DE2010654C3 - Normalisierung der Darmflora von Mensch und Haustier - Google Patents

Normalisierung der Darmflora von Mensch und Haustier

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Description

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20
Die Erfindung betrifft die im Patentanspruch genannte Verwendung.
Der im Patentanspruch genannte Stamm wurde in der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, unter der Registriernummer NCIB 10 415 hinterlegt.
Dieser Stamm ist eine Subkultur, welche man ursprünglich unter der Klassifizierung Lactobacillus w acidophilus erhielt. Die anfängliche Bestimmungshypothese wurde infolge mikroskopischer Eigenarten des Organismus und seiner gezeigten hohen Widerstandsfähigkeit gegen Hitze umgestoßen. Auch brachte das morphologische Bild Zweifel, da die Zellen sehr r> unregelmäßig sind und deshalb eine größere Ähnlichkeit mit Mikrobakterium als mit Streptococcus aufweisen. Die negativen Ergebnisse des Benzidintestes führten auch zur Aufgabe der vorherigen Alternative, und das Vermögen des untersuchten Stammes, bei 100C 4< > zu wachsen, ergab eine weitere negative Indikation. Infolgedessen wurde trotz der morphologischen Unregelmäßigkeit geschlossen, daß der Organismus ein Streptococcus und im einzelnen ein Streptococcus der Enterococcusgruppe sei (hohe Widerstandsfähigkeit 4r> gegen Hitze, Wachstum bei 100C und bei 45°C). Weitere Versuche festigten diese Schlußfolgerung. So konnte gezeigt werden, daß der Organismus die Fähigkeit hat, auf Slanetz'schem und Bartley'schem Nährboden zu wachsen. Aus diesen und anderen Gründen muß der w Organismus als ein Enterococcus angesehen werden. Auch die folgenden Eigenschaften konnten gezeigt werden: Wachstum bei einem pH-Wert von 9,6; Wachstum in Medien mit einer NaCI-Konzentration von 6,5%; Wachstum in einem 40%igen Gallen-Agar v> bzw. Nährboden. Alle diese Eigenschaften werden bekanntlich als spezifische Identifikationsmerkmale für Enterococci angesehen. Um einen Vergleich zu ermöglichen, schlossen sämtliche Versuche auch die Verwendung eines Stammes von dem zur Enterococcusgruppe gehörenden Streptococcus durans (ATCC 6056) ein, und außerdem einige Enterococcusstämme, die speziell für diese Aufgabe von Dünger isoliert worden waren.
Es wurde eine ausgedehnte Übereinstimmung zwischen dem Stamm Streptococcus durans und dem untersuchten Stamm festgestellt und infolgedessen anfänglich die Identität beider angenommen. Jedoch ergab fortgesetztes diesbezügliches Suchen in der Literatur und außerdem Vergleichsstudium, daß der Organismus mit größerer Wahrscheinlichkeit als Streptococcus faecium bestimmt werden könnte; nach Deibel (Bart. Reviews 28, 330-336, 1964) kann der Streptococcus durans im einzelnen als eine Variante des Streptococcus faecium angesehen werden. Diese Schlußfolgerung basierte hauptsächlich auf der Tatsache, daß der untersuchte Stamm bei 50°C wächst und Arabinose in Gärung bringt, wohingegen er Sorbit nicht in Gärung versetzt und Zitrat nicht als Kohlenstoffquelle verwendet Die vier aufgezeigten Merkmale stimmen mit den Eigenschaften des Streptococcus faecium überein, jedoch nicht mit denen des Streptococcus faecalis. Wie oben erwähnt, ist es von geringerer Bedeutung, ob der Organismus als Streptococcus durans oder als Streptococcus faecium klassifiziert wird.
Verglichen mit dem sogenannten, sehr j3-haemolytischen Stamm Streptococcus durans muß der untersuchte Stamm als praktisch nicht haemolytisch angesehen werden. Deshalb ist auch unter diesem Aspekt die Klassifizierung des Stammes als Streptococcus faecium als- korrekt anzunehmen. Darüber hinaus läßt der untersuchte Stamm Milch nicht gerinnen. Die Säurebildung in Milch ist schwach, z. B. im Vergleich mit dem Referenzstamm Streptococcus durans. Der End-pH-Wert in Milch war 5,5 bzw. 4,4.
Es sei herausgestellt, daß der Streptococcus faecium in der letzten Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 19577, nicht als selbständige Spezies betrachtet wird. Viele in den letzten Jahren durchgeführten Versuche haben jedoch sehr die Notwendigkeit einer Revision der Enterococcusgruppe in Bergey's Handbuch aufgezeigt und außerdem, daß diese Gruppe aus zwei verschiedenen Spezies bestehen sollte, nämlich dem Streptococcus faecalis einerseits und dem Streptococcus faecium andererseits. Der Streptococcus faecium ist vom Streptococcus faecalis dadurch sehr leicht unterschieden, daß ersterer Folsäure erfordert, letzterer jedoch nicht.
Eine Untersuchung der morphologischen und Züchtungseigenschaften des »Streptococcus faecium Cernelle NClB 10 415« hat die in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnisse gezeitigt:
Medium etc.
Eigenschaften
Morphologie
Lemco-Agar Blut-Agar und Brühe
Wachstum
Kultivationstcmpcratur
Temperaturbereich
Gramfärbung positiv, kokkoid, oft lanzettartig. Einzeln, als Paare und Ketten verschiedener Länge. Nicht bewegungsfahig.
30-45 C
15-45 C (über 45 C nicht geprüft)
Medium etc.
Eigenschaften
H2-Atmosphäre, Blut-Agar
Blut-Agar, 24hbei25°c"
Kohlenhydrate in Peptonwasser
(7 Tage bei 30C)
Hugh und Leifson, Glukose
(7Tagebei25"C)
MRS-Schmutzboden
Lackmusmilch
Harnstoff
Zitrat (Koser's)
Voges-Proskauer
M ethyl rot
Nitrat zu Nitrit
NH3 von Trypton
Gelatine-Agar- bzw. Nährbodenplatte Stärke-Nährbodenplatte
Milch-Nährbodenplatte
Katalasc
ZellfarbstoiT-Oxydase
Oxydase (Kovac's)
GutesWachstum, 7 Tags bei 3OX
Punktförmige Kolonien. Kreisförmig; eben; feucht; wenig konvex; gänzlich umrandet; opak und farblos. Butterartig, jS-haemolytisch.
Säure, aber kein Glas von Glukose, Saccharose, Lactose, Maltose, Mannit und Trehalose. Weder Säure noch Gas von Stärke, Glyzerin und Dulcit
Säure in offenen und geschlossenen Rohren
Gutes Wachstum. Keine Gasblasen mit heißem Draht-Homofermentiv. Säure, weder Gerinnung noch-Ausscheidung.
Geringes Wachstum
Klärung, aber Niederschlag mit HgCl2.
30 Sekunden
Bei mit Streptococcus faecium Cernelle NCIB 10 415 durchgeführten Züchtungsversuchen haben sich die folgenden zehn Aminosäuren als notwendige Wachstumsfaktoren für diesen Stamm erwiesen: Arginin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Methionin,Threonin,Tryptophan und Valin.
Vier B-Vitamine waren wichtige Wachstumsfaktoren: Riboflavin, Niacin, Pantothensäure und Folsäure.
Die folgenden Ergebnisse gaben Bestimmungen für die Resistenz des Organismus in vitro gegen einige Antibiotika und Chemotherapeutika:
Antibiotika und Chemotherapeutika
Gruppe
1. Sulfaisodimidin
2. Penicillin
3. Ampicillin
4. Streptomycin
5. Chlortetracyclin (Aureomycin)
6. Oxilclracyclin (Terramycin)
7. Chloramphenicol
8. Polymyxin
IV
III
III
IV
II
II
IV
In dieser Tabelle haben die verschiedenen Gruppen die folgenden Bedeutungen:
Gruppe I: »empfindlich« (allgemeine Infektion, übliche Dosierung);
Gruppe ll:»ziemlich empfindlich« (allgemeine Infektion, hohe Dosierung);
Gruppe Ill:»gering empfindlich« (lokalisierte Infektion, Konzentrierung des Chemotherapeutikums an der Infektionsstelle — beispielsweise bei Harntrakt-Infektionen);
Gruppe IV:»Resistent« (wahrscheinlich der Chemotherapie nicht zugänglich).
Die Züchtung des im Patentanspruch genannten Stammes, welcher nachfolgend als »Streptococcus
4>; faecium Cernelle 68« bezeichnet wird, erfolgt unter submersen anaeroben Bedingungen bei 30 bis 45° C, zweckmäßig 34 bis 40° C, unter Rühren in Medien, welche Kohlehydrate enthalten, wie Dextrose, eine Quelle für organischen Stickstoff, beispielsweise Pepton,
--,ο und einen Ausgangsstoff für Wachstumssubstanzen, beispielsweise Hefeextrakte. Die Züchtung findet am besten bei einem pH-Wert zwischen 5,8 und 7,2 statt, wobei zweckmäßig Ammoniumhydroxid als Säureregulator Verwendung findet. Die Zeit für die Züchtung
τ, beträgt zwischen 10 und 30 Stunden. Die optimalen Bedingungen sind 37°C und 16 Stunden.
Ist das Wachstum vollendet, wird die Bakterienmenge am besten unter Zuhilfenahme eines Separators abgetrennt und zweckmäßig in Wasser suspendiert,
Mi dann gefriergetrocknet und abgepackt.
Das gemäß der Erfindung verwendete Bakterium hat die Fähigkeit, sich im menschlichen oder tierischen Darm zu vermehren und kann deshalb in der Humanmedizin und als Zugabe zu tierischen Futtermit-
hi teln Verwendung finden, insbesondere zur Verhütung der Enteritis.
Der in Rede stehende Mikroorganismus produziert Milchsäure, ist für den Darm natürlich und besitzt eine
so hohe Lebensfähigkeit, daß er andere Darmbakterien hemmt und hierdurch die Darmflora normalisiert
Wenn er gefriergetrocknet Futtermitteln für Tiere beigegeben wird, dann ruft er auf biologische Art einen physiologischen Effekt hervor, welcher zu den gleichen · oder zu besseren Ergebnissen führt als die Fütterung von Antibiotika, welche häufig Tierfytter beigemischt werden. Er reduziert die Darminfektionen und vermehrt das Wachstum der Tiere je Gewichtseinheit des Futtermittels. Gleichzeitig wird die Anzahl der zum Erreichen des Endgewichts erforderlichen Fütterungstage vermindert
Das Gemisch hat sich als besonders vorteilhaft für die Aufzucht von Ferkeln und Kälbern erwiesen. Seine Beimischung zum Futter anstelle von Antibiotika hat zu einem schnelleren Erreichen des Verkaufsgewichts bei Ferkeln geführt als dies ohne jede Beimengung möglich gewesen wäre.
Deshalb kann das Gemisch als Ersatz für Antibiotika und Chemotherapeutika im Futter Verwendung finden. Dies ist von besonderer Bedeutung, da es die antibiotisch resistenten Bakterien am Wachstum hindert. Dieses Wachstum tritt häufig bei der Beimengung von Antibiotika zu Futter auf. Die so entwickelten antibiotisch resistenten Stämme bilden in der Humanmedizin ein wachsendes Problem.
Im folgenden wird ein Beispiel aufgeführt, um das Züchten von Streptococcus faecium Cernelle 68 und die Zusammensetzung des Produktes zu verdeutlichen.
30
Beispiel
Die Streptococcus faecium Cernelle 68-Kultur wird zweckmäßig als Strichkultur in Tomatensaft-Agar gehalten, welcher auf 5° C gekühlt ist. Die Kultur wird einmal je Monat auf neue sterile Röhrchen übertragen. Nachdem das Wachsen erkennbar geworden ist, wird ein Test mit Gram-Färbung und Aufstreichen auf eine Tomatenüaft-Agarplatte sowie eine Nährstoff-Agarplatte durchgeführt.
Eine Vorkultur mit folgenden Mengen wurde präpariert:
NaCl 5g
Pepton 10g
Fleischextrakt 3g
Dextrose 5g
Wasser 1000 ml
und auf vier 250-ml-Erlenmeyerkolben aufgeteilt sowie 20 Minuten bei 121°C sterilisiert. Unter sterilen Bedingungen wurde eine Platinschlinge von der Kultur zur Brühe gebracht. Die Inkubation dauerte 27 Stunden bei 24°C. Nach dem Wachsen wurde eine Kontrolle mit Gramfärbung, Aufstreichen auf eine Tomatensaft-Agarplatte sowie in einem Phasenkontrastmikroskop durchgeführt.
Eine Neutralisierungslösung, 6% NH4OH, wurde bereitet und mittels eines Sterilisationsfilters sterilisiert. Mit dem NH4OH enthaltenden Kolben war ein Glasröhrchen mittels eines an eine Schlauchpumpe anschließbaren Schlauches steril verbunden.
17 Liter des Substrates wurden zur schichtweisen Kultivierung hergestellt durch Abwiegen von
55
60
Pepton 510g
Dextrose 765 g
Hefe-Extrakt 119g
Wasser 1700 ml
Die festen Bestandteile wurden in Wasser gut gelöst und die Lösung Sterilisationskesseln aus rostfreiem Stahl zugeführt welche eine Verbindung zum sterilen Hinübertreiben der Flüssigkeit in den Züchtungskessel aufwiesen. Das Substrat wurde 50 Minuten bei 121°C (10 Liter) sterilisiert bzw. 40 Minuten bei 12 Γ C (7 Liter). Der Züchtungskessel war bei 1800C 4 Stunden sterilisiert worden.
Das Substrat wurde durch sterile Luft unter 0,5 atm. Druck von den Sterilisationskesseln zum Züchtungskessel gedrückt Das Inokulat wurde zugefügt Die Entlüftung des Kessels wurde in steriler Form durchgeführt Die mit einem pH-Regulator verbundene pH-Elektrode wurde angeschlossen. Der pH-Wert wurde in einem Bereich von 5,8 bis 7,2 konstant gehalten. Der Regulator sandte Impulse zur Schlauchpumpe, welche die NHiOH-Flüssigkeit durch die sterile Verbindung zum Kessel transportierte. Ein Kontaktthermometer war mit dem Kessel verbunden und die Temperatur wurde bei etwa 37° C gehalten. Der Motor des Rührwerkes wurde in Bewegung gesetzt und die Züchtung begonnen.
Das Wachsen wurde während etwa 16 Stunden bei konstantem pH-Wert und unter Rühren ermöglicht. Anfangs war das Substrat von dunkler Farbe und am Ende bekam es eine leuchtend gelbe Färbung. Es wurden etwa 3000 ml 6%ige NH4OH verwendet
Die erhaltene Kultur wurde in einem Separator separiert Die im Separator abgetrennte Bakterienmenge wurde unter aseptischen Bedingungen suspendiert. Die Suspension wurde bei 0,01 mm Hg während 20 Stunden gefriergetrocknet und das trockene Pulver in sterile Glasflaschen verpackt
Die erhaltene Kultur wurde im Mikroskop mit Gramfärbung und nach dem Wachsen auf Tomatensaftagar, Nährstoffagar und VRA-Agar überprüft. Die gefriergetrocknete Menge wurde zusätzlich durch Züchtungsversuche überwacht.
Zum mit der Erfindung erreichten technischen Fortschritt wird ausgeführt, daß das Konzentrat mit der Absicht entwickelt wurde, den Zusatz von Antibiotika im Futter zu ersetzen und auf diese Weise das Auftreten von resistenten Bakterienstämmen zu verhindern, in welchem Fall nämlich die entsprechenden Krankheiten nicht mit Antibiotika bekämpft werden können. Die Antibiotika sollen nicht dem täglichen Futter zugesetzt werden, sondern erst der Anwendung durch den Veterinär vorbehalten bleiben, und zwar zur Anwendung bei kranken Tieren, so daß mit diesen Antibiotika ein wesentlich besserer Effekt erreichbar ist.
Darüber hinaus wird die Verdauung der Tiere verbessert da das Konzentrat Milchsäure produzierende Bakterien enthält, die normalerweise im Verdauungstrakt bei Mensch und Tier vorhanden sind. Diese Bakterien eignen sich zum Aufschluß von Futtersubstanzen, wie Cellulose. Da Cellulose beispielsweise in verschiedenen Zuckerarten aufgeschlossen wird, wird das Futter besser absorbiert. Unter dem Einfluß der Bakterien während des Verdauungsvorgangs entstehen für den Körper wichtige Substanzen, beispielsweise die Vitamine B 1, B 2, B 6 und B 12. Dies wiederum ergibt eine normale oder etwas höhere Gewichtszunahme bei ein^r geringeren Futtermenge. Dementsprechend wird durch die Verwendung des Konzentrats ein verminderter Futterverbrauch erreicht.
Der Stamm Streptococcus faecium Cernelle 68 erzeugt Milchsäure, die wiederum den pH-Wert mindert. Damit sind die Lebensbedingungen für andere
Bakterien im Verdauungstrakt weniger günstig. Die meisten Darmbakterien sind unfähig, sich bei geringen pH-Werten zu vermehren. Ihr Wachstum wird gestoppt, und Streptococcus faecium Cernelle 68 entwickelt sich infolge seiner hohen Lebensfähigkeit sehr rasch in solchem Maße, daß er schließlich völlig dominiert und schädliche Bakterien weitgehend verdrängt. Die Wirkung hiervon ist, daß in wenigen Tagen ein Gleichgewicht der Darmflora erreicht wird, welche die Tiere gesunden läßt und Darmentzündungen vorbeugt.
Das Auftreten von Streptococcus faecium Cernelle 68 im Darmkanal begünstigt die Entwicklung unspezifischer Antikörper. Dies steigert die Resistenz der Tiere gegen Infektionen. Bei Kälbern hat sich außerdem eine Abnahme von Lungenentzündungen u. dgl. Infektionen ergeben. Diese Sekundärwirkung ist zusätzlich von großer wirtschaftlicher Bedeutung.
Beim Menschen wurde neben einer Regulierung dei Darmflora eine Schmerzlinderung bei Migräne beobachtet. Versuche haben darüber hinaus gezeigt, daß die Darmflora die Erzeugung von Antikörpern in der Milchsäuren fördert. Die auf diese Weise vermehrten Antikörper werden über die Muttermilch auf den Säugling übertragen.
Der gleiche Mechanismus ist bei den Tieren
ίο feststellbar. Durch den Zusatz des Konzentrats zum Sauenfutter während der letzten 10 Tage vor dem Abferkeln ergab eine bessere Entwicklung der Ferkel in den ersten Tagen nach der Guburt. Am besten sollte man das gefriergetrocknete Bakleriumkonzentrat dem Sauenfutter so lange zumischen, bis die Ferkel entwöhnt

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verwendung von Streptococcus faecium Strain Cernelle NCIB 10 415, der durch Vermehren in einer wäßrigen Nährlösung mit Kohlehydraten, einer Quelle für organischen Stickstoff sowie einer Quelle von Wachstumssubstanzen unter submersen anaercben Bedingungen sowie anschließender Trennung der entstandenen Bakterienmenge von der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit und gegebenenfalls darauffolgendem Gefriertrocknen der isolierten Bakterienmenge erhalten worden ist, zur Normalisierung der Darmflora von Mensch und Haustier, bei letzteren vorzugsweise als Zusatz zum Futter zur Verbesserung des Wachstums, insbesondere von Ferkeln und Kälbern.
    10
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