JPS6356294A - カルニチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はカルニチンアミドを加水分解してカルニチンを
製造する方法に関するものである。

本発明により製造されるカルニチンは脂肪酸代謝に関連
する物質としてビタミンＢＴと呼ばれたことがあり、従
来ＤＬ体が健胃剤などに使用されてきたが、最近では特
に９体が注目され、心臓疾患や脂肪血症の治療剤として
有用であり、また高カロリー輸液としても用いることが
できることが知られている。

従来の技術 従来ＤＬ−カルニチンの製法としては、古くから合成法
が仰られているが、合成法は、加熱、鉱酸、アルカリや
有害物質の使用などエネルギー的、公害的に不利であり
、また生成するカルニチンがＤＬ体である欠点がある。

最近生化学的方法として４１Ｊ　−）リメチルアミノ酪
酸の水酸化反応（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ！ｈｅｚ、、　　２
５　ｂ巻、１２４７頁、１９８１年）、３−デヒドロカ
ルニチンの還元反応（Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３９巻、３２９頁、１９８０年
）、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを経由す
る方法（公開特公昭５９−１１８０９３号）、クロトン
ベタインを基質とする方法（公開特公昭５９−１８５６
９４号、同５９−１１８０９３号）、ＤＬ−０−アシル
カルニチンのエステラーゼによる加水分解法（Ｂ１０ｔ
ｅＣｈｎＯ１，Ｂｉｏｅｎｇ、、　２　ｂ巻、９１１頁
、１９８４年）が研究された。しかし、これらの方法は
、原料が高価であったり、酵素が不安定であったり、高
価な補酵素の補給を必要とするなど工業的に不満足なも
のといわざるをえない。カルニチンアミドを鉱酸などの
使用により化学的に加水分解することは従来知られてい
たが、生化学的加水分解については全く知られていなか
った。

発明が解決しようとする問題点と問題点と解決するため
の手段 本発明者らは、カルニチンの有用性、特にその光学活性
体の有用性に着目し、エネルギー的、及び公害的に有利
な生化学的加水分解法が、カルニチン合成の中間体であ
るカルニチンアミドに対して適用できれば、工業的に有
利なカルニチンの製法と々りうると考え、その可能性を
、保存微生物、広く自然界から分離した微生物の検討に
よって追求した結果、本発明を完成するに至った。

作用 本発明は、安価に簡単に合成しうるカルニチンアミドに
、これを加水分解してカルニチンを生成せしめる酵素（
アミダーゼの１種）もしくは該酵素を含有する製剤、生
体標品（微生物、細胞）、固定化酵素、固定化菌体を作
用せしめてカルニチンを製造する方法である。勿論、生
化学的方法の常としてカルニチンアミドはその非毒性の
塩、例えばクロライドの形でも使用でき、カルニチンも
塩の形でも製造しうる。本発明方法によれば、常温かつ
中性附近という温和な条件で反応を行なうことができる
ので、エネルギー的、公害抑制の面からも従来法に比し
て有利であり、従来の生化学的方法のようなカルニチン
から誘導した化合物を原料とするのではなく、カルニチ
ン合成の中間体であり光学不活性（ＤＬ体）のカルニチ
ンアミドから光学活性のカルニチンをえることは本発明
の方法によって始めて可能となった。

本発明に使用する酵素は、一般名でアミダーゼと呼ばれ
、国際的な酵素分類の命名記号によると、加水分解酵素
の中で鎖状アミド結合に作ミドのような化合物に作用す
るアミダーゼの存在については従来全く知見がなく、本
発明の研究で始めて見出されたものである。

カルニチンアミドをカルニチンに変換する酵素を生産す
る微生物は、自然界より、カルニチンアミドからカルニ
チンを生成する能力に基いて選択分離することができる
。具体的には本発明者らが分離した菌株である細菌菌株
ＣＡ３２−Ｃ！、０Ａ−１０−１−５、Ｉ：！Ａ２７Ｂ
１゜ＣＡ３Ｑ−１１Ｂ、ＣＡ２８−５ＱＡＸＣＡ３０−
３５をあげることができる。これらの菌株は本発明者ら
が分離し、本発明に使用しうるものの代表法として微生
物工業技術研究所に寄託したものであシ、その分類学的
性質は次のとおりである。

これらの分離菌は、何れもダラム陰性、好気性の桿菌で
あり、バーゼーズ、マニュアル・オプ・システマチック
・バクテリオロジ−（Ｂｅｒ−ｇｅＥ’ｓ　Ｍａｎｕａ
ｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ　）第１巻（１９８４年）に従うと以下に記載す
る性質から、同書の分類セクション４のシュードモナダ
シ工科（Ｐｓｅｕｄｏｚｏｎａｄａｃｅａｅ　）　　の
中のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に
属する０以下、分離株の性質の共通性に基いて、若干の
グループに分けて分類学的性質を記載する。

先ず全分濡株に共通する性質を述べると、上記したとお
り、何れもダラム陰性、好気性の桿菌であシ、大きさば
０，５〜０．８　Ｘ　ｌ　７〜３．０ミクロンと比較的
小さいものから、１．２〜１．５×２．４〜４．２ミク
ロンと比較的大きいものまである（第１表参照）。通常
の条件で多形性は認められず、抗酸性もない。胞子をつ
くらず、運動性で極べん毛を有する。肉汁寒天培養でコ
ロニーは小さく、周縁は金縁、隆起は半レンズ−凸状、
表面は平滑で、光沢は半透明、乳白色〜灰白色（ｆ：！
Ａ３０−３５のみは別記するように菌体が黄色）、肉汁
液体培養で、表面の生育はなく中等度に濁った生育をす
る。一部の菌（ＯＡ−３２Ｃを代表法とする第Ｖ群）で
は葉片状の沈でん？生ずるが、他の株では沈でんはない
。

ゼラチンを液化せず、ＭＲテスト、ｖＰテスト、インド
ールの生成、でん粉の加水分解は何れも陰性である。無
機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）の利用はコハ
ク酸培地で何れも陽性である。オキシダーゼ、カタラー
ゼはともに陽性であり、０−Ｆテストは酸化的である。

クエン酸の利用は５１ｍ０ｎの培地で何れも陽性で元す
るが、他の株では変化がない（凝固、液化ももちろんな
ｈ）。

糖からの酸生成は第１表に示した以外に、ＣＡ３０−３
５を除いて何れも、Ｌ−アジピノース、Ｄ−マンノース
、Ｄ−フラクトース、シュクロース、マルトース、Ｄ−
）レバロース、Ｄ−ンルピット、Ｄ−マンノース、Ｄ−
フラクトース、グリセリン、でん粉に対して陰性である
。

以下、分離株の性質から更シて共通の性質ともつもノヲ
群別して、ＩＩ、ｌＮ２ｍ、　■、ｖ、ｖｔ。

群に分けて分類的性質を第１表に記載する。

第　　１　　表 ′菌体：黄色 第１表（つづき） □ｍ’−４−、−−−や、＋２＋−や＋　）　−＋−１
−−・１以上のような性質を有する菌は夫々の群につい
て数珠づつ分離されている。これらの菌を−く一ゼエー
ズ・マニュアル・オプ・システマチック・バクテリオロ
ジー、第１巻（１９８４年）に従って同定すると、何れ
もシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属
すると認められた。

１群はシュードモナス−プチダ（Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ　
）、およびシュードモナス・ブラフイルジ−（Ｐ。

ｄθ’１ａｆｉθ１ｄ１１）と多くの性質を共有するが
、前者とは一一ハイドロキシ酪酸の蓄積で、後者とは水
溶性色素の生成、４℃の生育で異なり、他にも該当する
菌種がないので、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　　と同定して、代表法０Ａ２
７Ｂ１を微生物工業技術研究所（以下微工研と省略す）
に寄託した。■群はシュードモナス・ブラフイルジーと
多くの性質を共有するが、アルギニンの利用、４℃の生
育で異る。

硫化水素の生成が陽性でｐ＋（５での生育が良好である
。該当する菌種がないのでシュードモナス属菌種（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　　と同定して、代表
法ＣＡ３０−１１Ｂを微工研に寄託した。■群もシュー
ドモナス・ブラフイルジーと多くの性質を共有するが、
水溶性色素の生成、４℃の生育で異る。該当する菌種が
彦＜、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｓｐ＋）　　と同定して、代表法ＣＡ２８−５０Ａを
微工研に寄託した。

■群はシュードモナス・ブラフイルジーとアルギニンの
利用、イノシトールの利用、４℃の生育で異り、該当す
る菌種がないのでシュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　Ｓｐ、　）　　と同定して、代表法ＣＡ１
０−１−５を微工研に寄託した。

■群はシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕ−ｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）に似た性質
を有するが、グルコース、アルギニンの利用で異り、該
当する菌種がないので、シュードモナス属菌種（ＰＳｅ
ｕｄＯｍＯｎａ８８ｐ、　）　　と同定して代表法ＣＡ
３２−Ｏｉ微工研に寄託した。■群は生育に生育因子を
必要とし、菌体が黄色である点で、キサントモナス（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）属に属するともみられるが色
素の吸収がキサントモナスンと同定されないので、一応
シュードモナス属に属すると考えた。この群の菌株は、
第１表記載の糖以外にも多くの糖（Ｌ−アラビノース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、マルトース、シュクロース、トレハロース、Ｄ−マニ
トール、イノシトール）から酸を生成する。シュードモ
ナス属に該当する菌種を見出せず、シュードモナス属菌
種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ８ｐ、）と同定して代表法
ＣＡ３０−３５を微工研に寄託した。

微工研に寄託した菌株名と微工研の寄託爵号を対応して
表すると次のとおりである。

０Ａ２７Ｂ１　　　・・・微工研菌寄第」りρ号０Ａ３
０−１１Ｂ・・・微工研菌寄第ｆ７１０号０Ａ２８−５
０Ａ・・・微工研菌寄第？Ｚθ７号ＣＡ１０−１−５・
・・微工研菌寄第Ｐ９６？号ＣＡ３２−Ｃ・・・微工研
菌寄第と７１号ＣＡ３０−３５　　・・・微工研菌寄第
９？６７号これらの微生物は、野生株、変異株の何れも
使用でき、微生物またはその培養液から抽出した酵素も
本発明に使用できる。さらて、この酵素活性を有する固
定化酵素、固定化微生物も勿論使用できる。

これらの微生物を培養して必要なアミダーゼ活性をふく
む標品をえるには、通常の培養法によればよく、特に説
明を要しないが、基質としテ用いるカルニチンアミドを
含有する培地に生育せしめた場合にアミダーゼ活性の高
い培養物をえることができる。また固形培地、液体培地
の何れも使用可能である。

上記のようにしてつくったアミダーゼ活性を含む微生物
またはそれによりつくった酵素標品をカルニチンアミド
に作用せしめる方法は、基質をふくむ溶液に酵素標品を
加えて反応が進行するまで培養すればよいが、微生物を
酵素標品とする培養は微生物の培養液に基質を加えて反
応せしめてもよく、また、微生物の培養液から分離した
酵素標品、菌体、洗浄菌、凍結乾燥菌体、アセト／乾燥
菌体など物理化学的、生化学的に処理した菌体、抽出液
、精選物、固定化処理標品などの形でも基質と接触せし
めることができる。

基質濃度は、バッチ式、連続式の何れによるかによって
も異るが、バッチ式では一般に媒質中１１〜３０係、好
ましくはα５〜１０％程度で、連続式ではこれよりや＼
濃度を低下させた方がよい。

反応は、普通５〜６０℃、好ましくは２５〜４０℃附近
、Ｉ）Ｈ’〜１０附近で行われる。反応時間は、静置、
攪拌、流下等の手段、あるいは酵素標品の形態、力価に
よって異ってくるので一様ではないが、バッチ法では通
常１〜１００□　　時間程度である。

反応の進行は、薄層クロマトグラフィーによりカルニチ
ンの生成を追跡して、あるいはペアソンらの酵素法によ
るＬ−カルニチンの分析によシ行なう。総カルニチン中
に占める５体と９体の比率あるいは光学純度は、反応液
からシリカゲルのクロマトグラフィーによりカルニチン
を分離し、Ｌ−フェニルアラニンのカルニチンアミドに
変換した後、高速’ｌ＆体クロマトグラフィーでＬ−フ
ェニルアラニンのＬ−カルニチンアミドとＬ−フェニル
アラニンのＤ−カルニチンアミドの両者の面積比で決定
することができる。反応終了後、反応液をイオン交換文
脂のカラムにかけ、稀塩酸で溶出、ａ３することにより
Ｌ−カルニチンクロライドとして回収される。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ カリＣＬ７５％、燐酸−カリ０．２５％、硫酸マグネシ
ウム（７水塩）０．０１係、硫酸第一鉄（７水塩）［１
，０１係、塩化ナトリウムα５％、ＤＬ−カルニチンア
ミド塩酸塩１％の組成の培地（ｐＨ７，２）５ａｆを大
型試験管に入れて一滅菌したものに、第１表に示した微
生物を植菌して２６℃で７２時間振とう培養した。この
培養の濃度にふくむｐＨ７，０の燐酸緩衝液０．５−を
加えて、さらに２６℃で２４時間振とう培養で反応させ
た結果、第２表に示した濃度にＬ−カルニチン（塩酸塩
として示す）が生成していた。

第２表 菌　株　　　　　　　　Ｌ〜カルニチン”０Ａ２７Ｂ１
　　　　　　　　５１１ＨＩ／ｗＣＡ２８−５０Ａ　　
　　　　　　　　五６　　〃”塩酸塩として示す 実施例２ 使用微生物として菌株ＣＡ３０−３５を用い、培地とし
て、グルコース１ｔ４．ポリペプトン０５係、肉エキス
（１３％、酵母エキス０３％、塩化ナトリウム０．２５
％の組成の培地（ｐＨ７，２）を用いる他は実施例１と
同様に実施した場合、培養液中のし一カルニチン生成量
は５、ａ　ｍｙ　／　ｒｒｔ（塩酸塩として）、さらに
培養を４８時間延長した場のＬ−力ル二チン生成量はａ
９〜／ｄ（塩酸塩）であった。この培養液中の総カルニ
チン中の５体：９体の比を分析したところ９１．５壬：
ａ５憾であった。

実施例３ 実施例１の培地で７２時間培養した培養液から菌体を遠
心分離により分けて２回洗浄したものを燐酸緩衝１（ｐ
ａｙ、ｏ）に加えて、菌体濃度が元の培養液中の濃度に
なるようにし、またＤＬ−カルニチンアミド（塩酸塩）
を１０■／ｄの濃度に加えたものを２４時間２６℃で振
とう培養した結果、培養液中のも一力ルニチンの生成量
（塩酸塩として示す）、培養液中のカルニチン中に占め
る５体の比率は第３表に示した如くであった。

第３表 菌株　　　　　　　Ｌ−カルニチン　　　Ｌ体ＣＡ２．
７Ｂ１　　　　　　　４．６　Ｉｎ９７ｍ７！　　　　
９８％ＯＡ　２８−５　ＯＡ　　　　　　５．４　　　
ｐ　　　　　９４％実施例４ 実施例１の培地に、第４表に示した菌株を７２時間培養
してから、菌体を遠心分離］７て２全加工、またＤＬ−
カルニチンアミド塩酸塩を加えて、混合液中の菌体濃度
が元の培養液中ので１８時間振とう反応させたとき反応
液中に第４表に示した濃度にＬ−カルニチン（遊歴形で
示す）が生成し、反応液中の総カルニチン中に占めるＬ
体の率は表示の如くであった。

第４表 菌株　　　　　　　　Ｌ−カルニチン”　　５体ＣＡ３
０−３５　　　　　　　α２６　　ｍｙ／ｍｌ　　　８
９．Ｓ係０Ａ２８−５０Ａ　　　　　　　　　Ｑ、９７
　　　　ｔｔ　　　　　　　９２．８／／ＣＡ３０−１
　１Ｂ　　　　　　　　　□、３２　　　　ｐ　　　　
　　４７．０ｔｔＣＡ”、０−５２Ｂ　　　　　　　　
　Ｑ、４４　　　　／Ｉ　　　　　　２６．８／／ＣＡ
３２−Ｃ！　　　　　　　　　　　　　１．８２　　　
　ｔｔ　　　　　　　５９．５／／ＣＡ１　０−１−５
　　　　　　　　１，１３　　　　／Ｉ　　　　　　４
１．８／／養遊雅形で示す 実施例５ 実施例３の方法において菌体を使用する反応でのカルニ
チンアミド塩酸塩の濃度を５％とす他は実施例３と同様
に実施し、菌体との反応時間を７２時間とした場合のＬ
−カルニチン（塩酸塩）の生成量は、菌株０Ａ２７Ｂ１
で１２．０η／　ＩＩＥＩＩＩ　％菌株０Ａ２８−５０
Ａで２４．９η／ｍ／であった。

実施列６ 実施例１の如く培養してえた菌株ＣＡ２８−５０Ａの菌
体を２０（ｌｙ／−の濃度になるよう生理食塩水に懸濁
した液１０ａ１ｔに４憾アルギン酸ナトリウム液１０−
を加え混合した後、１５憾の塩化カルシウム溶液にこの
混合液を徐々に滴下して、粒状の固定化菌体をえた。こ
の固定化菌体全量？ｊＤＬ−カルニチンアミド塩酸塩１
係をふくむｐ）（７，ｏの燐酸緩衝液２０ゴに加え、３
０℃で１６時間反応させたところ、Ｌ−カルニチン（塩
酸塩）が１．６η／ｄの濃度に生成していた。

発明の効果 本発明は上述したように、カルニチン合成の中間体で安
価に合成されるＤＬ−カルニチンアミドに微生物を反応
させてカルニチン、特に光学純度の高いＬ−カルニチン
を収率よく生成せしめるもので、工業的な光学活性カル
ニチンの：Ａ法を提供するものである。

特許出願人　　パイオール株式会社 代表者　中　山　　清 中央化成品株式会社 代表者　水　島　喜三部 手　続、補　正　書　（自発） 昭和６１年／λ月、２３日 特許庁長官　　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第６１−１９８
１７３号２、発明の名称　　カルニチンの製造法五補正
をする者 ４、補正の対象　　明細書の発明の詳細な説明の欄５、
補正の内容 （１１明細書第２１頁６行目の次に次の実施例７：Ｉ　
／％　りｆｇ　１％、ヘフトン１％、肉エキス０．５％
、塩化ナトリウム１５％、燐酸二カリ　０．７５　りｂ
　１　燐酸−カ　リ　０．２５　％　、　　硫酸マグネ
シウム（７水塩）　０．０１％、硫酸第一鉄（７水塩）
０．０Ｄ１％、カルニチンアミド塩酸塩０．５％の組成
の培地（ｐＨ７，２）　３０−をふくむ３００ゴ三角フ
ラスコに菌株ＣＡ２８−５ＣＩＡを植菌して、２６℃で
３日間振とう培養した。この培養液から菌体を遠心分離
により集めて、カルニチンアミド塩酸塩１０％をふくむ
ｐＨ７，０の燐酸緩衝液（生育培養の培養液量と同量）
にけん濁して２６′Ｃ−で９６時間静置反応させたとこ
ろ、Ｌ−カルニチン（塩酸塩として）が４ａ９ｆ　／　
ｔの濃度に生成した。

実施例８ グルコース２％、コーン会スチープ・リカー２％、塩化
ナトリウムα５％、燐酸二カリ０．７５％、燐酸−カリ
０．２５％、硫酸マグネシウム（７水塩）α０１％、硫
酸第一鉄（７水塩）　Ｏ，ＯＯ１％、カルニチンアミド
塩酸塩１％の組成の培地（ｐＨ７，２）　７′ｃ菌株Ｃ
Ａ２８−５０Ａを植）して、２０Ｃで６日間振とり培養
した。この培養液から菌体を遠心分離により集めてカル
ニチンアミド塩酸塩２０％をふくむｐＨ７，０の燐酸緩
衝液（生育培養の培養ｇ量と同量）にけん濁して２６℃
で１４４時間静置反応させたところ、反応液中にＬ−カ
ルニチン（塩酸塩として）が９７．６ｆ／ｌの濃度に生
成した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂（ナトリウム
型）カラムに通してＬ−カルニチンとカルニチンアミド
を吸着させ、ついで酢酸アンモニウムの稀薄溶液を流し
てＬ−力ルニチンをカルニチンアミドから分けて、Ｌ−
カルニチン分画を濃縮、アルコール添加冷却することに
よｐＬ−カルニチン分回収した。

手　　続　　補　　正　　書　（自発）昭和６２年８月
７３日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第６１−１９８
１７３号２、発明の名称　　カルニチンの製造法五補正
をする者 ５、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カルニチンアミドを加水分解してカルニチンを生成
   せしめる活性を有する酵素（アミダーゼ）もしくは、該
   酵素を有する微生物をカルニチンアミドに作用せしめて
   カルニチンを生成せしめることを特徴とするカルニチン
   の製造法。 ２、生成するカルニチンが光学活性体である特許請求範
   囲第１項記載の製造法。 ３、使用する微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕ−ｄｏ
   ｍｏｎａｓ）属の微生物である特許請求範囲第１項記載
   の製造法。 ４、使用する微生物が菌株ＣＡ３２−Ｃ（微工研菌寄第
   ８９１１号）、ＣＡ１０−１−５（微工研菌寄第８９０
   ８号）、ＣＡ２７Ｂ１（微工研菌寄第８９１２号）、Ｃ
   Ａ３０−１１Ｂ（微工研菌寄第８９０１号）、ＣＡ２８
   −５０Ａ（微工研菌寄第８９０９号）、ＣＡ３０−３５
   （微工研菌寄第８９０７号）で代表される分類学的性質
   を有する細菌である特許請求範囲第１項記載の製造法。