬用のビタミンに２として知られ
ており、血液の凝固を促進する脂溶性のビタミンで抗出
血性作用を有する重要な生理活性物質である。

〔従来の技術１発明が解決しようとする問題点〕メナキ
ノン−４の製造法としては、合成法および動植物組織か
らの抽出法が知られている。しかしながら、前者は、原
料の入手が困難なうえにコスト高であり、一方、後者は
、供給量が限られ、さらに、抽出操作が煩雑なことも加
わってコスト高を免れず、いずれも実用に適している方
法とはいい難い。

これに対して、メナキノン−４を多量に生成。

蓄積する微生物および／または生成させる条件を見出す
ことができれば、メナキノン−４を大量に生産できるの
で、非常に有利である。

本発明は、前記の事情に鑑みてなされたもので、新規微
生物の取得および微生物によるメナキノン−４の効率の
よい生産を目的とするものである。

〔問題を解決するための手段、作用〕

前記の目的を達成すべく、本発明者が鋭意検討を重ねた
結果、メナキノン−４を生産しない菌株を親株として変
異処理を行い、菌体内および／または菌体外にメナキノ
ン−４を生産する菌株を得ることに成功してさきに特許
出願した（特開昭６１−２１６６９６および特願昭６ｌ
−４１８４０）。その後、このメナキノン−４生産菌株
についてさらに研究を重ねた結果、フラボバクテリウム
属に属しスルホナミド耐性を有する新規な変異株を得、
この新規変異株がより優れたメナキノン−４生産能を有
することを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、フラボバクテリウム属に属し、メ
ナキノン−４生産能およびスルホナミド耐性を有する新
規微生物であり、この新規微生物を培地に培養し、菌体
および培養液中のそれぞれにメナキノン−４を蓄積させ
、該菌体および培養液中のぞれぞれから蓄積されたメナ
キノン−４を採取することを特徴とするメナキノン−４
の製造法である。

本発明の新規微生物は、フラボバクテリウム属に属し、
メナキノン−４生産能を有する微生物に変異処理を施し
て、スルホナミド耐性変異株を誘導することによって得
ることができる。

変異処理としては、通常の変異処理法、たとえば、紫外
線照射（ＵＶ処理）ならびにＮ−メチル−に−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンサル
ファネート（ＥＭＳ）および亜硝酸などの化合物をそれ
ぞれ使用する化学処理などのそれぞれを施す常法が採用
される。

本発明の新規微生物は、スルファグアニジン（ｓｕｌｆ
ａｇｕａｎｉｄｉｎｅ）　＋　　スルファピリジン（ｓ
ｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ）またはスルファチアゾール
（ｓｕｌｆａｔｈｉａｚｏｌｅ）などのスルホナミドに
対して耐性を有する。

この新規微生物の具体例としては、メナキノン−４生産
能を有するフラボバクテリウム　アクアタイル（Ｆｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｑｕａｔｉｌｅ）　Ｋｓ−
１５（微工研菌寄　第８１１６号）から誘導されたフラ
ボバクテリウム　アクアタイル（Ｐｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ａｑｕａｔｉｌｅ）ｃｏ−３１（微工研菌寄
　第９１９４号）が挙げられる。

ここで使用されるフラボバクテリウム　アクアタイルＫ
ｓ−１５は自然界より分離されたフラボバクテリウム　
アクアタイルＮ１１２３８−７　　（微工研菌寄第８１
１３号）（この菌学的性質は、「ビタミン」第５８巻、
　Ｐ４０９〜４１９．　（１９８４）に記載されている
）を親株として、変異処理を３回行って得られたもので
ある。

以下に、フラボバクテリウム　アクアタイルに３−１５
を得る方法を説明する。

すなわち、液体培地中で予め生育増殖させたフラボバク
テリウム　アクアタイルに２３Ｂ−７の菌体をＮＴＧを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中に懸濁させ、これを
振盪して変異処理に付す。この菌体をリン酸緩衝液で洗
浄した後、同様な緩衝液中に懸濁させる。この菌体から
、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む寒天培地を使
用して、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸耐性株　フラ
ボバクテリウム　アクアタイルＨＭＡ　２５０−１５　
　（微工研菌寄　第８１１４号）を得た。

さらに、フラボバクテリウム　アクアタイルＨＮＡ２５
０−１５を液体培地で予め生育増殖させ、リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）中に懸濁させ、ＵＶ処理を行った。

ウスニン酸を含む寒天培地を使用して、ウスニン酸耐性
株ＵＳＮ’−２（微工研菌寄　第８１１５号）を得た。

さらにフラボバクテリウム　アクアタイルＵＳＮ’−２
を液体培地で生育増殖させ、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）中に懸濁させ、ＵＶ処理を行った。メナジオンを含む
寒天培地を使用して、メナジオン耐性株に、−１５（微
工研菌寄　第８１１６号）を得た。

このようにして得られたフラボバクテリウム　アクアタ
イルＫｓ−１５からフラボバクテリウム　アクアタイル
ＣＤ−３１が得られる。

このフラボバクテリウム　アクアタイルＣＤ−３１の菌
学的性質は、メナキノン−４生産性およびスルホナミド
耐性を有する点で大きく異なる他はフラボバクテリウム
　アクアタイルＮｏ、２３８−７と実質適に異なる処は
ない。

このフラボバクテリウム　アクアタイルＣＤ−３１は、
生成したメナキノン−４を菌体内に蓄積するとともに菌
体外へ排出する。

なお、この菌株の培養に際して、培地または、培養液に
、界面活性剤を添加することにより、メナキノン−４の
菌体外への排出量を増加させることができる。界面活性
剤としては、非イオン界面活性剤が好ましい、この界面
活性剤の代表例としては（商品名として表示する）、ユ
ニオン（高級アルコール）、エマルゲン（ポリオキシエ
チレンオレイルエーテル）、プラウノン（ノニルフェニ
ル、ヒマシ油）、レオドール（ポリオキシエチレン　ソ
ルビタン、テトラオレイン酸ポリオキシエチレレン）、
リカノン（ポリオキシエチレン　オレイルエーテル）、
シルパン（ソルビタン　モノパルミテート）、アミゼッ
ト（ヤシ脂肪酸　モノエタノールアミド）およびニュー
コール（特殊ノニオン）などがある。これらの界面活性
剤は、培地または培養液に添加されるが、培地または培
養初期の培養液に添加することが好ましい。

培地または培養液の界面活性剤の濃度は０．０１ｗｔ／
ν２（以下２と記す）乃至生育抑制濃度の範囲内であれ
ばよく、使用する菌株、培養液の菌体濃度および界面活
性剤の種類などにより適宜選択されるが、通常は、０．
０１〜１χ程度、好ましくは０．０１〜０．３ｚ程度と
される。

この微生物を培養するにあたって用いられる栄養培地は
、炭素源、窒素源および無機塩などを含有する通常の微
生物培養用の培地が用いられる。

この炭素源としては、これらの微生物が資化しうるちの
であればよく、グルコース、フラクトース、シュクロー
ス、マルトース、廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分解
物などの炭水化物、グリセロール、ソルビトールなどの
糖アルコール、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン
、アラニン。

グリシン、プロリン、メチオニンなどのアミノ酸、乳酸
、ピルビン酸、酢酸、リンゴ酸、コハク酸。

フマール酸、クエン酸、プロピオン酸、脂肪酸などの有
機酸類、エタノール、プロパツール、ブタノールなどの
アルコール類を単独または組み合わせて使用することが
できる。これらのうちグリセロールが特に好ましい。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、ペプトン。

肉エキスなどが用いられる。これらのうちポリペプトン
が特に好ましい。

無機塩としては、リン酸塩、マグネシウム塩。

鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用いられ、さら
に、アミノ酸、核酸、ビタミン、酵母エキス。

麦芽エキスなどの生育促進物質も使用される。一般に、
Ｋ　ｚ　ＨＰ　Ｏａ　＊　Ｎ　ａ　Ｃ１および酵母エキ
スをそれぞれ添加した場合には、メナキノン−４の生成
量は増大される。また、使用する菌株が栄養要求性を示
す場合には、その要求性物質を培地に添加する。

さらに、これらの微生物の培養用いられる前記の培地に
、イソペンテニルアルコール、ジメチルアリルアルコー
ル、ゲラニオール、ファルネソールなどのアルコール類
およびシキミ酸、０−サクシニル安息香酸、Ｌ−チロシ
ン、バラヒドロキシフェニルピルビン酸、セダーウッド
オイル、α−ピネン、ジフェニルアミンなどを添加する
ことにより、これらを添加しない場合に比してメナキノ
ン−４の生成量が増大する傾向にある。

本発明で使用される微生物の培養は、ｐＨ５〜８．５、
培養温度２０〜４０℃で１〜１０日間好気的に振盪培養
または通気培養することによって行われる。

メナキノン−４は菌体内に蓄積され、さらに、菌体外に
排出されるので、培養液を遠心分離または濾過して培養
上澄液と菌体とを分離した後、菌体および／または培養
上澄液から抽出、単離される。

菌体からメナキノン−４を単離するには、常法によるこ
とができる。すなわち、たとえば、生菌体または乾燥菌
体をアセトン中に懸濁し、６０℃で２時間抽出する。こ
の抽出物を濃縮後、エーテルで抽出し、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーを行い、メナキノン−４画分を分
取し、これを濃縮してメナキノン−４が得られる。

培養上澄液中からメナキノン−４を単離するには、常法
によることができる。すなわち、たとえば、培養上澄液
をそのまま、あるいは、濃縮した後、たとえば、ヘキサ
ン、ベンゼン、およびエチルエーテルなどの水に不溶な
有機溶媒を加え、有機溶媒層へメナキノン−４を転溶さ
せ、メナキノン−４抽出物を濃縮後、エーテルに溶解し
、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、メナキ
ノン−４画分を分取し、これを濃縮してメナキノン−４
が得られる。

メナキノン−４の同定は、高速液体クロマトグラフィー
、薄層クロマトグラフィー、ｕｖスペクトル、ＩＲスペ
クトル、マススペクトルなどによって行った。また、メ
ナキノン−４の定量法としては高速液体クロマトグラフ
ィーを使用した。

〔実施例〕

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （Ａ）フラボバクテリウム　アクアタイルＣＤ−３１の
取得 ペプトン−グリセロール液体培地（Ｍ３１培地）（グリ
セロール１５ｇ、酵母エキスｌｆｌ　ＫＨｔＰＯ４３ｇ
、ＮａＣｌ　２　ｇ、　ＭｌｌＳＯａ・７１１ｔ００．
２ｇおよび純水１０００　ｄ、　ｐＨ７，０）で３０°
Ｃ２４時間生育させたフラボバクテリウム　アクアタイ
ルに、−１５をＮＴＧ　１００ｐｒ／ｒｄを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中に１０’個／　ｍｌと
なるように懸濁し、３０℃３０分間振盪した。

その後、遠心分離で集菌した菌体を０．１Ｍリン酸緩衝
液で洗浄し同様な緩衝液中に１０”個／となるように懸
濁した。スルファグアニジン３．５ｇ・／ｍＲを含むペ
プトン−グリセロール寒天培地（前記ペプトン−グリセ
ロール液体培地に寒天２０ｇ／Ｉを添加したもの）上に
前記の懸濁液０．１ｄを塗布し、出現したコロニーをス
ルファグアニジン耐性株として採取した。これらの耐性
株の中からメナキノン−４を多量生産するフラボバクテ
リウム　アクアタイルＣＤ−３１（微工研菌寄　第９１
９４号）を得た。

（Ｂ）メナキノン−４の製造 グリセロール６０ｔ／ｌ、ポリペプトン２３ｔｒ／Ｉ。

酵母エキス３ｇ　／１．　Ｋ、ＨＰＯ４７ｇ　／１．　
ＮａＣ１５ｇ　／１゜Ｍｇ５Ｏ・７８ｔＯ０，８ｇ　／
１を含む培地１００−をｌＩｌ、容三角フラスコに入れ
、１２０°Ｃで２０分間加熱殺菌を行った。

前記と同様な培地を用いて３０℃で１日間前項１！（試
験管培養）して得られたフラボバクテリウム　アクアタ
イルＣＤ−３１の培養液を、培地に対してｌ容量χ接種
し、培養温度３０℃で回転振盪培養を行った。培養開始
８日目に培養を終了した。培養液のｐｉは、４．９５で
あり、６１０ｎｓ＋の吸光度（０，Ｄｌ。Ｒ，）は、１
５．０であった。

培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメナ
キノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に、４
６■／ｌおよび菌体中には培養液１１あたり６３■／ｌ
のメナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産
性は、１０９■／ｌであった。

実施例２ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルを０．２χ加え
た以外は、実施例１と同様にして培養した。

培養開始８日目に培養を終了した。培養液のｐＨは４．
８５であり、６１０ｎｍの吸光度（０，０６１６−）は
、１７．５であった。

培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメナ
キノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に４３
■／Ｉ、および菌体中には培養液１ｊ２あたり８９■／
ｌのメナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生
産性は、１３２■／ｌであった。

実施例３ 本培養の培地中に、リカノンを０．１χ加えた以外は、
実施例１と同様にして培養した。

培養開始８日目に培養を終了した。培養液のｐＨは６．
７であり、６１０ｎｍの吸光度（０，０６１０−）は、
７．８であった。

培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメナ
キノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に９４
■／１．および菌体中には培養液１１あたり４５■／１
のメナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産
性は、１３９ｍｇ／ｆであった。

実施例４ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルおよびリカノン
をそれぞれ０．２χおよび０．１χ加えた以外は、実施
例１と同様にして培養した。

培養開始８日目に培養を終了した。培養液のｐＨは６．
４であり、６１０ｎｍの吸光度（０，Ｄｈ、。、１１Ｉ
）は、９．６であった。

培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメナ
キノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に１３
２■／１．および菌体中には培養液１１あたり７１■／
！のメナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生
産性は、２０３■／ｌであった。

〔発明の効果〕

本発明の新規微生物は、メナキノン−４の生産性が高く
、この新規微生物を使用する本発明のメナキノン−４の
製造法によってメナキノン−４を容易にしかも効率良く
製造することができる。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野　和書

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）フラボバクテリウム属に属し、メナキノン−４生
   産能およびスルホナミド耐性を有する新規微生物。
2. （２）フラボバクテリウム属に属し、メナキノン−４生
   産能およびスルホナミド耐性を有する新規微生物を培地
   に培養し、菌体および培養液中のそれぞれにメナキノン
   −４を蓄積させ、該菌体および培養液中のぞれぞれから
   蓄積されたメナキノン−４を採取することを特徴とする
   メナキノン−４の製造法。